Pseudomonas oleovorans katalysierten Bildung

Diss.ETHNr. 9751

Stereochemische Untersuchungen ^der

^von

Pseudomonas oleovorans katalysierten Bildung

^von

Aldehyden

^aus

^Olefinen.

ABHANDLUNG

zur

Erlangung

^{desTitelseines}

Doktors derNaturwissenschaften der

EIDGENÖSSISCHEN

TECHNISCHEN HOCHSCHULE

ZÜRICH

vorgelegt

^von

PIEDER CADUFF

dipl.

^{Chem. ETH}

geboren

^am10. Juli 1959

vonCumbel/GR

Angenommen

^auf

Antrag

^von Prof.Dr. D.

Arigoni,

^Referent

PDDr. B.

Jaun,

Korreferent

Zürich 1992

Zusammenfassung

Der

Organismus

Pseudomonas oleovorans

verfügt

^{über ein}

Enzymsystem,

das

befähigt ist,

^{1-Octen zu}7-Octen-l-ol zu

hydroxylieren.

^{Des Weiteren}

wird die terminale

Doppelbindung

^derart

oxidiert,

^dass

1,2-Epoxyoctan

^und

Caprylaldehyd

^entstehen.Während der

Aldehydbildung

tritt eine intramole¬

kulare

1,2-Wasserstoffwanderung

auf. Es ist

bekannt,

^{dass das}

Epoxid

^nicht

eineZwischenstufefür die

Gewinnung

^des

Aldehyds

darstellt. In der vor¬

liegenden

^Arbeitwurde

regioselektiv

monodeuteriertes 1-Octenmit_ganzen Pseudomonasoleovorans-Zellen

inkubiert,

^um den stereochemischen Ver¬

lauf der

Bildung

^von

Caprylaldehyd festzulegen.

^Es

gelang nicht,

^dener¬

wünschten

Caprylaldehyd

^{in der}

Kulturlösung

nachzuweisen. Eine in den Bakterienzellen anwesende

Aldehyddehydrogenase

^{ist in der}

Lage,

^denen-

zymatisch gebildeten Aldehyd sogleich

^zurCarbonsäurezuoxidieren. Aus diesem Grunde wurde ebenfalls nach der

Caprylsäure

^Ausschau

gehalten.

Aber auchdieses

Metabolisierungsprodukt

konnte nicht erfasst werden. Auf Grund dieses Befundes mussten die relevanten

Komponenten

^des

Enzym¬

systems

^derPseudomonas oleovorans isoliert werden.

Die

Isolierung

^des Rubredoxins und die

partielle Reinigung

der Pseudomo¬

nas

oleovorans-Monooxygenase

^waren

Voraussetzungen,

^{um ein}

Enzym¬

system ^zu

erstellen,

^{das aus}

NADPH, Spinat-Ferredoxin-NADP+-Reduk-

tase, ^Rubredoxin

(bzw. Ferredoxin)

^{und der}

partiell gereinigten Monooxy¬

genase bestand. Wurde 1-Octen als Substrat für dieses

POM-Enzymsystem eingesetzt,

^{konnte die}

Caprylsäure

^als

Oxydationsprodukt

identifiziert wer¬

den. Bei

Verwendung

^von

cis-[l-2H]-l-Octen

als Substrat wardie isolierte

Caprylsäure

^{am Zentrum}

C(2)

monodeuteriert. Da der

Deuterierungsgrad

des Produktes demDeuteriumanteil in

cis-Stellung

^{desSubstrates}

entsprach,

warausschliesslichder

cis-ständige Ligand

^von

C(l)

^nach

C(2) gewandert.

Dabei wirdder

primäre Deuteriumisotopeneffekt

^eher

überwunden,

^alsdass

ein Wasserstoffatom aus der

trans-Lage

wandern würde. Diese Aus¬

schliesslichkeit der

1,2-Wanderung

^des

cis-ständigen Liganden

^{konnte in}

einer

komplementären

Inkubation durch Einsatz von

trans-[l-2H]-l-Octen

als Substrat

belegt

^werden.

Seite: JJ TheoretischerTeil

Umden stereochemischen Verlauf der

Aldehydbildung

beschreibenzukön¬

nen, musste zudem die

Konfiguration

^des

Wanderungsterminus

^untersucht

werden. Dazu wurde die

Synthese

^vonselektiv a-monodeuterierter

Capryl¬

säurebekannter

Konfiguration

^am

C(2)-Zentrum notwendig.

Durch Reduk¬

tionvon

[1-2H]-Heptanal

mit dem chiralen

Midland-Reagenz

^{wurdestereo¬}

selektiv monodeuterierter

[l-2H]-Heptanol hergestellt.

^Die

Konfiguration

des entstandenen Carbinolzentrums wurde auf

unabhängige

Weise enzyma- tisch und

NMR-spektroskopisch

bestimmt. In mehreren

Syntheseschritten

mit bekanntem stereochemischen Verlauf wurde die

[2-2H]-Caprylsäure

hergestellt.

^{Nach einer}

Veresterung

der Carbonsäure mit

optisch

^{reinem L-}

Mandelsäuremethylester

^{konnte die}

Konfiguration

^des

C(2)-Zentrums 2H- NMR-spektroskopisch

^{ermittelt werden. Diese}

analytische

^{Methodik er¬}

möglichte

nun, die

Konfiguration

^der

enzymatisch gebildeten [2-2H]-Ca- prylsäure

^zubestimmen.

Bei der

Verwendung

^von

[2-2H]-1-Octen

als Substrat des beschriebenen

POM-Enzymsystems

^wurde

nachgewiesen,

dass 63% der a-monodeuterier¬

ten

Caprylsäure

^die

(2R)-Konfiguration

besitzen. Die restlichen37% weisen die

antipodale Konfiguration

^{auf. Wurde}

cis-[l-2H]-l-Octen enzymatisch

umgesetzt, ^standen26% der

(2R)-konfigurierten

Carbonsäure 74% der

(S)- [2-2H]-Caprylsäure gegenüber.

^{Daaus beiden}

Inkubationsexperimenten

^der

[2-2H]-Caprylaldehyd ^entsteht,

wird keiner der Anteile durch die Oxidation zurCarbonsäure verändert. Somit stellt sich diese

Verteilung

bereits bei der

Bildung

^des

Caprylaldehyds

^ein.

Die Ausschliesslichkeit der

1,2-Wanderung

^des

cis-ständigen

Substituenten

erlaubt,

^die

Richtung

^des

elektrophilen Angriffs

^der oxidierenden Eisen-

oxo-spezies

^{auf die}

Substratdoppelbindung

^{und die}

Konfiguration

^des

a-monodeuterierten

Caprylaldehyds

miteinander zu korrelieren. Somit ent¬

spricht

^das

(2R)/(2S)-Verhältnis

im

Aldehyd

^der

Häufigkeit

^des

elektrophi¬

len

Angriffes

^ausdem

jeweiligen

Halbraum der

Substratdoppelbindung.

^Als

interne

Standardisierung

^wurde

jeweils

^die

Menge

^der

enzymatisch gebilde¬

ten, ^terminal

ungesättigten Caprylsäure

verwendet. Diese Carbonsäure ist durch

Hydroxylierung

^und

Oxydation

^der

Substratmethylgruppe gebildet

worden.

TheoretischerTeil Seite: m

Neben dem

Caprylaldehyd

^wird

1,2-Epoxyoctan gebildet.

Da dieses Meta¬

bolisierungsprodukt

^{nicht im}

gleichen

^zellfreien

System nachgewiesen

^wer¬

den

konnte,

^wurdendie relativen Anteile der

konfigurationsisomeren,

^mo-

nodeuterierten

Epoxide

^aus Inkubationen von eis- bzw.

trans-[l-2H]-l-

Octenmit ganzenPseudomonas oleovorans-Zellenermittelt.

Basierendauf denausden Inkubationen mit den

Enzymsystemen

^{und den}

ganzenBakterienzellengewonnenen Resultaten wurdeein mechanistisches Bild

entworfen,

^dasdie

Beschreibung

^der

Metabolisierung

^{vonterminalun¬}

gesättigten

Kohlenwasserstoffen mit dem

Enzymsystem

der Pseudomonas oleovoranserlaubt. StellvertretendwirdderReaktionsmechanismusfür die

Metabolisierung

^von

cis-[l-2H]-l-Octen

im Schema A

dargestellt.

ANTI D...._ _....H

SYN

I

V-'FeV

Y-V-X-

D-JLfi G

SYN

8

^a

As

H

A

^H

J

SchemaA: Reaktionsschema der

Metabolisierung

^von

cis-[l-2H]-l-Octen

^{mit dem}

Enzymsystem

der Pseudomonas oleovorans.

Summary

The

organism

Pseudomonas oleovorans bearsanenzyme

System capable

^of

hydroxylating

^{1-octene to} 7-octene-l-ol. In addition the Substrate double bondcanbe oxidizedto

yield 1,2-epoxyoctane

and octanal. In thecourseof the

aldehyde

^formationanintramolecular

1,2-hydride

^{shift is}

required.

^Itis

known that the

epoxide

^isnotanintermediate for theformationof the alde¬

hyde.

^Inanattempt^to

investigate

^the

stereochemistry

^{of the}

aldehyde

^for¬

mation

regioselectively

monodeuterated 1-octenes were incubated with whole cells of Pseudomonas oleovorans. In this incubationnooctanal could bedetected. Thereforeacellfree_enzyme

system

^was

prepared.

Isolation of rubredoxin and

partially purification

^{of the} Pseudomonas oleovorans monooxygenase allowed^toreconstituteanenzyme system^con-

sisting

^of

NADPH, spinach-ferredoxin-NADP+-reductase,

^rubredoxin

(respectively ferredoxin)

^{and the}

partially purified

monooxygenase.

Using

1-octeneasSubstratefor this

POM-enzyme

system, octanoic acidwas de- tectable

by GLC/MS.

Incubation of

cis-[l-2H]-l-octene yielded

^{an a-mo-}

nodeuterated octanoic acid

having

^{thesamedeuteriumcontentas found in}

cis-position

of the Substrate. This

implies

^that

only

^the

ligand

ⁱⁿ

cis-position

of the Substrate is able to

undergo

^the

1,2-migration

ⁱⁿ

spite

^ofanadverse

isotope

effect. The

complementary

^incubation

using trans-[l-2H]-1-octene

confirmedthe observed

specificity

^ofthe

^1,2-shift.

To

investigate

^the

stereochemisty

^{of the}

aldehyde

^formation

analytical

^tools

hadto be established in order todetermine the

configuration

^{at the}

C(2)-

centerof octanalorof octanoic acid. The

synthesis

^of

[2-2H]-octanoic

^acid

of known

configuration

^{was initiated}

by

the reduction of

[l-2H]-heptanal

witha chiral Midlandreagent. ^The

configuration

^ofthe

resulting [1-2H]-1- heptanol

^wasestablished

by

^meansof

enzymatic oxidation/reduction

^{in the}

presence ofyeast ^alcohol

dehydrogenase

^and

by

^NMR

analysis.

^Different

consecutive

synthetic

steps of known stereochemical course were carried out to form the

[2-2H]-octanoic

acid of known

C(2)-configuration.

^After

Seite: II

Summary

esterification of the

carboxylic

^{acid with}

optically

^active

methylester

^{of L-}

mandelic acid the

diastereotopic ligands

^ofthe monodeuteratedcentercould be identified

by

^meansof

2H-NMR-spectroscopy.

^This

analytical

^methodo-

logy

^allowedtodetermine the

configuration

^{of the}

enzymatically produced [2-2H]-octanoic

^acid.

When

[2-2H]-1-octene

^wasusedas Substrate for the

POM-enzyme system

63% of the a-monodeuteratedoctanoicacid are of

(2R)-configuration

^and 37% have

antipodal configuration.

Incubation of

cis-[l-2H]-1-octene

^with

the same enzyme

system

resulted in 26% of

(2R)-

^{and 74% of}

(2S)

^mo¬

nodeuterated octanoic acid.

The exclusive

migration

^{of the}

ligand

ⁱⁿ

cis-position

of the Substrate double bondallowstocorrelatethe side of

electrophilic

^{attackonthe doublebond}

by

the oxidative

iron-oxo-species

^{and the}

configuration

of the a-monodeute- rated

aldehyde.

Therefore the

quotient (2R)/(2S)

^is

monitoring

^{the ratio of}

the

Re/Re-

^and

Si/Si-attack

^on the Substrate double bond. The amountof 1-octenoic acid

produced by hydroxylation

and oxidation of the Substrate

methyl

group allows^todetermine the turnoverof the reaction. Because in¬

cubation time is

kept

^{constant the} results from incubation of each of the monodeuterated Substratescanbe

compared.

Afurther

product

^{of the}

enzymatic

^conversionof 1-octene with whole cells of Pseudomonas oleovorans is

1,2-epoxyoctane.

^This

epoxide

^couldnotbe isolated

using

^thecell free POM enzymesystem.The relative distribution of Constitution isomeric monodeutrated

epoxides

^{was determined}

by

^incuba¬

tion of eis- and

trans-[l-2H]-1-octene

with the bacterial cells.

Onthe basis of the results with the POM enzyme system ^{and the}

experi-

mentswith whole Pseudomonas oleovorans cells a mechanistic scheme is

proposed

^todescribe the metabolism of

terminally

unsaturated

hydrocarbons

with the enzymesystemof Pseudomonas oleovorans. Scheme A illustrates

Summary

Seite: m

the reaction

pathway

for incubation of

cis-[l-2H]-l-octene

with the enzyme system.

Y vi ^M i5—Fe-X-

H...] ^L-H

c

ANTI

Y-W-lf

h^\q7^r

E

SYN

""l

v-w-r Y-'FeW-r

0

F

t ^{H.^AC..H}

^D

Y

»I ^w iB—Fe-X-

DJL.R

G

I

Y-'FeH-r

Y-Fe-r

J

H

SchemeA: Reaction of

cis-[l-2H]-l-Octen

^{with the}Pseudomonas oleovoransen¬

zymesystem.