Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” –
UNESP
Faculdade de Medicina de Botucatu
Expressão e localização de receptores
Toll-like
-1, -2, -4 e -6
em membranas corioamnióticas de gestações complicadas
por corioamnionite histológica
Natália Prearo Moço
Orientadora: Profa. Dra. Márcia Guimarães da Silva
Co-orientador: Prof. Titular José Carlos Peraçoli
Botucatu 2011
Faculdade de Medicina de Botucatu
Expressão e localização de receptores
Toll-like
-1, -2, -4 e -6
em membranas corioamnióticas de gestações complicadas
por corioamnionite histológica
Natália Prearo Moço
Orientadora: Profa. Dra. Márcia Guimarães da Silva
Co-orientador: Prof. Titular José Carlos Peraçoli
Botucatu 2011
S
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I
I
O
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Capítulo I
Revisão da literatura……….. 02
Referências bibliográficas………. 21
Capítulo II Article: “Expression and localization of TLR-1, -2, -4 and -6 in chorioamniotic membranes of pregnancies complicated by histologic chorioamnionitis.” 32 Abstract……… 34
1. Introduction……… 35
2. Materials and methods……….. 37
2.1. Study population………. 37
2.2. Collection of chorioamniotic membranes……… 37
2.3. Immunohistochemistry………... 38
2.4. Real time PCR……… 39
2.5. Statistical analysis……….. 39
3. Results………. 40
3.1. Socio-demographic and obstetrics characteristics of the patients……….. 40
3.2. Immunohistochemical localization of TLRs in chorioamniotic membranes…………... 41
3.3. Relative quantification of TLRs………. 43
4. Discussion………... 44
5. References... 47
R
As membranas corioamnióticas formam uma estrutura de extrema importância para o
desenvolvimento fetal. Dentre suas principais funções estão a de proteção do feto contra
traumas, de manutenção do volume do líquido amniótico e de proteção dos vasos do cordão
umbilical contra compressão, além de atuarem como barreira contra infecções vindas do trato
genital inferior 1.
A placenta é um órgão materno-fetal constituído de uma porção fetal que se origina a
partir do saco coriônico e uma porção materna de origem endometrial. O componente fetal da
placenta corresponde ao córion viloso e o componente materno é formado pela decídua basal.
A decídua, que corresponde ao endométrio gravídico, possui três regiões distintas: decídua
basal, a qual constitui a parte mais distante do feto; decídua capsular, que corresponde à
porção superficial que cobre o feto e decídua parietal, que representa o restante da placenta 2,3.
Durante o desenvolvimento embrionário, o crescimento do saco coriônico leva à
compressão das vilosidades coriônicas, as quais são associadas à decídua parietal. A redução
no suprimento sanguíneo das vilosidades coriônicas leva à rápida degeneração das mesmas,
formando uma região relativamente avascular denominada de córion liso. Após a formação do
córion liso, as vilosidades associadas à decídua basal aumentam em número e se ramificam,
constituindo o córion viloso, também chamado de córion placentário ou frondoso3.
Morfologicamente, o âmnio possui uma porção membranosa, que se acopla ao córion liso; uma
porção placentária, que recobre o córion viloso e uma porção funicular, que circunda o cordão
umbilical4.
O crescimento do saco coriônico é acompanhado por crescimento ainda mais rápido do
saco amniótico3. Em decorrência desse crescimento, aproximadamente na 16ª de semana de
gestação ocorre a fusão dessas duas membranas, originando as membranas corioamnióticas 5.
E
As membranas corioamnióticas fundem-se à decídua capsular e após o desaparecimento da
porção capsular da decídua, elas aderem à decídua parietal. (Figura 1).
Histologicamente, as membranas corioamnióticas são constituídas de diferentes
camadas celulares e por componentes da matriz extracelular (MEC). A camada celular mais
interna é o âmnio, de origem ectodérmica, o qual é constituído por monocamada de células
epiteliais cubóides ou colunares e camada de tecido conectivo rico em colágeno, intercalada por
células mesenquimais6. Os principais colágenos encontrados no âmnio (Figura 2) são os
colágenos tipo III, IV e V da membrana basal; colágenos tipo I, III, IV e VI da camada compacta;
colágenos tipo I, III e VI da camada de fibroblastos e colágenos tipo I, III e IV da camada
intermediária (esponjosa)1. Várias microvilosidades são encontradas entre as células do epitélio
amniótico, tanto na porção apical quanto nas bordas laterais. A presença dessas
microvilosidades e de desmossomos entre células epiteliais adjacentes contribui para a
comunicação intercelular e fornece barreira mecânica contra possível invasão de patógenos. O
córion, camada mais externa, a qual mantém proximidade com a cavidade amniótica, é
constituído pelas camadas celular e reticular e pela membrana basal7(Figura 2). Os principais
colágenos encontrados no córion são os colágenos tipos I, II, III, IV, V e VI da camada reticular
e o colágeno tipo IV da membrana basal1.
Cada componente dessa complexa estrutura desempenha papel importante no
metabolismo das membranas, assim como na integridade e resistência das mesmas. O âmnio,
apesar de apresentar-se mais delgado, com cerca de 50µm de espessura, é mais resistente,
devido à maior concentração de colágeno. O córion, apesar de apresentar cerca de 200µm de
espessura, possui menor quantidade de colágeno, apresentando tecido conjuntivo menos
organizado5.
A força e a integridade das membranas corioamnióticas são mantidas pelo balanço
dinâmico estabelecido entre fatores intrínsecos que regulam a síntese e a degradação do tecido
conectivo da matriz extracelular. Os componentes moleculares da matriz extracelular são
altamente resistentes à ação das proteases extracelulares e a degradação fisiológica desses
componentes exige participação de um grupo específico de proteases denominadas
metaloproteinases8. As metaloproteinases (MMPs) são enzimas endógenas zinco dependente9
que possuem a capacidade de degradar matriz extracelular, desempenhando importante papel
no processo de remodelamento e acomodação das membranas fetais com o avanço da
gestação. O controle da quantidade de MMPs ativas é feito pelos inibidores teciduais de
metaloproteinases (TIMPs), os quais também são produzidos por células secretoras de
metaloproteinases10,11. O principal papel dos TIMPs na remodelação tecidual é o equilíbrio entre
eles e as MMPs, com a formação de complexos na razão de 1:1, inibindo a atividade
proteolítica das últimas12.
O termo corioamnionite é empregado como referência às condições clínica, sub-clínica e
histológica, sendo a corioamnionite clínica freqüentemente denominada de infecção
intra-amniótica ou amnionite13. A corioamnionite clínica está presente em 1% a 2% dos partos de
termo e em 5% a 10% dos partos pré-termo, havendo aumento dessa incidência quando há
rotura prematura das membranas por tempo prolongado14. O diagnóstico de corioamnionite
clínica geralmente se baseia na presença de temperatura materna acima de 38°C e pelo menos
dois dos seguintes achados: leucocitose materna (acima de 15 mil células/ cm3), taquicardia
materna (acima de 100 bpm), taquicardia fetal (acima de 160 bpm) e odor fétido do líquido
amniótico14. Dentre os fatores de risco associados à infecção intra-amniótica estão nuliparidade,
baixa idade materna, trabalho de parto prolongado, rotura das membranas por tempo
prolongado, exames vaginais múltiplos, monitoramento fetal interno prolongado, vaginose
bacteriana e presença de mecônio no líquido amniótico15,16. Outros possíveis fatores de risco
para infecção intra-amniótica, na medida em que alteram a função do sistema imune materno,
incluem presença de doenças crônicas e o estado nutricional e emocional maternos17,18 .
C
Corioamnionite histológica é definida pela presença de infiltrado inflamatório
polimorfonuclear nas membranas corioamnióticas (Figura 3), conseqüente de infecção
bacteriana do líquido amniótico, das membranas fetais, da placenta e do útero19. A maioria dos
casos de corioamnionite histológica ocorre na ausência de sinais clínicos e de sintomas de
infecção20 e este diagnóstico pode ser feito em mais de 20% das gestações de termo e em mais
de 50% dos partos pré-termo13,21,22.
A principal complicação materna decorrente de infecção intra-amniótica é a bacteremia,
porém apenas 5% a 10% das gestantes com corioamnionite clínica desenvolvem tal
complicação23,24. Outras complicações maternas, menos diagnosticadas, incluem
anormalidades do trabalho de parto, com maior necessidade de administração de ocitocina e
maior taxa de cesárea; além disso, há aumento do risco de hemorragia e endometrite
pós-parto19. Duff et al.25 demonstraram que 75% das gestantes com corioamnionite clínica
apresentaram redução da contratilidade uterina e, mesmo com administração aumentada de
citocina, 34% dessas pacientes tiveram a resolução da gestação por cesárea devido à falha no
progresso do trabalho de parto. Reforçando esses achados, Mark et al.26 observaram que a
corioamnionite clínica esteve associada com aumento das anormalidades do trabalho de parto e
indicação de cesárea.
Dentre as complicações fetais e neonatais decorrentes de infecção intra-amniótica,
destacam-se sepse, pneumonia, estresse respiratório e óbito sendo que os riscos dessas
complicações diminuem com o avanço da idade gestacional19. A corioamionite clínica também
pode causar complicações a longo prazo, destacando-se problemas neurológicos decorrentes
da resposta inflamatória, como leucomalácia periventricular, hemorragia intraventricular e
paralisia cerebral, tanto em crianças nascidas a termo quanto em pré-termo27,28. Segundo
Shalak et al.29 recém-nascidos de termo com encefalopatia hipóxico-isquêmica apresentaram
níveis séricos elevados de interleucina (IL-) 6, IL-8 e RANTES. Segundo esses mesmos
autores, as citocinas podem causar injúria cerebral por diversos mecanismos incluindo efeito
tóxico direto via aumento da produção de óxido nítrico sintase, ciclooxigenase e radicais
livres30,31 ou ainda através da síndrome da resposta inflamatória sistêmica32,33. Entretanto, ainda
não se sabe porque apenas parte dos fetos expostos à infecção intra-uterina desenvolve
seqüelas neurológicas, nem mesmo qual é o mecanismo exato pelo qual as citocinas causam a
necrose cerebral. Yoon et al.34 sugerem que a predisposição genética pode determinar a
intensidade da resposta inflamatória fetal e que o desenvolvimento de danos neurológicos pode
estar associado ao fator genético. Yoon et al.34 demonstraram ainda que aumento de citocinas
pró-inflamatórias no líquido amniótico esteve associado com aumento de 4 a 6 vezes no risco
de leucomalácia periventricular. Grether & Nelson35 publicaram estudo de caso-controle no qual
a corioamnionite clínica esteve associada à paralisia cerebral, baixo Apgar e hipotensão. Estudo
publicado posteriormente por Alexander et al.36 demonstrou associação entre corioamnionite
clínica e risco três vezes maior de leucomalácia periventricular e hemorragia intraventricular nas
Em relação à corioamnionite histológica, trabalhos demonstram que os resultados
neonatais adversos mais freqüentemente associados a esse achado incluem hemorragia
intraventricular, leucomalácia periventricular, displasia broncopulmonar e paralisia cerebral37-45.
Nesse mesmo sentido, metanálise publicada em 200227 demonstrou associação da
corioamnionite, tanto clínica quanto histológica, com maior risco de desenvolvimento de
leucomalácia periventricular e paralisia cerebral. Quanto às complicações a longo prazo,
estudos recentes têm associado à corioamnionite histológica ao autismo46, otite recorrente47 e
asma48.
A principal causa de corioamnionite é a via ascendente do trato genital inferior a partir de
microrganismos da própria flora vaginal, em especial dos microrganismos da vaginose
bacteriana que acessam o trato genital superior através da cérvice (revisado por Romero,
200649). Outras possíveis rotas de infecção incluem a via hematogênica ou transplacentária,
infecção retrógrada da pelve e infecção transuterina causada por procedimentos como a
amniocentese19. A infecção intra-amniótica geralmente apresenta-se polimicrobiana50,51 e, na
maioria dos casos é causada pela combinação de microrganismos anaeróbicos e aeróbicos19.
Os principais microrganismos presentes na cavidade amniótica de gestantes com
corioamnionite clínica são os micoplasmas Ureaplasma urealitycum e Mycoplasma hominis;
bacilos Gram-negativos como os do gênero Bacteroides e Prevotela, ambos encontrados na
vaginose bacteriana; coliformes como Escherichia coli e Streptococcus do grupo B52-54 .
Segundo Galask et al.55, os microrganismos da flora vaginal apresentam capacidade de
atingir as membranas corioamnióticas e infectar a cavidade amniótica, entretanto permanecia
obscuro se a propagação bacteriana pelas membranas corioamnióticas precedia a invasão da
cavidade amniótica. Recentemente, Kim et al.56 propuseram novo modelo de invasão
microbiana da cavidade amniótica (Figura 4) em que o estágio inicial caracteriza-se por adesão
microbiana intra-amniótica e invasão das membranas por extensão da proliferação no líquido
amniótico.
As bactérias presentes no líquido amniótico produzem fosfolipases, as quais ativam a
liberação de ácido aracdônico, ativando e amplificando a via de produção de prostaglandinas.
Além disso, as bactérias contêm componentes da parede e produzem endotoxinas as quais são
reconhecidas por receptores do sistema inume inato, desencadeando a ativação de macrófagos
e a liberação de citocinas inflamatórias, como IL-1, IL-6 e Fator de Necrose Tumoral (TNF-). As citocinas produzidas provocam liberação adicional de prostaglandinas pelas células
amnióticas, deciduais e pelos macrófagos57. A liberação de prostaglandinas, a qual pode dar
início às contrações uterinas, é um dos mecanismos pelos quais a infecção intra-amniótica pode
ser causa direta de trabalho de parto pré-termo (TPP)58. Diversos estudos clínicos têm
estabelecido relação entre presença de infecção intra-amniótica e complicações gestacionais,
como TPP e rotura prematura de membranas pré-termo (RPM-PT)50,59-65. A RPM-PT é um dos
mais difíceis problemas da clínica obstétrica e está relacionada à pelo menos 30% de todos os
casos de trabalho de nascimentos pré-termo, tornando a RPM-PT a causa direta mais
comumente identificada de prematuridade (revisado por Menon & Fortunato, 200766). Apesar
disso, os mecanismos envolvidos na RPM-PT ainda não são completamente compreendidos e
a prevenção e o tratamento ainda são rudimentares. O TPP é uma importante intercorrência
obstétrica que acomete de 5 a 10% das gestações67-69 e, apesar dos novos tratamentos e
estratégias de prevenção, sua incidência não tem diminuído nos últimos anos70. Goldenberg et
al.71 demonstraram que infecção intra-amniótica acomete de 25% a 40% das gestações
pré-termo, entretanto, essa porcentagem provavelmente é subestimada, visto que a infecção
intra-amniótica nem sempre é diagnosticada pelos métodos de cultura comumente empregados.
Fahey19 descreve a fisiopatologia do TPP e da RPM-PT associados à infecção intra-amniótica e
complicações neonatais decorrentes (Figura 5).
Durante a gestação, a ocorrência da interação especial entre o sistema imune materno e
células fetais permite a sobrevivência e o desenvolvimento adequado do feto. As células fetais
expressam aloantígenos de origem paterna que, devido à existência de barreira física e
imunológica, representada pela interface materno-fetal, não são reconhecidos como estranhos
pelo organismo materno. O papel da interface materno-fetal é fundamental, pois garante o
adequado desenvolvimento da gestação, promovendo tolerância ao aloenxerto enquanto
mantém a resposta imune materna contra possíveis patógenos.
O paradigma de que sucesso da gestação dependia do predomínio de resposta imune
de perfil Th2, enquanto a resposta imune de perfil Th1 era associada a resultados gestacionais
adversos foi aceito por muitos anos pela comunidade científica72,73. Atualmente, estudos
demonstram que o sucesso da gestação depende de um complexo e dinâmico balanço entre
citocinas com atividade anti e pró-inflamatórias, que se modifica ao longo da gestação
normal74,75. O primeiro trimestre da gestação é marcado por resposta imune de perfil Th1, visto
que nesse primeiro estágio o micro-ambiente inflamatório torna-se necessário tanto para
permitir o correto reparo do epitélio uterino, o qual sofre danos conseqüentes da implantação do
feto, quanto para remoção de debris celulares76. No segundo trimestre o predomínio passa a
ser de resposta imune de perfil Th272,77,78, com aumento de citocinas com atividade
anti-inflamatórias importantes para a manutenção da gestação. No terceiro trimestre e no momento
do parto, o predomínio volta a ser de perfil Th1, tanto sistemicamente79, quanto nos tecidos
placentário e no líquido amniótico80-82.
G
O conceito de que a placenta e seus anexos atuam como barreiras imunológicas contra
a invasão de patógenos na cavidade amniótica baseia-se em estudos que demonstram que
esses tecidos expressam agentes antimicrobianos83 e componentes do sistema imune inato80.
O sistema imune inato atua como primeira linha de defesa contra a invasão de patógenos,
porém reconhece microrganismos através de um grupo limitado de receptores, diferentemente
do que ocorre na imunidade adquirida, na qual o repertório de receptores é bem mais amplo. Os
receptores do sistema imune inato são conhecidos como receptores de reconhecimento de
padrão (PRRs), os quais são capazes de reconhecer regiões microbianas denominadas
padrões moleculares associados à patogénos (PAMPs)84. Diferentes PRRs interagem com
diferentes PAMPs, ativando vias de sinalização específicas84. Dentre as principais funções dos
PPRs destacam-se opsonização, ativação do sistema complemento, fagocitose, indução de
apoptose e ativação de vias de sinalização de citocinas pró-inflamatórias85.
Os receptores Toll-like (TLRs) representam uma importante classe de PRRs e sua
descoberta, em meados da década de 1990, alterou o conceito de que a imunidade inata era
responsável apenas pelo reconhecimento inespecífico de microrganismos85,86. O primeiro
membro da família TLR a ser descoberto foi a proteína Toll, inicialmente identificada como
produto gênico essencial para o desenvolvimento embrionário de drosófilas, porém,
posteriormente descobriu-se que tal proteína desempenha papel essencial na resposta
anti-fúngica das moscas87. Foram descritas na literatura dez isoformas de TLRs em tecidos
humanos, as quais são denominadas TLR-1 a TLR-1081. Os genes responsáveis pela
expressão de TLRs estão dispersos pelo genoma humano, sendo que os genes para TLR-1 e
TLR-6 são encontrados no cromossomo 4p14, o gene para TLR-2 no cromossomo 4q31.3-q35
e o gene para TLR-4 no cromossomo 9q32-q3388.
R
Os membros da família TLR possuem estrutura básica constituída por três domínios: um
domínio extracelular que contém repetições ricas em leucina; um domínio transmembrana muito
curto e um domínio citoplasmático denominado domínio receptor Toll/IL-1 (TIR), o qual
compartilha uma região conservada de cerca de 200 aminoácidos com o receptor de IL-181,84
(Figura 6).
Os receptores Toll-like são classicamente divididos em dois grupos. O primeiro grupo,
composto por receptores expressos na superfície das células, inclui 1, 2, 4,
TLR-5, TLR-6 e TLR-11. Esse grupo é responsável pelo reconhecimento da maior parte dos
patógenos, visto que são capazes de reconhecer componentes das membranas dos
microrganismos, como lipídios, proteínas e lipoproteínas. O segundo grupo, que inclui
receptores expressos exclusivamente em vesículas intracelulares como endossomos e
lisossomos, é composto por TLR-3, TLR-7 e TLR-9, os quais reconhecem apenas ácidos
nucléicos de origem microbiana88 .
A principal via de sinalização utilizada pelos receptores Toll-like de superfície é a via que
culmina na ativação do fator de transcrição NF-kB (Figura 7). A ligação do PAMP ao Toll-like na
superfície da célula leva ao recrutamento de várias moléculas de sinalização celular
citoplasmáticas. A ligação do PAMP ao Toll-like na superfície da célula leva ao recrutamento de
várias moléculas de sinalização celular citoplasmáticas. A primeira molécula recrutada é a
proteína MyD88, a qual possui um domínio TIR que se liga ao domínio TIR do receptor Toll-like.
Uma segunda proteína a ser recrutada dentro do complexo de sinalização é a cinase associada
ao receptor de IL-1 (IRAK). A IRAK contém um domínio de morte que medeia as interações com
o domínio de morte da MyD88. Quando ocorre o recrutamento da IRAK, ela sofre
autofosforilação, dissociando-se da MyD88 e ativando o fator 6 associado ao TNF-R (TRAF-6).
O TRAF-6 ativa a cascata de cinase IkB, levando à ativação do NF-kB. Os genes que são
expressos em resposta à ativação do NF-kB codificam proteínas importantes para a resposta
imune inata, como citocinas e moléculas de adesão endotelial89. Em alguns tipos celulares os
Toll-like acoplam-se a outras vias de sinalização intracelular, levando à ativação do fator de
transcrição AP-1, porém, os mecanismos envolvidos nessas vias ainda são pouco conhecidos90.
A ativação do fator de transcrição AP-1, diferentemente da via do NF- kB, está envolvida com a
transdução de sinais intracelulares através de proteínas cinases associadas à mitógeno
(MAPKs). Modelo proposto por Chi et al. 90 sugere que as MAPKs desempenham papel tanto na
regulação de citocinas pró quanto antiinflamatórias. Na fase inicial da ativação de macrófagos
há rápida síntese de citocinas pró-inflamatórias, parcialmente mediadas pelas MAPKs. Em um
segundo momento, a atividade das MAPKs é reduzida pela ação de fosfatases, o que leva ao
A regulação negativa das vias de sinalização dos TLRs, que visa evitar ativação
deletéria desses receptores, ocorre de duas maneiras distintas: pela remoção imediata do sinal
ou pela prevenção de sinalização adicional91. A remoção do sinal atual pode ser alcançada pelo
nível de moléculas adaptadoras e moléculas de sinalização disponíveis, o que ocorre através de
redistribuição, impedimento de acesso ao TLR e/ou degradação dessas moléculas91. A família
de receptores Toll-like também expressa o receptor TIR8/SIGIRR, o qual atua na inibição da
sinalização pelo recrutamento do receptor e interferência na sinalização intracelular92. Outro
importante membro dessa família que atua inibindo a via de sinalização dos TLRs é o T1/ST2, o
qual seqüestra moléculas adaptadoras, impedindo que a sinalização tenha continuidade93.
Além disso, as IRAKs, importantes proteínas do complexo de sinalização, podem ser
rapidamente reguladas por degradação após sua ativação94,95.
O TLR-4, primeiro TLR descrito na literatura96, atua no reconhecimento de
lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias Gram-negativas, que atua como importante ativador de
macrófagos e desencadeador de choque séptico97. A ligação do TLR-4 ao LPS depende dos
co-receptores CD14 e MD2. O LPS liga-se à proteína ligante de LPS (LBP) presente na corrente
sanguínea, em seguida a LBP transfere o LPS para o co-receptor CD14, o qual permite, então,
a formação do complexo TLR4-MD2-LPS98. O complexo formado leva à ativação do NF-B e, consequentemente, à produção de citocinas como IL-1 e IL-6. Outros possíveis PAMPs para o
TLR-4 são mananas presentes em Candida albicans e glucuronoxilomanana de Cryptococcus
neoformans99,100.
O TLR-2 está envolvido no reconhecimento de amplo espectro de PAMPs derivados de
bactérias, fungos, parasitas e vírus88. Dentre esses PAMPs estão lipoproteínas de diversas
bactérias, peptideoglicanos e ácido lipoteicóico de bactérias Gram-positivas, lipoarabinomanana
de micobactérias, zimozan de fungos e hemaglutinina de vírus do sarampo88. A grande
capacidade de reconhecimento do TLR-2 deve-se, em parte, a sua capacidade de formar
heterodímeros com TLR-1 e TLR-6101. O heterodímero TLR-1/TLR-2 participa do
reconhecimento de lipopeptídeos triacetilados, enquanto o heterodímero TLR-2/TLR-6 atua no
reconhecimento de zimozan e lipopeptídeos diacetilados88.
Diversos estudos na literatura demonstram a expressão de TLR-1, -2, -4 e -6 no trato
genital feminino e em tecidos maternos. Em relação ao TLR-1, Fazeli et al.102, empregando a
técnica de imunoistoquímica, demonstraram forte imunomarcação no citoplasma de células
epiteliais da vagina, enquanto que na ectocérvice a imunomarcação desse receptor foi mais
intensa na camada basal do epitélio. Na endocérvice a imunomarcação limitou-se à camada
basal das células de revestimento das glândulas secretoras. A imunomarcação apresentou-se
intensa nas glândulas endometriais, no epitélio das tubas uterinas e nas células miometriais102.
Nesse sentido, outros pesquisadores demonstraram a expressão de TLR-1 em células epiteliais
Quanto ao TLR-2, Fazeli et al.102, demonstraram forte imunomarcação nas células
epiteliais da vagina e da ectocérvice. Células epiteliais das tubas uterinas e do endométrio
demonstraram imunomarcação positiva para esse receptor. Na endocérvice a expressão foi
observada em algumas regiões da porção apical das glândulas. Corroborando esses
resultados, outros pesquisadores demonstraram expressão de TLR-2 no trofoblasto111,112, no
endométrio105,106,113, nas células epiteliais da vagina e da cérvice103 e nas membranas
corioamnióticas114,115.
Fazeli et al.102 observaram expressão de TLR-4 no epitélio das células de revestimento
das glândulas endocervicais, nas glândulas endometriais e no epitélio das tubas uterinas,
porém, a imunomarcação desse receptor foi negativa no epitélio da vagina e na ectocérvice.
Nesse sentido, Aflatoonian et al.116 localizaram expressão de TLR-4 principalmente no trato
genital superior, não sendo detectada na vagina e na ectocérvice, o que pode explicar a
ausência de constante ativação do sistema imune na resposta à flora vaginal comensal normal.
Em relação à expressão de TLR-6, Fazei et al.102 detectaram imunomarcação na porção
basal do epitélio vaginal, no epitélio ectocervical e nas glândulas endocervicais, principalmente
na porção apical do epitélio. Além disso, o TLR-6 também foi detectado nas células epiteliais do
endométrio e das tubas uterinas. Corroborando esses achados, outros trabalhos na literatura
demonstraram expressão de TLR-6 já em células epiteliais das tubas uterinas, do endométrio,
da endocérvice, da ectocérvice e da vagina103-110. A exemplo de TLR-1, -2 e -4, a expressão de
TLR-6 foi detectada em células trofoblásticas, porém Abrahams et al.112 observaram que a
expressão desse receptor só é detectada no trofloblasto a partir do 3° trimestre de gestação117.
Apesar da diversidade de estudos avaliando a expressão de receptores TLR1, 2, 4 e
-6 no trato genital feminino, poucos estudos foram realizados avaliando a expressão desses
receptores em tecidos gestacionais na presença de corioamnionite histológica e os resultados
são conflitantes80,117,118. Estudo publicado recentemente por Rindsjö et al.118, utilizando a técnica
as placentas estudadas. Segundo esses autores, a expressão de TLR-2 esteve reduzida em
placentas de gestantes com corioamnionite histológica, quando comparadas com placentas de
gestantes sem corioamnionite histológica. Tal resultado difere dos achados encontrados por
Kim et al.115, que observaram expressão aumentada de TLR-2 em membranas corioamnióticas
na presença de corioamnionite histológica, quando comparadas com membranas na ausência
de infiltrado inflamatório. Kumazaki et al.80, empregando a técnica de imunoistoquímica,
demonstraram imunomarcação mais intensa em células de Hofbauer de gestações pré-termo
complicadas por corioamnionite histológica, quando comparadas com gestações pré-termo sem
corioamnionite histológica e também com placentas de gestações a termo.
A expressão dos receptores TLR-2 e TLR-4 pelo epitélio amniótico sugerem que esse
epitélio não funciona apenas como barreira mecânica aos microrganismos, mas que também é
requerido na ativação do sistema imune inato contra invasão de patógenos na cavidade
amniótica115. Segundo Kim et al.115 o aumento na expressão de ambos os receptores, em
membranas corioamnióticas de termo, corrobora a idéia de que o parto espontâneo está
associado, ainda que modestamente, à um ambiente inflamatório presente nos tecidos
gestacionais, com produção de citocinas pró-inflamatórias, conforme descrito por Keelan et
al.119. Nesse sentido, diversos estudos apontam que a expressão de ambos receptores pode
ser positivamente regulada por estímulo microbiano120-122. Porém, Holmlund et al.114, utilizando
as técnica de imunistoquímica e PCR em tempo real, não observaram diferença na expressão
de TLR-2 e de TLR-4 entre trofoblastos estimulados, respectivamente, com zimozan e LPS e
trofoblastos não estimulados. De acordo com esses pesquisadores, a possível explicação para
tal resultado é possível que ambos os receptores estejam normalmente super expressos nos
tecidos uterinos como mecanismo de defesa, o qual pode rapidamente ser mobilizado e
proteger o feto contra infecções durante a gestação e o parto.
Em estudo com camundongos, Gonzalez et al.123 avaliaram a expressão de TLRs pela
substancialmente diferente no tecido uterino de fêmeas prenhes e não prenhes e que o RNA
mensageiro dos receptores TLR-2, -3, -4 e -9 aumentam ao longo da prenhez. Esses dados
estão de acordo com Beijar et al.124 que relataram que as vilosidades placentárias do primeiro
trimestre demonstraram menor expressão de TLR-4 quando comparados com o mesmo tecido
de prenhez de termo.
Considerando que os TLR-1, TLR-2, TLR-4 e TLR-6 reconhecem a maioria dos
microrganismos envolvidos na invasão microbiana da cavidade amniótica e que essa infecção
desempenha papel importante na ativação da resposta inflamatória das membranas
corioamnióticas, e que esse conhecimento é conflitante, além da escassez de trabalhos na
literatura avaliando a expressão de TLR-1 e TLR-6 em tecidos gestacionais, o estudo da
expressão gênica desses TLRs e sua localização poderão corroborar o papel da imunidade
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A
Expression and localization of TLR-1, -2, -4 and -6 in chorioamniotic membranes
of pregnancies complicated by histologic chorioamnionitis.
Natália Prearo Moço a, Laura Fernandes Martin a, Ana Carolina Pereira a, Jossimara Polettini a, José Carlos
Peraçoli b, Kunie Iabuki Rabello Coelho a, Márcia Guimarães da Silvaa*.
a.
Department of Pathology, Botucatu Medical School, São Paulo State University, UNESP,
Botucatu, São Paulo, Brazil. b.
Department of Gynecology and Obstetrics, Botucatu Medical School, São Paulo State
University, UNESP, Botucatu, São Paulo, Brazil.
*Corresponding author
Department of Pathology, Botucatu Medical School, São Paulo State University.
Distrito de Rubião Júnior, CEP: 18618-970, Botucatu, São Paulo, Brazil.
Telefone: +55 (14) 3811-6238 Fax: +55 (14) 3815-2348
Abstract
Introduction: Acute chorioamnionitis is a response to microbial infection of the amniotic fluid.
The innate immune system constitutes the host’s first line of defense against pathogens and, in
this regard, Toll-like receptors (TLRs) are important regulators of such nonspecific response.
However, the expression of these receptors in chorioamniotic membranes in pregnancies
complicated by chorioamnionitis has not been well established. Objective:The purpose of this
study was to examine the localization of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 in fetal membranes
and determine whether histologic chorioamnionitis is associated with changes in gene
expression of these receptors Material and Methods: One hundred and fifteen chorioamniotic
membranes were included in the study. They were collected at the Obstetrics Service of the
Botucatu Medical School, São Paulo State University, UNESP, from pregnant women with
preterm delivery or term delivery with or without labor. Both groups were stratified on the basis of
the presence of histologic chorioamnionitis. Fragments of the chorioamniotic membranes were
sent for histopathologic analysis in order to confirm histologic chorioamnionitis. Other
membranes fragments measuring 1cm2 were placed into RNA later and submitted to total RNA
extraction. After RNA extraction, the samples with concentration between 0.02 and 0.2 g/L of RNA were submitted to cDNA collection for later use in quantifying the expression of TLR-1,
TLR-2, TLR-4 and TLR-6 by the real-time PCR technique using the TaqMan® Gene Expression
Assays System. Results: All membranes analyzed expressed TLR-1 and TLR-4, whereas
99.1% expressed TLR-2 and 77.4% expressed TLR-6. TLR-1 and TLR-2 expression were
statistically higher in the membranes of preterm pregnancies in the presence of chorioamnionitis
as compared with preterm membranes in the absence of the inflammatory infiltrate. Among the
membranes of term pregnancies, there was no statistically significant difference in the
expression of such receptors. Regarding TLR-4 and TLR-6 expression, there was no statistically
significant difference in the membranes of preterm or term pregnancies, in the presence or
and TLR-6 included amniotic epithelial cells, chorionic and decidual cells, and neutrophils.
Conclusion: Chorioamniotic membranes are sources of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6, and
increased expression of TLR-1 and TLR-2 is related to the presence of histologic
chorioamnionitis in preterm pregnancies.
Keywords: Preterm delivery, chorioamniotic membranes, histologic chorioamnionitis, Toll-like
receptor, real-time PCR, immunolocalization.
1. Introduction
The chorioamniotic membranes comprise a structure of great importance for fetal
development. Among its principal functions are protection of the fetus from trauma, maintenance
of amniotic fluid volume, and protection of the umbilical cord and fetal blood from compression,
besides serving as a barrier against infections arising from the lower genital tract[1]. In addition
to coating the placental surface and forming the amniotic sac, fetal membranes act to maintain
ideal sterile conditions of the amniotic fluid and are the immunologic barrier[1]. Recent studies
have also suggested this role of fetal membranes, demonstrating that this tissue expresses
antimicrobial agents [2] and components of the innate immune system, such as Toll-like
receptors (TLRs) [3]. TLRs are the principal signaling molecules through which mammals sense
infection, part of so-called innate immunity. At present, thirteen mammalian TLRs have been
identified [4], and ten of these isoforms (TLR1-10) are expressed in humans [5-7].
TLR-2 recognizes the widest spectrum of microbial components, including peptidoglycan
and lipoteichoic acid from Gram positive bacteria [8,9], lipoproteins from Gram-negative bacteria
[10], mycoplasms [11] and fungal zymosan [12]. The broad specificity of TLR-2 is due to its
ability to act both as a homodimer and as a heterodimer with TLR-1 and TLR-6 [13]. TLR-4 has
TLRs leads to the activation of NF-kB, a transcription factor that is involved in the expression of
proinflammatory cytokines and antimicrobial peptides (defensins) [4].
TLRs are expressed on many different immune cells as well as on non-immune cells
such as the epithelium in mucosal systems of the intestinal tract [16] and the female
reproductive tract [16,17]. According to Beijar et al.[18], in the term placenta, there is
immunoreactive staining in the cytoplasm of the syncytiotrophoblast and distinctly darker
staining in some areas of the expression of microvillous, whereas staining was not readily
apparent in the basal membranes. Kim et al. [19] described that TLR-2 expression was
polarized to the basal surface of amniotic epithelial cells in the membranes without
chorioamnionitis, but this distribution was lost in the presence of inflammation.
Few studies have evaluated TLR expression in gestational tissue in the presence of
histologic chorioamnionitis, and the results of these studies are controversial. Histologic
chorioamnionitis, defined as the infiltration of fetal membranes by polymorphonuclear
leukocytes, occurs in most cases in the absence of clinical signs and symptoms of infection, and
this diagnosis can be made in more than 20% of term pregnancies and in more than 50% of
preterm births [20-22]. Kim et al. [19] described that both term and preterm spontaneous labor
with histologic chorioamnionitis is associated with an increased expression of TLR-2 and TLR-4
in the chorioamniotic membranes. According to Rindjo et al. [23], the expression of TLR-2 in
placentas with chorioamnionitis was significantly lower than in placentas without
chorioamnionitis.
The purpose of this study was to examine the localization of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and
TLR-6 in fetal membranes and determine whether histologic chorioamnionitis associated with
2. Materials and methods
2.1. Study population
A cross-sectional study was conducted to examine the expression pattern of 1,
TLR-2, TLR-4 and TLR-6 in chorioamniotic membranes by immunohistochemistry and gene
expression of these receptors by real-time PCR.
The study group consisted of the chorioamniotic membranes of 115 pregnant women
who presented with preterm or term deliveries, in the presence or absence of histologic
chorioamnionitis. Samples were collected in the Obstetrics Unit of the Hospital of Botucatu
Medical School, São Paulo State University, located in central São Paulo State, Brazil.
Chorioamniotic membranes were obtained from patients in the following groups:
G1: Preterm delivery without histologic chorioamnionitis (n=35)
G2: Preterm delivery with histologic chorioamnionitis (n=35)
G3: Term delivery without histologic chorioamnionitis (n=35)
G4: Term delivery with histologic chorioamnionitis (n=10)
Exclusion criteria were multiple pregnancies, diabetes, fetal anomalies, and placenta
previa. Gestational age was calculated from the first day of the last menstruation and/or from the
first trimester ultrasound. The Institution Human Research Ethics Committee approved the study
(Protocol 3170-2009, and written informed consent was obtained from all participants.
2.2. Collection of chorioamniotic membranes
All chorioamniotic membranes collected were stored in RNA later® (RNA Stabilization
histopathological analyses. Histologic chorioamnionitis was diagnosed by the presence of
neutrophilic infiltration present in chorioamniotic membranes, according to Yoon et al. 24.
2.3. Immunohistochemistry
Tissues were prepared, fixed, and embedded for routine histologic examination and
immunohistochemistry. Tissues sections were deparaffinized and subjected to antigen-retrieval
by boiling in Trilogy™solution (Cell Marque, Hot Springs, AR) for thirty minutes. Sections were then immediately transferred to fresh hot Trilogy™ solution in a second staining dish for five
minutes and washed in PSB buffer (Biocare Medical, Concord, CA, USA).
Endogenous peroxidase activity was quenched with Peroxidazed 1 (Biocare Medical) for
ten minutes at room temperature, and sections were washed again in PBS buffer. The following
primary antibodies were applied for three hours at room temperature: polyclonal rabbit anti-TLR1
(1:2000; Abcam, Cambridge, MA, USA), monoclonal mouse anti-TLR2 (1:400; Biolegend, San
Diego, CA, USA), monoclonal mouse TLR4 (1:300; Biolegend) and polyclonal rabbit
anti-TLR6 (1:300; Abcam). Staining was performed using MACH 4 universal detection system
2.4. Real time PCR
Total RNA was extracted from chorioamniotic membranes samples using Illustra
RNAspin Mini Isolation Kit (GE Healthcare). To preclude genomic DNA contamination, all RNA
samples were treated with RNase-free DNAse I (New England Biolabs®) before amplification.
The quality and concentration of extracted total RNA were measured with Epoch (Biotek®)
Spectrophotometer. Sample RNA (0.1µg/µL) was subjected to reverse transcription using the
High-Capacity cDNA Archive Kit following the manufacturer’s instructions (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Real time quantitative PCR was used to quantify mRNA expression of
defensins, and TaqMan-validated primers and TaqMan MGB probes were used for amplification
of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 (Hs00413978_m1, Hs00610101_m1, Hs00370853_m1 and
Hs00271977_s1, respectively). Expression levels of the relevant genes in each sample were
normalized to TBP (TATA box binding protein, ID Hs99999910_m1), which was used as the
housekeeping gene. Amplification was performed using a Line Gene K (Bioer®), with an optical
unit that permits real-time monitoring of increased PCR product concentration. The threshold
cycle number (CT) is the PCR cycle number, at which fluorescence release reaches a threshold
level and was used to determine relative TLR mRNA expression, using the ddCT method 25. The mean of CT of samples derviced from term pregnancies without histologic chorioamnionitis
was used as a calibrator. Thermal cycling was initiated with a denaturating step of 10 minutes at
95°C followed by 40 cycles of 95°C for 15 seconds and 60°C for 1 minute. All reactions were
performed in duplicate, and no template controls were included in each run.
2.5. Statistical analysis
Maternal age and gestational age at delivery were compared between the study groups
using ANOVA and the Kruskal Wallis test, respectively. Marital status, ethnicity, mode of
delivery, parity and previous pregnancy complications were compared employing the
Kolmogorov-Smirnov test (with Lilliefors' correction), comparisons of TLR mRNA concentrations
were performed using the non-parametric Kruskal-Wallis test. A p value <0.05 was considered to
be statistically significant. Statistical analyses were performed with SigmaStat Software version
3.1.
3. Results
3.1. Socio-demographic and obstetrics characteristics
The socio-demographic and obstetrics characteristics of the study population are
described in the Table 1. Maternal age, parity, previous pregnancy complications, marital status
and ethnicity were not statistically significantly different between groups. In relation to gestational
age at delivery, there was no statistically significant difference in preterm and term groups, when
Table 1. Socio-demographic and obstetrics characteristics of the study population. Characteristics Preterm delivery without CAM (n=35) Preterm delivery with CAM (n=35) Term delivery without CAM (n=35) Term delivery with CAM (n=10) Maternal age * 25.2 ± 6.72 a 22.8 ± 6.44 a 25.9 ± 6.07 a 20.7 ± 3.53 a
Marital status
Single 22.6% (7/31) a 37.,1% (13/35) a 24.2% (8/33) a 14.3% (1/7) a
Married 77.4% (24/31) a 62.9% (22/35) a 75.8% (25/33) a 85.7% (6/7) a
Ethnicity
White 93.9% (31/33) a 85.7% (30/35) a 81.8% (27/33) a 87.5% (7/8) a
Non-white 6.1% (2/33) a 14.3% (5/35) a 18.2% (6/33) a 12.5% (1/8) a
Type of delivery
Vaginal 42.8% (15/35) a 54.3% (19/35) a 42.8% (15/35) a 50% (5/10) a
Cesarean 57.2% (20/35) a 45.7% (16/35) a 57.2% (20/35) a 50% (5/10) a
Gestational age at delivery (days)+
240 (177 – 258) a 233 (182 – 258) a 273 (207 – 288) b 282 (267 – 292) b
Parity
=1 39.4% (13/33) a 51.5% (17/33) a 37.5% (12/32) a 75% (6/8) a
>1 60.6% (20/33) a 48.5% (16/33) a 62.5% (20/32) a 25% (2/8) a Proportions followed by at least one same letter do not differ.
* values expressed as mean SD + values expressed as median (min - max) CAM: histologic chorioamnionitis
3.2. Immunohistochemical localization of TLRs in chorioamniotic membranes
Immunostaining of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 in chorioamniotic membranes
included in this study are presented in Figure 1. Cells that stained immunohistochemically for
TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 included amniotic epithelial cells, chorionic and decidual cells,
Figure 1. Immunohistochemical staining of TLR-1, TLR-2, TLR-4, TLR-6 in chorioamniotic membranes. All TLRs are expressed in amniotic epithelial cells, chorionic and decidual cells (A, C, E, and G) and acute inflammatory cells (B,D,F and H) in the
3.3. Relative quantification of TLRs
Relative quantification of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 mRNA in chorioamniotic
membranes included in the study is presented in Figure 2 and Table 2. All membranes analyzed
expressed TLR-1 and TLR-4, whereas 99.1% expressed TLR-2, and 77.4% expressed TLR-6.
TLR-1 and TLR-2 expression in the membranes of preterm pregnancies was statistically higher
in the presence of histologic chorioamnionitis as compared with preterm membranes in the
absence of the inflammatory infiltrate. Among the membranes of term pregnancies, there was no
statistically significant difference in the expression of such receptors. Regarding 4 and
TLR-6 expression, there was no statistically significant difference between membranes of preterm or
term pregnancies, or in the presence or absence of histologic chorioamnionitis.
