In our screening methods, we performed assays using a luciferase gene reporter assay to determine the ability of alkaloids to interact with FXR and TGR5 in the HepG2 cell line. Some compounds have also shown the ability to potentiate the effects of OCA or LCA.
Zoznam skratiek
Proteín CREB sa viaže na prvok cAMP, dôležitý transkripčný prvok potrebný na pamäť a prežitie neurónov.
Úvod
Teoretická časť
Nukleárne receptory a ich štruktúra
V dôsledku trojrozmernej štruktúry heterodimérneho komplexu RXR je však väzbová afinita k DNA odlišná (Khan et al. 2003). Okrem toho môže LBD obsahovať aj signály jadrovej lokalizácie, proteínovú interakciu s motívmi dimerizácie proteínu tepelného šoku, koregulátory a iné transkripčné faktory (Khan et al. 2003).
Princípy regulácie nukleárnych receptorov
Farnezoidný X receptor (FXR)
- Role FXR v metabolizme žlčových kyselín
- Role FXR v metabolizme lipidov
- Role FXR v metabolizme glukózy
- Role FXR v ovplyvnení Alzheimerovej choroby
Okrem toho FXR reguluje expresiu transportérov žlčových kyselín, čím chráni pečeň pred zvýšenými hladinami týchto žlčových kyselín. Obmedzuje vychytávanie črevných žlčových kyselín do hepatocytov znížením expresie Na+-taurocholátového kotransportujúceho polypeptidu (NTCP), transportéra zodpovedného za import žlčových kyselín pečeňou (Kemper 2011).
Receptory spojené s G proteínom a ich štruktúra
Princíp regulácie receptorov spojených s G proteínom
Diacylglycerol aktivuje proteínkinázu C, ktorá ďalej fosforyluje mnohé intracelulárne proteíny, aby vyvolala bunkovú odpoveď (Rang et al. 2007). V treťom prípade podjednotka Ga*0 priamo ovplyvňuje iónové kanály, čo má za následok rôzne cielené účinky ovplyvnením polarizácie membrány (Rang et al. 2007).
Receptor žlčových kyselín spojený G proteínom (GPBAR1/TGR5)
- Role TGR5 v ovplyvnení pečeňovej fibrózy
- Role TGR5 v ovplyvnení autoimunitnej hepatitídy a hepatitídy B
- Role TGR5 v ovplyvnení nealkoholickej steatohepatitídy
- Role TGR5 v ovplyvnení portálnej hypertenzie
FXR priamo reguluje génovú expresiu, zatiaľ čo TGR5 nepriamo, iniciáciou špecifických „downstream“ signálnych dráh (Ma et al. 2021). Vysoká expresia receptora TGR5 je tiež dôležitým rizikovým faktorom pre polycystické ochorenie pečene alebo hepatobiliárnu rakovinu (Ma et al. 2021). Pri portálnej hypertenzii môžeme aktiváciou tohto receptora znížiť kontrakciu hepatálnych hviezdicových buniek a zlepšiť intrahepatálnu mikrocirkuláciu (Ma et al. 2021).
Inhibícia kontinuálnej aktivácie HSC je preto jedným zo základných cieľov vedúcich k prevencii a liečbe fibrózy pečene (Ma et al. 2021). Preto tento mechanizmus ukazuje sľubný nový základ pre liečbu autoimunitných ochorení pečene (Ma et al. 2021). Ako už bolo spomenuté, aktivácia TGR5 podporuje sekréciu GLP-1 črevnými bunkami, čo má antidiabetický účinok a tento GLP-1 znižuje steatózu, zápal a tiež fibrózu pečene (Ma et al. 2021).
Oxid dusnatý je dôležitým vazodilatátorom a pokles jeho sekrécie výrazne zvyšuje intravaskulárny tlak (Ma et al. 2021). Aktivácia TGR5 môže súčasne iniciovať expresiu cystationín gama-lyázy a serínovej fosforylácie eNOS, čo vedie k produkcii sírovodíka (H2S) a NO, čo vedie k expresii a sekrécii silného vazokonstriktora endotelu. 1 (ET-1) je inhibovaný v LSEC (Ma et al 2021).
Corydalis cava (L.) Schweigg. a Koerte ako zástupca čeľade Fumariaceae
- Morfologický popis
- Taxonomické zaradenie
- Obsahové látky a použitie
- Morfologický popis
- Taxonomické zaradenie
- Obsahové látky a použitie
Tieto látky majú farmakologický účinok pri liečbe ochorení nervového, kardiovaskulárneho a tráviaceho systému (Deng et al. 2021). Hľuzy tejto rastliny sú veľmi bohatým zdrojom izochinolínových alkaloidov rôznych štruktúrnych typov, ktoré sú hlavnými zložkami tejto rastliny (Chlebek et al. 2011). Prírodné produkty sú jedným z najcennejších zdrojov na liečbu AD a keďže mnohé druhy Corydalis sa v ľudovom liečiteľstve používali na zlepšenie pamäti, moderné farmakologické experimenty tento efekt potvrdili (Iranshahy et al. 2014).
Podľa výskumu, ktorý publikoval Chlebek a jeho tím (Chlebek et al. 2011), alkaloidy (+)-kanadín, kanadín, bulbokapnín a korydalín z Corydalis cava vykazovali miernu aktivitu proti AChE, zatiaľ čo tetrahydropalmatín a protopín z Corydalis yanhusuo boli neaktívne. Vzťah medzi chemickou štruktúrou alkaloidov protoberberínového typu z druhu Corydalis, ktorý je konštitučným podtypom izochinolínových alkaloidov, a ich inhibičnou aktivitou AChE je znázornený na obr. Okrem tohto dôležitého inhibičného účinku na AchE vykazujú alkaloidy z Corydalis ďalšie overené vlastnosti, medzi ktoré patria antiagregačné účinky na krvné doštičky, protizápalové, antivírusové, antihypertenzívne, tiež inhibujú oxidáciu lipoproteínov s nízkou hustotou (LDL), kardioprotektívne . vlastnosti, antiplazmoid a iné (Iranshahy et al.
Podľa viacerých autorov je počet taxónov zaradených do rodu Pseudonarcissus v uvedenej časti veľmi rôznorodý (Hulcová et al. Alkaloidy izolované z rastlín narcisov ako narciklazín, hemantamín a lykorín vykazujú zaujímavé protinádorové a apoptotické účinky (Hulcová et al.). 2019).
Ciele práce
Experimentálna časť
- Experimentálne metódy
- Génová reportérová esej (gene reporter assay)
- Cytotoxicita (cytotoxicity assay)
- Časovo rozlíšený fluorescenčný rezonančný prenos energie
- Použitá bunečná línia a práca s bunkami
- Pomôcky a prístroje
- Použité chemikálie
- Skúmané látky (Použité alkaloidy)
- Štatistická analýza dát
Kryštály sa rozpustia pridaním DMSO (dimetylsulfoxid), test sa uskutoční pridaním malého množstva "Cell Titer 96® Aqueous One solution" a výsledky sa vyhodnotia meraním absorbancie pomocou spektrofotometra (Technický bulletin Cell Titer 96® Aqueous One-solution, Cell Proliferation Assay Promega Corporation). Test TR-FRET (časovo rozlíšený fluorescenčný rezonančný prenos energie) LanthaScreenTM test koaktivátora farnesoidného X receptora bol získaný od Thermo Fisher. Pracovný princíp TR-FRET (časovo rozlíšený fluorescenčný prenos energie) Na rozdiel od klasickej FRET analýzy, TR-FRET analýza využíva cheláty lantanoidov s dlhým polčasom rozpadu ako donorové druhy.
Aby sa predišlo týmto interferenciám, analýza TR-FRET sa vykonáva meraním FRET s primeraným oneskorením, zvyčajne 50-100 mikrosekúnd po excitácii spôsobenej svetelným zdrojom čítačky mikrotitračných doštičiek. Medzi najčastejšie používané lantanoidy v TR-FRET analýze patrí terbium a európium (LanthaScreen™ TR-FRET Farnesoid X Receptor Coactivator Assay 2007). Počas testu koaktivátora LanthaScreenTM je FXR-LBD nasledovaný ako ligand k testovanej zlúčenine pridaním zmesi fluoresceínového koaktivátorového peptidu a terbium-anti-GST protilátky a po inkubačnej dobe pri izbovej teplote sa stanoví pomer TR FRET 520:495 je zabezpečená a môže sa použiť na stanovenie EC50 (stredná efektívna koncentrácia) látok z krivky závislej od dávky.
Blízkosť fluorescenčne naviazaného terbium koaktivačného peptidu k naviazanej protilátke spôsobuje zvýšenie TR-FRET signálu. Cytotoxicita na bunkách línie HepG2 bola uskutočnená pomocou súpravy Cell Titer 96® AQueous One solution kit (Promega) na 96-jamkových platniach.
Výsledky
Génová reportérová esej
- FXR agonizmus
- FXR antagonizmus
- TGR5 agonizmus
- TGR5 antagonizmus
- Celkové vyhodnotenie dát
V rámci tohto experimentu sme hodnotili schopnosť daných alkaloidov pôsobiť ako antagonisty FXR, čo znamená schopnosť viazať sa na receptor bez jeho aktivácie a zabrániť naviazaniu agonistu. Namerané výsledky ukazujú, že látky masonín, homolykorín, 9-O-demetylhomolykorín, odulín, lykorín, karranín, lykorín a galantín môžu byť antagonistami FXR receptora v koncentráciách 10 µM aj 40 µM (viď. Ako súčasť tohto experimentu hodnotili sme schopnosti daných alkaloidov pôsobiť ako antagonisty TGR5, čo znamená schopnosť viazať sa na receptor bez jeho aktivácie a zabrániť väzbe agonistu.
Testovali sme zlúčeniny v koncentráciách 10 μM a 40 μM zriedených 5 μM LCA v porovnaní s LCA v koncentráciách 5 μM alebo 10 μM (pozitívna kontrola, o ktorej je známe, že pôsobí ako agonista TGR5). Všetky látky tejto hodnotenej skupiny, okrem lykorínu v koncentráciách 10 μM aj 40 μM a hipeastrínu v koncentráciách 40 μM, pôsobili ako antagonisty TGR5 v koncentráciách 10 μM aj 40 μM. Žiadna z testovaných látok nepôsobila ako významný agonista FXR, ale 10 uM (-)-scoulerín vykazoval slabé agonistické účinky na FXR.
Množstvo látok vykazovalo antagonistické účinky na FXR, menovite: masonín, homolykorín, 9-O-demetylhomolykorín, odulín, lykorín, karanín, lykorín a galantín v koncentráciách 10 µM aj 40 µM, ako aj (-)-kanadín, ( +)-korydalín a (+)-talictricavín v koncentráciách 40 uM. Nasledujúce antagonisty TGR5 fungovali v našich testoch: masonín, homolykorín, 9-O-demetylhomolykorín, odulín, lykorinín, karanín, epimaritidín a galantín v koncentráciách 10 µM a 40 µM a (-)-scoulerín, (+)-tetrahydropalmát - talictrikavín pri 40 mikromolárna koncentrácia.
Cytotoxicita
- Cytotoxicita u všetkých látok
- Vyhodnotenie cytotoxicity u všetkych látok
- Cytotoxicita hippeastrinu
- Vyhodnotenie cytotoxicity hippeastrinu
- Cytotoxicita (-)-kanadinu a (+)-korydalinu
- Vyhodnotenie (-)-kanadinu a (+)-korydalinu
Na základe testov génového reportéra sme vyhodnotili základné očakávané agonistické a antagonistické účinky testovaných alkaloidov na receptory FXR a TGR5. Na obrázkoch 31 a 32 vidíme vizuálne znázornenie cytotoxicity, kde najtmavšie jamky sú metabolicky najaktívnejšie, pri vyššom výskyte svetlejšej farby sa ich životaschopnosť znižuje. Vizuálne znázornenie cytotoxicity - najtmavšie bunky sú metabolicky najaktívnejšie, pozri DMSO: 2B-D, a najsvetlejšie bunky sú mŕtve, pozri DMSO s pridanou SDS: 2E-G.
Avšak aj pri mikroskopickej analýze väčšina z nich vykazovala cytotoxický účinok, ktorý môžeme vidieť na nasledujúcich obrázkoch 34 a 35. Cytotoxické spomedzi nami skúmaných alkaloidov boli: lykorín, pankracín, montanín a hemantamin v koncentráciách 10 μM a 50 μM . , (-)-scoulerín a (+)-talictricavín v skúmaných koncentráciách 40 μM a hippeastrín boli toxické iba pri 50 μM. Keďže toxicita hippeastrínu v koncentráciách 10 μM nebola potvrdená a zároveň sme zistili, že je toxický už pri koncentrácii 50 μM a vykazoval zosilňujúce účinky na aktivitu LCA v TGR5 v teste génového reportéra, v nasledujúcich experimentoch sme testovali toxicitu v rôznych koncentráciách, aby sa zistila jeho maximálna netoxická koncentrácia.
Keďže (-)-kanadín a (+)-korydalín vykazovali antagonistické účinky v teste génového reportéra a súčasne nevykazovali cytotoxickú aktivitu na FXR a TGR5 v predchádzajúcom teste cytotoxicity pri koncentráciách 40 μM, ďalej sme testovali ich cytotoxicitu pri rôznych koncentráciách, konkrétne 200 μM (pozri obr. 42), môžeme mať súčasne vizuálne znázornenie experimentu na obr. Najtmavšie bunky sú metabolicky najaktívnejšie, pozri DMSO: 2B-G, a najsvetlejšie sú mŕtve, pozri DMSO s pridanou SDS: 2B-G.
Následné génové reportérové eseje u Hippeastrinu
- Vyhodnotenie
Časovo rozlíšený fluorescenčný rezonančný prenos energie (TR-FRET) Aby sme určili schopnosť skúmaných alkaloidov viazať sa priamo na rekombinantnú FXR ligand viažucu proteínovú doménu bez použitia bunkovej línie, vykonali sme TR-FRET test, ktorý je opísaný podrobnejšie. v kapitole 5.1.3., pre alkaloidy, ktoré vykazovali najvýraznejšiu potenciálnu antagonistickú aktivitu voči FXR v teste génového reportéra, t.j. Potvrdilo sa, že všetky skúmané alkaloidy majú antagonistický účinok na FXR, ale (+)-korydalín si vyžadoval vyššiu koncentráciu, pretože antagonistický účinok nebol dokázaný pri 1 μM, ale pri 10 μM to bolo možné znížiť účinok OCA (agonista ) o 24 % v porovnaní s plným účinkom. Najprv sa uskutočnil test génového reportéra na vyhodnotenie schopnosti študovaných alkaloidov interagovať s receptormi FXR a TGR5 v bunkovej línii HepG2 a pôsobiť ako agonisty alebo antagonisty.
Ukázalo sa však, že 40 uM (-)-kanadín, (+)-korydalín a (+)-taliktrikavín sú jedným z najsilnejších antagonistov FXR (pozri obr. 20), ktoré sme následne široko použili v iných experimentálnych metódach. Masonín, homolykorín, 9-O-demetylhomolykorín, odulín, lykorinín, karanín, epimaritidín a galantín v 10 uM a 40 uM a (-)-scoulerín, (+)-tetrahydropalmatín a (+)-taliktrikavín v 40 uM (pozri obr. 24 a 25), avšak, ako pri FXR, (-)-kanadín, (+)-korydalín a (+)-taliktricavín pôsobili v týchto testoch ako jedny z najsilnejších antagonistov TGR5 (pozri Hipeastrin ukazuje schopnosť zvrátiť účinky a zvýšiť ). LCA v TGR5, ale len pri koncentráciách nad 40 μM a zároveň sa toxicita prejavila až pri koncentráciách nad 40 μM po 24 a 48 hodinách, ale v kombinácii s LCA bola toxická už od koncentrácie 100 μM pri 48. hodiny. H.
U všetkých skúmaných alkaloidov sa potvrdil antagonistický účinok na FXR, ale (+)-korydalín vyžadoval vyššiu koncentráciu, keďže antagonistický účinok nebol dokázaný pri 1 μM, ale pri 10 μM bol schopný znížiť účinok OCA . o 24 % v porovnaní s plným efektom. Podrobnejšie štúdie sú potrebné aj pre hipeastrín, ktorý preukázal aktivitu zosilnenia účinkov agonistu LCA na TGR5, avšak pri koncentráciách nad 40 μM sa po 24 hodinách ukázal ako cytotoxický.
Časovo rozlišený fluorescenčný rezonančný prenos energie (TR-FRET)
- Vyhodnotenie
Polovičná inhibičná koncentrácia
- Vyhodnotenie
Na stanovenie IC50 sme najskôr vykonali antagonistický test génového porteru vo zvyšujúcich sa koncentračných rozsahoch skúmaných látok (pozri. Na základe vykonania testu génového porteru sme hodnotili zvyšujúcu sa schopnosť skúmaných látok zvyšovať aktivitu OCA pri zvyšujúcich sa koncentráciách sú potvrdené). týchto látok.
Diskúsia
Zároveň sme v iných experimentoch pracovali aj s (-)-kanadínom, (+)-korydalínom a (+)-talictricavínom, keďže mali najsilnejšie antagonistické účinky hlavne na FXR, ale aj na TGR5. V nasledujúcich experimentoch sme testovali toxicitu hipeastrínu v rôznych koncentráciách po 5 hodinách, 24 hodinách a 48 hodinách, aby sme zistili maximálnu netoxickú koncentráciu. S touto látkou sme však pokračovali aj v ďalších experimentoch, kde bola testovaná jej aktivita v sérii zvyšujúcich sa koncentrácií hipeastrínu v zmesi s rovnomernou koncentráciou LCA a naopak v sérii zvyšujúcich sa koncentrácií LCA v zmesi s konštantnou koncentráciou hipeastrínu.
Keďže (-)-kanadín, (+)-koridalín a (+)-taliktricavín sa ukázali ako silné antagonisty FXR a TGR5 v teste reportérového génu, ďalej sme skúmali ich aktivitu. Pri nižších koncentráciách nevykazovali toxické účinky na bunky, preto bolo možné s týmito koncentráciami pracovať v ďalších testoch. Nakoniec sme uskutočnili komplementárny génový reportérový test v sérii zvyšujúcich sa koncentrácií (-)-kanadínu a (+)-koridínu od 1 uM do 10 uM, 50 uM až 100 uM.
V rámci ďalších experimentov sme vykonali RT-PCR reakciu na potvrdenie účinkov (-)-kanadínu a (+)-korydalínu stanovením miery vplyvu špecifických génov regulovaných týmito receptormi, ktorých výsledky boli pozitívne. Hoci (-)-kanadín a (+)-korydalín vykazovali potenciálne užitočnú antagonistickú aktivitu na FXR a TGR5 vo všetkých testoch, tieto štúdie ukázali
Záver
Aberrant DNA methylation of G protein-coupled bile acid receptor Gpbar1 (TGR5) is a potential biomarker for hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma. Use of BACE1 immobilized enzyme reactor for the characterization of multifunctional alkaloids from Corydalis cava (Fumariaceae) as targets for Alzheimer's disease. In vitro and in silico acetylcholinesterase inhibitory activity of thalictricavine and canadine and their predicted penetration across the blood-brain barrier.
Dual agonist of Farnesoid X receptor and Takeda G protein-coupled receptor 5 inhibits hepatitis B virus infection in vitro and in vivo. Reviews: current topics role of nuclear receptors in the regulation of gene expression by dietary fatty acids. Discovery of novel cholic acid derivatives as highly potent agonists for G protein-coupled bile acid receptor.
