RESSALVA
Atendendo solicitação da autora, o texto
completo desta dissertação será
Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada
Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3811-6148 Fax (14) 3811-6148 posgraduacao@ibb.unesp.br
Campus de Botucatu Instituto de
Biociências PG-BGA
DIAGNÓSTICO MORFOLÓGICO E MOLECULAR DE
Haemonchus
spp. EM BOVINOS E OVINOS.
MARIA REGINA LUCAS DA SILVA
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia de Parasitas e Microorganismos.
Prof. Titular Dr. Alessandro Francisco Talamini do Amarante Orientador
Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada
Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3811-6148 Fax (14) 3811-6148 posgraduacao@ibb.unesp.br
Campus de Botucatu Instituto de
Biociências PG-BGA
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“Julio de Mesquita Filho”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU
DIAGNÓSTICO MORFOLÓGICO E MOLECULAR DE
Haemonchus
spp. EM BOVINOS E OVINOS.
Maria Regina Lucas da Silva
Bióloga
Prof. Titular Dr. Alessandro Francisco Talamini do Amarante Orientador
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia de Parasitas e Microorganismos.
Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada
Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3811-6148 Fax (14) 3811-6148 posgraduacao@ibb.unesp.br
Campus de Botucatu Instituto de
Biociências PG-BGA
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE - CRB 8/5651
Silva, Maria Regina Lucas da.
Diagnóstico morfológico e molecular de Haemonchus spp. em bovinos e
ovinos / Maria Regina Lucas da Silva. - Botucatu, 2014.
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu
Orientador: Alessandro Francisco Talamini do Amarante Capes: 21302022
1. Haemonchus. 2. Bovino - Infecções. 3. Ovino - Doenças. 4. Sistema
gastrointestinal - Doenças.- Diagnóstico. 5. Diagnóstico molecular.
Palavras-chave: Bovinos; Diagnóstico; Haemonchus spp.; Ovinos; Parasita
I
II
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus, que me deu força, me orientou e me iluminou em todos os momentos desta caminhada.
Aos meus pais Sebastião Bernardino da Silva e Maria José Lucas da Silva e ao meu irmão José Reginaldo Lucas da Silva, pelo amor incondicional e pelo apoio que me deram.
Aos meus ex-professores e também amigos, Elza Amélia de Souza, Mauro Oswaldo Medeiros e Sueli Maria Alves que sempre me apoiaram e me incentivaram a seguir em frente, além da ajuda financeira que me forneceram nos momentos de dificuldades. Não tenho palavras para expressar a gratidão que tenho por tudo que fizeram por mim.
Ao meu orientador Alessandro Francisco Talamini do Amarante, pela oportunidade, ensinamentos, paciência e compreensão.
Aos pós-graduandos do Laboratório de Helmintologia Veterinária, César Cristiano Bassetto, José Henrique das Neves, Maurício Orlando Wilmsen, Michelle Cardoso dos Santos e Nadino Carvalho e ao aluno de iniciação cientifica Jorge Konrado Xavier.
Aos professores e funcionários do Departamento de Parasitologia, em especial, a Profª Mônica Regina Vedrame do Amarante, pela orientação na parte molecular do projeto e aos funcionários Alessandra Ragozo, Valdir Ângelo Paniguel, Roberto Gonzales e Olga Demant.
Aos professores Katia Denise Saraiva Bresciani, Lucia Helena O’Dwyer de Oliveira, Raimundo Souza Lopes, Reinaldo José da Silva por aceitarem a serem membros de minha banca de qualificação e defesa.
À Rosânea Menezes de Souza e Vanessa Stramantinoli Rossi por compartilharem a residência comigo e por terem me aguentado durante todo este período.
As minhas amigas Fabíola Maria Belmonte Dourado, Gislene Lopes Maciel e Jacqueline Cruz Neves pela amizade, companheirismo e pelo apoio mesmo que distante.
A Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela bolsa concedida.
1
RESUMO
Infecções por nematódeos gastrintestinais causam consideráveis perdas na pecuária.
Haemonchus spp. é o principal nematódeo que acometem bovinos e ovinos principalmente em
regiões tropicais e subtropicais. Portanto este estudo teve por objetivo avaliar metodologias de diagnóstico baseado em analises morfológicas e moleculares de larvas infectantes e adultos de
Haemonchus spp. Foram utilizados 23 bezerros e 20 cordeiros naturalmente infectados por
nematódeos gastrintestinais. Antes da necropsia dos animais, fezes foram coletadas para realização de coproculturas e obtenção de larvas infectantes, que foram morfometricamente analisadas. Logo após o sacrifício dos animais, os abomasos foram removidos e congelados, para posterior recuperação dos exemplares de Haemonchus spp. que foram armazenados em
álcool 70º. No caso dos ovinos, os parasitas permaneceram estocados em alcool 70º por mais de um ano antes de serem analisados, enquanto que os parasitas dos bovinos foram armazenados por apenas quatro meses. O diagnóstico morfológico dos Haemonchus machos
foi realizado por meio da análise de sínlofe e mensuração de espículos. Os mesmos parasitas utilizados na análise morfológica foram submetidos à análise molecular, com utilização da PCR, com os primers 52/154, 75/86 e Hplacbotu. A técnica padrão ouro para identificação de
Haemonchus similis foi análise de espículos e para Haemonchus placei foi PCR com os
primes HplacBotu. Todas as amostras de ovinos foram consideradas como sendo de
Haemonchus contortus, devido à especificidade parasitária e nenhuma evidencia de outras
espécies de Haemonchus nas análises moleculares. Os resultados demonstraram diferença
estatística no comprimento da distância entre o final da L3 e o final da bainha das larvas infectantes das três espécies. Houve sobreposição de medidas de apenas 1,26% entre as espécies H. placei e H. contortus. Na análise de espículo foram observadas algumas
sobreposições de medidas que ocasionaram erros na identificação específica de H. placei e H. contortus. Em relação à sínlofe, a maioria das amostras de H. placei e H. similis apresentaram
34 cristas na junção esôfago intestino, entretanto na metade do corpo houve uma grande variação no número de cristas para essas duas espécies. A sínlofe de H. contortus demonstrou
algumas irregularidades no padrão de cristas o que dificultou o diagnóstico específico. Além disso, foi observada que a sínlofe de parasitas armazenado em álcool 70º por mais de um ano estava degradada. Nas análises moleculares o par de primer 52/54 amplificou 94,43% das
amostras de Haemonchus similis. Muitas amostras de H. similis, H. placei e H. contortus
utilizadas no estudo não amplificaram com os primers 75 e 86. O par de primer Hplacbotu
amplificou todas as amostras de H. placei e nenhuma amostra das outras duas espécies. Em
2
pode ser usado como método para identificar inequivocadamente larvas de H. similis e para
indicar se H. contortus e H. placei estão presentes em uma população. Em adição novos
estudos são necessários para aperfeiçoar técnicas de biologia molecular e consequentemente permitir a identificação correta das espécies de Haemonchus. A associação de métodos
morfológicos, tais como análise de espículo e sínlofe, permite reduzir o risco de identificação incorreta principalmente de H. contortus e H. placei.
3
ABSTRACT
Nematodes gastrointestinal infection causes considerable losses in the livestock industry. Haemonchus spp. is major nematode that affects cattle and sheep mainly in tropical
and subtropical region. Therefore, the aim of the present study was to assess diagnosis methodologies based in morphological and molecular analysis of infective larvae and adults
of Haemonchus spp. Twenty-three calves and twenty lambs naturally infected with
gastrointestinal nematodes were utilized. Before necropsy of animals, faecal samples were collated for preparing faecal cultures and obtaining infective larvae that were morphometrically analyzed. After the euthanasia of animals the abomasums were removed and frozen for posterior recovered Haemonchus specimens that were stored in alcohol 70º. In
the case sheep, the parasites remained stored in alcohol 70º for more than one year before be analyzed, while the parasites of cattle were stored for only four months. The morphological diagnosis of males Haemonchus spp. was released by synlophe analysis and spicule
measurements. The same parasites used in the morphological analysis were submitted in the molecular analysis, using PCR, with primers 52/159, 75/86 and HplacBotu. The “gold
standard” method used to identify Haemonchus similis was spicules analysis and to identify
Haemonchus placei was PCR with the primers HplacBotu. All Haemonchus specimens
recovered from sheep were assumed to be Haemonchus contortus based on host specificity,
and because the molecular analysis did not show any evidence of other Haemonchus species.
The results presented statistic differences in the sheath tail length of infective larvae of three species. There was overlapping of measurements was only 1.26% between H.contortus and H. placei. In the espicule analysis also were observed same overlapping of measurements that
caused misidentification of H. placei and H. contortus. In relation the synlophe most samples
of H. placei and H. similis presented 34 ridges in the esophageal-intestinal-junction. However,
in the midbody there was great variation in the ridges number for these two species. In the synlophe of H. contortus was observed same irregularities in the ridges pattern, that difficult
specific diagnosis. In addition, was observed that synlophe of parasites stored in alcohol 70º for more than one year appeared degraded. In the molecular analysis the primer par 52/54 amplified 94.43% of H. similis samples. Many samples of H. placei, H. similis and H.
contortus did not show PCR product with primers 75 and 86. The par primer HplacBotu
amplified all H. placei samples and no samples of the other two species. In conclusion, the
sheath tail extension analysis of infective larvae can be used to identify unequivocally larvae of H. similis and to indicate if H. contortus and H. placei are present in a population. In
4
allowing the accurate diagnosis of Haemonchus species. The association of morphological
methods such as spicule and synlophe analysis should be useful to reduce the misidentification principally of H. contortus and H. placei.
6
1. Considerações iniciais
O Brasil atualmente ocupa lugar de destaque na produção e exportação de carne bovina, porém as infecções por nematódeos gastrintestinais se constituem em grande problema sanitário. Além de prejudicarem o ganho em peso, podem causar mortalidade, principalmente de animais jovens, que somente apresentam resposta imunológica eficiente às infecções com aproximadamente 18 meses de idade (BIANCHIN et al., 1995, CATTO et al., 2005, CATTO et al., 2009).
Em relação à ovinocultura, o Brasil possui clima favorável e grande extensão territorial, entretanto, as infecções parasitárias também consistem em entrave relevante para a expansão da produção. Nos ovinos, além de acometerem os animais jovens, os nematódeos também representam problema considerável para fêmeas no periparto, devido a sua baixa imunidade (AMARANTE et al., 1992).
Estudos realizados no Brasil relataram a presença de várias espécies de nematódeos gastrintestinais parasitando bovinos, sendo elas: Cooperia punctata, Cooperia pectinata, Cooperia spatulata, Haemonchus placei, Haemonchus similis, Haemonchus contortus,
Trichostrongylus axei, Trichostrongylus colubriformis, Oesophagostomum radiatum,
Ostertagia ostertagi, Ostertagia lyrata, Strongyloides papillosus, Trichuris discolor,
Trichuris globulosa, Bunostomum phlebotomum e Capillaria bovis (CATTO et al., 1993,
AMARANTE et al., 1997, BORGES et al., 2001, BRESCIANI et al., 2001, SANTOS et al., 2010). Em ovinos são relatadas as seguintes espécies: C. punctata, C. pectinata, C. spatulata, Cooperia curticei, Cooperia oncophora, H. contortus, T. axei, T. colubriformis, O. ostertagi,
Teladorsagia circuncincta, Oesophagostomum venulosum, Trichuris ovis e Nematodirus
spathiger (AMARANTE et al.,1997, RAMOS et al., 2004).
Dentre estas se destacam as espécies de Haemonchus, que além de serem muito
prevalentes, em todas as regiões do país (CATTO e UENO, 1981, AMARANTE et al., 1997, LIMA, 1998, BORGES et al., 2001, NETO e FONSECA, 2002, SANTOS et al., 2010), causam sérios danos aos animais, devido ao hábito hematófago dos parasitas que em infecções pesadas ocasionam anemia severa, edema submandibular, perda de apetite e, consequentemente, redução no ganho em peso (GENNARI et al., 1991). Portanto, a haemonchose é causa importante de prejuízos econômicos na bovinocultura e ovinocultura.
As espécies de Haemonchus estão envolvidas em relatos de resistência
anti-helmíntica. Nos Estados Unidos, Gasbarre et al. (2009) observaram H. placei e H. contortus,
7
de ovinos, com múltipla resistência a benzimidazóis, levamisole, ivermectina, moxidectina e closantel. Em bovinos a situação também é preocupante, estudos recentes comprovam que espécies de Haemonchus são resistentes a muitos anti-helmínticos em várias regiões do país
(PAIVA et al., 2001, RANGEL et al., 2005, MELO et al., 2006, SOUTELLO et al., 2007, SOUZA et al., 2008).
19
4. Considerações finais
Em muitos estados brasileiros não existem dados epidemiológicos consistentes relacionados com a haemonchoses em ruminantes. Devido à grande importância econômica da doença para a pecuária brasileira está é uma situação inaceitável. O problema é agravado pela ausência de uma metodologia padronizada para diferenciação de H. contortus e H. placei. Portanto a identificação correta das espécies é indispensável (AMARANTE, 2011).
A padronização de metodologias para o diagnóstico de Haemonchus spp. é essencial
para identificação correta das espécies e consequentemente para conhecimento da epidemiologia do parasita e escolha do tratamento anti-helmíntico a ser empregado.
Presume-se que seja possível a identificação precisa das espécies de Haemonchus em
análises de larvas infectantes com técnicas morfológicas e moleculares, o que evitaria o sacrifício dos animais em estudos de resistência e epidemiologia.
O Capítulo 2 da dissertação intitulado “Morphological and molecular identification of
Haemonchus species in ruminants naturally infected with nematodes” teve por objetivo
