UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE MUTAGENICIDADE E
TOXICIDADE DA LECTINA HIPOGLICEMIANTE DE FOLHA DE Bauhinia monandra (Pata-de-vaca).
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE MUTAGENICIDADE
E TOXICIDADE DA LECTINA HIPOGLICEMIANTE DE FOLHA DE Bauhinia monandra (Pata-de-vaca).
Herbert Ary A.A. Costa Nóbrega Sisenando
Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte – Centro de Ciências da Saúde para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.
ORIENTADORA: Profª.drª. Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros
CO-ORIENTADORA: Profª.drª. Ana Conceição Ribeiro Dantas Saturnino
CATALOGAÇÃO NA FONTE
D192i
Sisenando, Herbert Ary A. A. C. N.
Avaliação do potencial de mutagenicidade e toxidade da lectina hipoglicemiante de folha de Bauhinia monandra (pata-de-vaca) / Herbert Ary A. A. C. N. Sisenando. – Natal, 2009. 67p.: il.
Orientadora: Profª. Drª. Sílvia Regina B. de Medeiros. Co-orientadora: Profª. Drª. Ana Conceição R. D. Saturnino. Dissertação (mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
1. Diabetes – Dissertação. 2. Fitoterápicos – Dissertação. 3. Mutagenicidade – Dissertação. I. Medeiros, Sílvia Regina B. de. II. Saturnino, Ana Conceição R. D. III. Título.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE MUTAGENICIDADE
E TOXICIDADE DA LECTINA HIPOGLICEMIANTE DE FOLHA DE Bauhinia monandra (Pata-de-vaca).
Coordenadora do Curso de Pós-Graduação: Profª.drª. Técia Maria de Oliveira Maranhão
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE MUTAGENICIDADE
E TOXICIDADE DA LECTINA HIPOGLICEMIANTE DE FOLHA DE Bauhinia monandra (Pata-de-vaca).
Presidente da Banca: Profª.drª. Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________ Profª.drª. Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros (Universidade Federal do Rio Grande do Norte)
___________________________________________ Profª.drª. Patrícia M. Guedes Paiva
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho primeiramente a Deus, pois sem Ele, nada seria possível e não estaríamos aqui reunidos, desfrutando, juntos, destes momentos que nos são tão importantes.
AGRADECIMENTOS
A deus, que em sua infinita misericórdia nos deu mais uma chance de aprendizado.
Aos meus pais e irmãos, em especial minha mãe, por ter me aturado (compreendido) nos momentos tristes e de dificuldade.
Aos meus amigos e amigas, aos quais por muitas vezes recorri para enxugar as lágrimas das dificuldades ou para comemorar os sucessos obtidos.
As professoras Lucymara Fassarella Agnez Lima e Kátia Castanho Scortecci, pela paciência e total apoio durante os procedimentos realizados no Laboratório de Biologia Molecular e Genômica - LBMG.
A professora Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho, pelo fato de ter autorizado e disponibilizado a proteína para a realização dos testes de mutagenicidade e toxicidade, como também, na sua importante participação intelectual no desenvolvimento de algumas etapas deste projeto.
As professoras Silvia R. Batistuzzo de Medeiros e Ana Conceição R. D. Saturnino; pelo inesquecível acolhimento e por ter me proporcionado à chance de realizar esse grande sonho.
EPÍGRAFE
“Não há nada na natureza que não seja venenoso. A diferença entre remédio e veneno está na dose de prescrição”.
LISTA DE TABELAS
Artigo 01
Tabela 1 Analysis of BmoLL induced citotoxicity in CC104 strain. 38 Tabela 2 Mutant frequency in wild-type and MutM and MutY
deficient E. coli strain treated with BmoLL.
38
Tabela 3 Mutagenic potential of BmoLL on the microsuspension
mutagenicity assay, with and without metabolic activation. 39 Artigo 02
Tabela 1 Result of DH10B bacterial transformation at study concentrations of the infusion of B. monandra and leaf infusion negative control (plasmid DNA treated with distilled water).
50
Tabela 2 Result of the Allium cepa test, assessing the presence of micronuclei in the F1 region, after treatment with the infusion of B. monandra at determinate concentrations and after treatment with a negative control (distilled water).
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Bauhinia monandra; Folha (A), Flores (B) e Arvore (C). 24 Artigo 01
Figura 1 Agarose gel electrophoresis of pBCKS plasmid DNA (1µg)
treated with different BmoLL concentrations. 38 Figura 2 Agarose gel electrophoresis of pBCKS plasmid incubated
with different BmoLL concentrations in the presence of 12.8 U of exonuclease III enzyme.
38
Artigo 02
Figura 1 Electrophoretic run in 0.7% agarose gel of dry B. monandra leaf infusion at concentrations: 2 (0.8 µg/µL), 3 (4 µg/µL), 4
(20 µg/µL) and 5 (100 µg/µL), negative (1) and positive (6)
controls.
50
Figura 2 Electrophoresis in 0.7% agarose gel after treatment of plasmid DNA with exonuclease III enzyme and with infusion of dry B. monandra leaves at concentrations: 2 (0.8 µg/µL),
3 (4 µg/µL), 4 (20 µg/µL) and 5 (100 µg/µL), negative (1)
and positive (6) controls.
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Características genéticas das linhagens de S. typhimurium mais comumente utilizadas no teste de Ames segundo Mortelmans e Zeiger (2000).
29
LISTA DE ABREVIATURAS
BmoLL Lectina de folha de Bauhinia monandra
C12H25SO4Na Dodecil sulfato de sódio
E. coli Escherichia coli g/v grama/volume
CC104 E. coli selvagem kDA Kilodalton
S. typhimurium Salmonella typhimurium DNA Ácido desoxirribonucléico CC104mutMmutY E. coli deficiente de
reparo FPG Formamidopirimidina-DNA-glicolase OMS Organização Mundial da
Saúde TA1535 Linhagem de S. typhimurium
DM Diabetes Mellitus TA1537 Linhagem de S.
typhimurium
B. monandra Bauhinia monandra TA1538 Linhagem de S.
typhimurium
B. manca Bauhinia manca TA97 Linhagem de S.
typhimurium
B. guianensis Bauhinia guianensis TA98 Linhagem de S.
typhimurium
B. racemosa Bauhinia racemosa TA100 Linhagem de S.
typhimurium
B. variegata Bauhinia variegata TA102 Linhagem de S.
typhimurium
B. splendens Bauhinia splendens TA104 Linhagem de S.
typhimurium
SUMÁRIO
Dedicatória v
Agradecimentos vi
Epigrafe viii
Lista de Tabelas ix
Lista de Figuras x
Lista de Quadros xi
Lista de Abreviaturas xii
Resumo 15
Abstract 16
Resumen 17
1. Introdução 18
2. Revisão Bibliográfica 20
2.1 Diabetes 21
2.2 Plantas medicinais 22
2.3 Bauhinia monandra 23
2.4 Lectina de folha de Bauhinia monandra (BmoLL) 25 2.5 Testes de Genotoxicidade e citotoxicidade 27
2.5.1 Teste de Kado 28
2.5.2 Ensaio de mutagênese direta 30
2.5.3 Teste de genotoxicidade in vitro com DNA plasmidial 31
3. Artigo 34
4. Conclusão 42
5. Apêndice 44
5.1 Participação como autor em artigo científico, cujo tema tem correlação
5.2 Resumos Publicados em Anais de Congressos e Simpósios 54
5.2.1 Eventos Internacionais 54
5.2.2 Eventos Nacionais 54
5.2.3 Eventos Regionais 55
6. Anexos 56
6.1 Certificado de honra ao mérito por trabalhos premiados em
congressos/simpósios 57
RESUMO
As plantas medicinais têm sido usadas desde a antiguidade no tratamento de diversas enfermidades humanas. As folhas de Bauhinia monandra são amplamente utilizadas no Brasil como fitoterápico no tratamento do Diabetes Mellitus. A partir das folhas de B. monandra, foi purificada uma lectina galactose-específica, denominada de BmoLL, que também apresentou uma importante capacidade hipoglicemiante. Seguindo as normas propostas pela portaria nº 116 de 08/08/1996 do Ministério da Saúde do Brasil, o trabalho objetivou avaliar o potencial de mutagenicidade e toxicidade da BmoLL a partir da utilização dos testes com cepas de Escherichia coli da linhagem CC104 (Teste de mutagênese direta), com cepas de Salmonella
typhimurium da linhagem TA (Teste de Kado), com plasmídeo pBCKS (Quebra de DNA plasmidial) e com enzima Exonuclease III (Detecção de sítios abásicos). Os resultados demonstraram que a lectina foi incapaz de aumentar a freqüência de mutação reversa das cepas de S. typhimurium, com e sem ativador metabólico. No entanto, uma diminuição significativa na freqüência de mutação espontânea foi observada nas cepas de E. coli, especialmente na deficiente de reparo (CC104mutMmutY), indicando um potencial antioxidante da lectina. A BmoLL é incapaz de gerar danos genotóxicos e citotóxicos, com base nas concentrações testadas e nos ensaios realizados.
ABSTRACT
Medicinal plants have been used since antiquity to treat various human diseases. The leaves of Bauhinia monandra are widely used in Brazil as herbal remedies in the treatment of Diabetes Mellitus. From the leaves of B. monandra was purified a galactose-specific lectin, called BmoLL, which also showed a significant hypoglycemic capacity. Following the proposed rules by decree No 116 of 1996/08/08 of the Ministry of Health of Brazil, the study aimed to evaluate the potential for toxicity and mutagenicity of BmoLL from the use of tests with
Escherichia coli strain CC104 (Forward mutagenesis assay) with Salmonella typhimurium strain TA (Kado test), with plasmid pBCKS (Break occurrences in plasmid DNA) and enzyme exonuclease III (Search of abasic sites). The results demonstrated that the lectin was unable to increase the frequency of reverse mutation of strains of S. typhimurium, with and without metabolic activity. However, a significant decrease in the frequency of spontaneous mutation was observed in strains of E. coli, especially in poor repair (CC104mutMmutY), indicating an antioxidant potential of the lectin. BmoLL is unable to generate genotoxic and cytotoxic damage, based on the concentrations and the tests performed.
RESUMEN
Las plantas medicinales se han utilizado desde la antigüedad para el tratamiento de diversas enfermedades humanas. Las hojas de la Bauhinia monandra se utilizan ampliamente en Brasil como phytotherapic en el tratamiento de la Diabetes Mellitus. De las hojas de B. monandra fue purificado una lectina específica de galactosa, llamado BmoLL, que también mostró una importante capacidad de reducir los niveles de glucosa en la sangre. De acuerdo con los estándares propuestos por la ordenanza n ° 116 del 08/08/1996 del Ministerio de Salud de Brasil, el estudio tuvo como objetivo evaluar el potencial de toxicidad y mutagenicidad de BmoLL mediante el uso de pruebas con la Escherichia coli cepa CC104 (Prueba de mutagénesis directa), con la Salmonella typhimurium cepa TA (prueba de Kado), con el plásmido pBCKS (Roto de ADN de plásmido) y la enzima exonuclease III (Detección de sitios abasicos). Los resultados demostraron que la lectina fue incapaz de aumentar la frecuencia de mutación inversa de las cepas de S. typhimurium, con y sin actividad metabólica. Sin embargo, una disminución significativa en la frecuencia de mutación espontánea, se observó en las cepas de E. coli, especialmente en la bacteria con sistema de reparación deficiente (CC104mutMmutY), lo que indica un potencial antioxidante de la lectina. BmoLL no es capaz de generar daños genotóxico y citotóxico, en las concentraciones y en las pruebas realizadas.
As plantas constituem uma importante fonte de produtos naturais ativos, os quais diferem em termos de estrutura e propriedades biológicas (1). Os Fitoterápicos constituem uma importante alternativa terapêutica, especialmente nos países mais pobres. Na África, a fitoterapia acaba sendo uma forma terapêutica para 4/5 da população (2). Os altos preços praticados pela indústria farmacêutica e a cultura milenar do uso dos produtos naturais no tratamento das mais diversas enfermidades são fortes pilares para o crescimento dessa alternativa terapêutica no mundo moderno.
Entre as inúmeras espécies vegetais de interesse medicinal encontram-se as plantas do gênero Bauhinia. O gênero Bauhinia inclui um número grande de espécies ornamentais, originadas da Ásia, bem distribuídas nas cidades brasileiras e que apresentam uma excelente aceitação por parte da medicina popular, como também, já possuem importantes propriedades farmacológicas relatadas na literatura científica (1,3).
Com o propósito de controlar o uso de fitoterápicos no território nacional, a Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde, através da portaria nº 116 de 08/08/1996, estabelece normas para o registro, comprovação da eficácia e testes de toxicidade, dentre os quais a avaliação da mutagenicidade (4).
Como muitas substâncias, presentes em plantas medicinais, expressam atividade citotóxica e genotóxica e mostram correlação com a incidência de tumores (5-10), e também considerando a grande utilização pela medicina popular das folhas
2.1 – Diabetes
Diabetes Mellitus é um grupo de distúrbios do metabolismo glicídico, no qual a glicose é subutilizada, produzindo hiperglicemia (12). O DM é classificado em quatro subtipos principais da doença: diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, outros tipos específicos de diabetes e diabetes gestacional (13). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), as doenças crônicas não transmissíveis são atualmente a principal causa de mortalidade no mundo. O Diabetes Mellitus é considerado uma das principais doenças crônicas que afetam o homem contemporâneo, acometendo populações de países em todos os estágios de desenvolvimento econômico-social (14).
Devido a fatores como: o aumento da expectativa de vida, a urbanização crescente, o sedentarismo, a obesidade e a adoção de estilo de vida moderno, caracterizado pela alimentação hipercalórica e ricas em hidratos de carbono de absorção rápida, a incidência e prevalência de Diabetes estão aumentando no mundo todo, alcançando proporções epidêmicas. Pelo impacto social e econômico, tanto em termos de produtividade quanto de custos, o DM vem sendo reconhecido, em vários países, como problema de saúde pública com reflexos sociais importantes (14).
ocorra uma redução na expectativa de vida em decorrência da doença em 15 anos para o DM tipo 1 e de 5 - 7 anos para os DM tipo 2 (15,16).
2.2 – Plantas Medicinais
O uso de espécies vegetais na cura de doenças remonta ao início da civilização, desde o momento em que o homem despertou a consciência e começou um longo percurso no manuseio, adaptação e modificação dos recursos naturais para o seu próprio benefício. Essa prática milenar, atividade humana por excelência, ultrapassou todas as barreiras e obstáculos durante o processo social, cultural e evolutivo chegando até os dias atuais, sendo utilizada por grande parte da população como fonte de recurso terapêutico. É admirável que este conjunto de conhecimentos fitoterápicos tenha subsistido por milênios e as plantas medicinais sejam utilizadas em todos os países, tanto desenvolvidos como em desenvolvimento. Nos primeiros, constituindo matéria-prima para a produção industrial de derivados químicos puros, já nos países em desenvolvimento, são utilizados em sua forma bruta, no tratamento das mais diversas enfermidades (17).
As condições sócio-econômicas da população associada à vasta flora medicinal brasileira têm levado um número crescente de pessoas a fazerem uso de extratos de partes de plantas, como folhas, no tratamento de determinadas doenças, como é o caso do diabetes. Destacando que poucos remédios, ditos naturais, para o tratamento do diabético tiveram seu valor terapêutico comprovado, bem como as suas atividades citotóxicas e mutagênicas analisadas.
2.3 – Bauhinia monandra
As plantas do gênero Bauhinia, distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do hemisfério ocidental e oriental, compreendem um conjunto de aproximadamente 300 (trezentas) espécies. No Brasil, as plantas do gênero
Bauhinia são conhecidas popularmente como “Pata-de-vaca” ou “Unha-de-boi” (1). As folhas, caules e raízes das espécies de Bauhinia, especialmente, B.
manca, B. rufescens, B. forficata, B. cheitantha e B. splendens, são amplamente utilizadas no Brasil e em outros países sob forma de chá e outras formas de uso para o tratamento de várias enfermidades (1).
Estudos fitoquímicos realizados com as espécies desse gênero têm mostrado a presença de importantes compostos orgânicos de interesse medicinal na sua constituição, entre eles: alcalóides, lactonas, flavonóides, terpenóides, esteróides, triterpenóides, taninos, quinonas e outros. Embora muitos compostos sejam conhecidos, pouco se conhece sobre a atividade farmacológica da maioria das substâncias isoladas do gênero Bauhinia(1).
B. guianensis (21), antiulcerogênica da B. racemosa (22), Antitumoral da B. variegata (23), analgésica da
B. splendens (24), e de estimular a função tireoidiana por parte da B. purpúrea (25). A ação hipoglicemiante foi observada em estudos realizados que utilizaram extratos de B. ungulata, B. candicans, B. megalandra e B. forficata (27-29).
ratos, um extrato hidroalcoólico por via oral e observar a redução da glicemia através do teste da glicose-oxidase. Recentemente, Menezes e colaboradores (34) observaram a capacidade do extrato aquoso na concentração de 10% (g/v) dessa espécie em reduzir a glicemia de camundongos normoglicêmicos, esta mesma resposta foi observada por Minto e Pereira (35).
Análise Fitoquímica realizada por Macedo e colaboradores (36), nos extratos aquoso e alcoólico de folhas de B. monandra, detectou a presença de diversos compostos orgânicos que podem estar diretamente relacionados à capacidade hipoglicemiante. Na triagem fitoquímica, foi detectado a presença de lactonas, esteróides, triterpenóides, alcalóides, taninos, flavonóides e outros. A presença de flavonóides e esteróides na constituição da B. monandra também foi descrita por Argolo e colaboradores (37) em trabalho realizado com extrato etanólico das folhas secas, através da metodologia descrita por Soler-Rivas e colaboradores (2000), onde identificou a capacidade antioxidante desta espécie.
2.4 - Lectina de Folha de Bauhinia monandra (BmoLL)
Estas proteínas, de origem não-imunológica, apresentam ampla distribuição na natureza, participando de numerosos processos celulares através de suas características estruturais e mecanismos de interação, tendo as plantas a principal fonte de obtenção (3). As lectinas de origem vegetal são classificadas em merolectinas, hololectinas, quimerolectinas e superlectinas (42,43). Os ensaios de hemaglutinação e inibição da hemoaglutinação são, respectivamente, os métodos empregados na detecção da proteína e da sua afinidade a um determinado carboidrato específico (44,45).
Na literatura, existem diversos trabalhos que reportam a capacidade de certas lectinas atuarem como agentes estimuladores da linfocitose humana (51), na atividade anti-tumoral (45, 52, 53), na atividade anti-bacteriana (54), como agentes anti-mutagênicos (55) e como responsáveis pelos processos de sinalização necessários à metabolização da glicose (56). Macedo e colaboradores (57) observaram a capacidade da BmoLL como agente larvicida contra Zabrotes subfasciatus e Callosobruchus
maculatus. A lectina obtida das folhas de B. monandra também apresentou uma importante ação hipoglicemiante em ratos normais e diabéticos após 4 (quatro) horas seguintes a sua administração por via oral (50).
2.5 – Testes de genotoxicidade e citotoxicidade
As mutações podem ser gênicas ou cromossômicas. Mutações gênicas são aquelas que ocorrem em nível de gene, podendo afetar um único par de nucleotídeos ou mais pares de bases de um único gene, alterando ou não o polipeptídeo por ele codificado. Nessa classe estão as substituições de pares de bases, inserções e deleções (58). Já as mutações cromossômicas podem afetar vários genes. Essa classe se constitui por alterações tanto no número quanto na estrutura dos cromossomos (59). É importante ressaltar ainda, a correlação existente entre mutagênese (produção de mutação) e carcinogênese (produção de câncer) (58). As substâncias químicas carcinogênicas podem ser classificadas em dois
taxa de mitogênese, contudo existem substâncias químicas denominadas de carcinógenos completos, que são capazes tanto de lesar o DNA, quanto estimular a mitogênese (59,60).
2.5.1 – Teste de Kado
Na avaliação toxicológica de fitoterápicos, o teste desenvolvido por Ames (61) e modificado por Maron e Ames (62) vem sendo muito empregado para detecção de danos ao material genético através da utilização da Salmonella typhimurium em trabalhos in vitro, com e sem a presença de ativador metabólico (S9 mix) num ambiente de microssuspensão. Estudos mostram uma forte sensibilidade do teste na detecção da grande maioria dos compostos mutagênicos (63-65). Com o intuito de aumentar a sensibilidade do testes de Ames, Kado e colaboradores (66) desenvolveram uma metodologia baseada no aumento da quantidade de bactéria e na redução da quantidade de amostra a ser tratada. Esta modificação proporcionou um incremento na sensibilidade de aproximadamente 10 vezes quando comparada à metodologia de Maron e Ames (62), ficando conhecida como teste de Kado.
analisadas, com ou sem ativador metabólico, já é suficiente para caracterizar a substância testada como mutagênica.
A literatura reporta a utilização do teste de Ames, na avaliação do potencial mutagênicos de diversos compostos de origem natural, como os extratos da
Chrysobalanus icaco (68), Schinus terebinthifolius (69), Aplysina fulva (70), Byrsonima crassa (71), Ocotea duckei (72), Helichrysum herbaceum, Helichrysum regulosum e Helichrysum simillimum (73). Entre as plantas do gênero Bauhinia, somente existe relatos da realização do teste de Ames para detecção de atividade mutagênica no extrato aquoso de folhas da espécie B. forficata (74).
Quadro 1 – Características genéticas das linhagens de S. typhimurium mais comumente utilizadas no teste de Ames segundo Mortelmans e Zeiger (75).
TA1535 TA1537 TA1538 TA97 TA98 TA100 TA102 TA104
Mutação
his1 hisG46 hisC3076 hisD3052 hisD6610 hisD3052 hisG46 hisG428 hisG428
Tipo de
Mutação SPB
2 DQL3 DQL3 DQL3 DQL3 SPB2 SPB2 SPB2
Alvo da
Mutação GC GC GC GC GC GC AT AT
TRE4 20-35 5-25 15-35 90-180 25-75 75-225 240-320 245-475
LPS5 Rfa rfa rfa rfa rfa rfa rfa rfa
Reparo ∆uvrβ6 ∆uvrβ6 ∆uvrβ6 ∆uvrβ6 ∆uvrβ6 ∆uvrβ6 + ∆uvrβ6
Mutação para
Biotina bio
- bio- bio- bio- bio- bio- + bio
-Plasmídio - - - PKM101 PKM101 PKM101 PKM101 e
PAQ1 PKM101
1
his – mutação responsável pela síntese da histidina; 2 SPB – Substituição de pares de bases; 3 DQL – Deslocamento do quadro de leitura; 4 LPS – permeabilidade da membrana de lipossacarídeos; 5 TER – Taxa de reversão expontânea (número de colônias); 6
2.5.2 – Ensaio de Mutagênese direta
A avaliação do potencial mutagênico de um determinado composto pode ser obtida através do uso de espécies bacterianas que apresentam mutações pontuais conhecidas. Uma linhagem bacteriana derivada da Escherichia coli, denominada de CC, tem um importante papel na detecção da mutagenicidade pelo fato de apresentarem mutações no códon para o ácido glutâmico, o que possibilita a detecção de mutagenicidade através de dois sistemas: mutagênese reversa com o gene lacZ e mutagênese direta com o gene rpoB (76).
A detecção da mutagenicidade através do sistema de mutagênese direta consiste na exposição de cepas da linhagem CC a um meio enriquecido com rifampicina, e posterior observação do crescimento de colônias mutantes. O ensaio fundamenta-se na capacidade que a rifampicina tem de ligar-se a subunidade β da
enzima RNA polimerase, inibindo com isso a transcrição de genes importante para codificação de proteínas indispensáveis para sobrevivência bacteriana. O processo mutacional responsável pelo crescimento de colônias no meio com rifampicina é resultado de uma mutação por substituição de bases no gene rpoB, o qual é responsável pela codificação da subunidade β da RNA polimerase (77).
mutação espontânea (transversões do tipo G→T) devido ao acúmulo de
8-oxo-7-hidrodesoxiguanosina no DNA (58). Já a deficiência de MutY-glicolase proporciona um acúmulo de falhas por emparelhamentos errôneos de bases nitrogenadas e também uma deficiência no processo de sinalização de sítios abásicos (78).
O teste de mutagênese direta também permite avaliar a citotoxicidade do composto em estudo, através da análise da sobrevivência bacteriana após o tratamento em relação ao controle. Nesse caso, as cepas CC104 e CC104mutMmutY foram tratadas e distribuídas num meio contendo estreptomicina e tetraciclina/canamicina, respectivamente.
Não existem relatos na literatura referentes à utilização do ensaio de mutagênese direta para detecção de eventos mutacionais desencadeados por lectinas ou extratos de plantas do gênero Bauhinia. Entre os trabalhos publicados, o ensaio foi usado na avaliação mutagênica do óleo de coco (79), da Schinus
terebinthifolius(69, 80) e da Eugenia caryophyllata(81).
2.5.3 – Teste de genotoxicidade in vitro com DNA plasmidial
A avaliação da genotoxicidade através da realização de testes em in vitro pode ser obtido através do uso de plasmídeos. Os testes se fundamentam na capacidade que algumas substâncias químicas apresentam de quebrar as ligações fosfodiéster do DNA, produzindo alterações na conformação plasmidial. O mesmo plasmídeo tratado pode ser submetido a outros que possuem a capacidade de detectar outros tipos de lesões que não chegam a quebrar a fita de DNA, como os testes da transformação bacteriana com cepas DH5α ou DH10β e o ensaio para
O plasmídeo é uma molécula circular dupla de DNA capaz de se reproduzir independentemente do DNA cromossômico. O pBCKS (pBluescript II KS) apresenta 3400 pares de base, sendo produzido a partir do pUC19. O plasmídeo apresenta um gene de resistência ao clorafenicol, o que permite a seleção do vetor em bactérias e contém o gene lacZ, o qual pode ser usado como alvo para mutagênese, uma vez que pode estabelecer α complementação em bactérias com genótipo lacZ∆M15 (80).
Artigo Publicado na Revista Food and Chemical Toxicology (ISSN: 0278-6915)
Qualis CAPES: B1 em Medicina II. Fator de impacto: 2,186.
Publicado em Fevereiro de 2009, volume 47, páginas 303-308.
5.1 – Participação como autor em artigo científico, cujo tema tem correlação com o abordado no projeto de dissertação.
Artigo Publicado na Revista Brasileira de Farmacognosia (ISSN: 0102-695X)
Qualis CAPES: B5 em Medicina II.
Publicado em Out/Dez de 2008, volume 18, páginas 509-516.
5.2 – Resumos Publicados em Anais de Congressos e Simpósios
5.2.1 - EVENTOS INTERNACIONAIS
Evaluation of mutagenic potential of Bauhinia monandra leaf lectin (BmoLL) by Salmonella microsuspension mutagenicity assay, 2007. 6º International Congress of Pharmaceutical Sciences;
Avaliação do extrato aquoso de folhas de Bauhinia monandra quanto ao caráter genotóxico, 2006. 12º Congreso de la Asociación Latinoamericana de Genética;
Assessment of genotoxic activity of the BmoLL lectin obtained and purified from leaves of Bauhinia monandra, 2006. 3rd International Symposium in Biochemistry and Biotechnology;
Evaluation genotoxic and citotoxic potential of the extract Bauhinia monandra, 2006. 3rd International Symposium in Biochemistry and Biotechnology;
Caracterização fitoquímica do extrato de Bauhinia monandra, 2007. 34º Congresso Brasileiro de Análises Clínicas;
Análise do potencial de quebras de ligações fosfodiéster do DNA e avaliação citotóxica do extrato de Bauhinia monandra, 2007. 34º Congresso Brasileiro de Análises Clínicas;
Análise de micronúcleo em Allium cepa após tratamento com infuso hipoglicemiante das folhas da Bauhinia monandra, 2007. 53º Congresso Brasileiro de Genética;
Análise de mutagenicidade do extrato aquoso de Bauhinia monandra frente ao Teste de Kado, 2007. VIII Congresso Brasileiro de Mutagênese;
Avaliação genotóxica do infuso das folhas Annona muricata L. utilizada popularmente como anti-cancerígeno, 2006. 33º Congresso Brasileiro de Análises Clínicas;
Genotoxic Evaluation of Bauhinia monandra Infusion and Lectin from Leaves, 2006. XXXV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular (SBBq);
Triagem Fitoquímica do extrato alcoólico e aquoso das folhas de Bauhinia monandra, 2006. XIX Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil;
5.2.3 - EVENTOS REGIONAIS
Avaliação genotóxica do infuso da Bauhinia monandra frente a lectina BmoLL extraída e purificada de suas folhas, 2006. XVII Encontro de Genética do Nordeste;
6.1 - Certificados de Honra ao Mérito por trabalhos premiados em congressos/Simpósios:
6.1.1 - 4º Congresso Regional de Analises Clinicas do Nordeste, 2005.
Resumo:
ANÁLISE DO POTENCIAL GENOTÓXICO DA LECTINA BMOLL EXTRAÍDA DA Bauhinia monandra.
Márcia F. S. Macedo1 *; Herbert A. A. A. C N. Sisenando1; Aurizângela O. Sousa1; Silvia R. B. Medeiros1; Ana C. R. D. Saturnino1; Luana C. B. B. Coelho2 1 – Universidade Federal do Rio Grande do Norte 2 – Universidade Federal de
Pernambuco
6.1.2 - 3rd International Symposium in Biochemistry and Biotechnology, 2006.
Resumo:
EVALUATION OF GENOTOXIC AND MUTAGENIC POTENTIALS FROM WATER TREATED WITH Moringa oleifera SEED FLOUR
Lucíola A. D. M. M. Rolim1, Márcia F. S. Macedo2, Herbert A. A. A. C. N. Sisenando2, Luana C. B. B. Coelho1, Silvia R. Batistuzzo de Medeiros2, Patrícia M. G. Paiva1 1 laboratório de Glicoproteínas, UFPE, recife; 2 Laboratório de Biologia Molecular e
Genômica, UFRN, Natal.
Seed flour from Moringa oleifera is widely used in developing countries as a natural coagulant for water treated. Lectin and antimicrobial activities were already detected in water treated with M. oleifera seeds. The aims of this work were to evaluated the genotoxic effect and mutagenic potential of water treated with M. oleifera seed flour according to established protocol. Aliquots of water containing 0.0125, 0.05, 0.2 or 0.8 µg of seed flour/µl were analyzed. Genotoxicity was evaluated by DNA plasmid
assay. Mutagenicity was measured according to Kado test using Salmonalla typhimurium TA97, TA98, TA100 and TA102. plasmid DNA assay revealed by electrophoresis that there was no break of phosphodiester bonds in DNA molecule. Kado test did not show any mutation effect, by frameshift (TA97 and TA98) or base substitution (TA100 and TA102). These preliminary results indicated that water treated with M. oleifera seed flour was not genotoxic nor mutagenic in studied concentrations. However, other mutagenic assays must be perfomed with soluble active principles to guarantee the security to population of this water treatment.
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