Avaliação do potencial antimicrobiano das espécies vegetais cipura paludosa e chenopodium ambrosioides / Ana Milda Karsten Baumgart, 2014. 49 Tabela 2 – Concentração inibitória mínima dos extratos e óleo essencial de Chenopodium ambrosioides contra bactérias Gram-negativas.
Objetivo Geral
Objetivos Específicos
Doenças infecciosas
Agentes antimicrobianos
As propriedades antimicrobianas de extratos e substâncias são geralmente estudadas por meio de testes in vitro, como por exemplo o teste de suscetibilidade (BELLA CRUZ et al., 2010). As bactérias Gram-positivas possuem uma parede celular espessa e multicamadas, consistindo principalmente de peptidoglicano que circunda a membrana citoplasmática (MIMS et al., 1999). Nas bactérias Gram-negativas, a camada de peptidoglicano é fina e fica no topo de uma membrana externa, ancorada em moléculas de lipopolissacarídeos e lipoproteínas no peptidoglicano (MIMS et al., 1999).
A investigação química de extratos vegetais e produtos naturais quanto à atividade antimicrobiana mostrou que as plantas superiores representam uma fonte potencial de novos agentes anti-infecciosos (HEEMANN et al., 2006). O mecanismo de ação dos óleos essenciais é complexo e ainda não totalmente explicado (KNOBLOCH et al., 1989; YUNES; CECCHINEL-FILHO, 2007). Assim, não existe um método padronizado para expressar os resultados dos testes antimicrobianos de produtos naturais (FENNEL et al., 2004).
Estudos preliminares conduzidos por Chekem et al. 2010) na Universidade de Dschang (África Central) sobre a atividade antifúngica do óleo essencial das partes aéreas (folhas, flores e galhos) de C. O óleo essencial inibiu completamente o crescimento micelial dos fungos testados na concentração de 0,3 % (GARDEN et al., 2008). Os fungos atingem o organismo através do trato respiratório e podem causar lesões integrais, viscerais ou meningoencefálicas (LACAZ et al., 2002; SCHAECHTER et al., 2002).
A utilização de imunoterapia, terapia fotodinâmica e a busca de novas moléculas é realizada utilizando peptídeos vegetais (GULLO et al., 2013). O critério utilizado para interpretação dos resultados da bioautografia foi o aparecimento de zonas de inibição ou halos ao redor das substâncias isoladas no CCD, indicando sua atividade antimicrobiana (RAHALISON et al., 1994).
Resistência antimicrobiana
Bactérias
As bactérias são organismos procarióticos, não possuem núcleo típico, seu material genético não é protegido por membrana, é encontrado em cromossomos circulares, chamados nucleóides. A coloração de Gram é uma forma simples de classificar bactérias, utiliza princípios morfotintoriais da parede celular e através dela podemos classificar as bactérias em dois grandes grupos, Gram-positivas e Gram-negativas (TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). O peptidoglicano é essencial para a estrutura, duplicação e sobrevivência nas condições normalmente hostis em que as bactérias crescem.
A parede celular Gram-negativa contém duas camadas fora da membrana citoplasmática e não existem ácidos teicóicos ou lipoteicóicos (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2010). Na Figura 2 podemos observar as diferenças acima mencionadas em relação às bactérias Gram-negativas e Gram-positivas. As bactérias patogênicas são caracterizadas pela sua capacidade de transmitir, aderir e invadir células e tecidos do hospedeiro, sua toxigenicidade e sua capacidade de escapar do sistema imunológico do hospedeiro (JAWETZ; MELNICK; ADELBERG, 2005).
Outras espécies fazem normalmente parte da microbiota humana, mas também podem causar doenças.
Fungos
Sua estrutura celular possui parede celular, mitocôndrias, aparelho de Golgi, ribossomos associados ao retículo endoplasmático e citoesqueleto composto por microtúbulos, microfilamentos e filamentos intermediários (SCHAECHTER et al., 2002). Essa descrição mostra que os fungos são tão semelhantes às células hospedeiras que dificulta o desenvolvimento de estratégias terapêuticas específicas, direcionadas contra o agente infeccioso e ao mesmo tempo não tóxicas ao hospedeiro (SCHAECHTER et al., 2002). Quanto à sua capacidade de produzir doenças, os fungos são classificados em patógenos primários e patógenos oportunistas (ZAITZ; RUIZ; SOUZA, 2004).
Dentre as infecções fúngicas mais comuns, encontramos as micoses cutâneas, que são causadas principalmente por dermatófitos, que utilizam a queratina como nutriente durante a infecção da pele, cabelos e unhas, e são classificadas em três gêneros: Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton (WHITE et al., 2008). Embora as infecções causadas por dermatófitos sejam geralmente limitadas a áreas superficiais da epiderme, esses fungos podem se comportar de forma invasiva e causar infecção profunda e disseminada em pacientes imunocomprometidos, mesmo com aparecimento de granulomas dermatofíticos (RODWELL et al., 2008). Diversos fungos presentes no ambiente ou parte da flora normal podem, em determinadas situações, transformar-se de saprófitos em patógenos, causando quadros clínicos variados, desde processos febris benignos até septicemia, por vezes fatal (LACAZ et al., 2002).
A transmissão exógena ocorre principalmente em pacientes debilitados pelo tratamento com antibióticos e imunossupressores e no curso de doenças crônicas (LACAZ et al., 1998; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008; FISHER; COOK, 2001).
Plantas medicinais e atividade antimicrobiana
Destes, 10 são derivados de produtos naturais, 64 são derivados de produtos naturais com certas modificações, 23 são completamente sintéticos e 1 é sintetizado a partir de produtos naturais (NEWMAN; CRAGG, 2007). De 2006 a 2010, foram aprovados 6 novos agentes antibacterianos, dos quais 3 eram derivados de produtos naturais com modificações e 3 eram completamente sintéticos (NEWMAN; CRAGG, 2012). Em relação aos antifúngicos em 2006, existiam 29 medicamentos, sendo 1 de origem biológica, 3 derivados de produtos naturais com modificações, 22 totalmente sintéticos e 3 foram sintetizados a partir de produtos naturais (NEWMAN; CRAGG, 2007).
Em termos de agentes antifúngicos, estão sendo pesquisados medicamentos com alvos específicos para reduzir a toxicidade, pois as células fúngicas e as células humanas são semelhantes e compartilham muitas vias metabólicas intermediárias onde existem enzimas semelhantes. As pesquisas sobre agentes antifúngicos buscam inibidores da biossíntese do ergosterol, inibição de topoisomerases ou mesmo da parede celular fúngica (ZACCHINO, 2001).
Óleos Essenciais e atividade antimicrobiana
Para avaliar a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais, utilizamos dois testes, o método de difusão em ágar e o método de diluição em ágar (KALEMBA; KUNICKA, 2003). A maior parte deste trabalho é feita com óleos essenciais sem fracionamento e em muitos casos sem identificação de constituintes químicos. Sabe-se, entretanto, que a lipofilicidade de sua estrutura hidrocarbonada e a hidrofilicidade de seus grupos funcionais são importantes para a ação antimicrobiana dos componentes dos óleos essenciais (KALEMBA; KUNICKA, 2003).
O modo de ação dos agentes antimicrobianos depende do tipo de microrganismo ao qual estão ligados, principalmente da estrutura da sua parede celular e da disposição da membrana externa. Os componentes dos óleos destroem a parede celular de bactérias e fungos e a membrana citoplasmática, interrompem a movimentação de prótons, o fluxo de elétrons, o transporte ativo e a coagulação do conteúdo celular (KALEMBA; KUNICKA, 2003; BURT, 2004). Alguns componentes dos óleos essenciais de natureza fenólica, por exemplo o carvacrol e o timol, podem causar ruptura na face externa da camada lipopolissacarídica, seguida de desintegração parcial da membrana externa (HELANDER et al., 1998).
Ambas as estruturas rompem a membrana externa das bactérias Gram-negativas, liberando lipopolissacarídeo (LPS), aumentando a permeabilidade da membrana citoplasmática ao ATP.
Cipura paludosa
Com o objetivo de melhorar a extração de compostos antifúngicos, um segundo estudo avaliou o extrato hexânico, que melhorou o rendimento (1,1%) de antifúngicos com atividade comparável ao óleo essencial (JARDIM et al., 2010). A composição química dos extratos e óleos essenciais de C. ambrosioides tem sido objeto de diversos estudos. 1998), identificou σ-terpineno e ascaridol no óleo essencial de C. Os procedimentos para obtenção de extratos brutos, frações, óleo essencial e hidrolatos foram realizados no Laboratório de Análises Fitoquímicas da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI pelas acadêmicas Ruth Tomasoni. Degenhardt e Liliane Trivellato Grassi, liderados pela professora Dra.
Legenda: OE- Óleo essencial; EBF EtOH – Extrato etanólico bruto de folhas; EBR – Extrato bruto de cenoura; EBC – Extrato bruto de caule; P. O óleo essencial apresentou atividade antifúngica moderada contra C. tropicalis. Foi considerado com atividade antifúngica fraca com CIM de 781,25 ppm e foi considerado inativo contra C. Os resultados obtidos em fungos filamentosos indicam atividade antifúngica moderada do óleo essencial contra A.
Comparando estes resultados com os avaliados no presente estudo, observamos que em relação a A. 2009), também foi avaliada a atividade antifúngica do óleo essencial das folhas C. O óleo essencial inibiu completamente e inibiu parcialmente o crescimento de A. violaceum. o crescimento de A. niger na concentração de 800 ppm. Isto poderia explicar porque algumas substâncias apresentaram menor atividade antimicrobiana do que o óleo essencial do qual foram extraídas, como observado com as substâncias ascaridol e isoascaridol em relação ao óleo essencial de C.
À medida que aumentamos a concentração do óleo essencial, a diferença na condutividade elétrica também aumentou, essa diferença comprova que quando há aumento na condutividade elétrica da suspensão celular, a membrana citoplasmática é rompida, causando danos celulares e observamos ainda uma comportamento dose-dependente de 6.250 ppm a 12.500 ppm, o que é explicado pelo valor MIC de 6.250 ppm. Análise do óleo essencial e frações obtidas do hidrolato de Chenopodium ambrosioides e avaliação do potencial antitumoral.
Chenopodium ambrodioides
Ensaios microbiológicos
O teste de difusão em ágar, também chamado de difusão em placas, é um método físico no qual um microrganismo é testado contra uma substância biologicamente ativa em um meio de cultura sólido e o tamanho da zona é relacionado. As técnicas de aplicação do antimicrobiano no método de difusão são a utilização de discos, cilindros de aço inoxidável ou vidro e perfuração em ágar (PINTO; KANEKO; OHARA, 2003). O teste de difusão em disco foi aceito pela Food and Drug Administration (FDA) e estabelecido como padrão pelo CLSI (BARRY; THORNSBERRY, 1991).
O método consiste em colocar os discos sobre o meio de cultura sólido previamente inoculado em placas de Petri, os discos devem ser colocados de forma que sua distância até a lateral da placa seja maior que 15 mm e não se sobreponham às zonas de inibição. O pH do meio de cultivo deve estar entre 7,2 e 7,4, e a profundidade recomendada é de aprox. 4mm (BARRY;. THORNSBERRY, 1991). Como controle positivo utiliza-se o caldo contendo o quimioterápico padrão com a suspensão padronizada do microrganismo testado e como controle negativo o meio de cultura com o solvente utilizado para dissolver a amostra e a suspensão microbiana (SAHM; WASHINGTON II , 1991).
A macrodiluição envolve testes em tubos de ensaio, com volume de meio de cultura variando de 1 a 10 ml.
Equipamentos
Reagentes
Material Vegetal
Cipura paludosa
Parte da fração de DCM foi fracionada em sílica gel por cromatografia em coluna, eluindo com gradiente de n-hexano:acetato de etila com polaridade crescente originando diversas frações, onde frações 58-65 referentes a isoleuterina, 17% de DCM e frações produzidas 77- 3. correspondente à eleuterina apresentou rendimento de 6,5% também a partir do DCM.
Chenopodium ambrosioides
O material botânico foi seco e separado em folhas, caules e raízes, triturado e submetido separadamente ao processo de maceração com etanol, apenas as folhas foram submetidas ao processo de distribuição líquido-líquido com solventes que não se misturam entre si e em ordem crescente de polaridade (diclorometano, acetato de etila e butanol). O hidrolato resultante foi submetido à partição líquido-líquido, repetindo-se o mesmo procedimento do extrato bruto das folhas. O óleo essencial obtido foi denominado CAOE com rendimento de 1,15%, representou duas substâncias principais que foram identificadas como: 1-isopropil-4-metil-benzeno (p-cimeno) (42,32%) e 1-isopropil-4-metil -2,3-dioxabiciclo[2.2.2]oct-5-eno (ascaridol, total de 92,09% do óleo essencial analisado.
Micro-organismos
Preparação dos inóculos
Bactérias
Fungos leveduriformes
Fungos filamentosos
Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Método de diluição em ágar (macrodiluição)
Método de diluição em caldo (microdiluição)
