Alvaro Jhovaldo Lopez Ayme
O efeito do pH na interação da Albumina Sérica Humana e os
Flavonoides Quercetina e Quercitrina.
São José do Rio Preto
2014
Alvaro Jhovaldo Lopez Ayme
O efeito do pH na interação da Albumina Sérica Humana e os
Flavonoides Quercetina e Quercitrina.
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biofísica Molecular, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biofísica Molecular, Área de Concentração – Biofísico-Quimica de macromoléculas, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.
Orientador: Prof. Dr. Marinônio Lopes Cornélio
Alvaro Jhovaldo Lopez Ayme
O efeito do pH na interação da Albumina Serica Humana e os
Flavonoides Quercetina e Quercitrina.
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biofísica Molecular, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biofísica Molecular, Área de Concentração – Biofísico-Quimica de Macromoléculas, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.
Comissão Examinadora
Prof. Dr. Marinônio Cornélio Lopes
UNESP – São José do Rio Preto
Orientador
Prof. Dr. Marcelo Andrés Fossey
UNESP – São José do Rio Preto
Prof. Dr. Amando Siuiti ito
USP-Riberão Preto
RESUMO
Os flavonoides são compostos polifenólicos encontrados nas plantas que são responsaveis pela pigmentação e em alguns casos atuam como inibidores de infecções por microorganismos. Recentemente seu papel como antioxidante e na regulação dos mecanismos de sinalização celular em humanos foi descoberta, motivo pelo qual a pesquisa com os flavonoides despertou interesse na comunidade científica.
diminuíram enquanto que as constantes de supressão do complexo Quercitrina-HSA aumentaram.
Da availação das constantes de supressão a diferentes temperaturas (288, 298 e 308K) observou-se que o mecanismo de supressão para ambos flavonoides é estático.
A compensação entálpica(ΔHo)–entrópica(ΔSo) foi encontrado para ambos complexos, descrevendo que o processo com contribuições entálpico-entrópico e interações eletrostáticas (ΔHo<0 e ΔSo>0) acontece no complexo Quercetina-HSA, enquanto que um processo com contribuições entálpicas e interações Van der Waals e pontes de Hidrogênio (ΔHo<0 e ΔSo<0)acontece no caso do complexo Quercitrina-HSA. O numero de sítios de ligação (n) foi mantido constante para os complexos Quercetina-HSA e Quercitrina-HSA na faixa de pH de 7.0 a 6.0(≈ 1.0).
A análise da distancia por meio de FRET determinaram que há um incremento das distancias num pH acídico para o complexo Quercetina-HSA, enquanto que as distancias entre Quercitrina-HSA mateve-se quase constante na faixa de pH 7.0 a 6.0.
Os resultados sugerem que o grupo glicosilado (no caso da Quercitrina) dificulta o enfraquecimento do complexo para um meio ligeiramente acídico, enquanto que a ausência do grupo glicosilado (no caso da Quercetina) permite o enfraquecimento do complexo.
Palavras-chave: Flavonoides, Quercetina, Quercitrina, HSA, Supressão da Fluorescência, pH.
ABSTRACT
The flavonoids are poliphenolic compounds found in plants, which are responsible to provide pigmentation and in some cases act as an inhibitors of infections mediated by microorganism. Recently, their role as an antioxidant and in the regulation of signaling mechanism have been discovered, reason by which the research with flavonoids have grown.
An important protein, which is found in the human plasma is the Human Serum Albumin (HSA), which is responsible to transport the nutrients (ligands) found in the blood to show them to cells and tissues. The process by which the HSA give off the ligand to cell is called delivery. In the delivery process, it is hope that the strenght of the Flavonoid-HSA complex is weakened, causing the delivery of the ligand.
Due to the strenght of the Flavonoid-HSA complex could be weakened by a physiological factor such as pH, is that in the present work is studied the effect of the pH on the interaction between HSA and the flavonoids Quercetin and Quercitrin.
In order to determine the role of the pH as a modulator of flavonoids delivery, this work will explore, i) the quenching constants, ii) thermodynamic parameters such as enthalpy (ΔHo), entropy (ΔSo) and the Gibbs free energy (ΔGo), iii) the number of binding sites and iv) FRET of the Quercetin-HSA and Quercitrin-HSA complexes in the pH range from 7.0 to 6.0.
From the fluorescence quenching studies at different temperatures (288, 298 and 308K) it was showed that the quenching mechanisms for both flavonoids (Quercetin and Quercitrin) are static.
An enthalpy-entropy compensation was found for both complexes, describing that an enthalpy-entropy driven process with electrostatic interactions (ΔHo<0
and ΔSo>0) occur in the Quercetin-HSA complex, while an enthalpy driven
process with Van der Waals and Hydrogen bonds interactions (ΔHo<0 and
ΔSo<0) happen in the case of the Quercitrin-HSA complex. The number of
binding sites (n) were maintained constants for both Quercetin-HSA and Quercitrin-HSA complexes in the pH range from 7.0 to 6.0 (≈ 1.0).
The distance analysis by FRET for the Quercetin-HSA complex showed an increment of the distances at an acidic pH, while the distances between Quercitrin-HSA were maintained nearly constant in the pH range from 7.0 to 6.0.
The results suggest that the additional glycosilated group (in the case of Quercitrin) difficult the reduction of tightening of the complex in a slightly acidic medium while the absence glycone residue (in the case of Quercetin) permit the reduction of the tightening of the complex in a slightly acidic medium.
Dedicatória
Dedico este trabalho a todos meus seres queridos e as pessoas com que tive o prazer de compartir alguns momentos especiais, os quais ficaram por sempre na minha memória.
Agradecimentos
Índice de Figuras
Figura 2.1 Albert Gyorgyi e sua vitamina P. a) Fotografía de Albert Szent-Gyorgyi (1893-1986). b) Estrutura molecular da rutina, a qual foi denominada inicialmente como vitamina P. ... 3
Figura 2.2 Estrutura dos principais grupos de flavonoides. a) Estrutura básica dos flavonoides. De acordo à posição do grupo fenil se podem classificar em b) Flavonoides, c) Isoflavonoide, e d) Neoflavonoide. ... 4
Figura 2.3 Estrutura molecular dos flavonoides a) Quercetina e b) Quercitrina. .... 5
Figura 2.4 Esquema representativo da estrutura secundaria da Albumina Sérica Humana (HSA). Pontes disulfeto são desenhadas com linhas pretas contínuas. Hélices são representados por retângulos, e loops e turns por linhas. Extraído de Peters, (1996) [12]. ... 9 Figura2.5 Estrutura tridimensional da Albumina Sérica Humana (HSA). Os seis subdomínios são mostrados e estão coloridos na seguinte maneira: subdomínio IA: azul; subdomínio IB: celeste; subdomínio IIA: verde escuro; subdomínio IIB: verde claro; subdomínio IIIA: vermelho; subdomínio IIIB: laranja. O grupo hemo (vermelho) está no subdomínio IB. O sitio de Sudlow I (no subdomínio IIA) está ocupado por warfarina (marrom). O sitio de Sudlow II (no subdomínio IIIA) esta ocupado por dois miristatos (preto). Os sítios FA geralmente estão ocupados por miristatos (preto). Extraído de Fasano et al.,(2005) [14]. ... 10 Figura 2.6 Representação esquemática das mudanças conformacionais dependentes de pH da HSA. Observam-se as formas E (extended), F (fast), N (neutral), B (basic) e A (aged) da HSA. Um ponto branco no domínio II representa o resíduo Trp-214. Extraído de Qiu et al.,(2006) [24]. ... 11 Figura 2.7 Espectro Eletromagnético. ... 12 Figura 2.8 Transições eletrônicas e vibracionais de uma molécula. a) v1, v2, v3 e v4 são os
estados vibracionais presentes num determinado estado eletrônico (E0 e E1). b) Espectro de
Figura 2.10 Diagrama de Jablonski. Os eventos que acontecem depois da absorção de um fóton como são a conversão interna, dissipação de calor, fluorescência e fosforescência são observados. ... 16 Figura 2.11 Representação do deslocamento de Stokes. Observam-se os espectros de excitação e de fluorescência sobrepostos. As diferenças entre as freqüências de absorção e emissão determinam o deslocamento de Stokes. ... 17 Figura 2.12 Espectros de absorbância e fluorescência dos aminoácidos triptófano (Trp), tirosina (Tyr) e fenilalanina (Phe). Trp: λex= 295nm, λem=353nm; Tyr: λex= 275nm, λem= 304nm; Phe:
λex= 260nm, λem= 282nm. As estruturas dos aminoácidos são observadas na parte inferior.
Extraído de Lakowicz.,(2004) [32]. ... 18 Figura 2.13 Fluoróforos extrínsecos. Dansil Cloride (DNS-Cl), 5-Iodo-acetamido-fluoresceina (5-IAF), isotiocianato de fluoresceína (FITC), tetra-metil-rodamina (TRITC), acrilodan, 4-cloro-7-nitro-benzofurazano (NBD-CI). Extraído de Lakowicz.,(2004) [32]. ... 19 Figura 2.14 Espectrofluorímetro. a) Representação esquemática mostrando os componentes básicos do fluorímetro. b) Fluorímetro Cary Eclipse (Varian, Palo Alto, CA), equipado com Peltier (Varian, Palo Alto, CA). ... 20 Figura 2.15 Mecanismo de supressão estático e dinâmico. a) No mecanismo de supressão estático as altas temperaturas causam uma desestabilização do complexo o que ocasiona uma diminuição das constantes de supressão, enquanto no b) mecanismo de supressãocolisional as altas temperaturas favorecem a difusão das moléculas incrementando assim a constante de supressão. Extraído de Lakowicz.,(2004) [32]. ... 23 Figura 2.16 Representação esquemática do processo de FRET. a) Mostra-se que depois da excitação, o doador excitado transfere energía não radiativa à molécula aceitadora próxima localizada a uma distancia r. b) Sobreposição dos espectros de absorção e emissão do aceitador e doador respectivamente. ... 26
A concentração de flavonoide Quercitrina foi de 0 a 15μM com um incremento de 1μM por titulação. O espalhamento do tampão fosfato é mostrado. O comprimento de onda de excitação foi de 295nm. ... 32 Figura 4.3 Espectro UV- visível da Quercetina em tampão fosfato a) a pH de 7.0 e 6.0. b) Coeficiente de extinção molar (ε) em 295nm e c) 345nm na faixa de pH de 7.0 a 6.0. ... 34 Figura 4.4 Espectro UV- visível da Quercitina em tampão fosfato a) a pH de 7.0 e 6.0. b) Coeficiente de extinção molar (ε) em 295nm e c) 345nm na faixa de pH de 7.0 a 6.0. ... 36
Figura 4.14 Entropias padrão (ΔSo) versus entalpias padrão (ΔHo) das ligações da Quercetina à
HSA na faixa de pH de 7.0 a 6.0. As regiões entálpica/entrópica estão claramente detalhadas na figura. Os números em negrito representam os valores de pH. ... 59 Figura 4.14 Gráficos de Van’t Hoff do complexo Quercitrina-HSA a a) pH 7.0 e b) 6.0. .... 62 Figura 4.15 Entropias padrão (ΔSo) versus entalpias padrão (ΔHo) das ligações da Quercitrina à
HSA na faixa de pH de 7.0 a 6.0. As regiões entálpica/entrópica estão claramente detalhadas na figura. Os números em negrito representam os valores de pH. ... 63 Figura 4.16 Sobreposição dos espectros de emissão da fluorescência da HSA (_____) e de
absorção da Quercetina (...) a a) pH 7.0 e b) pH 6.0 a 298K. [HSA] =[Quercetina] = 4µM. ..
... ... ... 67 Figura 4.17 Dependência das distâncias(r, em azul) e a sobreposição dos espectros (J, em vermelho) entre o Trp 214-HSA e a Quercetina com o pH. [HSA] =[Quercetina] = 4µM. T=298K. ... ... ... 69
Figura 4.18 Sobreposição dos espectros de emissão da fluorescência da HSA (_____) e de
absorção da Quercitrina (...) a a) pH 7.0 e b) pH 6.0 a 298K. [HSA] =[Quercitrina] = 4µM. ..
... ... ... 70 Figura 4.19 Dependência das distâncias (r, em azul) e a sobreposição dos espectros (J, em vermelho) entre o Trp 214-HSA e a Quercitrina com o pH. [HSA] =[Quercitrina] = 4µM. T=298K. ... ... 72
Índice de tabelas
Tabela 2.1 Classes de flavonoides. Mostram-se as classes de flavonoides, ligações químicas, grau de insaturação, os grupos funcionais característicos, alguns exemplos representativos e sua fonte de localização. ... ... 6 Tabela 4.1 Constantes de supressãoda fluorescência da HSA pela Quercetina a pH 7.0, 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0. Três temperaturas foram testadas (288,298 e 308K). R é coeficiente de correlação. ... 47 Tabela 4.2 Constantes de supressão da fluorescência da HSA pela Quercitrina a pH 7.0, 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0. Três temperaturas foram testadas (288,298 e 308K). R é coeficiente de correlação. ... 50 Tabela 4.3 Constantes de ligação do complexo Quercetina-HSA a pH 7.0, 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0 em três temperaturas diferentes (288, 298 e 308K). ... 52 Tabela 4.4 Constantes de ligação do complexo Quercitrina-HSA a pH 7.0, 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0 em três temperaturas diferentes (288, 298 e 308K). ... 54 Tabela 4.5 Parâmetros termodinâmicos do complexo Quercetina-HSA a pH 7.0 - 6.0 (intervalos de 0.2). ΔH° e ΔS° foram calculados de acordo com a equação 19. R é o coeficiente de correlação. ... ... 57 Tabela 4.6 Valores de ΔG° do complexo Quercetina-HSA a pH 7.0 - 6.0 (intervalos de 0.2). .. ... ... 60 Tabela 4.7 Parâmetros termodinâmicos do complexo Quercitrina-HSA a pH 7.0 - 6.0 (intervalos de 0.2). ΔH° e ΔS° foram calculados de acordo com a equação 19. R é o coeficiente de correlação. ... ... 61 Tabela 4.8 Valores de ΔG° do complexo Quercitrina-HSA a pH 7.0 - 6.0 (intervalos de 0.2). .64 Tabela 4.9 Valores calculados do análise de FRET para o complexo Quercetina-HSA. J é a sobreposição dos espectros (Equação 23), R0 é a distância Foster (Equação 22) e r é a distância
entre o Trp-214 HSA e a Quercetina. ... ... 68 Tabela 4.10 Valores calculados do análise de FRET para o complexo Quercitrina-HSA. J é a sobreposição dos espectros (Equação 23), R0 é a distância Foster (Equação 22) e r é a distância
Abreviaturas
HSA - Albumina Sérica Humana
ESR -
Electrospin resonance
HPLC - High performance liquid chromatography
Trp-214 HSA - Residuo Trp na posi
ção214 da HSA
Índice
1. Estado da arte... 1
2. Introdução... 3
2.1. Os Flavonoides... 3
2.1.1. Historia... 3
2.1.2. Estrutura, nomenclatura e classificação. ... 4
2.1.3. Propriedades dos flavonoides... 7
2.1.3.1.Efeitos anti-oxidativos... 7
2.2. Albumina Sérica Humana... 8
2.2.1. Historia... 8
2.2.2. Estrutura e função... 8
2.2.3. Mudanças conformacionais a HSA induzida por pH... 11
2.3. Espectroscopia UV- visível... 12
2.3.1. Lei de Lambert e Beer... 12
2.3.2. Instrumentação... 14
2.4. Espectroscopia de fluorescência no estado estacionário... 15
2.4.1. Princípios básicos... 15
2.4.1.1.Diagrama de Jablonski... 15
2.4.1.2.Deslocamento de Stokes... 16
2.4.2. Fluoróforos... 17
2.4.2.1.Fluoróforos intrínsecos... 17
2.4.2.2.Fluoróforos extrínsecos... 18
2.4.3. Instrumentação... 19
2.5. Efeito da filtragem interna... 20
2.6. Supressão da fluorescência... 21
2.6.1. Mecanismo de supressão estático... 21
2.6.2. Mecanismo de supressão dinâmico... 22
2.6.3. Desvío da equação de Stern-Volmer: Modelos alternativos. ... 24
2.6.3.1.Modelo combinado de supressão estático-dinámico. ... 24
2.6.3.2.Modelo da esfera de ação. ... 24
2.6.3.3. Modelo de Perrin. ... 25
2.7. Transferência ressonante de energia por fluorescência (FRET) ... 26
3. Materiais e métodos... 27
3.1. Reagentes e soluções estoque... 27
3.2. Espectroscopia UV- visível... 28
3.3. Espectroscopia de fluorescência no estado estacionário... 28
4. Resultados... 29
4.1. Fluorescência da HSA ... 29
4.1.1. Supressão da fluorescência da HSA pela Quercetina. ... 29
4.1.2. Supressão da fluorescência da HSA pela Quercitrina. ... 31
4.2. Absorção dos flavonoides na faixa de emissão e excitação da HSA. ... 33
4.2.1 Absorção da Quercetina na faixa de emissão e excitação da HSA. ... 33
4.2.3 Correção da filtragem interna. ... 35
4.3 Mecanismo supressão da fluorescência da HSA pelos flavonoides. ... 37
4.3.1 Mecanismo supressão da fluorescência da HSA pela Quercetina. ... 37
4.3.2 Mecanismo supressão da fluorescência da HSA pela Quercitrina. ... 40
4.4 Efeito do etanol na fluorescência da HSA. ... 42
4.5 Espectro UV-visível da Quercetina em tampão fosfato a pH 7.0. ... 43
4.6 O papel do pH nas constantes de supressão... 45
4.6.1 O papel do pH nas constantes de supressão da fluorescência da HSA pela Quercetina. ... 45
4.6.2 O papel do pH nas constantes de supressão da fluorescência da HSA pela Quercitrina. ... 48
4.7 Análise do número de sítios de ligação. ... 51
4.7.1 Análise do número de sítios de ligação do complexo Quercetina-HSA...52
4.7.2 Análise do número de sítios de ligação do complexo Quercitrina-HSA.. 54
4.8 Termodinâmica da interação proteína-ligante. ... 56
4.8.1 Termodinâmica da interação Quercetina-HSA. ... 57
4.8.2 Termodinâmica da interação Quercitrina-HSA. ... 61
4.9 Análise das distancias por FRET. ... 65
4.9.1 FRET do complexo Quercetina-HSA. ... 67
4.9.2 FRET do complexo Quercitrina-HSA. ... 70
4.10 Modelo do efeito do pH na interação entre flavonoides e HSA. ... 73
5. Conclusões... 74
1
Capítulo 1
Estado da arte
As proteínas são moléculas orgânicas constituídas por uma seqüência de aminoácidos, as quais possuim papeis principais na célula: atividade ou estrutural. No primeiro grupo se encontram as proteínas catalíticas conhecidas como enzimas. Os restantes poderiam ser classificados no segundo grupo. Nesse contexto encontramos à Albumina Sérica Humana (HSA) a qual é classificada como uma proteína estrutural que tem por principal função reconhecer e unir-se aos ligantes presentes no sangue e leva-as às células alvo. Uma característica importante das proteínas é que para realizar suas funções dependem de fatores físico-químicos, as quais podem alterar sua atividade e estabilidade. Alguns de estes fatores são o pH, força iônica e a temperatura.
Horie et.al, (1988) demonstrou que o espectro ESR (electrospin resonance) da proteína plasmática albúmina na presença de uma suspensão de hepatócitos de rato, era alterado. Adicionalmente, também observou alterações nos espectros ESR da proteína plasmática na presença de eritrócitos, fantasmas de eritrócitos e liposomas, sugerindo que uma mudança conformacional da proteína plasmática era causada pela presença das membranas biológicas [1]. O que possivelmente estava acontecendo era que a presença das membranas biológicas estava alterando o pH nos redores da membrana fazendo-a ligeiramente mais ácida e ocasionando na proteína que estiver nas proximidades sofrer uma mudança conformacional, a qual ajudaría a liberar o ligante que estivesse a ela unido.
2
lisado celular e os flavonoides glicosilados não. Assim se inferiu que os flavonoides glicosilados não foram capazes de difundir através da membrana celular [2-4].
De acordo com estas informações parece que existe ao menos dois controles para a captação de flavonoides pelas células alvo, sendo o primeiro uma mudança conformacional da proteína plasmática induzida pela presença da membrana biológica que facilitaria a liberação dos flavonoides e o segundo dependeria da capacidade dos flavonoides em difundir através de membrana.
3
Capítulo 2
Introdução
2.1 Os Flavonoides
2.1.1 Historia
Em 1930 Albert Szent-Gyorgyi trabalhando no isolamento da vitamina C nas laranjas encontrou outra sustância, que atuava de maneira sinérgica e foi sugerido que sería uma nova classe de vitaminas (denominando-se vitamina P). Anos depois se determinou que essa substância fosse um flavonoide que hoje em dia é chamada de rutina (Figura 2.1) [5] . Nas décadas seguintes se observou um aumento no interesse da pesquisa com os flavonoides, principalmente pelos benefícios que trouxe nos tratamentos de varias enfermidades como a toxicemia na gravidez, febre reumática, diabetes e câncer [6]. A partir dos anos 80 até 90 os flavonoides foram estudados intensamente por suas ações como agentes anti-mutagénicos e anti-oxidantes em sistemas biológicos [7,8] . Anos depois o paradigma de ação dos flavonoides mudaría, e foi reconhecido também seu papel como modulador anti-inflamatório [9-11].
Figura 2.1 Albert Szent-Gyorgyi e sua vitamina P. a) Fotografía de Albert Szent-Gyorgyi (1893-1986). b) Estrutura molecular da rutina, a qual foi denominada inicialmente como vitamina P.
4
2.1.2 Estrutura, Nomenclatura e classificação.
Os flavonoides são compostos polifenólicos encontrados principalmente em plantas. Estes podem estar em forma livre (agliconas) o glicosiladas, e adicionalmente podem diferir em seus substituintes (tipo, número e posição). Estruturalmente são caracterizados por possuir uma estrutura planar devido a um duplo enlace no anel aromático central [5]. Todos os flavonoides compartilham uma estrutura esquelética básica de fenil-benzopirano C6-C3-C6 (Figura 2.2a). A posição do anel fenólico relativo
ao motivo benzopirano permite uma separação destes compostos em flavonoides (2-fenil-benzopirano), isoflavonoide (3-fenil-benzopirano) e neoflavonoide (4-fenil-benzopirano) (Figura 2.2) [6].
Figura 2.2 Estrutura dos principais grupos de flavonoides. a) Estrutura básica dos flavonoides. De acordo à posição do grupo fenil se podem classificar em b) Flavonoides, c) Isoflavonoide, e d) Neoflavonoide.
a
5
Adicionalmente os grupos se subdividem em classes, sendo os flavonoides mais comuns as flavonas (dupla ligação C2-C3 e radical C4 oxo), flavonoles (flavonas com grupo
3-OH) e flavanonas (análogos de flavonas com uma ligação única C2-C3); as mais
abundantes dos isoflavonoides incluem as isoflavonas(análogos das flavonas); e os mais abundantes dos neoflavonoides incluem as 4-arilcoumarina (dupla ligação C3-C4) e sua
forma reduzida 3,4-dihidro-4-arilcoumarina (Tabela 2.1).
Um dos flavonoides mais estudados é a quercetina, a qual pertence à classe dos flavanoles. A Quercetina possui cinco grupos hidroxila, das quais dois estão no grupo fenil nas posições 3’ e 4’, e os três restantes estão nas posiçesõ 3, 5 e 7 do benzopirano (Figura 2.3a). É encontrada na cebola, maçã e brócolis. Às vezes a Quercetina aparece naturalmente em sua forma glicosilada, a qual é conhecida como Quercitrina. A Quercitrina possui adicionalmente um resíduo ramanosido na posição 3 do benzopirano (Figura 2.3b).
Figura 2.3 Estrutura molecular dos flavonoides a) Quercetina e b) Quercitrina.
6
Tabela 2.1 Classes de flavonoides. Mostram-se as classes de flavonoides, ligações químicas, grau de insaturação, os grupos funcionais característicos, alguns exemplos representativos e sua fonte de localização.
Classes
Conexão do anel B ao C (posição no anel
C)
Instauração no anel C
Grupos funcionais no anel C
Exemplos Fonte
Flavanoles 2 Nenhum
3-hidroxi 3-O-galato (+)-Catequina (+)-Galocatequina (-)-Epicatequina (-)-Epigalocatequina (-)-Epicatequina-3-galato (-)-Epigalocatequina-3-galato Chá, uvas vermelhas e vinho vermelho
Flavanonas 2 Nenhum 4-oxo
Eriodictiol Hesperetina Naringenina
Frutas cítricas
Flavonas 2 Duplaligação2-3 4-oxo
Apigenina Luteolina
Pimentas verdes.
Isoflavonas 3 Dupla ligação2-3 4-oxo
Daidzeina Genisteina Gliciteina Biochanina A Formononentina Quase presente em todos os alimentos
Flavonoles 2 Dupla ligação2-3 3-hidroxi, 4-oxo
7
2.1.3 Propriedades dos Flavonoides
Uns dos efeitos mais importantes dos flavonoides é o sequestro de radicais livres derivados de oxigênio. Ademais, experimentos in-vitro demonstraram que os flavonoides possuem propriedades antiinflamatórias, antialérgicas, virais e anti-cancerígenas [4,5].
2.1.3.1Efeitos anti-oxidativos
A propriedade dos flavonoides melhor descrita para quase todos os grupos de flavonoides é sua capacidade para atuar como anti-oxidante. Sendo que as flavones e catequinas parecem ser os melhores flavonoides para a proteção do corpo contra as espécies reativas de oxigênio [5].
O mecanismo mediante o qual o flavonoide atua como antioxidante é direto, devido a que na presença de radicais livres de oxigênio os grupos hidroxila dos flavonoides são oxidados resultando em um radical mais estável e menos reativo.
RH O
Flavonoide R
OH
Flavonoide( ) ( ) )( 1
8
2.2 Albumina Sérica Humana
2.2.1 Historia
A origem do termo Albumina vem do latín albus (branco), a qual foi atribuída à cor da parte do ovo que envolve a gema quando este é fritado. O medico grego Hipocrates de Cós relatou em seu livro Aforismos que a urina espumosa seja provavelmente devido à presença de Albumina. Em 1616, Harvey descreveu a circulação do sistema sanguíneo humano e o conhecimento de que o soro humano continha a albumina se fazia cada vez mais comum entre os químicos da época. Foi a partir dessa data que os químicos começaram a pesquisar o procedimento de purificação da Albumina. Tal procura pela purificação tomou muito maior importância durante a Segunda Guerra Mundial, devido a que nos acampamentos médicos nos campos de batalha precisavam albumina pura como um substituinte ao soro humano perdido pelos militares feridos. Assim, foi que em 1941 se obteve a HSA em um grau de pureza que só continha 2% de globulinas [12].
Hoje em dia se conhece muito sobre a bioquímica de produção, a estrutura e as funções da HSA. Algumas propriedades da proteína HSA como sua capacidade carregadora de drogas, plasticidade em sua estrutura, etc, continuam sendo tema atual de pesquisa.
2.2.2 Estrutura e função
9
Figura 2.4 Esquema representativo da estrutura secundaria da Albumina Sérica Humana (HSA). Pontes disulfeto são desenhadas com linhas pretas contínuas. Hélices são representados por retângulos, e loops e turns por linhas. Extraído de Peters, (1996) [12].
10
Figura2.5 Estrutura tridimensional da Albumina Sérica Humana (HSA). Os seis subdomínios são mostrados e estão coloridos na seguinte maneira: subdomínio IA: azul; subdomínio IB: celeste; subdomínio IIA: verde escuro; subdomínio IIB: verde claro; subdomínio IIIA: vermelho; subdomínio IIIB: laranja. O sitio de Sudlow I (no subdomínio IIA) está ocupado por warfarina (marrom). O sitio de Sudlow II (no subdomínio IIIA) esta ocupado por dois miristatos (preto). Os sítios FA geralmente estão ocupados por miristatos (preto). Extraído de Fasano et al., (2005) [14].
11
Uma das funções mais importantes da HSA é sua capacidade extraordinária de unir-se aos ligantes. Essa característica tem atraído muitos esforços para entender quais são os mecanismos que determinam sua ligação a drogas, e dessa forma entender como isso pode estar relacionado à disponibilidade das drogas [14].
2.2.3 Mudanças conformacionais na HSA induzidas por pH
Dos estudos físico-químicos foi estabelecido que a HSA é uma proteína flexível e que facilmente pode mudar sua conformação. Essa adaptabilidade conformacional da HSA envolve não só os sítios vizinhos imediatos ao sitio de ligação [12,18-20]. Assim, uma das mudanças conformacionais mais estudadas da HSA foi as dependentes de pH. Sendo que entre o pH 2.7 e 4.3, HSA mostra uma forma fast (F), caracterizada por um incremento na viscosidade, baixa solubilidade, e perda significativa de α-helices. Entre o pH 4.3 e 8.0, HSA mostra sua forma neutra (N) a qual é caracterizada pela estrutura conhecida em forma de coração. A pH maiores a 8, HSA exibe uma forma básica(B) com perda de α-hélices(Figura 2.6) [12,21-23].
12
2.3 Espectroscopia UV-visível
2.3.1 Lei de Lambert e Beer
A radiação ultravioleta (UV) e visível compreende só uma pequena porção do espectro eletromagnético, a qual inclui outras formas de radiação como as de radio, infravermelho (IR), cósmicas, e raios X (Figura 2.7) [25].
Figura 2.7 Espectro Eletromagnético.
Cada radiação eletromagnética tem uma energia associada, a qual é definida mediante a seguinte equação:
v h
E )( 2
Onde E é a energia (em joules), h é a constante de Planck (6.62 x 10-34 J.s), e v é a
freqüência (em segundos).
A radiação eletromagnética é considerada como a combinação dos campos elétrico e magnético que viajam através do espaço com um movimento em forma de onda. Devido a que a radiação atua como onda, ela pode ser classificada em termos de sua freqüência ou comprimento de onda, as quais estão associadas pela seguinte equação.
/
c
13
Sendo c a velocidade da luz (3x108 m.s-1), e λ o comprimento de onda (em metros).
Quando a radiação interage com a matéria vários processos podem acontecer, as quais incluem: reflexão, espalhamento, absorbância, fluorescência e reações fotoquímicas. As moléculas geralmente absorvem uma faixa longa de comprimento de onda devido a que estas possuem vários modos excitados de vibração e rotação a temperatura ambiente (Figura 2.8)[25,26].
Figura 2.8 Transições eletrônicas e vibracionais de uma molécula. a) v1, v2, v3 e v4 são os
estados vibracionais presentes num determinado estado eletrônico (E0 e E1). b) Espectro de
absorbância gerado a partir das transições eletrônicas da molécula.
Existe uma regra geral a qual diz: “A um maior numero de moléculas capaz de absorver luz, então maior será a luz absorvida”. Adicionalmente, “se uma molécula é mais eficiente em absorver luz, então absorvera mais luz”. Essas idéias podem ser resumidas em uma única expressão conhecida como a lei de Lambert e Beer (Equação 4) [25-28].
)(4 l
c I
I
Alog( 0 / )
14
Sendo A a absorbância (ou densidade óptica), Io a intensidade da luz incidente sobre a
amostra, I a intensidade da luz passando através da amostra, ε o coeficiente de absorção molar (M-1cm-1), c a concentração da amostra (M) e l o comprimento da cubeta que
contém a amostra (cm).
2.3.2 Instrumentação
Um típico espectrofotômetro UV-visível consiste de uma fonte de luz, um monocromador, e um detector (Figura 2.9). A fonte de luz é usualmente uma lâmpada de deutério, a qual tem a capacidade de emitir radiação eletromagnética na região UV do espectro eletromagnético. Uma segunda lâmpada de tungsteno é necessária para emitir radiação na região visível. O monocromador é uma grade de difração, e seu papel principal é separar o feixe de luz em seus comprimentos de ondas que a compõem. Um sistema de fendas logo vai a selecionar o comprimento de onda desejado, que incidirá na cubeta que contem a amostra. A luz que passa através da amostra vai ao detector, o qual geralmente é um tubo fotomultiplicador, onde se detecta a intensidade da luz transmitida (I) [26].
Figura 2.9 Espectrofotômetro UV-visível. a) Esquema representativo mostrando os componentes básicos do espectrofotômetro. b) Espectrofotômetro UV-visivel Cary 3-E (Varian, Palo Alto, Califórnia).
15
2.4 Espectroscopia de Fluorescência no estado estacionário
2.4.1 Princípios básicos
2.4.1.1 Diagrama de Jablonski
A absorção de luz (fótons) por uma população de moléculas induz uma passagem dos elétrons de um nível eletrônico fundamental S0 a um estado excitado Sn (n > 1). Uma
molécula excitada vai retornar ao estado fundamental S0 seguindo os possíveis passos
(Figura 2.10)[26,27].
-A molécula em Sn vai retornar ao menor estado excitado S1 mediante dissipação
de parte de sua energía ao ambiente. Este fenômeno é usualmente conhecido como conversão interna.
-Do estado excitado S1, a molécula vai chegar ao nível fundamental S0 mediante
diferentes processos competitivos.
-Emissão de um fóton (fluorescência) com uma constante de velocidade de radiação kΓ.
-Parte da energia absorvida é dissipada no meio como calor. Este tipo de energia não é radiativo e acontece com uma constante de velocidade de ki.
-As moléculas excitadas transferem parte de sua energía para moléculas situadas próximas. Esta transferência de energía acontece com uma constate de velocidade kq (supressão colisional), ou com uma constante de velocidade kt
(transferência de energía a distância)
-Uma passagem transitória acontece ao estado tripleto excitado T1 de
uma energía menor que S1 com uma constante de velocidade kisc (inter-system
crossing). Para cada estado excitado S, existe um estado excitado T de menor energía. O estado tripleto é um estado excitado e é energeticamente instável.
16
Figura 2.10 Diagrama de Jablonski. Os eventos que acontecem depois da absorção de um fóton como são a conversão interna, dissipação de calor, fluorescência e fosforescência são observados.
2.4.1.2 Deslocamento de Stokes
O fenômeno conhecido como Shift de Stokes foi descrito em 1852 quando G.G. Stokes pesquisava as propriedades ópticas da quinina. O shift de Stokes é o distancia que existe entre a primeira banda de absorção e o máximo espectro de fluorescência (Figura 2.11) [25-27]. Assim temos que o deslocamento de Stokes pode ser definido por:
f
a v
v v
)(5
17
Figura 2.11 Representação do deslocamento de Stokes. Observam-se os espectros de excitação e de fluorescência sobrepostos. As diferenças entre as freqüências de absorção e emissão determinam o deslocamento de Stokes.
2.4.2 Fluoróforos
Um cromóforo é um grupo molecular, que usualmente contém uma ligação π. Quando o cromóforo tem a capacidade de emitir um fóton este é chamado de fluoroforo [25]. Geralmente os fluoróforos podem ser divididos em intrínseco ou extrínseco, sendo que os intrínsecos são os que ocorrem em forma natural (e.g. triptófano em proteínas), e os extrínsecos são agregados à amostra para proporcionar fluorescência.
2.4.2.1 Fluoróforos intrínsecos
18
Figura 2.12 Espectros de absorbância e fluorescência dos aminoácidos triptófano (Trp), tirosina (Tyr) e fenilalanina (Phe). Trp: λex= 295nm, λem=353nm; Tyr: λex= 275nm, λem= 304nm; Phe:
λex= 260nm, λem= 282nm. As estruturas dos aminoácidos são observadas na parte inferior.
Extraído de Lakowicz.,(2004) [32].
2.4.2.2 Fluoróforos extrínsecos
19
Figura 2.13 Fluoróforos extrínsecos. Dansil Cloride (DNS-Cl), 5-Iodo-acetamido-fluoresceina (5-IAF), isotiocianato de fluoresceína (FITC), tetra-metil-rodamina (TRITC), acrilodan, 4-cloro-7-nitro-benzofurazano (NBD-CI). Extraído de Lakowicz.,(2004) [32].
2.4.3 Instrumentação
20
Figura 2.14 Espectrofluorímetro. a) Representação esquemática mostrando os componentes básicos do fluorímetro. b) Fluorímetro Cary Eclipse (Varian, Palo Alto, CA), equipado com Peltier (Varian, Palo Alto, CA).
2.5 Efeito da filtragem interna (Inner Filter Effect)
As amostras que contém densidade óptica maiores que 0.05 são um sério problema quando se tenta estudar fluorescência em um sistema right-angle, devido a que dois tipos de efeito de filtragem interna poderíam acontecer [32,33]. O efeito de filtragem interna primário (PIFE), o qual é definido como o decréscimo na intensidade do feixe de luz de excitação no ponto de observação devido à absorção óptica do cromóforo na região de excitação, causa que as moléculas investigadas sejam excitadas com um feixe de luz menos intenso fazendo que o rendimento quântico aparente da emissão de fluorescência mostre um decréscimo. O efeito de filtragem interna secundário (SIFE), acontece quando o cromóforo absorve na região de emissão causando um decréscimo na intensidade de fluorescência [34]. Para evitar o PIFE e SIFE, geralmente é aplicada uma correção aos dados de fluorescência, que tem a seguinte expressão (Equação 6):
2 ) (
log ex em
obs corr
OD OD
anti F
F )( 6
21
2.6 Supressão de Fluorescência
Supressão faz referência ao processo pelo qual uma molécula perde sua fluorescência pela presença de um agente, chamado de supressor [27,32]. Os mecanismos de supressão podem ser diferenciados em base a sua dependência com a viscosidade, temperatura ou tempo de vida da fluorescência [32].
2.6.1 Mecanismo de supressão estático
Este tipo de supressão de fluorescência resulta da formação de um complexo não fluorescente entre o fluoróforo e o supressor. Quando este complexo absorve luz de excitação, retorna imediatamente para o estado fundamental sem emissão de fóton. A reação de formação do complexo pode ser expressa da seguinte forma:
Q F Q
F ( 7)
Sendo a constante de associação (KS) definida como:
] ][ [ ] [ Q F Q F KS
(8)
Sendo [F-Q] a concentração do complexo, [F] a concentração do fluoróforo livre, e [Q] a concentração do supressor. Se o complexo não é fluorescente então a fração da fluorescência remanescente (F/F0) é igual à fração de fluoróforos não complexados.
] [ ] [ ]
[F 0 F FQ ( 9)
] [ ] [ ] [ ]
22 ] [ 1 ] [ ]
[ 0 K Q
F F
S
)(11
Na equação 11 se observa que a dependência de Fo/F com respeito à [Q] é linear, esta
equação é conhecida como a equação de Stern-Volmer [32]. Devido a que a temperatura afeta a formação e estabilidade do complexo, o valor de Ks diminui com
respeito ao incremento da temperatura (Figura 2.15). Adicionalmente, devido a que o complexo é não fluorescente e a fluorescência observada só é do fluoróforo não complexado, então o tempo de vida (τ) do fluoróforo não complexado permanece constante (Figura 2.15).
2.6.2 Mecanismo de supressão dinâmico
A supressãodinâmica (ou colisional) também é descrito pela equação de Stern-Volmer (Equação 12). ] [ 1 ] [ 1 ] [ ] [ 0
0 k Q K Q
F F
D
q
(12)
Sendo F0 e F as intensidades de fluorescência em ausência e presença do supressor, kq é
a constante de supressãobimolecular, τ0 é o tempo de vida do fluoróforo em ausência de
supressor, KD é a constante de supressãocolisional e Q e a concentração do supressor.
É necessário reconhecer que a simples linearidade do plot de Stem-Volmer (F0/F versus
23
Figura 2.15 Mecanismo de supressão estático e dinâmico. a) No mecanismo de supressão estático as altas temperaturas causam uma desestabilização do complexo o que ocasiona uma diminuição das constantes de supressão, enquanto no b) mecanismo de supressãocolisional as altas temperaturas favorecem a difusão das moléculas incrementando assim a constante de supressão. Extraído de Lakowicz.,(2004) [32].
24
2.6.3 Desvío da equação de Stern-Volmer: Modelos alternativos
O análise da supressãoda fluorescência é classicamente descrito pelo modelo de Stern-Volmer (Equação 11). Algumas vezes um desvío da linearidade é observada na supressão da fluorescência, não fazendo possível a utilização do modelo de Stern-Volmer. Para tais casos, três modelos alternativos podem ser testados: 1) Modelo de supressão combinado estático-dinâmico, 2) modelo da esfera de ação e 3) modelo de Perrin. A continuação se detalhara os três modelos.
2.6.3.1 Modelo combinado de supressão estático-dinámico
Este modelo estabelece que a supressãoé influenciado pela formação de um complexo e pelos eventos colisionais ao mesmo tempo. Este modelo é de segunda ordem em [Q], o qual gera um devío da linearidade causado pela combinação de supressão dinâmico e estático ao mesmo tempo(Equação 13) [32].
+K Q
+K
Q
= F F
S D
o 1 1
13Sendo F0 e F são as fluorescências na ausência e presença de supressor respectivamente,
KD e KS as constantes de supressão dinâmico e estático respectivamente e [Q] a
concentração de supressor.
2.6.3.2 Modelo da esfera de ação
Este modelo é uma combinação de supressão estático e dinâmico que adicionalmente requer que o cromóforo e o supressor estejam numa certa distância um ao outro, chamado esfera de ação (Equação 14) [32,34].
K QD
o = +K Q S
F
25
Sendo F0 e F são as fluorescências na ausência e presença de supressor,
respectivamente, KD e KS as constantes de supressão dinâmico e estático
respectivamente e [Q] a concentração de supressor.
2.6.3.3 Modelo de Perrin
Este modelo assume a existência de uma supressãoinstantânea do doador excitado pelo supressor, só se o supressor esta localizado dentro da esfera de volume Vq nas
vizinhanças do fluoróforo e não existe supressãofora da esfera (Equação 15) [35,36].
K Q
o = p
F
F e
15Sendo F0 e F são as fluorescências na ausência e presença de supressor respectivamente,
26
2.7 Transferência ressonante de energia por fluorescência (FRET)
O FRET é um processo não radiativo, onde um doador excitado transfere energía a um aceitador não excitado através de uma interação dipolo-dipolo. O aceitador deve absorver a energía no comprimento de onda de emissão do doador, mas não precisa re-emitir a energía absorvida[27-32].
Existem vários fatores que determinam o grau de transferência de energía, entre as quais temos; o grau de sobreposição dos espectros de emissão e excitação, a orientação dos dipolos e a distância entre as moléculas doadoras e aceitadoras (Figura 2.16) [32].
Figura 2.16 Representação esquemática do processo de FRET. a) Mostra-se que depois da excitação, o doador excitado transfere energía não radiativa à molécula aceitadora próxima localizada a uma distancia r. b) Sobreposição dos espectros de absorção e emissão do aceitador e doador respectivamente.
27
Capítulo 3
Materiais e Métodos
3.1Reagentes e soluções estoque
A Albumina Sérica Humana Fraction-V (A1653-5G), Quercetina (Q0125), Fosfato de Sódio Dibásico Anidro (S7907) e o Cloreto de Sódio (S9888-25G) foram comprados de Sigma Chemical Co. (Sant Louis, USA). O ácido cítrico (A1026.01.AG) foi comprado de Synth (São Paulo, Brasil). A Quercitrina foi concedida pelo professor Wagner Vilegas (IQ-UNESP-Araraquara) e o protocolo de extração é encontrado em Saldamnha, L et al.[37]. Para toda preparação das soluções foi usado água mili-Q.
O tampão fosfato foi preparado com 50 μM Na2HPO4, 150 mM NaCl e o valor final de
pH foi ajustado mediante titulação de 5M de Acido cítrico.
As soluções estoque de Albumina Sérica Humana foram preparadas em tampão fosfato a pH 7.0 e filtradas com filtro milipore de 2.1μm. As concentrações foram determinadas espectrofotometricamente a 280nm usando o valor de coeficiente de extinção molar de 36,500 M-1cm-1 [38]. Adicionalmente para evitar o congelamente e descogelamento,
alíquotas de 50μl de HSA foram guardadas a -20oC por um período menor que um mês.
As soluções estoque dos flavonoides Quercetina e Quercitrina foram preparadas em uma mistura de 5% água Mili-Q e 95% de Et-OH. As concentrações foram determinadas espectrofotometricamente usando os coeficientes de extinção molar de 19,950 M-1cm-1 (λ = 257 nm) e 21,880 M-1cm-1 (λ = 376 nm) para Quercetina, e 19,950
M-1cm-1 (λ = 258 nm) e 15,100 M-1cm-1 (λ = 350 nm) para a Quercitrina [39]. Alíquotas
28
3.2 Espectroscopia UV-Visível
Os espectros UV-visíveis foram registrados a temperatura ambiente no Espectrofotômetro Cary 3-E (Varian Palo Alto, CA), usando uma cubeta de quartzo de 1cm. Nas medidas dos espectros de absorbância da Albumina Sérica Humana, Quercetina e Quercitrina a faixa usada foi de 200 -500 nm.
3.3 Espectroscopia de Fluorescência no estado estacionário.
29
Capítulo 4
Resultados e discussão
4.1 Fluorescência da HSA
A fluorescência é uma propriedade intrínseca das proteínas a qual é causada pela presença de três aminoácidos principais: fenilalanina, tirosina e triptofano [32]. A Albumina Sérica Humana (HSA) é uma proteína a qual tem um único resíduo de triptófano localizado na posição 214 do domínio II [13]. Fazendo uso da capacidade de fluorescência do W214, nesta seção se apresentará os espectros de emissão da HSA na ausencia e presença dos flavonoides Quercetina e Quercitrina.
4.1.1 Supressão da fluorescência da HSA pela Quercetina.
O espectro da emissão de fluorescência da HSA a pH 7.0 (298K) antes de interagir com o flavonoide Quercetina é mostrado na figura 4.1a. O espectro de fluorescência observado foi corrigido (com respecto ao espalhamento do tampão fosfato) e normalizado em base ao máximo valor de fluorescência. Em seguida, se tituló alíquotas de Quercetina observandose uma diminução (ou supressão) da fluorescência da HSA (Figura 4.1a). As concentrações de Quercetina usada foi de 0 a 15 μM, e se observó supressão da fluorescência a todas as concentrações utilizadas.
30
Figura 4.1 Espectro de emissão da fluorescência da Albúmina Sérica Humana (HSA) antes e depois da interação com o flavonoide Quercetina a 298K. a) pH 7.0 e b) pH 6.0. [HSA] = 4μM. A concentração de flavonoide Quercetina foi de 0 a 15μM com um incremento de 1μM por titulação. O espalhamento do tampão fosfato é mostrado. O comprimento de onda de excitação foi de 295nm.
a)
31
4.1.2 Supressão da fluorescência da HSA pela Quercitrina.
O espectro da emissão de fluorescência da HSA a pH 7.0 (298K) antes de interagir com o flavonoide Quercitrina é mostrado na figura 4.2a. O espectro de fluorescência observado foi corregido (com respecto ao espalhamento do tampão fosfato) e normalizado em base ao máximo valor de fluorescência. Em seguida, se tituló alíquotas de Quercitrina observandose uma diminução (ou supressão) da fluorescência da HSA (Figura 4.2a). As concentrações de Quercitrina usada foi de 0 a 15 μM, e se observó supressão da fluorescência a todas as concentrações utilizadas.
32
Figura 4.2 Espectro de emissão da fluorescência da Albúmina Sérica Humana (HSA) antes e depois da interação com o flavonoide Quercitrina a 298K. a) pH 7.0 e b) pH 6.0. [HSA] = 4μM. A concentração de flavonoide Quercitrina foi de 0 a 15μM com um incremento de 1μM por titulação. O espalhamento do tampão fosfato é mostrado. O comprimento de onda de excitação foi de 295nm.
a)
33
4.2 Absorção dos flavonoides na faixa de emissão e excitação da HSA
Devido à capacidade dos flavonoides de absorver na faixa de excitação e emissão da HSA se faz necessario corregir os espectros de emissão da HSA na presença dos flavonoides para evitar alguma alteração nos dados de fluorescência [33,34].
4.2.1 Absorção da Quercetina na faixa de emissão e excitação da HSA
34
Figura 4.3 Espectro UV- visível da Quercetina em tampão fosfato a) a pH de 7.0 e 6.0. b) Coeficiente de extinção molar (ε) em 295nm e c) 345nm na faixa de pH de 7.0 a 6.0.
a)
b)
35
4.2.2 Absorção da Quercitrina na faixa de emissão e excitação da HSA
Os espectros UV-visível da Quercitrina em tampão fosfato a pH 7.0, 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0 forom registrados. Os picos máximos de absorbância da Quercitrina a pH 7.0 foram detectados a 264 nm (Banda I) e 353 nm (Banda II), enquanto que a pH 6.0 foram a 257 nm (Banda I) e 346 nm (Banda II) (Figura 4.4a). Adicionalmente um decréscimo na capacidade de absorção foi observada na banda I da Quercitrina a pH 6.0 enquanto que um incremento na absorção foi observada na banda II da Quercitrina a pH 6.0 . A partir dos espectros de absorbância, os coeficientes de extinção molar da Quercitrina a pH 7.0, 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0 foram calculados a 295nm e 345nm (Figura 4.4b e 4.4c respectivamente). Na figura 4.4b se observa como o coeficiente de extinção molar da Quercitrina em 295nm aumenta gradualmente de pH 7.0 a pH 6.0, sendo um coportamente distinto ao observado com a banda I da Quercetina.
Na figura 4.4c mostra como o coeficiente de extinção molar da Quercitrina em 345nm aumenta gradualmente de pH 7.0 a pH 6.0.
4.2.3 Correção da filtragem interna
36
Figura 4.4 Espectro UV- visível da Quercitina em tampão fosfato a) a pH de 7.0 e 6.0. b) Coeficiente de extinção molar (ε) em 295nm e c) 345nm na faixa de pH de 7.0 a 6.0.
a)
b)
37
4.3 Mecanismo supressão da fluorescência da HSA pelos flavonoides
O mecanismo de supressão pode ser descrito como estático ou dinâmico dado sua dependência com a temperatura, viscosidade ou tempo de vida da fluorescência. Assim temos que, se com o aumento da temperatura a difusão das moleculas doadora e aceitadora é incrementada então o mecanismo de supressãoé dinâmico. No caso que se forme o complexo entre as moleculas doadoras e aceitadoras e estas sejam diminuídas com o aumento da temperatura então o mecanismo de supressãoserá estático [27,32].
4.3.1 Mecanismo supressão da fluorescência da HSA pela Quercetina
A supressão da fluorescência da HSA pela Quercetina a pH 7.0 (298K) mostrou um desvío da linearidade a concentrações acima dos 8μM de Quercetina não podendo ser descrito pelo modelo clássico de Stern-Volmer (Figura 4.5a). Trabalhos prévios também encontraram um desvío da linearidade no plot F0/F versus [Q] da supressão da
fluorescência da HSA pela Quercetina sugerindo analisar só na região linear [40], ou simplesmente não considerar o desvio da linearidade e analisar os dados com o modelo linear de Stern-Volmer [41].
38
(298K) (Figura 4.5a). A supressão da fluorescência da HSA pela Quercetina a pH 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0 em 298K também obedeceu o modelo de Perrin. A figura 4.5b mostra a supressão da fluorescência da HSA pela Quercetina a pH 6.0 (298K).
Adicionalmente a supressão da fluorescência da HSA pela Quercetina a pH 7.0, 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0 foram analisados na região linear não mostrando diferenças qualitativas com respeito as analise prévias (Figura 4.5, inserções).
Para determinar o mecanismo de supressão da HSA pela Quercetina a pH 7.0, três temperaturas diferentes foram usadas (288, 298 e 308K). Na figura 4.5a se observa como o declive do gráfico F0/F versus [Q] diminui com o incremento da temperatura
demostrando que o mecanismo de supressão da HSA pela Quercetina a pH 7.0 é estático.
O mecanismo de supressão da HSA pela Quercetina a pH 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0 também foram determinados por sua dependência com a temperatura (288, 298 e 308K) demostrando que o mecanismo de supressão é também estático. A figura 4.5b se observa a dependência do declive do gráfico F0/F versus [Q] com a temperatura. Esse
resultado está em concordância ao previamente encontrado por Liu et al., 2010[42]. Os valores das constantes de supressão da HSA pela Quercetina(KP) calculados usando
39
Figura 4.5 Supressão da fluorescência da HSA pela Quercetina a a) pH 7.0 e b) pH 6.0 em três temperaturas diferentes (288, 298 e 308 K). As inserções mostraram um comportamento linear para concentrações abaixo de 8μM.
a)
40
4.3.2 Mecanismo supressão da fluorescência da HSA pela Quercitrina
A supressão da fluorescência da HSA pela Quercetrina a pH 7.0 (298K) mostra um comportamento linear e foi muito bem descrito pelo modelo clássico de Stern-Volmer (Figura 4.6a). A supressão da fluorescência da HSA pela Quercitrina a pH 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0 em 298K também obedecio o modelo de Stern-Volmer. A figura 4.6b mostra a supressão da fluorescência da HSA pela Quercitrina a pH 6.0(298K).
Para determinar o mecanismo de supressão da HSA pela Quercetrina a pH 7.0, três temperaturas diferentes foram usadas (288, 298 e 308K). Na figura 4.6a se observa como o declive do plot F0/F versus [Q] é diminuido pelo incremento da temperatura
demostrando que o mecanismo de supressão da HSA pela Quercetina a pH 7.0 é estático.
O mecanismo de supressão da HSA pela Quercetrina a pH 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0 também foram determinados por sua dependência com a temperatura (288, 298 e 308K) demostrándose que o mecanismo de supressão é também estático.
Os valores das constantes de supressão da HSA pela Quercetrina (KSV) calculados
usando o modelo de Stern-Volmer são mostradas na tabela 4.2.
41
Figura 4.6 Supressão da fluorescência da HSA pela Quercitrina a a) pH 7.0 e b) pH 6.0 em três temperaturas diferentes (288, 298 e 308 K).
a)
42
4.4 Efeito do etanol na fluorescência da HSA
Lin et al.(1995) demostrou que as altas concentrações de etanol causam alterações na estrutura das proteinas [45]. Esas alterações estruturais induzidas por etanol poderiam tambem influenciar a capacidade de fluorescência das proteínas.
Devido que os flavonoides Quercetina e Quercitrina foram resuspendidos em etanol (95% v/v), poderia ser possível que o etanol cause alguma alteração na fluorescência da HSA. Para determinar o efeito do etanol na fluorescência da HSA um experimento de titulação com etanol (95% v/v) na presença de 4 μM HSA foi feito.
Os resultados mostraram que a fluorescência da HSA não sufriu nenhuma perda significativa nas concentrações de etanol usadas nos experimentos de supressão (Figura 4.7). Resultados similares foram obtidos por Ding, F. et al. (2009) estudando a interação de C.I. acid red 2 com a HSA [46].
43
4.5 Espectro UV-visível da Quercetina em tampão fosfato a pH 7.0
A Quercetina é um flavonoide de naturaleza apolar a qual num meio polar podería ser induzida a formar agregados. Para determinar se a Quercetina estaria formando agregados no tampão fosfato, os quais poderiam estar influenciando no desvío da linearidade observada nos experimentos de supressão da fluorescência, se realizou medidas de absorbância da Quercetina a diferentes concentrações em tampão fosfato a pH 7.0 (298K).
O espectro de absorbância da Quercetina em tampão fosfato a pH 7.0 (298K) aumentou com o incremento da concentração e mostraram duas bandas: banda I (λ=372 nm) e banda II (λ=254nm) (Figura 4.8a).
Ao analisar as absorbâncias a 254 nm e 372 nm versus a concentração de Quercetina observou-se uma relação linear e ausência de deslocamento de bandas, a qual obedece a lei de Lambert e Beer. Sendo os coeficientes de extinção molar da Quercetina de 34,800 M-1cm-1 (λ = 254nm) e 29,520 M-1cm-1 (λ = 372 nm).
44
Figura 4.8 Quercetina em tampão fosfato. a) Espectro UV-visível foi registrado a diferentes concentrações de Quercetina. As absorbâncias a b) 254 nm (Banda II) e c) 372 nm (Banda I) são graficados versus a concentração de Quercetina.
a)
b)
45
4.6 O papel do pH nas constantes de supressão
Para entender como o pH altera a ligação dos flavonoides à HSA, neste trabalho foi medido as constantes de supressão da fluorescência da HSA pela Quercetina e Quercitrina na faixa de pH de 7.0 a 6.0 (tabelas 4.1 e 4.2 respectivamente).
A faixa de pH de 7.0 a 6.0 foi selecionada por assemelhar-se ao pH nas vizinhanças extracelulares das membranas biológicas [48].
4.6.1 O papel do pH nas constantes de supressão da fluorescência da HSA pela Quercetina
As constantes de supressãoda fluorescência da HSA pela Quercetina (Kp) na faixa de
pH de 7.0 a 6.0 (298K) mostraram um leve decréscimo (Figura 4.9b). Uma regressão linear foi aplicado as constantes de supressãoda fluorescência da HSA pela Quercetina (Kp) na faixa de pH de 7.0 a 6.0 (298K) para exemplificar a tendência de queda das
constantes (Figura 4.9b).
As constantes de supressãoda fluorescência da HSA pela Quercetina (Kp) na faixa de
pH de 7.0 a 6.0 foram também determinados a 288K (Figura 4.9a) e 308K (Figura 4.9c), observando-se a mesma tendência de queda para ambos casos.
46
Figura 4.9 Dependência das constantes de supressão do complexo Quercetina-HSA ([HSA] = 4μM) contra a variação de pH a três temperaturas diferentes a) 288 K, b) 298 K e c) 308 K. A faixa de pH estudada foi de 7.0 a 6.0 com um incremento de 0.2.
a)
b)
47
Tabela 4.1 Constantes de supressãoda fluorescência da HSA pela Quercetina a pH 7.0, 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0. Três temperaturas foram testadas (288,298 e 308K). R é coeficiente de correlação.
pH 7.0 pH 6.8 pH 6.6 pH 6.4 pH 6.2 pH 6.0
KP
(x 104 M-1)
288K 13.35 ± 0.20
(R=0.96) 10.91 ± 0.06 (R=0.99) 11.22 ± 0.16 (R=0.97) 11.02 ± 0.13 (R=0.98) 10.58 ± 0.18 (R=0.96) 11.78 ± 0.13 (R=0.98) 298K 10.06 ± 0.11
(R=0.99) 9.69 ± 0.14 (R=0.98) 9.93 ± 0.07 (R=0.99) 9.81 ± 0.05 (R=0.99) 9.76 ± 0.14 (R=0.98) 9.78 ± 0.11 (R=0.98) 308K 8.75 ± 0.13
48
4.6.2 O papel do pH nas constantes de supressão da fluorescência da HSA pela Quercitrina
As constantes de supressãoda fluorescência da HSA pela Quercitrina (KSV) na faixa de
pH de 7.0 a 6.0 (298K) mostraram-se bem menos suscetíveis (Figura 4.10b). Uma regressão linear foi aplicado às constantes de supressão da fluorescência da HSA pela Quercitrina (KSV) na faixa de pH de 7.0 a 6.0 (298K) para exemplificar a tendência das
constantes (Figura 4.10b).
As constantes de supressãoda fluorescência da HSA pela Quercitrina (KSV) na faixa de
pH de 7.0 a 6.0 foram também determinados a 288K (Figura 4.10a) e 308K (Figura 4.10c), observando-se uma tendência a aumentar para ambos casos.
Assim, os resultados reforçam o argumento de que o pH ligeiramente ácido seja capaz de aumentar ou ter efeito quase nulo sobre a afinidade da ligação Quercitrina-HSA.
49
Figura 4.10 Dependência das constantes de supressão do complexo Quercitrina-HSA ([HSA] = 4μM) contra a variação de pH a três temperaturas diferentes a) 288 K, b) 298 K e c) 308 K. A faixa de pH estudada foi de 7.0 a 6.0 com um incremento de 0.2.
50
pH 7.0 pH 6.8 pH 6.6 pH 6.4 pH 6.2 pH 6.0
KSV
(x 104 M-1)
288K 3.37 ± 0.26
(R=0.95) 5.83 ± 0.30 (R=0.96) 7.77 ± 0.46 (R=0.95) 7.44 ± 0.44 (R=0.95) 7.03 ± 0.45 (R=0.94) 4.66 ± 0.58 (R=0.90) 298K 2.07 ± 0.15
(R=0.94) 2.67 ± 0.15 (R=0.95) 2.98 ± 0.12 (R=0.98) 2.50 ± 0.14 (R=0.96) 2.28 ± 0.13 (R=0.96) 2.45 ± 0.09 (R=0.97) 308K 1.43 ± 0.09
(R=0.95) 1.61 ± 0.11 (R=0.94) 1.68 ± 0.07 (R=0.97) 1.48 ± 0.11 (R=0.93) 1.44 ± 0.11 (R=0.92) 1.66 ± 0.11 (R=0.95)
51
4.7Análise do número de sítios de ligação
Nas interações proteína-ligante é de vital importância conhecer a estequiometria das reações, devido a que proporciona informação sobre o número de sítios de ligação[32,49].
Considerando que a proteína e o ligante formem um complexo imediatamente depois de que cada um se encontre, temos que:
P L nL +
P n
16Sendo P a proteína, L o ligante, n o numero de sítios de união e Ln-P o complexo
formado. Assim a constante de equilíbrio é:
n n b L P P L =K
17Sendo Kb a constante de ligação e n o número de sítios de ligação na proteína.
Considerando que a quantidade total de proteína é P0, logo temos que P0 = P + Ln-P,
sendo P a proteína livre. Adicionalmente a relação entre a intensidade de fluorescência da proteína livre e unida é de F0/F, logo rearranjando temos [50-52].
Q n + K log = F F Fo b loglog
52
4.7.1 Análise do número de sítios de ligação do complexo Quercetina-HSA
A figura 4.11 mostra os gráficos de condição de equilibrio para a supressão da fluorescência da HSA pela Quercetina a pH 7.0 e 6.0. A dependência de log [(F0-F)/F]
com respeito ao log[Quercetina] é linear, com um declive igual a n e com um intercepto num valor fixo igual a log Kb. Na tabela 4.3 estão detalhados os valores de Kb e n para
os complexos Quercetina-HSA a pH 7.0, 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0 (em 288, 298 e 308K) Os valores de Kb do complexo Quercetina-HSA a pH 7.0 mostrou um decréscimo com o
aumento da temperatura, sendo similar ao obtido anteriormente com as constantes de supressão(Kp). A mesma dependência com a temperatura foi observada para os
complexos Quercetina-HSA a pH 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0.
O número de sítios de ligação para os complexos da Quercetina-HSA na faixa de pH de 7.0 a 6.0 (288, 298 e 308K) foi aproximadamente igual a 1, sugerindo a existència de um único sitio de ligação na interação Quercetina-HSA.
Tabela 4.3 Constantes de ligação do complexo Quercetina-HSA a pH 7.0, 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0 em três temperaturas diferentes (288, 298 e 308K).
pH 7.0 pH 6.8 pH 6.6 pH 6.4 pH 6.2 pH 6.0
Kb
(x 104 M-1)
288K 11.4 ± 1.6
(R=0.97) 9.74 ± 0.78 (R=0.99) 12.59 ± 0.76 (R=0.99) 10.72 ± 0.43 (R=0.99) 12.07 ± 1.0 (R=0.99) 11.23 ± 0.4 (R=0.99) 298K 10.7 ± 1.2
(R=0.98) 8.76 ± 0.9 (R=0.99) 10.31 ± 0.6 (R=0.99) 8.81 ± 0.39 (R=0.99) 9.34 ± 0.68 (R=0.99) 9.65 ± 0.24 (R=0.99) 308K 9.66 ± 0.73
(R=0.99) 8.06 ± 0.43 (R=0.99) 7.97 ± 0.24 (R=0.99) 8.0 ± 0.3 (R=0.99) 6.55 ± 0.32 (R=0.99) 7.44 ± 0.59 (R=0.99)
n
288K 1.41 ± 0.07
(R=0.97) 1.34 ± 0.04 (R=0.99) 1.26 ± 0.03 (R=0.99) 1.32 ± 0.02 (R=0.99) 1.24 ± 0.04 (R=0.99) 1.35 ± 0.02 (R=0.99) 298K 1.21 ± 0.05
(R=0.98) 1.29 ± 0.05 (R=0.99) 1.25 ± 0.027 (R=0.99) 1.30 ± 0.02 (R=0.99) 1.26 ± 0.03 (R=0.99) 1.27 ± 0.01 (R=0.99) 308K 1.19 ± 0.04
53
Figura 4.11 Gráfico de supressãoda fluorescência da HSA pela Quercetina a a) pH 7.0 e b) pH 6.0 em três temperaturas diferentes (288, 298 e 308K)
a)
54
4.7.2 Análise do número de sítios de ligação do complexo Quercitrina-HSA
A figura 4.12 mostra os gráficos de condição de equilibrio para a supressão da fluorescência da HSA pela Quercitrina a pH 7.0 e 6.0. A dependência de log [(F0-F)/F]
com respeito ao log[Quercitrina] é linear, com um declive igual a n e com um intercepto num valor fixo igual a log Kb. Na tabela 4.4 estão detalhados os valores de Kb e n para
os complexos Quercitrina-HSA a pH 7.0, 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0 (em 288, 298 e 308K) Os valores de Kb do complexo Quercitrina-HSA a pH 7.0 mostrou um decréscimo com
o aumento da temperatura, sendo similar ao obtido com as constantes de supressão(KSV). A mesma dependencia com a temperatura foi observada para os
complexos Quercitrina-HSA a pH 6.8, 6.6, 6.4, 6.2 e 6.0.
O número de sítios de ligaçãopara os complexos da Quercitrina-HSA na faixa de pH de 7.0 a 6.0 (288, 298 e 308K) foi aproximadamente igual a 1, sugerindo a existência de um único sitio de ligação na interação Quercitrina-HSA.
pH 7.0 pH 6.8 pH 6.6 pH 6.4 pH 6.2 pH 6.0
Kb
(x 104 M-1)
288K 3.13 ± 0.4
(R=0.94) 11.2 ± 0.88 (R=0.97) 20.8 ± 1.0 (R=0.98) 18.8 ± 1.0 (R=0.98) 19.3 ± 0.96 (R=0.98) 3.95 ± 0.77 (R=0.90) 298K 1.23 ± 0.21
(R=0.94) 5.21 ± 0.54 (R=0.95) 4.1 ± 0.35 (R=0.97) 2.26 ± 0.24 (R=0.97) 1.61 ± 0.37 (R=0.90) 2.92 ± 0.33 (R=0.96) 308K 0.78 ± 0.21
(R=0.90) 1.59 ± 0.35 (R=0.90) 1.61 ± 0.22 (R=0.94) 0.51 ± 0.18 (R=0.90) 0.58 ± 0.16 (R=0.90) (R=0.96) 1.9 ± 0.2
n
288K 0.93 ± 0.06
(R=0.94) 0.77 ± 0.04 (R=0.97) 0.67 ± 0.02 (R=0.98) 0.66 ± 0.03 (R=0.98) 0.66 ± 0.02 (R=0.98) 1.00 ± 0.09 (R=0.90) 298K 1.18 ± 0.08
(R=0.94) 0.78 ± 0.05 (R=0.95) 0.89 ± 0.04 (R=0.97) 1.03 ± 0.05 (R=0.97) 1.08 ± 0.10 (R=0.90) 0.91 ± 0.05 (R=0.96) 308K 1.23 ± 0.12
(R=0.90) 1.00 ± 0.10 (R=0.90) 1.00 ± 0.06 (R=0.94) 1.39 ± 0.15 (R=0.90) 1.34 ± 0.13 (R=0.90) 0.93 ± 0.05 (R=0.96)
55
Figura 4.12 Gráfico de supressãoda fluorescência da HSA pela Quercitrina a a) pH 7.0 e b) pH 6.0 em três temperaturas diferentes (288, 298 e 308K).
a)
