Isoforms and alternative splicing of the plasma membrane calcium ATPase

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Isoforms and alternative splicing of the plasma membrane calcium ATPase

Doctoral Thesis Author(s):

Stauffer, Thomas P.

Publication date:

1995

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https://doi.org/10.3929/ethz-a-001486493 Rights / license:

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ISOFORMS AND ALTERNATIVE SPLICING OF THE PLASMA MEMBRANE CALCIUM ATPase

A dissertation submittedtothe

SWISSFEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH forthe

degree

^of

Doctor ofNaturalSciences

presented by

Thomas P. Stauffer

Dipl.

phil II;

University

^{of Zurich}

born28th

July

¹⁹⁶⁴ citizenofRuti,BE andZurich,ZH

accepted ^onthe recommendation of Prof. Dr. ErnestoCarafoli,^examiner Prof. Dr. BernardC. Rossier,co-examiner

Dr. DaniloGuerini, co-examiner

Zurich 1995

Summary/Zusammenfassung

¹

Summary

Ca2+

ions are

important

second messengers involved in many cellular processes.

Signals

^are transmitted

by raising

^the

normally

very low intracellular

Ca2+

concentration

(about

¹⁰⁰

nM) by

several orders of

magnitude.

^{Different molecules, like}

Ca2+

Channels,

antiporters

^{or ATP} driven pumps, ^areinvolvedin the

generation

^andthe regulation^ofthe

Ca2+

signal.

The

plasma

^membrane

Ca2+-ATPase _(PMCA)

isinvolved in the restoration of the

Ca2+ _resting

level. Dueto its

high Ca2+ _affinity

itwas

proposed

^tobe

responsible

for the fine

tuning

of the intracellular

Ca2+

concentration. The enzyme is encoded

by

four genes

(PMCA1-4),

which result in four distinct isoforms. Their numberisfurther increased

by

alternative

splicing

^{at three} distinctsites.

Analyzing

^{the tissue} distribution of the four human PMCA transcripts ^and their relative amountsby quantitative ^{PCRon reverse}transcribed mRNA, ^it becomes obvious thatthere exist two different

expression

patterns^{for the} four genes. Two gene

products

^were found to be

expressed ubiquitously

ⁱⁿ all tissues

(PMCA1

^and

4),

^{whereasthe other}two

(PMCA2, 3)

^weredetected in neuronal andmuscle tissues

only.

^The

highest

^{amounts of PMCAmRNA}

were found in neuronal tissues. In further

experiments

the variants at the splice^siteswere

analyzed by

RT-PCR,andresultedinthe

discovery

^ofnew

splice

^forms.Aquantitative

analysis

^ofthe

splice

^formswas

performed

^{in the} different tissues, showing that there exists a

general,

normally ^most abundant splice ^{variant at each} splice ^site. Since, ^no information was available about the different genes ^and their location at the protein level, antibodieswere

generated

specificfor the fourgene

products.

^Thereforethe N-terminalparts^ofthefour isoformswereover

expressed

ⁱⁿE.coli and used to immunize rabbits. The antibodies were

highly specific

^{for the}

corresponding

isoform and showed no

crossreactivity.

All antibodies

recognized

^the

corresponding

^rat isoforms, except ^the

antibody against

PMCA4. The antibodies were used to

analyze

the distribution of the four enzymes ⁱⁿ different human and rat tissues

by

^{Western blot}

analysis.

^The

resultsverifiedthe

finding

^obtained

by

^the

previous study

^{on the}transcripts,

though

^{some minor}

discrepancies

^{in the}

expression

pattern ^{were found.}

PMCA1 and 4 were found to be expressed ^{in almost all} tissues, whereas PMCA2 and3 werefound again onlyin neuronal tissues. In

general

^PMCA1

was the more abundant

housekeeping

enzyme with ^some

exceptions

e.g.

erythrocytes.

As also shown on thetranscript level, ^the

highest

^{amounts of}

PMCA were found in neuronal tissues, therefore cellular and subcellular distribution of the PMCA isoforms were

analyzed

^{in brain}

by immunohistochemistry

and immunoelectron

microscopy. Interestingly,

^the

housekeeping

^isoform

(PMCA1)

^{wasfound tobe} expressed

ubiquitously

ⁱⁿ brain but in different relative amounts, whereas PMCA2 and 3 were found

only

in very

specific regions (PMCA2: Purkinje

^cell dendrites; ^PMCA3:

choroid

plexus).

^The

specific

distribution of theisoforms and their distinct biochemical

properties

suppose that

they

represent ^well

adapted

^{forms for}

specific regions containing

^{different but well defined}

physiological

properties.

Summary/Zusammenfassung

³

Zusammenfassung

Kalziumionen sind

wichtige

^sekundare Botenstoffe, ^{welche an etlichen} zellularen Prozessen

beteiligt

^{sind. Die}

Signale

^{werden durch die}

Veranderung

^der intrazellularen lonenkonzentration ubermittelt. Die normale Konzentration

liegt

^{bei zirka 100 nM und kann sich bei der}

Signalubermittlung

^{bis auf 800} nM erhohen. Verschiedene Molekiile, wie KalziumionenkanaleOder ATP

angetriebene Kalziumionenpumpen

^{sind fur} die Produktionund

Regulation

^dieses

Signales

verantwortlich.

Die Plasmamembran Kalzium-ATPase

(PMCA)

^ist

partiell

verantwortlich fur die

Wiederherstellung

^der Grundkonzentration der Kalziumionen. Da das

Enzym

^{eine sehr} hohe Kalziumaffinitat besitzt, wird angenommen, dass ^es fur die

Feinregulation

^der intrazellularen Kalziumionenkonzentration

zustandig

^{ist. Das}

Enzym

wird durch vierGenekodiert. Die Variability wird weiter erhohtdurch alternatives

Spleissen

^an drei Orten.

Die

Gewebeverteilung

^der

Transkripte

^{der vier}

Genprodukte

^der Plasmamembran Klazium-ATPase und deren relative

Menge

wurde mittels der

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

^{an revers} transkribierter mRNA bestimmt. Im

generellen

wurden zwei unterschiedliche

Verteilungsmuster gefunden:

^{Die Isoformen 1 und 4}

(PMCA1, 4)

^{wurden in}

jedem

^Gewebe

exprimiert,

wahrend Isoformen 2und 3nurin neuronalemGewebe in hohen Mengen gefundenwurden. Dieswarauchdas Gewebe, ^{in dem}die hochste

Menge

^{an PMCA}

spezifischer

mRNA dedektiert wurde. In weiteren

Experimenten

^{wurde das}

Spleissmuster

^{an alien drei} Orten, ^an denen alternatives

Spleissen

^entstehen kann, untersucht. Dabei wurden bisher unbekannte

Spleissformen

^{entdeckt. Die}

quantitative Analyse

^der

Spleissformen zeigte,

^{dasses an}

jedem

^{Ort eine}

Hauptform gibt,

^welchein jedem Gewebe vorhanden ist und normalerweise den

Hauptanteil

^darstellt.

In neuronalem Gewebe wurdeeine sehr hohe Varibialitatvon

Spleissformen gefunden.

Daes keine Informationen uber die Prasenz und die

Verteilung

^derProteine der vier PMCA-Formen

gab,

wurden Isoformen

spezifische Antikorper hergestellt.

Dazu wurde der N-terminale Bereich der

jeweiligen

^{Isoform in}

E.coli

uberexprimiert

^{und Kaninchen mit dem}

aufgereinigten Peptid

immunisiert. Die

Antikorper

^{waren hoch} isoformen-spezifisch ^und

zeigten

keineKreuzreaktion mit denanderen Isoformen.AlleAntikorper,^ausserdem gegen PMCA4, erkannten auch die

entsprechende

Rattenisoform. Die Antikorper ^{wurden in}

Western-blot-Experimenten

^{verwendet urn die vier}

Isoformen in menschlichen wie auch

Rattengeweben

nachzuweisen. Die

Resultate entsprachen ^im Prinzip ^denErgebnissen,die bei der

Analyse

der mRNA erhalten wurden: die beiden Isoformen 1 und 4 waren in fast alien Geweben

exprimiert

^{wahrend2 und3wiederum nur in}neuronalem Gewebe

gefunden

wurden. Die Isoformenverteilung im Hirn wurde daraufhin mittels Immunohistochemie aufzellularerundsubzellularere Ebene untersucht. Es

zeigte

sich ein sehr interessantes Muster. Wie erwartetwurde Isoform 1 fast in alien

Hirnregionen

^im Zellkbrper und in den Auslaufern von Neuronen

gefunden.

^{PMCA2 und 3 wurden im}

Gegensatz

^{dazu nur in sehr}

spezifischen Hirnregionen

ⁱⁿ grossen Mengen

gefunden (PMCA2:

Purkinjezellen-Dendriten;

PMCA3: Choroid

Plexus).

Korrelationen mit den bekannten biochemischen

Eigenschaften

^{der Isoformen lassen die}

Hypothese

zu, dass die Isoformen

spezifisch

angepasste

Enzyme

sind, welche fiir die

Regulation

^der Kalziumionen an dem

jeweiligen

^Ort verantwortlich sind.