“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA
Eloise Brasil de Moraes
Epidemiologia Molecular e Estudo da Diversidade
Genética da Tuberculose no Estado de São Paulo
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais.
Orientadora: Profa. Dra. Ida Maria Foschiani Dias Baptista
Botucatu
Eloise Brasil de Moraes
Epidemiologia Molecular e Estudo da
Diversidade Genética da Tuberculose
no Estado de São Paulo
Dissertação apresentada à
Faculdade de Medicina,
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais.
Orientadora: Profa. Dra. Ida Maria Foschiani Dias Baptista
Botucatu
Dedico este trabalho aos meus pais: Edson Luis de Moraes, pelo exemplo de trabalho, iniciativa e perseverança que tanto admiro e Teresinha de Jesus Brasil de Moraes, a mulher mais forte que conheço, por toda sua coragem e fé, pelo enorme coração que carrega e por ser minha maior incentivadora.
A memória dos meus queridos avós José Brasil e Nair Gil Brasil.
Alicerces de uma família que fez de mim o que sou hoje.
Agradeço a Deus pela minha vida.
A minha orientadora Dra. Ida Maria, por todos os ensinamentos, por depositar sua fé e confiança em mim e na minha capacidade, pelo incentivo durante o caminho, pela compreensão e paciência. Pelo carinho e apreço que sempre demonstra por seus alunos. Por se tornar minha amiga Ida.
Ao meu querido namorado Alisson, por sempre estar presente, pela capacidade incansável de me fazer rir, por ser meu companheiro e amigo, meu porto seguro. Pelo amor e carinho compartilhados nesses seis anos que tanto me fortalecem.
A companheira de jornada e desde então minha amiga, Amanda "Finardi", por todos os momentos compartilhados. Pela valiosa ajuda dentro e fora do laboratório. Pelas conversas científicas, filosóficas e banais. Foi um honra compartilhar com ela todas as dificuldades e sucessos, tristesas e alegrias. Sem uma amiga como ela por perto seria tudo muito mais difícil.
A também amiga de todas as horas, Bia Sartori, por compartilhar ensinamentos e dividir todos os momentos bons e ruins, por todas as conversas e músicas terapêuticas e por sempre ter bons e sábios conselhos a dar.
A minhas eternas amigas-irmãs kel, Gra e Má por sempre me incentivarem nessa caminhada.
A amiga Letícia Slompo que dividiu conosco essa jornada e contribuiu muito para a realização desse trabalho.
As amigas Pri Medeiros e Babi Amorim por dividirem esse mesmo barco desde o começo. Pelas conversar descontraídas de laboratório e nas incansáveis idas e vindas a Botucatu.
agradecer demais ter crescido com um grande amigo. Obrigada por dividir mais esse momento comigo.
Ao meu querido Fefezinho, meu sobrinho, pessoinha que me enche de alegria e amor imensurável, que ilumina meus dias e me faz querer ser uma pessoa melhor a cada dia.
A toda minha família amada, meus padrinhos, Genésio Brasil e Lurdinha Brasil, tios Mané e Madalena, primos Eder, Roberta, Eduardo e Danúbia Brasil. Mimos Enrico e Eric. Por sua presença e carinho sempre.
A Juliana Reategui por também ter se tornado minha amiga e por tantas vezes ouvir meus desabafos.
A toda Família Farago, Vô Tereza, sogra Ana e cunhada Alessana por se tornarem minha família também e por sempre torcerem pelo meu sucesso. Serei eternamente grata por tanto carinho e cuidado que todos têm por mim.
A equipe do Instituto Adolfo Lutz de Bauru, Luciana, Virgínia, e Mara pela colaboração e carinho ao me receber no laboratório.
A Pqc. Heloisa da Silveira Paro Pedro e Rosângela do Instituto Adolfo Lutz São José do Rio Preto pela colaboração neste trabalho.
A Marcia Simonetti por intermediar e auxiliar na autorização de acesso ao banco de dados do Centro de Vigilância Epidemiológica que muito contribuiu para a realização deste trabalho.
A Monica Silveira também pela colaboração na realização deste trabalho.
A Profa Alexandrina Sartori pelo incentivo e disponibilidade sempre dispensado desde o início.
A Seção Técnica de Pós-Graduação, especialmente a secretária Bruna Jorgetto pela gentileza e atenção de sempre com os alunos.
Ao Dr. Ricardo Cavalcante e Dr. Carlos Magno pela contribuição na análise e direcionamento da parte epidemiológica deste trabalho.
A todos que de certa forma colaboraram ou acompanharam meu crescimento pessoal e profissional durante essa caminhada.
“A PERFEIÇÃO
O que me tranquiliza é que tudo o que existe, existe com uma precisão absoluta. O que for do tamanho de uma cabeça de alfinete não transborda nem uma fração de milímetro além do tamanho de uma cabeça de alfinete. Tudo o que existe é de uma grande exatidão. Pena é que a maior parte do que existe com essa exatidão nos é tecnicamente invisível. Apesar da verdade ser exata e clara em si própria, quando chega até nós se torna vaga pois é tecnicamente invisível. O bom é que a verdade chega a nós como um sentido secreto das coisas. Nós terminamos
adivinhando, confusos, a perfeição.”
Clarice Lispector A descoberta do mundo, 1968
(A igualdade serve) para agravar e tornar mais amarga a desigualdade real que nunca pode ser eliminada e que a ordem civil estabelece, tanto para benefício dos que têm de viver em uma condição humilde como dos privilegiados.
A tuberculose (TB) é uma importante causa de mortalidade, sendo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) o agente etiológico. O estudo da epidemiologia
molecular associada à epidemiologia clássica propicia a compreensão da disseminação de M. tuberculosis e auxilia na investigação epidemiológica, determinando surtos e fatores de risco para a transmissão na população. Este estudo teve como objetivo fornecer uma visão mais apurada sobre a epidemiologia molecular e a diversidade genética de M. tuberculosis pela técnica de MIRU-VNTR e
Tuberculosis (TB) is a major cause of mortality, and Mycobacterium tuberculosis
(M. tuberculosis), the causative agent. The study of molecular epidemiology
associated with classical epidemiology, provides an understanding of the spread of
M. tuberculosis and ads in epidemiological investigation, determining outbreaks
and risk factors for transmission in the population. This study aimed to provide a more accurate view of the molecular epidemiology and genetic diversity of M. tuberculosis by MIRU-VNTR technique and get a better understanding of the
Figura 1: Taxas de incidência de tuberculose estimados, 2014. _______________________ 24
Figura 2: Coeficiente de incidência de TB. Brasil, 2005- 2014. Fonte: Sistema de informação de agravos de notificação (SINAN); Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) _______________________________________________________________________ 25
Figura 3: Casos novos de tuberculose e coeficiente (por 100 mil hab) de incidência no Estado de São Paulo, 1998 a 2014 (15) _____________________________________________ 26
Figura 4: Porcentagem da meta atingida dos sintomáticos examinados por região do Estado de São Paulo, 2009 a 2013 (15) _____________________________________________ 27
Figura 5: Esquema da técnica de Spoligotyping (72) __________________________________ 38
Figura 6: Distribuição geográfica global das principais linhagens de M. tuberculosis
baseado em dados de Spoligotyping no SITVITWEB(73). _____________________________ 39
Figura 7: Posição dos 41 MIRU no cromossomo de M. tuberculosis H37Rv. Primeiro
número indica a posição de cada locus ocupado por um MIRU. A letra C indica a
orientação contraria a estabelecida por Cole et. al., (1998) (64). Algarismos romanos indicam o tipo de MIRU (I, II ou III). Os números seguintes indicam a localização de
cada loci. A esfera em preto indica os 12 loci com número variável de MIRU (81). _ 40
Figura 8: Diagrama dos genes deletados na LSP RDRio. Todos os elementos entre os genes Rv3346c e Rv3355c foram excisados resultando na deleção de 26,3 Kb da
sequência de DNA. Adaptado (74). ______________________________________________________ 42
Figura 9: Fórmula para cálculo da diversidade alélica segundo índice discriminatório Hunter-Gaston (HGDI) (88). ___________________________________________ 56
Figura 10: Mapa da divisão administrativa da Secretaria de Estado da Saúde dos Departamentos Regionais de Saúde (DRS). Número de casos diagnosticados e notificados pelos DRS-VI Bauru e DRS-XV SJRP incluídos neste estudo. ___________ 62
21:30. ____________________________________________________________________________________ 68
Figura 12: Árvore gerada pelo algorítimo Minimum Spanning Tree(MST) a partir de
375 isolados com perfil completo de MIRU-VNTR identificando os DRS-VI de Bauru
em vermelho e DRS-XV SJRP em azul. _________________________________________________ 72
Figura 13: Imagem destacada do ramo superior da Figura 12. Amostras destacadas de São José do Rio Preto com alta similaridade com a população de Bauru. _______ 73
Figura 14: Árvore gerada pelo algorítimo Minimum Spanning Tree (MST) a partir de
375 isolados com perfil completo de 14 MIRU-VNTR identificando as amostras
provenientes de Unidades Prisionais atendidas pelos DRS-VI Bauru e DRS-XV SJRP. ___________________________________________________________________________________________ 74
Figura 15: Eletroforese em gel de agarose 2%. À Esquerda - PCR-Multiplex RDRio dos isolados de M. tuberculosis. Nos poços 2 a 7 em azul - fragmentos de 530pb
(sem deleção) e no poço 9 em vermelho - fragmento de 1175pb (com deleção). À direita - PCR-Multiplex RD174 de isolados de M. tuberculosis. Nos poços 2, 3, 4, 5, 7
e 8 - fragmentos de 500pb em vermelho (com deleção). No poço 6 – dois fragmentos 500 e 300pb (cepa mista) e no poço 9 - fragmento de 1175pb em azul (sem deleção). Nos poços 1 e 10 para ambas as figuras - marcador de peso molecular de 100pb, conforme indicado pelas setas. ________________________________ 75
Figura 16: Árvore gerada pelo algorítimo Minimum Spanning Tree (MST) a partir de 375 isolados com perfil completo de MIRU-VNTR identificando os DRS-VI Bauru em
vermelho e DRS-XV SJRP em azul. Setas indicando a posição do cluster
Tabela 1: Iniciadores Desenvolvidos para Amplificação por PCR dos 24 MIRU-VNTR: ____________________________________________________________________________________ 51
Tabela 2: Classificação 24 MIRU-VNTR ________________________________________________ 53
Tabela 3: Distribuição do número de casos de TB por municípios segundo os
DRS s/ SP. _______________________________________________________________________________ 60
Tabela 4: Características clínicas e epidemiológicas de 530 pacientes com
tuberculose conforme o DRS de origem. ______________________________________________ 64
Tabela 5: Resistência aos tuberculostáticos em pacientes com tuberculose
conforme a região de origem. __________________________________________________________ 66
Tabela 6: Número de casos de pacientes provenientes de unidades prisionais de cada DRS discriminados por penitenciária Estadual. ________________________________ 67
Tabela 7: Relação das amostras sem amplificação para alguns marcadores em cada DRS. ______________________________________________________________________________________ 69
Tabela 8: Diversidade alélica 14 MIRU-VNTR das cepas de M. tuberculosis dos
pacientes com tuberculose do Estado de São Paulo. _________________________________ 70
Tabela 9: Número de repetições predominantes em mais de 50% em cada locus
para cada DRS. __________________________________________________________________________ 70
Tabela 10: Número de cópias dos MIRU 2 e 40 dos isolados com e sem deleção RDRio. _____________________________________________________________________________________ 76 Tabela 11: Fatores epidemiológicos, clínicos, microbiológicos e radiológicos
associados com a presença da deleção RDRio em 530 pacientes com tuberculose - análise univariada. ______________________________________________________________________ 77
DRS-XV SJRP pela análise filogenética fora do âmbito familiar. _____________________ 80
Tabela 14: Grupos de contatos identificados no estudo discriminando os perfis de
MIRU-VNTR, genótipos RD e características clínico-epidemiológicas separados por
AIDS - Acquired Immunodeficiency Syndrome - Síndrome da Imunodeficiência Adiquirida
AMK –Amicacina
BAAR - Bacilos álcool ácido resistentes
BCG - Bacillus Calmette-Guérin
CAP –Capreomicina
CIP - Cirpofloxacina
CS - Cicloserina
CSA - Ciclosporina
CTAB - N-cetyl-N,N,N,-trimethyl ammonium bromide
CVE - Centro de Vigilância Epidemiológica
DMSO - Dimetilsulfóxido
DNA - Desoxiribonucleic Acid - Ácido Desoxirribonucléico
dNTP - dNTPs- Desoxiribonucleotideos trifosfatos; refere-se a dATP, dCTP, dGTP, e dTTP
DR - Direct Repeat
DRS - Departamento Regionais de Saúde
DRS-VI Bauru - Departamento Regional de Saúde de Bauru
DRS-XV SJRP - Departamento Regional de Saúde de São José do Rio Preto
DVR - Direct Variable Repeat
EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético
EMB –Etambutol
ETH - Etionamida
EUA - Estados Unidos
HGDI - Índice Discriminatório Hunter-Gaston
HIV - Human Immunodeficiency Virus - Vírus da imunodeficiência humana
IAL-Bauru - Adolfo Lutz de Bauru
IAL-SJRP - Instituto Adolfo Lutz de São José do Rio Preto
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
INF-gama - Interferon-gama
INH - Isoniazida
IS6110 - Sequência de Inserção 6110
kb - kilobase
LAM - Latin American – Mediterranean
LSP - Large Sequence Polymorphism - Polimorfismo em Sequências Longas
LVX - Levofloxacina
M - Molar
M. tuberculosis - Mycobacterium tuberculosis
MDT-TB - Tuberculose Multirresistente
MgCl2 - Cloreto de Magnésio
MIRU - Mycobacterium Interspersed Repetitive Units
MNT - Micobactérias não tuberculosas
MST - Minnimum Spanning Tree
MTBC - Complexo Mycobacterium tuberculosis
NaCl - Cloreto de sódio
nM - milimolar
NaOH - Hidróxido de sódio
pb - pares de Base
PCR - Polimerase Chain Reaction
pmol - picomol
PPD - Purified Protein Derivatite
qsp. - quantidade suficiente para
RD - Region of Differences - Regiões de Diferenças
RDRio- Region of Difference RDRio –Região de Diferença RDRio
RFLP-IS6110 - Restriction Fragment Lenght Polymorphism - Polimorfismo do
Tamanho dos Fragmentos de Restrição baseado na IS6110
RIP - Rifampicina
RJ –Rio de Janeiro
SDS - Dodecil sulfato de sódio
SINAN - Sistema de informação de agravos de notificação
SNP - Single Nucleotide Polymorphism- Polimorfismo de Nucleotídeo Único
SP - São Paulo
Spoligotyping - Spacer-oligonucleotidetyping
STR - Estreptomicina
Taq - Thermus aquaticus
TB –Tuberculose
TBE - Tris-borato-EDTA
TE - Tris-EDTA
TRIS - 2-Amino-2-hidroxmetil-propano-1,3-diol
TSA –Teste de Sensibilidade a Drogas
Variável
XDR-Extreme Drug Resistance –Extremamente Droga Resistente
µg - microgramas
µL - microlitros
µM - micromolar
1.0 INTRODUÇÃO ... 20
1.1 História ... 21
1.2 Epidemiologia ... 23
1.3 Microbiologia ... 28
1.4 Transmissão e Patogênese ... 29
1.5 Diagnóstico e Tratamento ... 31
1.6 Co-infecção TB e HIV ... 34
1.7 Evolução Genética e Epidemiologia Molecular ... 36
2.0 JUSTIFICATIVA ... 43
3.0 OBJETIVOS ... 45
3.1 Objetivo Geral ... 46
3.2 Objetivos Específicos ... 46
4.0 Casuística e Métodos ... 47
4.1 Extração do DNA Genômico dos Isolados de M. tuberculosis: ... 49
4.2 Amplificação dos 24 lociMIRU-VNTR ... 50
4.2.1 Interpretação e Tabulação dos Resultados: ... 54
4.3 Detecção da Deleção da Região RDRio e RD174 ... 54
4.4 Análise Estatística: ... 55
4.5 Cálculo da Diversidade Alélica e Taxa de Agrupamento ... 56
5.0 RESULTADOS ... 58
5.1 População Estudada ... 59
5.2 Teste de Sensibilidade às drogas antituberculosas ... 65
5.3 Pacientes pertencentes a Unidades Prisionais...66
5.4 Diversidade genética de Mycobacterium tuberculosis no Estado de São Paulo ... 68
5.3.1 MIRU-VNTR ... 68
5.3.2 Região RDRio e RD174 ... 74
5.3.2 Análise de Cluster ... 78
6.0 Discussão ... 83
7.0 Conclusões... 94
1.1 História
A tuberculose (TB) é uma doença infecto contagiosa causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) stricto senso,
podendo também ocorrer casos de infecção por outras espécies de micobactérias do complexo M. tuberculosis (MTBC). O gênero Mycobacterium, segundo estudos,
pode ter surgido há mais de 150 milhões de anos1,2, e de acordo com registros é provável que um antigo progenitor de M. tuberculosis tenha co-evoluído com a raça
humana há cerca de 3 milhões de anos2.
Foram identificados indícios de lesões compatíveis com as de TB em múmias do antigo Egito, datadas de 3000 anos atrás1, tornando este patógeno o de maior impacto na humanidade2 matando mais pessoas do que qualquer outro agente infeccioso1,3.
A doença esteve presente em grandes civilizações da antiguidade, como na Romana e Egípcia4,5, foi identificada também nas ilhas de Bórneu (Ásia) antes da colonização européia5, e nas Américas em múmias peruanas que apresentavam lesões pulmonares semelhantes às de TB. Estes relatos indicam a presença do patógeno nestes continentes antes mesmo da chegada dos colonizadores6-9.
Em meados de 460 a.C. o termo tísica, phthisis em grego, foi um dos
primeiros a denominar a doença. Hipócrates a descrevia como a patologia que mais acometia indivíduos entre 18 a 35 anos, sendo na maioria das vezes fatal. Apesar de ter sido considerada pela maioria dos autores gregos como hereditária, Aristóteles (384-322 a.C.) já acreditava em sua natureza contagiosa. O termo
consumption que descreve o perecimento corporal também aparece em trechos
bíblicos e caracteriza o definhamento progressivo da doença1.
à Grande peste branca , como foi chamada a epidemia de TB que acometeu
presença do patógeno já era bem conhecida, sendo os colonizadores doentes os responsáveis por infectar os nativos que culminou em alta taxa de mortalidade neste período3,10.
Descrições clínicas mais precisas surgiram a partir do século XVII, como tubérculos pulmonares ou em outras partes do corpo que progrediam para úlceras e cavitação. Assim por meio da observação dos estágios da doença foi possível identificar a evolução da TB, não descartando, nesta época, a hipótese de contágio por contato íntimo3.
No século XVIII a crença popular associava a TB muitas vezes com vampirismo, visto que os indivíduos acometidos pela doença apresentavam comportamento associados a atos vampirescos, como sede e o adoecimento de familiares com contato próximo, os quais apresentavam sintomas que iam desde olhos avermelhados e inchados, sensibilidade à luz, palidez, e a tendência de expelir sangue ao tossir11.
Em 1839, Johann Lukas Scholein apresentou o termo tuberculose que descrevia a doença pela presença dos tubérculos pulmonares para separá-la de outras doenças já conhecidas, como a escrófula. No mesmo período admitiu-se que toda manifestação que apresentava tubérculos em qualquer região do corpo tratava-se da mesma doença11.
Ãté então já existia a ideia de que pequenas criaturas vivas poderiam ser
responsáveis por estas lesões e pelo desenvolvimento da TB e que consequentemente outra pessoa poderia adquirir a doença a partir da inalação daquilo que um paciente doente expelisse dos pulmões3.
Somente em 1882, Robert Koch apresentou a descoberta de M. tuberculosis
como agente causador da TB o qual ele havia isolado, cultivado e batizado de
bacilo de Koch . Este feito lhe rendeu o prêmio Nobel de Medicina em 19051.
Ao final do século 19, após a doença ter sido associada com vários aspectos como o vampirismo e até por sofrimento de amor , finalmente ela começa a ser
doente de vitima à perigosa e capaz de transmitir a doença para outros indivíduos. Em 1895 Wilhelm Konrad von Rontgen descobre o Raio-X que passa a contribuir para um melhor diagnóstico, bem como auxiliar no entendimento da progressão e na severidade da doença12.
A primeira vacina e até hoje utilizada é a Bacillus Calmette-Guérin (BCG) desenvolvida a partir de uma cepa de Mycobacterium bovis em estado atenuado,
obtida de tubérculos bovinos que não causavam a doença nos animais expostos e lhes conferia proteção contra os isolados virulentos. Essa vacina foi utilizada pela primeira vez em 1921 para humanizar crianças3.
No entanto, o avanço mais significativo durante os milhares de anos em que a TB se faz presente na história da humanidade, foi com a introdução da quimioterapia em 1944, com a utilização da estreptomicina (STR), e a partir de 1952 com a descoberta da isoniazida (INH), além de ácido para-amino-salicílico e mais tarde o etambutol (EMB) e a rifampicina (RIP)12.
1.2 Epidemiologia
Doença milenar, a TB ainda hoje se mantem como a mais mortal doença transmissível no mundo. Dados mais recentes da Organização Mundial da Saúde (OMS)13 mostram que em 2014, 9 milhões de pessoas adoeceram de TB, apesar de uma aparente diminuição nas taxas de incidência em relação aos anos anteriores e esforços para diagnóstico e tratamento efetivos. Cerca de 1,5 milhão de pessoas morreram em decorrência da doença, taxa ainda extremamente alta considerando ser uma doença tratável e curável13.
A co-infecção com HIV (Human Immunodeficiency Virus - Vírus da
Figura 1: Taxas de incidência de tuberculose estimados, 2014.
Fonte: WHO (2015)
O Brasil ainda ocupa seu lugar entre os 22 países de alta carga de TB. Apesar da perceptível diminuição na taxa de incidência, prevalência e mortalidade, segundo Boletim Epidemiológico de 2014 do Ministério da Saúde, atingindo com isto a meta do milênio proposto pela OMS para 201514.
Figura 2: Coeficiente de incidência de TB. Brasil, 2005- 2014.
Fonte: Sistema de informação de agravos de notificação (SINAN); Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE)
Figura 3: Casos novos de tuberculose e coeficiente (por 100 mil hab.) de incidência no Estado de São Paulo, 1998 a 2014
Fonte: Galesi e Fukasava (2015)
Figura 4: Porcentagem da meta atingida dos sintomáticos examinados por região do
Estado de São Paulo, 2009 a 2013
Fonte: Galesi e Fukasava (2015)
Outro fator a ser dimensionado na epidemiologia da TB, são as Unidades Prisionais que podem ser vistas como instituições amplificadoras para sua transmissão, e estas quando mal gerenciadas tem relação direta com a disseminação da doença para a população em geral16,17.
O Brasil possui a quarta maior população carcerária de todo o globo e a incidência de TB é 20 vezes maior entre detentos do que entre a população geral 18-20. A prevalência de TB somente em prisões da cidade de São Paulo (SP) foi 70
vezes maior do que entre a população geral brasileira. Um estudo na prisão Estadual do Rio de Janeiro (RJ) evidenciou uma prevalência 35 vezes maior do que na população de todo o Estado21-24.
Dentro do sistema prisional, eles ainda são expostos a vários outros fatores que contribuem para a evolução da TB, como por exemplo, a superlotação, a desnutrição e a prevalência do vírus HIV 27-30.
Ademais, são particularmente comum nas prisões, o difícil acesso aos cuidados de saúde, aliado com o diagnóstico tardio, a falha na interrupção da transmissão da doença e consequentemente o surgimento de cepas multirresistente (MDR-TB)28,31.
No contexto da alta prevalência de MDR/XDR-TB, o atraso na detecção da TB, o tratamento inadequado, a alta rotatividade de detentos e a superlotação são os principais fatores, responsáveis pela transmissão rápida da doença, entre a população carcerária e a população em geral, até mesmo por meio do fluxo dos funcionários e dos visitantes dentro das unidades penitenciárias. Além disso, prisioneiros libertados sem uma avaliação clínica adequada, podem também infectar as pessoas em suas comunidades, representando um risco grave para a saúde pública30,32.
Estas circunstâncias revelam que medidas urgentes devem ser tomadas para detectar e tratar a TB em detentos, assim como traçar as possíveis rotas de transmissão da TB na comunidade e nas prisões29.
Nesse sentido os estudos de epidemiologia molecular realizados hoje em diversos países mostram que a transmissão da TB nas prisões, e invariavelmente das prisões para população em geral, contribui significativamente para as altas taxas de incidência e persistência da doença nas populações carcerárias (24) (33).
1.3 Microbiologia
Patógeno intracelular obrigatório, M. tuberculosis se apresenta em forma de
natureza hidrofóbica permite a retenção de fucsina, evitando assim a dessecação e a descoloração por álcool e ácido. Essa característica é também bastante associada com a virulência do microrganismo34.
As micobactérias são capazes de resistir no ambiente por semanas ou até meses quando protegidas da luz solar, e possuem mais resistência aos ácidos e desinfetantes que a maioria das outras bactérias. Relativamente resistem ao calor e ao congelamento, mas são inativadas pela luz ultravioleta e ao calor de aproximadamente 65ºC por 30 minutos. O bacilo é fototrófico e heterotrófico e tem respiração anaeróbia. A replicação ocorre mais lentamente do que outras bactérias (entre 12 a 24 horas) e se duplicam em intervalos de 15 minutos até 1 hora em torno de 37ºC35.
1.4 Transmissão e Patogênese
A TB atinge várias faixas etárias, e não distingue níveis sociais, é uma doença que mantém a atenção das autoridades competentes sempre em alerta, pois o número de casos tem aumentado mundialmente nas últimas duas décadas. O risco de desenvolver a doença ainda aumenta consideravelmente quando a infecção com TB coexiste com uma alteração do sistema imune, tal como na coinfecção HIV-TB1,2,13.
Sua transmissão se dá diretamente pelo ar, quando o indivíduo com a forma pulmonar ou laríngea da doença espirra, tosse ou fala e libera bacilos no ambiente que podem infectar outro indivíduo. A contaminação acontece a partir da inalação de pequenas partículas aerossóis de 1-5µm que podem conter de 2 a 3 bacilos vivos, secretados anteriormente pelo indivíduo doente e que são capazes de atingir bronquíolos e alvéolos pelas vias distais36. A infecção propriamente dita varia conforme o grau de contato com o doente, a quantidade inalada de bacilos e também da resposta imune do indivíduo contaminado37.
células dendríticas, sendo essa a primeira linha de defesa contra TB. Se eficaz essa resposta elimina o bacilo, caso contrário, com o crescimento bacteriano este é disseminado por via hematogênica para outras partes do corpo37.
A resposta imune contra a TB desempenha um papel fundamental no combate à infecção. A maioria das pessoas infectadas, cerca de 90%, não desenvolve a doença durante a vida toda. Em cerca de 5 a 10%, as defesas imunes são vencidas logo após a primeira infecção tuberculosa e o indivíduo adoece. Nessa situação, a forma clínica é chamada primo-infecção, ou primária, e pode acometer qualquer órgão ou sistema. As formas de TB primária, ou primo-infecção, podem ser apenas ganglionares, ou envolverem gânglios e pulmão. O comprometimento pulmonar pode assumir diferentes formas clínico-radiológicas: pneumônicas, bronco-pneumônicas, cavitárias. Nessa forma, o paciente, comumente uma criança, apresenta-se irritadiço, com febre baixa, sudorese noturna, inapetência e exame físico inexpressivo38.
Quando as defesas imunes são efetivas e conseguem deter a infecção inicial e a doença desenvolve-se posteriormente, a partir de um foco latente, ela é chamada de reinfecção endógena, ou seja reativação dá doença previamente estabelecida. Quando consequente a uma nova infecção, na qual o sistema imune foi incapaz de conter sua progressão, é chamada reinfecção exógena. A reinfecção da doença é denominada TB pós primária, ou secundária38.
Os sintomas da TB se apresentam na maioria das vezes com febre baixa, geralmente no período da tarde, sudorese noturna, emagrecimento, perda de apetite, fraqueza, prostração, palidez, tosse persistente com ou sem presença de secreção podendo evoluir para tosse com pus ou sangue39.
oxigênio, necessário ao desenvolvimento do bacilo. A lesão cavitária é consequência da liquefação e drenagem do conteúdo caseoso de uma lesão granulomatosa. A drenagem dá lugar a uma cavidade pulmonar, chamada caverna tuberculosa36.
Para o bacilo, outros órgãos e tecidos não possuem condições tão favoráveis quanto o pulmão, por isso, na maior parte das vezes a TB extrapulmonar é, geralmente, paucibacilar e sua progressão é mais lenta. Os sintomais são menos frequentes do que na forma pulmonar e são específicos de acordo com o órgão afetado, sendo marcada por manifestações inflamatórias ou obstrutivas. Pode haver concomitância da lesão extrapulmonar e a pulmonar ativa. Praticamente qualquer local ou sistema do organismo pode ser afetado pela TB38.
O M. tuberculosis é o exemplo clássico de uma bactéria intracelular que
persiste por longos períodos dentro do hospedeiro, causando uma infecção crônica latente, sem lesão tecidual. Dessa maneira, mesmo que a imunidade celular seja capaz de a progressão da doença, frequentemente não consegui eliminá-la completamente40,41.
Durante a infecção latência, o bacilo não se replica ou pode se replicar lentamente durante toda a vida do indivíduo. O estado de latência não apresenta clinicamente nenhum sintoma e muitos casos de TB ativa surgem de reativação do bacilo dormente40,41. As células epiteliais do pulmão, assim como nódulos linfáticos,
outros órgãos e tecidos são alvos dos bacilos durante a infecção latente. De fato, quase 15% das reativações de TB ocorrem em sítios extrapulmonares, sem comprometimento pulmonar42.
1.5 Diagnóstico e Tratamento
O diagnóstico de TB é feito a partir da baciloscopia e cultura de escarro, se a suspeição for de TB pulmonar ou de outros espécimes clínicos em caso de TB extrapulmonar, como biópsias, aspirado, pus, urina, e fluidos estéreis como, por exemplo, líquido cérebro-espinhal, sinovial, pleural, pericardial e peritoneal38.
A baciloscopia, inicialmente avalia a presença de bacilos álcool acido resistentes (BAAR), por meio de um esfregaço de amostra clínica coletado e corado pela técnica de Ziehl-Neelsen. O Método é rápido, de simples realização e de baixo custo, porém com sensibilidade e especificidade baixas, pois é necessária uma grande quantidade de bacilos no material, pelo menos 5000 bacilos por mililitro. Essa desvantagem permite apenas 50 a 70% de positividade para pacientes com TB pulmonar43.
Já a cultura é uma técnica imprescindível para o diagnóstico, pois mesmo que demorada devido ao longo tempo de multiplicação do bacilo e sendo mais dispendiosa, permite seu isolamento possibilitando uma análise morfológica e testes bioquímicos para identificação43.
No Brasil, a cultura e os testes de sensibilidade são indicados apenas nos casos de suspeita de TB com baciloscopia negativa para o diagnóstico das formas extra-pulmonares, nos casos de falha no tratamento ou recidiva, e quando há suspeição de infecção por micobactérias não tuberculosas (MNT). Além de pacientes no grupo de risco como HIV positivos, oriundos de unidades prisionais, moradores de rua e profissionais de saúde44.
Em paralelo, para complementar o diagnóstico de TB pulmonar, os clínicos podem contar com a radiografia de tórax, que permite a visualização da presença de sinais da doença no pulmão, métodos adicionais também incluem a ressonância magnética e a tomografia computadorizada38.
O Purified Protein Derivatite (PPD), ou prova tuberculínica é outra técnica
complementar para a identificação de TB latente, essa técnica baseia-se em uma reação de hipersensibilidade cutânea por meio de aplicação intradérmica de um purificado concentrado de cepas atenuadas de M. tuberculosis, cuja leitura é
vacinação com BCG, por isso não é usado como diagnóstico, pois a negatividade do teste não elimina a possibilidade de infecção38,45.
Testes moleculares baseado em Polimerase Chain Reaction (PCR) também
são utilizados no diagnóstico de TB e têm como alvo regiões específicas do genoma de M. tuberculosis. Apesar dessas técnicas ainda serem consideradas de alto custo
em regiões de baixa prevalência da doença, a utilização desses métodos otimiza os resultados e facilita a escolha terapêutica, nesse caso tornando o método mais barato e eficaz quando utilizados em regiões de alta endemicidade38.
Desde o ano de 2013, o Ministério da Saúde iniciou discussão para implantar um equipamento de teste molecular rápido: o GeneXpert® teste MTB/RIP®, que identifica o DNA de M. tuberculosis em 2 horas, bem como a
resistência à Rifampicina. Em 2014, foram implantados 32 equipamentos em laboratórios públicos do Estado de São Paulo, foram realizados 28.997 testes e em 1.943 (6,7%) amostras foi detectado o bacilo, destas 58 (3%) com resistência à RIP15.
Até a década de 40, quando ainda não havia medicamentos efetivos contra a doença, o tratamento contra TB era primordialmente hospitalar. Com a descoberta da estreptomicina, isoniazida e rifampicina entre os anos de 1944 e 1957 deu-se início a era terapêutica da TB, com a introdução de quimioterapia e a quimioprofilaxia1. Em 1973 houve a implementação da vacina intradérmica BCG, tornando-se obrigatória, alguns anos depois, para menores de um ano de idade1.
O Esquema preconizado pelo Ministério da Saúde para o tratamento da TB pulmonar ativa, é chamado esquema I e composto por 4 drogas. A fase de ataque, ou intensiva, inlcui INH, RIP, PZA e EBM diariamente, em dose fixa combinada durante 2 meses e posteriormente a fase de manutenção com INH e RIP durante 4 meses. O esquema I é indicado para pacientes sem histórico de tratamento anterior ou em casos de recidiva depois de cura a mais de 5 anos48.
A quimioprofilaxia é utilizada como prevenção e combate a doença, sendo indicada para indivíduos com alto risco de desenvolver a TB, como por exemplo, contatos de casos com a doença ativa, indivíduos HIV positivos ou em indivíduos
imunossuprimidos. A droga indicada na profilaxia da TB é a isoniazida, exceto em casos de intolerância ou de resistência a essa droga, onde a indicação é substituí-la pela RIP49.
A grande dificuldade no controle da TB é o longo período de quimioterapia que faz com que grande parte dos pacientes descontinue o tratamento na presença de melhora significativa dos sintomas, e isso faz com que o paciente continue a eliminar bacilos, mantendo a cadeia de transmissão e possivelmente venha a desenvolver resistência. Por isso, a efetividade das ações dos programas de controle no diagnóstico e tratamento da doença é imprescindível49.
1.6 Co-infecção TB e HIV
Dentre as 9 milhões de pessoas que desenvolveram TB em todo o mundo em 2013, estima-se que cerca de 1 milhão (13%) eram HIV positivas13.Apesar do número de mortes ter diminuído desde 2004, as mortes em todo o mundo por
TB-HIV ainda somam-se 360 mil, ou seja, 25% do total de mortes por TB no ano de
201313. A TB, hoje continua sendo a principal causa de morte entre indivíduos soropositivos50,51.
Uma interação biológica complexa ocorre entre M. tuberculosis e o HIV no
hospedeiro co-infectado, resultando no agravamento de ambas as patologias. O HIV
aumenta a replicação do HIV acelerando a evolução natural da infecção viral52,53,54. A infecção por meio de M. tuberculosis prejudica a produção de interferon-gama
(IFN-gama) na TB, e esta deficiência não é revertida pelo tratamento anti-retroviral52,53.
Foi mostrado que um único paciente pode ser infectado e/ou re-infectado com mais de uma estirpe de M. tuberculosis mesmo durante um único episódio de
doença. Ao contrário da maioria de outras doenças oportunistas, que geralmente aparecem nos estágios finais da AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome -
Síndrome da Imunodeficiência Adiquirida) em decorrência do comprometimento imunológico grave, a TB pode ocorrer em qualquer momento durante a infecção pelo HIV 55,56.
As apresentações clínicas da TB diferem de acordo com a gravidade da imunodepressão associada com a infecção pelo HIV sendo esta, claramente ligada
ao nível sanguíneo de linfócitos T CD4+. Doença pulmonar localizada é a forma mais comum nas fases iniciais da infecção pelo HIV, no entanto, as formas
disseminadas de TB, em particular a TB meníngea, são as mais frequentes em pacientes gravemente imunodeprimidos e, obviamente, a mortalidade nesses casos significativamente maior57. Níveis de T CD4+ inferiores a 200 células/mL representa um limite de imunodepressão grave58.
Acima deste nível, um granuloma completa TB é produzido em resposta a infecção por M. tuberculosis, incluindo células gigantes multinucleadas,
macrófagos, linfócitos T CD4 + e CD8 e uma necrose caseosa central. Na radiografia de tórax as localizações pulmonares típicas podem ser observadas, muitas vezes com imagens de cavitação pulmonar57.
Assim como no hospedeiro imunocompetente, a apresentação clínica da doença também envolve febre, suores noturnos e perda de peso acompanhada de tosse produtiva com expectoração mucopurulenta ou hemoptise. Nesses estágios, a TB pleural e nos linfonodos são as localizações extrapulmonares mais comuns da doença, enquanto que a TB miliar e a meníngea são raramente vistas58.
A reação na pele à injeção intradérmica, PPD, é geralmente negativa nestes
mais comum, porém, a frequência de apresentação extrapulmonar ou disseminada é de aproximadamente 50% dos casos e a apresentação extrapulmonar muitas vezes coexiste com a forma pulmonar. As apresentações "atípicas" são frequentemente observadas na radiografia de tórax59. Estas incluem opacidades basais, ausência de cavitação, micronodular (miliar) padrões, hilar e adenopatias mediastinais, pleural e/ou derrame pericárdico. Ainda assim, até 10% dos casos podem apresentar uma radiografia de tórax normal, mesmo com baciloscopia de escarro positiva60.
Outro ponto de grande relevância foi que a pandemia de AIDS favoreceu ainda mais o surgimento da MDR-TB. Os primeiros surtos de associação TB-AIDS-MDR foram relatados nos Estados Unidos (EUA) no início dos anos 90. Estes foram os primeiros sinais de alarme do declínio dos programas de controle da TB que prevaleciam na época, não só nos EUA, mas também em outras partes do mundo61.
De fato, a epidemia de TB-MDR é considerada uma terceira epidemia resultante da interação entre as epidemias de TB e AIDS que não só afeta
hospedeiros imunodeprimidos, mas também se estende globalmente62. Isto pode ser explicado, parcialmente pelas dificuldades de prevenção da doença levando-se em consideração a sua transmissibilidade por vias aérea, e também a relação com as crescentes migrações humana de áreas com alta prevalência para áreas de baixa prevalência de TB. A MDR-TB atualmente ameaça os esforços para o controle efetivo da doença em todo o mundo13.
1.7 Evolução Genética e Epidemiologia Molecular
A fenotipagem por muitas décadas foi utilizada para classificação das micobactérias, porém essa ferramenta não tinha potencial para diferenciar os isolados em circulação assim, os métodos moleculares permitiram a comparação entre marcadores genéticos e também a discriminação desses isolados63.
O sequenciamento do genoma da cepa referência M. tuberculosis H37Rv
moleculares desenvolvidos para caracterizar geneticamente esses isolados contribuíram para uma melhor compreensão da dinâmica de transmissão e principalmente da avaliação dos programas de controle da doença65.
A metodologia IS6110-Restriction Fragment Lenght Polimorfism (RFLP -IS6110) foi padronizada e publicada no mesmo período em que a OMS declarou a
TB como emergência de saúde pública66. Essa técnica foi capaz de demonstrar a dinâmica de transmissão da doença, o que muito contribuiu para a definição de novas estratégias de melhoria nos programas de vigilância epidemiológica e na prevenção de sua transmissão67,68.
Essa técnica foi considerada por muitos anos padrão ouro, entre os métodos de tipagem molecular de M. tuberculosis em virtude de seu alto poder
discriminatório, pela forma padronizada e reprodutiva para sua realização. Entretanto, possui várias limitações que dificultam seu uso, como por exemplo, a necessidade de grande quantidade de DNA íntegro e seu baixo poder
discriminatório quando utilizada em isolados com baixo número de cópias de
IS6110 (< 6 cópias), necessitando com isto a utilização de métodos de genotipagem
complementares69.
Com a finalidade de amenizar as limitações encontradas no uso da técnica
RFLP-IS6110, o Spoligotyping foi desenvolvido em 1993, quando caracterizado a
natureza polimórfica do locus Direct Repeat (DR) ou locus de Repetição Direta,
Figura 5: Esquema proposto da técnica de Spoligotyping
Fonte: Adaptado de Barnes et. al., (2003)
A variabilidade do locus DR ocorre por meio de recombinação homóloga
entre repetições vizinhas ou distantes, por transposição mediada por sequência de inserção (IS) e por polimorfismos em nucleotídeos únicos (SNPs). Em uma
membrana com 43 sequências diferentes é possível verificar a ausência ou presença dessas DVRs e esta é caracterizada a partir da amplificação e hibridização dessas regiões. Os diversos padrões de Spoligotyping contêm sinais
filogenéticos, que seriam suficientes para avaliar a população e diferenciar os isolados em famílias71.
Com o suporte de uma base de dados criada a partir desses diferentes padrões, foi possível caracterizar a diversidade genética de isolados de M. tuberculosis a partir da variabilidade do locus DR. Até o momento 62 linhagens do
MTBC compõem um quarto Banco de Dados Internacional de Spoligotyping
famílias Latin American – Mediterranean (LAM), Haarlem e T são as linhagens mais
predominantes no Brasil e em especial a família LAM que tem alta prevalência74.
Figura 6: Distribuição geográfica global das principais linhagens de M. tuberculosis
baseado em dados de Spoligotyping no SITVITWEB
Fonte: Brudey et. al., (2006)
Este método permite criar um panorama da estrutura populacional dos isolados de M. tuberculosis em diversas partes do mundo, considerando que estas
evoluíram de um ancestral comum e que podem ser agrupadas em linhagens evolutivas de acordo com as assinaturas únicas de Spoligotyping75.
Outra metodologia cada vez mais utilizada como alternativa ao RFLP-IS6110
é o VNTR(Variable Number Tandem Repeat)76-80. A técnica de VNTR se baseia na amplificação por PCR de múltiplos loci repetitivos e é mais rápida, uma vez que não
necessita de altas concentrações de DNA e os resultados a partir de códigos
numéricos são também muito mais fáceis de comparar. Em 1998 foram identificados 41 loci VNTR no genoma de M. tuberculosis, denominados MIRU
Figura 7: Posição dos 41 MIRU no cromossomo de M. tuberculosis H37Rv
Primeiro número indica a posição de cada locus ocupado por um MIRU. A letra C indica a orientação contraria a estabelecida por Cole et. al., (1998). Algarismos romanos indicam o tipo de MIRU (I, II ou III). Os números seguintes indicam a localização de cada loci. A esfera em preto indica os 12 loci com número variável de MIRU. Fonte: Supply
et. al., (2006)
Com os avanços e melhoria dos métodos de tipagem pelo uso das VNTR foi
desenvolvido então, um sistema denominado MIRU-VNTR, que são mais rápidos e
combinam análises de PCR para os loci alvo81. Em 2006, foi estabelecida a aplicação
de 15 loci mais discriminatórios e que seriam suficientes para avaliar a população
em estudos de epidemiologia molecular82.
Desde então, a técnica tem sido aplicada em várias populações diferentes com a finalidade de definir a estrutura populacional de M. tuberculosis, identificar
as principais linhagens e sua distribuição geográfica, assim como, diferenciar isolados de M. tuberculosis em agrupamentos de pacientes que apresentam
ligações epidemiológicas e por fim identificar as cadeias de transmissão dos isolados83-86.
A combinação dessas metodologias permite analisar a diversidade genética e a epidemiologia molecular dos isolados de M. tuberculosis com o objetivo não
circulação, mas também estimar a recente taxa de transmissão da TB, e possivelmente detectar a transmissão de casos MDR-TB85.
Mais recentemente, foi reconhecido que as variações em isolados clínicos de
M. tuberculosis são resultado da inserção ou deleção de eventos em regiões
genômicas específicas conhecidas como regiões de diferença (RDs). Polimorfismos em sequências longas (LSPs), tais como as RDs têm sido usados para observar a
diversidade de isolados e diferenciar várias espécies MTBC com base em deleções genômicas. Assim, uma série de estudos tem ligado deleções de certas RDs com mudanças no potencial epidêmico da micobactéria e virulência87.
Em 2007, um estudo no Brasil descreveu a linhagem RDRio com alta prevalência, cerca de 30% dos isolados de M. tuberculosis, em pacientes com TB no
Estado do Rio de Janeiro e foi associada a uma maior virulência e adaptação específica. O genótipo RDRio apresenta uma deleção de 26,3 kb que inclui a perda ou modificação de 10 genes, entre eles dois genes PPE responsáveis por diminuir a resposta imune do hospedeiro e levando a um aumento da virulência. Esses isolados, segundo o estudo, ocorrem quase que exclusivamente entre a linhagem de família Spoligotyping LAM74. Juntamente com genótipo RDRio foi descrito também no estudo a deleção RD17474, que posteriormente em um estudo realizado por Gagneux et. al., (2006) foi testado como co-marcador para as cepas LAM/RDRio. Foi verificado nesse estudo, concordância na presença de deleção das duas regiões, ou seja, todas as cepas com a presença de deleção RDRio também apresentaram a deleção na região RD174, enquanto que a mesma se manteve intacta em cepas sem a deleção RDRio, inclusive cepas com genótipo LAM sem a deleção RDRio, o que segundo os autores indica que a deleção RD174 seja um marcador adicional para os perfil genético RDRio.
Figura 8: Diagrama dos genes deletados na LSPRDRio. Todos os elementos entre os
genes Rv3346c e Rv3355c foram excisados resultando na deleção de 26,3 Kb da
Fonte: Adaptado de Lazzarini et. al., (2007)
Com base nas informações apresentadas e frente à necessidade de verificar a associação entre os genótipos dos isolados de M. tuberculosis e os aspectos
clínico-epidemiológicos da TB, o presente estudo caracterizou a variabilidade genética e avaliou as possíveis associações entre os genótipos e a gravidade da doença utilizando para isto, os métodos de MIRU-VNTR, bem como, a análise da
Os mecanismos básicos da transmissão do M. tuberculosis com relação à
fonte, reservatório, modo de transmissão e de sua interação com o hospedeiro, ainda são pouco evidentes e podem ser um empecilho para o controle da TB. A constituição genética de um organismo é o conjunto originalde eventos recentes e evolucionários. A identificação de marcadores que exibem variabilidade entre isolados independentes constituem o núcleo da tipagem molecular das cepas. Portanto a genotipagem de agentes causadores de doenças infecciosas é essencial para a análise epidemiológica da transmissão.
A observação de diferentes características clínicas e epidemiológicas, associada à investigação genética, é essencial para identificar e caracterizar diferentes linhagens ou sublinhagens de cepas de M. tuberculosis. Diferentes
3.1 Objetivo Geral
Caracterizar o perfil genético dos isolados de M. tuberculosis em pacientes
com TB do Estado de São Paulo e investigar as possíveis associações com dados clínicos e epidemiológicos.
3.2 Objetivos Específicos
Caracterizar o perfil clínico-epidemiológico dos pacientes com TB.
Caracterizar o perfil genético dos isolados de M. tuberculosis por MIRU-VNTR.
Verificar a frequência das deleções RDRio e RD174 e a associação com variáveis epidemiológicas.
Investigar possível transmissão entre contatos de pacientes com TB.
Correlacionar os clusters ou grupos de clusters que apresentam forte
Trata-se de um estudo transversal de base populacional desenvolvido com amostras de pacientes atendidos em Unidades Básicas de Saúde de 2 Departamentos Regionais de Saúde (DRS) do Estado de São Paulo: DRS-VI Bauru e DRS-XV São José do Rio (DRS-XV SJRP), no período de 2012 a 2015.
No presente estudo foram incluídos 560 isolados de 530 pacientes diagnosticados com TB oriundos de 76 municípios, sendo 174 pacientes pertencentes ao DRS-VI Bauru, 354 ao DRS-XV SJRP. Um total de 11 pacientes
residia em municípios pertencentes a outras DRS s, no entanto foram atendidos e notificados pelos DRS s deste estudo.
A identificação e isolamento de M. tuberculosis foram realizados por
baciloscopia a partir da coloração por meio da técnica de Ziehl Neelsen, e a cultura em meio do sistema automatizado de detecção, o BACTECTM MGITTM. O teste de sensibilidade ás drogas anti-TB foi realizado utilizando o método das proporções14.
As amostras encaminhadas ao Laboratório de Biologia Molecular do Instituto Lauro de Souza Lima, eram provenientes dos Laboratórios Regionais do Instituto Adolfo Lutz de Bauru (IAL-Bauru) e do Instituto Adolfo Lutz de São José do Rio Preto (IAL-SJRP).
A coleta de dados clínico-epidemiológicos dos pacientes foi obtida a partir do sistema operacional dos Centros de Referência e também por meio do acesso ao site TBWEB - Sistema de Controle de Pacientes com TB (http://www.cvetb.saude.sp.gov.br/tbweb/index.jsp acesso em 20/01/2016) com autorização do Centro de Vigilância Epidemiológica (CVE).
As principais variáveis clínico-epidemiológicas selecionadas abrangem forma clínica, contato de TB, tipo de tratamento, histórico anterior de TB, tabagismo, alcoolismo, drogadição, diabetes, HIV, radiologia, baciloscopia, teste de
sensibilidade, sexo, idade, cor, município de origem e escolaridade.
qualquer idade; (iii) soropositivos e soronegativos para o HIV. Não foram incluídos nesse estudo pacientes com idade menor que 18 anos.
O projeto obteve aprovação junto ao Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Lauro de Souza Lima, atestando o cumprimento das normas regentes expressas na Resolução nº 466/2012 do Conselho Nacional de Saúde/Ministério da Saúde.
4.1 Extração do DNA Genômico dos Isolados de M. tuberculosis:
A extração do DNA foi feita conforme o protocolo descrito por van Embden et. al., (1993)66. Aproximadamente 50mg de massa bacteriana foi transferida para um tubo de microcentrífuga e misturada com 400 l de tampão TE 1X (Tris-HCL
10mM, pH 7.5, EDTA 1 mM, pH 8.0). A suspensão foi incubada a 80C por 20
minutos para matar os bacilos e em seguida, adicionado 50 l de lisozima na
concentração de 10 mg/ml; a mistura foi agitada e incubada a 37C durante a noite.
Foram adicionados 75 l de uma solução contendo Sodiumdodecylsulphate 10% (SDS) e 10μl de proteinase K na concentração de mg/ml. Ãpós agitação e
incubação por 10 minutos a 65C, foi adicionado 100l de NaCl 5M e em seguida
100l de solução CTAB/NaCl (N-cetyl-N,N,N- trimethylammoniumbromide). A mistura foi agitada até que o líquido se tornasse branco e incubada novamente por
10 minutos a 65C.
Em seguida foi adicionado clorofórmio + álcool isoamílico na proporção de
24:1 (750l), com agitação em vórtex por em 10 segundos, seguida de centrifugação por 15 minutos a 13.200rmp. O sobrenadante foi transferido para
um novo tubo de microcentrífuga e para precipitar o DNA foi adicionado 450l de
isopropanol com incubação durante a noite a - 20C.
sobrenadante novamente. O precipitado contendo o DNA foi ressuspendido em
volumes de 100l a 200l de tampão TE e estocado a - 20C até o uso.
4.2 Amplificação dos 24 lociMIRU-VNTR
Foram utilizados 24 sistemas de PCR. No entanto devido a inúmeras
dificuldades na realização da metodologia, incialmente foi caracterizado o sistema de 12 MIRU-VNTRs adicionados a dois marcadores, o ETR-B e o MTUB21, Somando 14 MIRU-VNTRs. Posteriormente foi possível a amplificação para o conjunto de 24 MIRU-VNTR para um número específico de isolados, essas informações serão detalhadas a seguir. Os iniciadores e as condições da PCR foram os mesmos
descritos por Supply et. al., (2006). Uma reação de PCR utilizando diferentes pares
de iniciadores (Tabela 1) foi realizada, mas a composição de cada reação incluía
, μl de tampão de PCR (10X, Invitrogen do Brasil), 2μl de MgCl , , μl de cada dNTP 25mM, 1Ude Taq DNA polymerase )nvitrogen do Brasil , , μl de Betaína
(10M) e 100pmol de cada par de iniciadores de PCR descritos na Tabela 1. Foram
utilizados 50ng dos DNA alvo. A cepa padrão de M. tuberculosis (H37Rv) foi
Tabela 1:Iniciadores Desenvolvidos para Amplificação por PCR dos 24 MIRU-VNTR
MIRUS Primer Primer –R
2 TGGACTTGCAGCAATGGACCAACT TACTCGGACGCCGGCTCAAAAT
4 CAGGTCACAACGAGAGGAAGAGC GCGGATCGGCCAGCGACTCCTC
10 GTTCTTGACCAACTGCAGTCGTCC GCCACCTTGGTGATCAGCTACCT
16 TCGGTGATCGGGTCCAGTCCAAGTA CCCGTCGTGCAGCCCTGGTAC
20 TCGGAGAGATGCCCTTCGAGTTAG GGAGACCGCGACCAGGTACTTGTA
23 CAGCGAAACGAACTGTGCTATCAC CGTGTCCGAGCAGAAAAGGGTAT
24 CGACCAAGATGTGCAGGAATACAT GGGCGAGTTGAGCTCACAGAA
26 CCCGCCTTCGAAACGTCGCT TGGACATAGGCGACCAGGCGAATA
27 TCGAAAGCCTCTGCGTGCCAGTAA GCGATGTGAGCGTGCCACTCAA
31 ACTGATTGGCTTCATACGGCTTTA GTGCCGACGTGGTCTTGAT
39 CGCATCGACAAACTGGAGCCAAAC CGGAAACGTCTACGCCCCACACAT
40 AAGCGCAAGAGCACCAAG GTGGGCTTGTACTTGCGAAT
ETR-A AAATCGGTCCCATCACCTTCTTAT CGAAGCCTGGGGTGCCCGCGATTT
ETR-B ATGGCCACCCGATACCGCTTCAGT CGACGGGCCATCTTGGATCAGCTAC
ETR-C CGAGAGTGGCAGTGGCGGTTATCT AATGACTTGAACGCGCAAATTGTGA
MTUB 04 CTTGGCCGGCATCAAGCGCATTATT GGCAGCAGAGCCCGGGATTCTTC
MTUB 21 AGATCCCAGTTGTCGTCGTC CAACATCGCCTGGTTCTGTA
MTUB 29 GCCAGCCGCCGTGCATAAACCT AGCCACCCGGTGTGCCTTGTATGAC
MTUB 30 CTTGAAGCCCCGGTCTCATCTGT ACTTGAACCCCCACGCCCATTAGTA
MTUB 34 GGTGCGCACCTGCTCCAGATAA GGCTCTCATTGCTGGAGGGTTGTAC
MTUB 39 CGGTGGAGGCGATGAACGTCTTC TAGAGCGGCACGGGGGAAAGCTTAG
QUB 11 CGTAAGGGGGATGCGGGAAATAGG CGAAGTGAATGGTGGCAT
QUB 4156 TGACCACGGATTGCTCTAGT GCCGGCGTCCATGTT
Iniciadores utilizados na amplificação dos 24 MIRU-VNTR, segundo Supply et. al., (2006).
As condições de amplificação também foram idênticas para os diferentes
MIRU-VNTRs, da seguinte forma: uma incubação inicial de 95ºC por 15 min,
seguido por 40 ciclos a 94ºC por 1 minuto, 59ºC 1 minuto e 72ºC 1,5 min seguido por uma incubação final a 72ºC por 10 min.
O número de repetições foi determinado pela definição do tamanho dos fragmentos em comparação com marcador de 100pb, por meio da análise em eletroforese em gel de agarose 2%, em tampão TBE (1M Tris, 0,5 EDTA; pH 8,3) 0,5%. A visualização dos produtos de PCR foi feita pelo corante GelRed (GelRed Nucleic Acid Gel Stain, 10.000X /Uniscience do Brasil). O número de repetições dos
Locus MIRU 02 Mtub04 ETRC MIRU 04 MIRU 40 MIRU 10 MIRU 16 Mtub21 MIRU 20 QUB11b ETRA Mtub29 Mtub30 ETRB MIRU 23 MIRU 24 MIRU 26 MIRU 27 Mtub34 MIRU 31 Mtub39 QUB26 QUB4156 MIRU 39 Conversão 154 424 577 580 802 960 1644 1955 2059 2163 2165 2347 2401 2461 2531 2687 2996 3007 3171 3192 3690 4052 4156 4348 Alélica
0 402 537 171 175 354 482 565 116 437 67 195 335 252 347 150 395 285 498 326 492 272 153 563 540 1 455 588 208 252 408 537 618 149 514 136 270 392 305 404 200 447 336 551 380 545 330 264 622 593 2 508 639 266 329 462 590 671 206 591 205 345 449 363 461 253 501 387 604 434 598 388 375 681 646 3 561 690 324 406 516 643 724 263 668 274 420 506 421 518 306 555 438 657 488 651 446 486 740 699 4 614 741 382 483 570 696 777 320 745 343 495 563 479 575 359 609 489 710 542 704 504 597 799 752 5 667 792 440 560 624 749 830 377 822 412 570 620 537 632 412 663 540 763 596 757 562 708 858 805 6 720 843 498 637 678 802 883 434 899 481 645 677 595 689 465 717 591 816 650 810 620 819 917 858 7 773 894 556 714 732 855 936 491 976 550 720 734 653 746 518 771 642 869 704 863 678 930 976 911 8 826 945 614 791 786 908 989 548 1053 619 795 791 711 803 571 825 693 922 758 916 736 1041 1035 964 9 879 996 672 868 840 961 1042 605 1130 688 870 848 769 860 624 879 744 975 812 969 794 1152 1094 1017 10 932 1047 730 945 894 1014 1095 662 1207 757 945 905 827 917 677 933 795 1028 866 1022 852 1263 1153 1070 11 985 1098 788 1022 948 1067 1148 719 1284 826 1020 962 885 974 730 987 846 1081 920 1075 910 1374 1212 1123 12 1038 1149 846 1099 1002 1120 1201 776 1361 895 1095 1019 943 1031 783 1041 897 1134 974 1128 968 1485 1271 1176 13 1091 1200 904 1176 1056 1173 1254 833 1438 964 1170 1076 1001 1088 836 1095 948 1187 1028 1181 1026 1596 1330 1229 14 1144 1251 962 1253 1110 1226 1307 890 1515 1033 1245 1133 1059 1145 889 1149 999 1240 1082 1234 1084 1707 1389 1282 15 1197 1302 1020 1330 1164 1279 1360 947 1592 1102 1320 1190 1117 1202 942 1203 1050 1293 1136 1287 1142 1818 1448 1335
Legenda: Conversão alélica dos tamanhos de fragmentos em número de cópias
SUPPLY et. al., (2006)
4.2.1 Interpretação e Tabulação dos Resultados:
O número de repetições determinado para cada locus foi formato em tabela Excel e importado no Software Bionumerics versão 7.5 (Applied Mathematics,
Bélgica) por meio de um protocolo chamado de Open Database Connectivety
(OBDC). Posteriormente, foram criados matrizes de similaridade, dendogramas e árvores filogenéticas utilizando índice de similaridade calculado pelo coeficiente categórico e os algorítmos Unweighted Pair Group Arithmetic Average (UPGMA) e Minimum Spanning tree (MST).
4.3 Detecção da Deleção da Região RDRio e RD174
A LSP de 26,3kb descrita como RDRio encontra-se entre os genes
Rv3346c-Rv335c. Esta deleção foi detectada por uma PCR-Multiplex descrita por Lazarini et. al., (2007)74. A deleção da região RD174 é utilizada como marcador da linhagem RDRio/LAM, encontra-se entre os genes Rv1994c-Rv1997c. A PCR simplex foi realizada de acordo com o protocolo padronizado por Lazarinni et. al., (2007). Por
meio de iniciadores que anelam nas regiões flanqueadoras e interna da sequência alvo.
RDRIO - A PCR foi realizada utilizando 20 pmol dos iniciadores BridgeF: 5 – CAC TCCGGC TGC CAA TCT CGT C –3', BridgeR: – CAC CGC GAG GCT GAA TGA GAC CA– 3', IS1561F: – GAC CTG ACG CCG CTG ACA C –3', IS1561R: – CAC CTA CACCGC TTC CTG CC –3'; 1U Taq polimerase (Invitrogen Life Technologies), tampão de reação 1X, MgCl2 2.0 mM, DMSO 5%, dNTP 0,2 mM cada um e H2O
deionizada autoclavada para o volume final de μL, foram aplicados 20ng de
DNA.
RD174– A PCR foi realizada utilizando 20 pmol dos iniciadores RD174F:
-AGC TGC TCC GGC TCG CGG TCC TCG TTG TC -3, RD174R: -ATC GCA GCG GTG
AAC GTT TCG ACG GCA TCT -3 e RD174)F: - GCC TATCCG CGG ACG GCA TCC ATT
