R e v ista d a S o c ie d a d e B rasileira d e M ed ic in a T ro p ica l 1 6 :1 7 5 -1 8 3 , O u t-D e z, 1 9 8 3
ARTIGOS
ESTUDO IMUNOBIOLÓGICO DE ESTOQUES DE
T R Y P A N O S O M A
C R U Z I
ISOLADOS DE PACIENTES NA FASE
AGUDA DA DOENÇA DE CHAGAS
1. Principais parâmetros da infecção produzida no camundongo
T.L. Kipnis, PA I. M inóprio, A .O . L uquetti, A. Rassi e W. Dias da Silva
E s to q u e s d e tr ip a n o s s o m a s iso la d o s d e p a c ie n te s n a f a s e a g u d a d a d o e n ç a d e C hagas f o r a m in je ta d o s e m g r u p o s d e c a m u n d o n g o s a lb in o s n ã o iso g ê n ic o s n a s d o s e s d e 1 03, 1 0 * e 1 0 s p a r a s ita s /c a m u n d o n g o s . O c u rs o d a in fe c ç ã o f o i s e g u id o p o r trê s m e se s. A p ctra sitem ia f o i e m g e ra l b a ix a , c o m p ic o s r e c o r re n te s , n a m a io r ia d a s v e ze s o s a n im a is e v o lu ia m p a ra c r o n ic id a d e . S o m e n te u m e s to q u e in d u z iu a lto ín d ic e d e m o r ta lid a d e . O s p a ra sita s e a s le sõ e s a p e sa r d e d e te c ta d a s n o p i c o d a p a r a s ite m ia e r e s tr ito s a o c o ra ç ã o e s ta v a m a u s e n te s a o s trê s m e se s. N e s ta é p o c a o s p e r fis d e Ig s a p r e se n ta r a m d ife r e n ç a s m a rc a n te s . G ru p o s d e a n im a is q u e f o r a m in o c u la d o s c o m e s te s e s to q u e s f o r a m d e s a fia d o s c o m d o s e s le ta is d a c e p a Y o u C L . E m a lg u n s c a so s o b te v e -s e u m a p a ra s ite m ia , m a s p a te n te .
Palavras chaves: T r y p a n o s o m a c r u z i. Doença de Chagas. Estoques. Cepas.
Isotipos de IgG.
Os mecanismos acionados pelo sistem a imu- nitário dos hospedeiros vertebrados no decurso da infecção pelo T r y p a n o s o m a c r u z i vêm sendo in
tensivam ente investigados usando-se com o m odelo básico, a infecção de anim ais de laboratório tais com o cam undongos, rato, coelho e m ais raram en te prim atas com cepas de T. c r u z i m antidas em la
boratório, via de regra, p or passagens sucessivas de cam undongo a cam undongo. Abstraindo-se a questão sobre se os hospedeiros com um ente usa dos seriam os mais adequados para esclarecer os fe nôm enos im unopatológicos ou im unobiológicos que acontecem n a doença hum ana ou no “ equilí brio de convivência” entre o parasita e seus reser vatórios silvestres, pelo m enos duas perguntas hão de ser feitas: a) As diferentes cepas de T. c r u z i ex
tensivam ente em pregados com o agentes ou fontes de agentes im unizantes são potencialm ente capazes de acionar os mecanismos im unitários funcionan- tes nas infecções naturais? b) O em prego de tais cepas com o células-alvo no estudo dos diferentes
Trabalho financiado por FAPESP, CNPq e UNDP/World Bank/WHO. Special Programme for Research and Train- ing in Tropica) f Diseases. D epartam ento de Imunologia, Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, Departam ento de Parasitologia, Instituto de Patolo gia Tropical da Universidade Federal de Goiás e D eparta m ento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Goiás.
Recebido para publicação em 9/5/1983.
m ecanismos im unes efetores, ta n to hum orais com o celulares, fornece inform ações transferíveis para os mecanis/nos efetores similares, desencadeados p e los tripanossom as presentes nos reservatórios sil vestres e/oii causando doença hum ana nas zonas endêmicas?
A pertinência de tais questões reforça-se pelo fato já am plam ente docum entado, de que, apesar da grande sem elhança m orfológica e antigênica existente entre as cepas conhecidas de T. c r u z i, es
tudos experim entais têm revelado acentuadas dife renças entre cepas com respeito, principalm ente, à capacidade de sobrevivência e/o u m ultiplicação ou diferenciação do parasita dentro de certas célu las29 e sua susceptibilidade à ação de um particular m ecanism o im une e fe to r1 10 12.
Com o objetivo de ten tar esclarecer essas questões decidim os analisar alguns parâm etros im unobiopatológicos de estoques de T. c r u z i co
K ip n is T L , M in ó p rio PM , L u q u e t t i A O , R a ss i A , D ias d a Silv a W. E s tu d o im u n o b io ló g ic o d e e s to q u e s d e T ryp a n o so m a c ru zi iso la d o s d e p a c ie n te s n a fa s e a g ud a d a d o e n ç a d e Chagas. R e v is ta d a S o c ie d a d e Brasileira d e M e d ic in a T ro p ica l 1 6 : 1 7 5 -1 8 3 , O u t-D e z, 1 9 8 3
M ATERIAL E MÉTODOS
Estoques de T. c r u z i — N o presente trabalho
foram usados 10 estoques de T. c r u z i obtidos de
pacientes não tratados e na fase aguda da doença de Chagas. Logo em seguida ao fecham ento do diagnóstico p or m eio de exam es clínico e laborato
rial, os pacientes eram subm etidos ao xenodiagnós- tico com T r ia to m a i n f e s t a m . Na Tabela 1 encon-
tram-se os dados referentes aos pacientes dos quais foram isolados os estoques de T. c r u z i utilizados.
As cepas de T. c r u z i Y e CL, usadas com o parâm e
tro , são m antidas neste laboratório através de pas sagens sucessivas de cam undongo para cam undongo.
T a b e la 1 - D a d o s r e f e r e n t e s a o s p a c i e n t e s d o s q u a i s f o r a m i s o l a d o s o s e s t o q u e s d e T r y p a n o s o m a c r u z i
I d e n t i f i c a ç ã o C a r a c t e r í s t i c a s C l í n i c a s N ? e s t o q u e i n i c i a i s s e x o i d a d e m u n i c í p i o
d )
z o n a d i a s d a i n f e c ç ã o
p o r t a d e e n t r a d a f e b r e
h i p e r t r o f i a lin -f o n o d o s
h e p a t o m e g a li a
e s p l e n o -m e g a li a
e d e m a s u b -c u t â n e o
m i o c a r d i t e
( 2 )
d i r e t o ( 3 ) s o r o l o g i aI g M
1 E R S M 8 M o n ta i. ru ra l 17 R o m a n a sim sim n ã o n ã o sim n ã o 16
2 M R S G F 4 M o n ta i. u r b a n a 12 A u se n te n ã o sim n ã o n ã o sim n ã o + 16
3 M L S G F 12 M o n ta i. u r b a n a 27 R o m a n a sim sim n ã o n ã o sim + 1.0 2 4
4 S U F 6 2 M o n ta i. ru ra l 32 C h a g o m a sim sim n ã o n ã o n ã o n ã o + 12 8
5 C P O F 5 3 C a rin h . ru ra l 2 0 C h a g o m a sim n ã o sim n ã o n ã o não + 4 0
6 D P S F 10 B arr. ru ra l 5 5 R o m a n a sim sim sim sim n ã o n ã o + 12 8
7 A H M L M 10 M o n ta i. ru ra l 14 R o m a n a sim n ã o n ã o sim sim n ã o + 10
8 IC F F 10 M o n ta i. r u ra l 14 R o m a n a sim sim sim n ã o n ã o n ã o + 5
9 H V N M M 12 M o n ta i. r u ra l 13 C h a g o m a sim n ã o n ã o n ã o n ã o n ã o +
10 R S T M 10 C o te g . ru ra l 2 0 C h a g o m a sim sim sim sim sim n ã o + +
- I m u n o f l . F C ( 4 ) lgG 64 64 24 25 6 80 25 6 20 20 8 0 2,8 1.8 2,8 2 ,2 A C 5 2 .7
2.8
2,8
2,8
(1 ) R e fe re -se a o m u n ic íp io o n d e f o i c o n tr a íd a a d o e n ç a - M o n ta i.: M o n ta lv â n ia (M G ), C a r in h .: C a rin h a n h a (B A ), B a r r .: B a rre ira s (B A ), C o te g ip e (B A ) (2 )iM io c a rd ite p e s q u is a d a p o r e le tr o c a r d io g r a m a e ra d io g ra fia d e tó r a x se ria d o s.
(3 ) P e s q u is a a f re s c o d o sa n g u e p e rifé ric o e n tr e lâ m in a e la m ín u la .
( 4 ) F ix a ç ã o d o c o m p le m e n to p e la t é c n ic a d e F re ita s e A lm e id a ( 4 ) , re a liz a d a p e lo D e p t? d e P a ra s ito lo g ia , M ic ro b io lo g ia e Im u n o lo g ia d a F a c . d e M e d ic in a d e R ib e irã o P re to d a U n iv e rsid a d e d e S ã o P a u lo .
(5 ) S o r o a n tic o m p le m e n ta r - A C .
O btenção das form as m etacíclicas — Os tria- tom íneos foram anestesiados com éter, presos sobre pranchas de dissecção, o abdom e aberto, o tra to digestivo dissecado, o reto retirado e aberto e o seu conteúdo depositado e m , placas de Petri contendo tam pão fosfato-salina, pH 7, 5, m =0.15 (T FS), e penicilina (500 U/m l)' é estreptom icina (500 ti g/m l). Após passagem em gaze, as form as
m etacíclicas foram enum eradas e inoculadas pela via intraperitoneal (i.p.) em cam undongos A /Sn ou C3H/He previam ente irradiados com 570 rads (fonte de Césio) e a parasitem ia avaliada a cada 3 dias.
O btenção dos tripom astigotas sangüíneos — U m a vez obtidas parasitem ias patentes, os animais foram sangrados, o sangue m isturado com igual volum e de TFS contendo 5 U /m l de heparina, os tripanossom as enum erados e as suspensões ajusta das para 10s , 104 e 103 form as tripom astigotas/ ml. Tripom astigotas sangüíneos das cepas Y e CL eram obtidos tam bém de cam undongos A /Sn ou C3H/He previam ente irradiados. Para a execução dos experim entos, formaram -se grupos hom ogê neos de 7 cam undongos albinos, não isogênicos e com 5 a 6 semanas de idade pesando 17 ± 1 g. Para cada estoque ou cepa de tripanossom as foram usados 3 grupos de cam undongos m achos e 3 grupos de cam undongos fêmeas, designados IF e IM, IIF e IIM, IIIF e IHM. Estes cam undongos foram injetados i.p. com l,0 m l das suspensões 103/m l (grupos IF e IM), 104 /m l (grupos IIF e IIM ) e 105/m l (grupos IIIF e IIIM). Os experim en
tos de reinfecção destinados a verificar a possível indução de im unização cruzada foram feitos utili- zando-se grupos de 6 a 7 camundongos que evoluí ram para a cronicidade. Três meses após a primo- -infecção, os cam undongos eram reinoculados com 105 tripom astigotas sangüíneos das cepas Y e CL tam bém obtidas de cam undongos previam ente irradiados.
Prepaity dos tecidos para exames histopatoló- gfcos — De cada grupo foram retirados 3 camun dongos com parasitem ia patente, os quais eram sacrificados e fragm entos de coração, baço, dia fragm a, fígado, esôfago, duodeno, colo e ceco, fixados em líquido de Bouin e os cortes obtidos corados pela hem atoxilina-eosina. Fragm entos de tais órgãos foram obtidos, tam bém , de cam undon gos na fase crônica (3 meses) da infecção e proces sados da m esm a m aneira.
Preparo dos tripanossom as para exames mor- fológicos — Suspensões ricas em tripanossomas eram depositadas sobre lâminas, os parasitos fixa dos com m etanol e as lâminas coradas pelo m étodo de Giemsa.
Avaliação da parasitem ia — F oi usado o m étodo descrito por B rener5.
Fracionam ento dos soros de cam undongo em coluna de p roteína
A — Sepharose — Lotes de 6 camundongos eram sangrados aos 3 meses após a infecção e os
K ip n is T L , M in ó p rio P M , L u a u e t t i A O , R a s s i A , D ias d a S ilv a W. E s tu d o im u n o b io ló g ic o d e e s to q u e s d e T ry p a n o s o m a c r u z i iso la d os d e p a c i e n te s n a fa s e a g u da d a d o e n ç a d e Chagas. R e v is ta d a S o c ie d a d e B rasileira d e M e d ic in a T ro p ic a l 1 6 : 1 7 5 -1 8 3 , O ut-D e z, 1 9 8 3
soros obtidos passados em filtros de M illipore (Millipore, Co.) com poros de 0,2 jum. Dois milili tros de soro eram m isturados com igual volum e de tam pão-tris-H C l, pH 8, 6, ^ = 0.15 e passados na coluna de pro teín a A-Sepharose previam ente equi librada com este m esm o tam pão. Após lavagem da coluna com este tam pão até a absorbância do efluente atingir valores próxim os de 0,02 os dife rentes isótipos de IgG eram eluidos, sucessivamen te, com os tam pões fosfato-salina, pH 7,0,
H = 0.15, citrato-ácido cítrico-salina, pH 5, 5, u =
0.15, fosfato-salina, pH 4 ,3, n = 0.15 e glicina-
■HC1 salina, pH '2, 8, n = 0.15. Os efluentes
correspondentes a cada eluição eram reunidos, o teor em proteínas determ inado pelo m étodo de Lowry e col.10 e referido em term os de proteínas totais eluidas por tam pão. Na padronização preliminar da coluna utilizando m isturas de soros de camundongos na fase crônica da infecção pelo
T. c r u z i e soros m onoespecíficos anti-isótipos de
IgG de cam undongos, verificou-se que o tam pão pH 5,5 eluiu, predom inantem ente, Ig G l, o tam pão
pH 4,3 eluiu IgG2b e o tam pão pH 2,5, Ig2a com traços de IgG2b. IgG3 não foi de'tectado. Os antissoros m onoespecíficos foram gentilm ente cedidos pelo Prof. Dr. Ivan M ota — D epartam ento de Im unologia, ICB, USP e as análises feitas pelo m étodo de dupla-difusão em gel de agarose.
Pesquisa de anticorpos específicos — F oi utilizado o m étodo descrito p or Freitas e Almei d a 7 para a fixação do com plem ento e o m étodo da im unofluorescência indireta6
corpos específicos.
para7 dosar os
anti-RESULTADOS
C aracterísticas gerais da infecção experim en tal — N a Tabela 2 e Figura 1 encontram -se os prin cipais dados referentes às infecções produzidas em cam undongos não isogênicos com 10s tripom asti- gotas pertencentes aos 10 diferentes estoques de
T. c r u z i recentem ente isolados de pacientes na fase
aguda da doença de Chagas..
T abela 2 - C a r a c te rístic a s d a s in fe c ç õ e s p ro d u z id a s e m c a m u n d o n g o s n ã o is o g ê n ic o s p o r d if e r e n te s e s to q u e s d t T rypanoso m a cru zi iso l a d o s d e p a c ie n te s n a fa s e a g u d a d a d o e n ç a d t C h a g a r.
Id e n ti fi c a ç ã o d o e s to q u e
S e x o d o p a c ie n te
S e x o d o c a m u n d o n g o
D ias d o s p ic o J * N ú m e r o d e c a m u n d o n g o s m o r to s
D ia d a M o rt e P a ra site m ia ( 1 0 5 / m l d e sa n g u e )
9 HVNM M F 31 38 45 3/7 24 31 33 0,2
(0 ,2 ) (0,2 ) (0,2)
M 1S 25 37 45 50 0/7 24(1) 31 (1) 0 ,2
(2 ,2 ) (1,7 ) (2,6) (2,1 ) (1,2)
8 ICF F F 22 33 44 0/7 _ 0,3
(0 ,3 ) (0,1 ) (0,2)
M 23 33 60 0 /7
(1-0) (2,3) (0 ,3 )
3 MLSG F F 23 5/7 37 2,3
(*,3 )
4 S U F F 18 1/7 33(1 ) 2,4
(2,4 )
M 24 42 1/7 39(1)
(5 ,4 ) (5,4)
5 CPO F F 14 0/7 2,5
(2,5 )
1 0 R S T M F 10 20 1/7 45(1) 4 ,0
(1 ,0 ) (4,0 )
M 27 0/7 _ 7,1
(7,1 )
1 E R S M F 26 43 2/7 3 6 (1 ) 43(1) 6,1
(4 ,7 ) (6,1)
2M R S G F F 18 24 0 /7 _ 9 ,2
(3 ,8 ) (9,2 )
M 18 24 0/7 _ 23,6
(1 3 ,4 ) (2 3 ,6 )
6 D P S F F 15 0 /7 _ 9,8
(9,8 ) 13(1)
M 13 7 /7 15(6) 22,6
(22,61
7 A HM L M F 8 7 /7 8(2) 10(2) 12(1) 14 (1)
(2 0 ,9 ) 16(1 )
M 8 6 /7 10 (5 ) 12(1) 30,5
(30,5 )
C EPA CL F 12 3 /8 18(3) 10,0
(10,4 )
M 12 7 /7 7(1) 26,3
(2 6 ,3 ) 12(1)
18(5 )
C EPA Y F 7 7/7 9(1) 17,0
(17.0 ) 11(6)
M 7 7/7 7(2) 26,5
(2 < ^ ) 9<5)
K ip n is T L , M in ó p rio P M , L u q u e t t i A O , R a ss i A , D ias d a S ü v a W. E s tu d o im u n o b io ló g ic o d e e s to q u e s d e T ry p a n o so m a c r u zi iso la d os d e p a c ie n te s n a fa s e a g u da d a d o ê n ç a d e Chagas. R e v is ta d a S o c ie d a d e Brasileira d e M e d ic in a T ro p ic a l 1 6 :1 7 5 -1 8 3 , O u t-D e z, 1 9 8 3
□ IA S
□ IAS
□ IA S
Fig. 1. Curvas de parasitem ia em grupos de camundongos inoculados com 10s formas tripom astigotas sanguíneos dos estoques de T. c r u z i 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10 com parados com as cepas Y e CL.
Com respeito à intensidade da parasitem ia, os estoques 3 ,4 , 5, 8 e 9 produziram baixas parasi- tem ias nas fêmeas enquanto os estoques 1, 2 ,6 , 7 e 10 produziram parasitem ias mais altas. Nos m achos, as parasitem ias foram , contudo, sempre m ais altas do que das fêmeas. Os estoques 3 ,4 , 5 e 7 produziram infecções caracterizados por um único pico de parasitem ia o qual aparece na 19 (estoque 7), na 2? (estoques 5 e 6) ou m esm o mais tarde, isto é, n a 3? ou 4 ? semanas após a infecção (estoques 3 e 4). Os estoques 1, 2, 8, 9 e 10 indu ziram infecções caracterizadas pelo aparecim ento de m ais de um pico conspícuo de parasitem ia. As infecções produzidas pelos estoques 2, 4, 5, 6 e 8 não foram letais, sendo que a grande m aioria dos anim ais evoluiu para a cronicidade. Os demais estoques produziram infecções caracterizadas por
K ip n is T L , M in ó p r io P M .L u q u e t t i A O , R a ss i A , D ias d a S ilv a W. E s tu d o im u n o b io ló g ic o d e e s to q u e s d e T r y p a n o so m a c r u z i isolados d e p a c i e n te s n a fa s e a g u d a d a d o e n ç a d e Chagas. R e v is ta d a S o c i e d a d e Brasileira d e M e d ic in a T ro p ica l 1 6 : 1 7 5 - 1 8 3 , O ut-D e z, 1 9 8 3
letalidade variável de acoido com o sexo do ca m undongo. Neste particular, sobressaem os esto ques 3, 6 e 7, os quais produziram m ortalidade elevada sendo que o estoque 6 só induz em cam un dongos m achos. A diferença na virulência dos estoques de T. c r u z i foi analisada com inóculos de
103 e 104 tripanossom as de dois estoques polares com respeito a este parâm etro, o estoque 7 virulen- to e o estoque 8 avirulento. Verificou-se que o estoque 7 induziu m ortalidade m esm o com inó culos m enores. Finalm ente, com o observação adi cional, o estoque de virulência mais pronunciada (estoque 7) produziu infecção com padrão similar à produzida pela cepa Y. N enhum dos estoques restantes produziu infecção sem elhante à produzi da pela cepa CL.
Distribuição tecidual dos parasitos e das lesões — 0 exame histopatológico de cortes do coração colhidos à época dos picos de parasitem ia revelou, consistentem ente, a presença de pseudo- cistos contendo am astigotas nas fibrocélulas car díacas, principalm ente naquelas das paredes ventri- culares. Infiltrados constituídos predom inante mente p or células m ononucleares ao lado de um a quantidade variável, porém substancial, de leucóci- tos polim orfonucleares, constituiu achado freqüen te não só próxim os a pseudocistos íntegros ou rompidos, m as m esm o em áreas dos cortes de cora ção aparentem ente sem células contendo form as amastigotas de T. c r u z i Nos cortes de coração
obtidos de cam undongos na fase crônica da infec ção, tan to pseudocistos de am astigotas com o
Tabela 3
lesões características da m iocardite descrita acim a foram , de o u tro lado, consistentem ente ausentes.
O exam e histopatológico dos dem ais órgãos, isto é, baço, diafragm a, fígado, esôfago, duodeno, jejuno-üeo, colo e ceco, não revelou a presença de pseudocistos de am astigotas, salvo em um caso (estoque 7) no qual foram encontrados raros pseu docistos no baço. O exam e dos tripanossom as corados pelo Giem sa revelou a presença, ta n to de form as finas com o de form as largas, nas prepara ções obtidas dos 10 estoques estudados.
Resistência à infecção — Na Tabela 3 estão representados os resultados de tentativa de reinfec- ção de cam undongos sobreviventes à prim o-infec- ções com alguns estoques de T. c r u z i e, posterior
m ente, desafiados com inóculos de tripom astigo tas sangüíneos das cepas Y e CL. Pelo fato dos cam undongos femeas serem m ais resistentes à infecção pelo T. c ru zi, decidiu-se usar som ente
cam undongos deste sexo no experim ento. Os re sultados m ostram que cam undongos na fase crôni ca da infecção produzida pelos tripanossom as do estoque 7 são resistentes à reinfecção p or tripanos somas das cepas Y e CL; enquanto que cam undon gos na fase crônica da infecção produzida por tripanossom as dos estoques 2, 5 e 8 apresentam parasitem ia discreta após desafio com tripanosso mas de cepa CL. Os cam undongos prim o-infecta- dos com o estoque 5 não apresentaram parasitem ia patente após a infecção pela cepa Y.
R e s is tê n c ia in d u z id a p e la p r im o - in fe c ç ã o c o m a lg u n s e s to q fie s d e Trypanosom a cruzi iso la d o s d e p a c ie n te s n a fa s e a g u d a d a d o e n ç a d e C hagas à r e in fe c ç ã o .
C a m u n d o n g o s p r im o - in fe c ta d o P
--- ---t ---:---D e sa fio c o m 1 0 S tr ip a n o s s o m a s :
C ep a Y C ep a C L
E s to q u e r f í I n ó c u lo P a ra site m ia L e ta lid a d e P a ra sitem ia L e ta lid a d e
2 10 4 _ _ + 0
(7)b 10s + 0 + 0
5 10s 0 0 + 0
(7)
7C 103 0 0 0 0
(6)
8 103 + 0 + 0
(7)
a - Camundongos não isogênicos prim o-infectados e desa fiados 4 meses depois com parasitem ia negativa, b - Número de camundongos desafiados com as cepas Y e
CL.
K ip n is T L , M tn ó p r io P M , L u q u e t t i A O , R a s s í A , D ias d a S iiv a W. E s tu d o im u n o b io ló g ic o d e e s to q u e s d e T ry p a n o so m a c r u z i isolados d e p a c i e n te s n a fa s e a gu d a d a d o e n ç a d e Chagas. R e v is ta d a S o c i e d a d e SrasB eira d e M e d ic in a T ro p ic a l 1 6 : 1 7 5 -1 8 3 , O ut-D e z, 1 9 8 3
porém não na fase crônica da infecção. Com o 8 destes estoques de tripanossom as foram obtidos de indivíduos provenientes do m esm o m unicípio, a variabilidade dos diferentes estoques poderia ser atribuída a um efeito seletivo exercido pelo pró prio hospedeiro. Tal suposição, conquanto neces site estudos mais cuidadosos, é reforçada pelo fato de os estoques 2 e 3 haverem sido isolados sim ulta neam ente de duas irm ãs, h abitantes de um a m esm a casa e que contraíram a infecção à m esm a época, um a na fase aguda sintom ática e a outra, oligossin- tom ática ou alternativam ente os parasitos destes estoques poderiam induzir im unossupressão em alguns hospedeiros14. Tal variabilidade foi tam bém notada, quando anim ais na fase crônica da infecção produzida p o r alguns destes estoques eram desafiados com inóculos letais de tripanosso mas das cepas Y ou CL. Observou-se, em alguns casos, (estoques 2, 5 e 8) parasitem ias baixas, porém patentes, após o inóculo desafiante. Esta variação poderia ser devido a: I) diferenças na capacidade de m odificar os processos de im unore- gulação em funcionam ento durante a infecção ou II) a presença nos tripanossom as de alguns epíto- pos diferentes. De o u tro lado, a existência de epí- topos com uns é evidente face os resultados de imu- noproteção cruzada. E xperim entos recentes m os traram que cam undongos infectados com tripanos somas da cepa Y produzem anticorpos predom i nantem ente confinados aos isotipos IgG2a e IgG2b, porém ausentes ou em níveis m uito baixos no iso- tipo Ig G l1 7. O fracionam ento dos soros dos cam un dongos infectados com alguns destes estoques em coluna de pro teín a A-Sepharose, revelou que as quantidades de IgG eluidas com tam pões de pH 6,5, pH 5,5 e pH 2,5 e cujos eluatos contém respectiva e predom inantem ente Ig G l, IgG2b e IgG2b + IgG2a, variam consideravelm ente segundo a origem dos tripanossom as inoculados. Assim, contrariam ente ao que ocorre com a cepa Y a qual induz restrição seletiva de IgG l específica, a cepa CL e o estoque 4 produzem um aum ento na pro dução deste isotipo de IgG. Com respeito ao isoti- po IgG2a, entre os 5 tripanossom as estudados, (cepa CL e estoques 4, 7, 8 e 10) som ente o esto que 10 não induziu restrição de síntese. F inalm en te, com relação ao isotipo IgG2b, observou-se res trição de síntese deste isotipo pelos estoques 7 e 8 e um a significativa potenciação pelo estoque 4. Estes resultados, conquanto prelim inares, sugerem que a restrição seletiva de isotipos de IgG no curso da infecção pelo T. c ru zi, provavelm ente controla
da pelo repertório antigênico do parasito se consti tua em um dos m ecanism os determ inantes do dire cionam ento da infecção ou para o equilíbrio (fase
crônica) ou para o desequilíbrio (m orte do hospe deiro). Tal hipótese não é improvável, um a vez que dois m ecanism os efetores adm itidos serem im por tantes no controle da infecção, isto é, lise induzida p or anticorpo e com plem ento10 e a citotoxicidade m edida por anticorpos e por células 1 1 2 1 5 envol vem a participação de IgG2b. Com o p ropósito de esclarecer o papel dessa regulação — disregulação na produção dos vários isotipos de IgG no destino da infecção, a síntese específica e inespecífica destas injunoglobulinas ao longo da infecção por tripanossom as de diferentes estoques, está sendo investigada neste laboratório. — Os dados da Tabe la 1 m ostram que nos 10 pacientes dos quais foram isolados os estoques de T. c r u z i utilizados neste
trabalho, a doença apresentou-se com característi cas variáveis. Assim, sinal de Rom afía ou Chagom a acom panhados de febre presentes em alguns pa cientes eram ausentes em outros. H ipertrofia de linfonodos, hepatom egalia e esplenom egalia con q uanto observadas na m aioria dos pacientes não foram detectados em alguns. C onstantes en tretan to , foram a presença de parasitos e de anticorpos específicos no sangue circulantes, este últim o fato indicando reatividade im unológica. Com respeito a estes dados os pacientes MLSG, SLJ e DPS fornecedores dos estoques de T. c r u z i de n 9 3 , 4 e
6, respectivam ente, apresentaram títu lo s m uito elevados de anticorpos IgM, os dois últim os acom panhados tam bém p or altos títu lo s de IgG detectados por im unofluorescência indireta. Estas diferenças observadas na evolução da doença adquirida “ in natura” reproduziram -se tam bém , em bora com outros parâm etros de avaliação, nas infecções experim entais produzidas em cam undon gos p o r estes estoques de T. c r u z i. Tom ando-se o
K ip n is T L , M in ó p r io P M , L u q u e t t i A O , R a sst A , D ias d a S ilv a W. E s tu d o im u n o b io ló g ic o d e e s to q u e s d e T ry p a n o s o m a c r u z i isolados d e p a c ie n te s n a fa s e agu d a d a d o e n ç a d e Chagas. R e v is ta d a S o c ie d a d e B fasiíeira d e M e d ic in a T ro p ic a l 1 6 : 1 7 5 -1 8 3 , O ut-D e z, 1 9 8 3
intensidade da resistência à reinfecções adquiridas pelos anim ais na fase crônica da infecção. M uito em bora todos os estoques tenham a capacidade de induzir im unidade cruzada a inóculos-desafíos com tripanossom as virulentos das cepas Y ou CL esta resistência em certos casos, era m enos pronuncia da. Isto se deve, provavelm ente, à presença de repertórios antigênicos com uns e diferentes na superfície dos tripanossom as estudados. Tais dife renças poderiam responder pelo m enos em parte pelas variações nos padrões das infecções por eles induzidas.
Este fato já tem sido assinalado por vários autores3 4 em cepas de T. c r u z i isoladas no R ecôn
cavo Baiano, e de pacientes crônicos16 . N o pre sente trabalho os autores encontraram resultados similares em pacientes na fase aguda. Seria reco mendável no fu tu ro o estudo do com portam ento de tripanossom as isolados de pacientes na fase aguda assintom ática, por ser esta a form a mais freqüente13. Um a das razões pelas quais os pes quisadores preferem a utilização de cepas altam en te virulentas é a facilidade de obtenção de um grande núm ero de parasitos, porém , desde que acreditam os ter dem onstrado ju n to com outros au tores, que na doença hum ana este não é o padrão dom inante de infecção justifica-se assim o estudo dos estoques m enos virulentos com o objetivo de o b ter resultados com paráveis aos da doença hum a na. Ressalte-se que neste caso a m ortalidade via de regra é inferior a 10% com o aconteceu na m aioria dos cam undongos inoculados com os dife rentes estoques utilizados no presente estudo.
Em conclusão, os nossos resultados perm i tem assinalar a im portância do estudo de outras cepas, convenientem ente caracterizadas, em fu tu ros estudos experim entais. O fato de ter-se acha do apenas um estoque com as características de virulência assinaladas para as cepas com um ente em pregadas nas infecções experim entais, CL, T ulahuén e outras perm ite pressupor-se que na infecção natural em hum anos, prevalecem popu lações de tripanossom as com características bem m enos virulentas que as descritas na literatura.
S U M M A R Y
T e n s to c k s o f tr y p a n o s o m e s is o la te d f r o m p a tie n ts a t t h e a c u te p h a s e o f C h a g a s’d isea se w e r e in je c te d i n t o g r o u p s o f o u t b r e d n o r m a l m i c e a t t h e d o s e s o f 1 0 3, 1 04 a n d 1 0 s p a r a s ite s /m o u s e a n d t h e c o u r s e o f t h e in f e c t i o n s f o l l o w e d u p f o r 3
m o n th s . T h e p a r a s ite m ia w a s u s u a lly lo w , w ith r e c u r r e n t p e a k s , t h e a n im a is e v o lv in g to c h ro n icity , o n l y o n e o f th e m in d u c in g h ig h r a tio o f m o rta -lity . P a tte m s o f p a ra site m ia a n d m o r ta lity w e re e ss e n tia lly d i f f e r e n t f o r e a c h s t o c k s tu d ie d ; o n ly o n e s t o c k d i d s h o w sim ila r p a t t e m s to w e ll k n o w n stra in s ( Y a n d C L ) c o m m o n l y u s e d in e x p e r im e n ta l w o rk .
P a ra site s a n d le sio n s, a lth o u g h d e t e c t e d a t t h e p e a k o f p a r a s ite m ia a n d r e s tr ic te d to h e a r t w e r e a b s e n t a f t e r th r e e m o n th s . A t th is p e r io d th e Ig s p r o file s s h o w e d s tr ik in g d iffe r e n c e s w ith r e s p e c t t o th e ir d is tr ib u tio n . G ro u p s o f m ic e th a t h a d b e e n in o c u la te d w i th o n e o f t h e s to c k s w e re c h a lle n g e d w i th t h e Y o r C L strains.
I n s o m e in s ta n c e s lo w p a r a s ite m ia s a lth o u g h p a t e n t w e r e se e n a f t e r t h e i n fe c tin g dose.
Key words: T r y p a n o s o m a c r u z i. Chagas’
Disease. Stocks. Strains. IgG isotypes.
AGRADECIM ENTOS
Os autores agradecem ao Dr. José Florisval de Ornelas pelo encam inham ento dos pacientes da região de M ontalvânia e ao Prof. Dr. Ivan M ota, ICB, USP e C entro de Im unologia da OMS pela realização dos testes de dupla-im unodifusão para detecção dos isotipos de IgG de cam undongos. Agradecem tam bém ao Dr. Benedito A. Peres do In stitu to de M edicina Tropical de São Paulo pela realização dos testes de Im unofluorescência e Hem agjutinação passiva.
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