CLAUDETE APARECIDA ALVES
EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES NO
ADENOCARCINOMA E NO ENDOMÉTRIO NORMAL DE
MULHERES APÓS A MENOPAUSA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutor em Ciências
CLAUDETE APARECIDA ALVES
EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE GENES NO
ADENOCARCINOMA E NO ENDOMÉTRIO NORMAL DE
MULHERES APÓS A MENOPAUSA
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Wagner José Gonçalves Co-orientadores: Prof. Dr. Ismael D. C. G. Silva
Profª. Dra. Claudia C. R. Bortoletto
III
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA
CHEFE DO DEPARTAMENTO: Prof.Dr. Afonso Celso Pinto Nazário
V
Aos meus queridos pais Maurílio e Conceição, responsáveis pela minha formação acadêmica e cúmplices na minha formação pessoal, dedicação e amor incondicional, em todos os momentos da minha vida.
VII
A DEUS
Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva, professor do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo, coordenador do Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Federal de São Paulo, pelo importante estímulo e preciosas sugestões na execução deste trabalho e pelos conhecimentos em biologia molecular compartilhados, disponibilidade e otimismo.
Prof. Dr. Wagner José Gonçalves, professor livre-docente Chefe da Disciplina de Oncologia Ginecológica do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo, pelo estímulo, atenção e ensinamentos em nossa vida acadêmica e na realização deste trabalho.
Aos professores Dra. Cláudia de Carvalho Ramos Bortoletto e Dr. Sérgio Mancini Nicolau, da Disciplina de Oncologia Ginecológica do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo, por compartilharem conosco o atendimento das pacientes deste estudo.
Prof. Dr. João Norberto Stávale, professor livre-docente do Departamento de Patologia da Universidade Federal de São Paulo, pela colaboração na leitura de lâminas deste trabalho.
Sr. Márcio Alexandre Custódio, Biólogo do Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Federal de São Paulo, pela colaboração na utilização dos equipamentos necessários à realização deste trabalho.
A todos os pós-graduandos e médicos da Disciplina de Oncologia Ginecológica do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo, Dr. Robério de Souza Damião, Dr. Marco Antônio Pereira, Dra. Maria Paula Ribas Caramuru, Dr. Renato Moretti, Dr. Ademir Narciso de O Menezes, Dr. Roney Signorini Filho, Dra Vivian Beatriz Natale, Dr. Milton Sakano, Dr. Levon Badiglian Filho pelo auxílio no atendimento das enfermas.
Dra. Elizabeth Rautmann Cesarino Linhares, pós-graduanda do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo, pela amizade, ensinamentos e apoio sempre recebidos.
Às secretárias do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo, Valéria Miranda dos Santos Medina, Zélia Maria Gomes Macedo, Maria Cecília da Rocha Santos e Karim Martim dos Santos pela dedicação e auxílio em nosso trabalho.
A todos os demais professores, pós-graduandos, residentes e funcionários do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo, pela solidariedade e cooperação durante o nosso estudo.
IX
A tecnologia microarray revelou ser metodologia eficiente na avaliação da expressão
diferencial de genes e, portanto, tornou-se ferramenta usual em investigação molecular do câncer.
Neste estudo, utilizou-se microarrays de cDNA contendo 2000 genes diferentes para
analisar a expressão gênica em 10 casos de carcinomas endometrióides humanos pós-menopausa pareados contra seus tecidos normais correspondentes adjacentes para identificar genes diferencialmente expressos.
Vários genes foram encontrados diferencialmente expressos neste estudo. Destacou-se o MAP3K8, gene que nunca havia sido descrito superexpresso neste tipo de neoplasia maligna.
Para validar a expressão diferencial deste gene, assim como a membrana array,
executou-se análise RT-PCR semiquantitativa. O MAP3K8 mostrou-se superexpresso em 30% das amostras de carcinoma de endométrio.
XI
Lista de abreviaturas e símbolos
cDNA – DNA complementar
RT-PCR – transcrição reversa – reação em cadeia de polimerase MAP3K8 – mitogen – activated protein kinase kinase kinase 8
COT – Cancer Osaka Thyroid Oncogene
TPL2 – Tumor progression locus 2
Lista de Tabelas
XIII
Lista de figuras
FIGURA 1 – Identificação de genes diferencialmente expressos em tumores endometriais.
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA... IV AGRADECIMENTOS ... VI RESUMO... VIII LISTAS... X
1. INTRODUÇÃO ...1
2. PROPOSIÇÃO ...7
3. PACIENTES E MÉTODOS...9
3.1. Pacientes ...10
3.1.1. Critérios de inclusão para o estudo...10
3.1.2. Critérios de exclusão para o estudo...10
3.2. Métodos ...12
3.2.1. Método Anátomo-patológico ...12
3.2.2. Método Biomolecular ...12
3.3. Análise dos dados ...14
3.4. RT-PCR ...15
3.5. Sequenciamento automático de DNA ...15
4. RESULTADOS...16
5. DISCUSSÃO ...22
6. CONCLUSÕES ...29
7. ANEXOS ...31
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...46 SUMMARY
O câncer de endométrio representa uma das mais comuns neoplasias malignas em ginecologia.
Desde 1972 o carcinoma de endométrio é a neoplasia maligna mais freqüente da pelve nos países desenvolvidos, mormente nos Estados Unidos da América (Barakat et al., 1997; Bristol R. E., 1999).
O Brasil classifica-se entre os países com alta incidência de câncer. A estimativa do INCA (Instituto Nacional do Câncer) para o ano de 1998 foi de 5.685 casos novos de câncer do corpo uterino, correspondendo à sexta mais freqüente neoplasia maligna da mulher, sendo superada apenas pelo colo uterino, pele, mama, intestino grosso e estômago (Brasil, 1998).
O câncer de endométrio, em especial, apresenta incidência variável dentre as diversas regiões do nosso país. A taxa específica para a região sudeste é de 9,9/100.000 mulheres (Brasil, 1998).
Assim, o estudo desta neoplasia se reveste de importância, pois, registra-se, de forma progressiva, o aumento de sua incidência, ao lado de considerável mortalidade (Rakar e Kovacic, 1990). A maior freqüência pode ser explicada pelo aumento da longevidade, das melhores condições nutritivas, da obesidade, da baixa paridade, do abuso da estrogenioterapia no climatério e a outros fatores ainda desconhecidos (Rodrigues de Lima et al., 1999).
Assinalaram Homesley e Zaino (1994) e Evans e Podratz (1996) que o número de óbitos em decorrência desta neoplasia praticamente dobrou desde 1987. Ressalta-se, ainda, que a sobrevida de cinco anos, quando se englobam todos os estádios clínicos, é da ordem de 72,7%, mesmo se considerando os progressos alcançados pelas diversas modalidades terapêuticas (International Federation of Gynecology and Obstetrics - 1995).
O prognóstico da maior parte das pacientes com câncer de endométrio no estádio I é bom, com índices de sobrevida em cinco anos de 80% a 98% (Gal et al., 1992; Evans e Podratz, 1996). Entretanto, esta sobrevida deve-se em grande parte, ao sangramento genital, que constitui sintoma relativamente precoce.
3
Para Tornos et al. (1992), embora a sobrevida das pacientes no estádio IG1, seja superior a 90%, não é desprezível a mortalidade inclusive neste subgrupo, face do grande número de pacientes acometidas.
A maior parte dos fatores prognósticos utilizados para prever a evolução das enfermas embasam-se no estudo de peças operatórias, obtidos por ocasião da cirurgia. Assim, quando a FIGO (1988) modificou e preconizou o estadiamento clínico-cirúrgico atual, vários fatores prognósticos passaram a ser avaliados com maior exatidão, identificando-se subgrupos com maior risco para apresentar recidivas e metástases. Estes dados, obtidos pelo estadiamento, são de suma importância para o adequado tratamento e prognóstico (Gal et al., 1992).
Indubitavelmente, os critérios adotados pela FIGO (1988) ao estadiar o câncer de endométrio, associando os informes da propedêutica clínica aos dados histopatológicos obtidos das peças operatórias na laparotomia, incluíram os principais fatores prognósticos, destacando-se o grau de invasão miometrial, a presença e o grau do comprometimento do colo, dos anexos, da vagina e dos paramétrios, o acometimento linfonodal, a presença de citologia peritoneal positiva, a invasão tumoral da mucosa da bexiga ou do reto e a ocorrência de metástases.
Gebrim et al. (1999) assinalaram a importância de vários elementos ao aquilatar o risco de recidivas. Consideraram, além do estadiamento, a idade da enferma, o volume do útero, a diferenciação histológica, o grau de invasão miometrial, o tipo histopatológico, o comprometimento linfonodal, a citologia peritoneal, a invasão linfática tumoral, os receptores hormonais e a obesidade. Na dependência destas variáveis, classificaram as pacientes em sem risco, com pequeno e com grande risco para recidivas da neoplasia.
Assim, as pacientes identificadas no subgrupo de grande risco deveriam receber terapia adjuvante, enquanto as de baixo risco seriam dispensadas da rádio, hormônio e/ou da quimioterapia.
Quanto aos subtipos histopatológicos sabe-se que os carcinomas de endométrio nas variedades adenoescamosa, serosa-papilífera, de células claras e indiferenciada são mais agressivos e associam-se a menores taxas de sobrevida (Wilson et al., 1990; Esteller et al., 1999; Stávale, 1999).
Se a histopatologia dos tumores proporciona dados relevantes para o prognóstico, a biologia molecular promoveu nova frente de pesquisas para a melhor compreensão das neoplasias e, eventualmente, novas oportunidades na seleção dos grupos de maior risco de recidivas e metástases.
Para Evans e Podrats (1996), as alterações verificadas na ploidia do DNA e na atividade proliferativa das células traduziriam as mudanças no conteúdo do material genético e na regulação do crescimento. Mais especificamente, estas características semiquantitativas decorreriam de alterações em vários proto-oncogenes ou de genes supressores de tumores, ou ainda de ambos, que codificam proteínas reguladoras (Friend et al., 1988).
Os genes de uma célula normal que podem ser ativados e originar o câncer são denominados de proto-oncogenes, enquanto executam normalmente sua função, obedecendo aos mecanismos de controle. Quando estes proto-oncogenes deixam de obedecer aos controles da célula e originam a neoplasia passam a constituir oncogenes (Weinberg, 1985). Ou seja, os oncogenes, responsáveis pela carcinogênese, são versões alteradas de genes normais do genoma humano (Friend et al.,1988).
A preservação de material genético capaz de induzir o desenvolvimento de câncer seria desvantagem para o organismo que contenha tais genes. Entretanto, os proto-oncogenes estão preservados amplamente ao longo da evolução biológica tanto de invertebrados quanto de vertebrados. Este fato traduz o papel essencial dos proto-oncogenes nos processos celulares normais (Slamon, 1987; Friend et al., 1988).
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fatores que gerenciam a transcrição do DNA para o RNA mensageiro (Bishop, 1991; Junqueira e Carneiro, 1997).
Apesar do grande número e da diversidade de ações, os proto-oncogenes são classificados de acordo com os mecanismos ou função na regulação do crescimento e, ainda, pelos caminhos de ativação. Aparentemente, haveria três mecanismos bioquímicos para sua ação: 1) pela fosforilação de proteínas, sendo a serina, treonina e a tirosina, como substratos. O papel do proto-oncogene seria a indução da fosforilação ou agir como seu catalizador. Estas proteínas tirosina-quinases são conhecidas há décadas, mas a sua importância tornou-se evidente com o estudo dos proto-oncogenes; 2) transmissão de sinais por GTPases e 3) controle da transcrição a partir do DNA (Bishop, 1991).
De forma geral, quando o fator de crescimento liga-se ao seu receptor (específico), este torna-se transitoriamente ativado. Esta ativação causa, por sua vez, a ativação de outras proteínas de forma seqüencial “em cascata” e a produção de pequenas moléculas regulatórias, designadas mensageiros secundários. Estes últimos, constituem sinais transmitidos para o núcleo da célula, onde a expressão de genes específicos seria induzida, resultando na divisão celular (Druker et al., 1989).
Portanto, os oncogenes codificam proteínas denominadas oncoproteínas, as quais são muito similares ao produto normal dos proto-oncogenes. Entretanto, como estas proteínas perderam os mecanismos de regulação que refreavam a sua atividade, estariam continuamente ativadas; eventualmente, estas proteínas não mais necessitam de sinais ou estímulos externos para sua ativação (Druker et al., 1989).
Por outro lado, sendo a transformação neoplásica um processo de múltiplas etapas, as aberrações que ocorrem em vários proto-oncogenes e/ou genes supressores de tumores, presumivelmente realizam-se antes ou no início do franco desenvolvimento da neoplasia (Evans e Podratz, 1996).
Assinalam-se, dentre os vários fatores que podem alterar os proto-oncogenes, a radiação ionizante e os carcinógenos químicos. Entre os mecanismos envolvidos destacam-se a amplificação, a translocação e as mutações destes genes para facilitar ou promover a transformação maligna (Slamon, 1987; Berchuck e Boyd, 1995).
p53, PTEN, c-myc além de vários outros, podem ser encontradas com freqüências variáveis neste tipo de tumor.
O microarray de cDNA é técnica relativamente recente e vem sendo
cada vez mais utilizada. Basea-se na utilização de uma matriz composta por pequenos sítios de sondas (cDNA) conhecidas e específicas localizadas em posições padronizadas em membranas de nylon ou lâminas de vidro. Para a identificação dos genes envolvidos nas atividades celulares que se quer estudar, utiliza-se o DNA complementar (cDNA) produzido pelo RNA mensageiro, extraído do tecido através da transcrição reversa. Para Kurian et al. (1999), o cDNA, recém sintetizado, pode ser identificado através da sua ligação com as sondas da membrana (“array”).
Com a tecnologia do cDNA microarray, é possível analisar qualitativa
e quantitativamente centenas a milhares de genes simultaneamente (Afshari et al., 1999; Heller et al., 1997; Schene et al., 1996). As aplicações dessa nova tecnologia variam desde estudos sobre etiopatogenia, diagnóstico, prognóstico a efeito de drogas (Afshari et al., 1999).
Estudos recentes têm avaliado a expressão diferencial de genes no endométrio normal e no neoplásico, assim como, nos tipos histopatológicos de carcinoma endometrial. (Risinger et al., 2003; Kao et al., 2002).
Propõe-se, no presente estudo,a:
1- Identificar genes diferencialmente expressos no adenocarcinoma de endométrio quando comparado com o tecido endometrial normal da mesma paciente através da técnica de cDNA array.
2- Confirmar os resultados pela transcrição reversa – reação em cadeia de polimerase ( RT-PCR).
3.1. Pacientes
Neste estudo, analisaram-se dez pacientes com sangramento genital da pós-menopausa, atendidas no Ambulatório de Oncologia Cirúrgica do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, no período de 2002 a 2004.
3.1.1. Critérios de inclusão para o estudo
− Mulheres com idade acima de 40 anos, apresentando sangramento genital da pós-menopausa, com diagnóstico histopatológico de adenocarcinoma de endométrio da variedade endometrióide.
− Apenas amostras contendo, pelo menos, 70% de tecido tumoral.
3.1.2. Critérios de exclusão para o estudo
- Enfermas com sangramento genital cuja etiologia não estivesse localizada na
cavidade uterina.
- As que fizeram uso de reposição hormonal mesmo que por pequeno período de
tempo.
- Mulheres que receberam radioterapia.
- Pacientes com neoplasia maligna da mucosa uterina com quaisquer variedades
histopatológicas distintas do adenocarcinoma endometrióide.
- Todas as afecções benignas do útero e da mucosa uterina responsáveis pelo
sangramento.
O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP-EPM (Anexo 1) e o consentimento livre e esclarecido foi obtido de todas as pacientes (Anexo 2).
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Realizaram-se em todas, anamnese, exames físico geral e ginecológico, coleta de citologia oncológica cérvico-vaginal e estudo histopatológico da mucosa uterina. Entre os exames subsidiários dosou-se a glicemia de jejum.
Anotaram-se entre os dados da anamnese, a idade, a raça, a época de incidência da menarca e da menopausa, o tempo de pós-menopausa e o número de gestações, de partos e de abortamentos. Alinham-se, no Anexo 3, os dados de identificação e registro das pacientes e, no Anexo 4, os respectivos antecedentes ginecológicos e obstétricos.
A idade variou de 55 a 70 anos, com média de 60. Observou-se predomínio da raça branca. A idade de incidência da menopausa situou-se entre 44 e 55 anos, com média de 50. O tempo de pós-menopausa oscilou de 6 a 22 anos, com média de 13,5.
O número de gestações oscilou de 0 a 7, com média de 3; o de partos foi de 0 a 7 e, de abortamentos, de 0 a 1.
Dentre os dados de exame físico geral, apreciaram-se o peso, a altura e o índice de massa corpórea. O índice de massa corpórea foi calculado pela relação entre o peso (em quilogramas) dividido pela altura (em metros) ao quadrado (Keys et al, 1972). No Anexo 5 registram-se as informações relativas ao valor deste índice.
Caracterizou-se, eventualmente, a hipertensão arterial sistêmica quando, em dois atendimentos consecutivos, os níveis registrados nos membros superiores ultrapassaram 140 mmHg para a sistólica ou de 90 mmHg para a diastólica (Anexo 5).
A propedêutica subsidiária solicitada, incluiu as dosagens séricas de FSH (hormônio folículo-estimulante) e de LH (hormônio luteinizante), apenas para se confirmar o estado de pós-menopausa. Os valores plasmáticos da glicemia de jejum de todas as pacientes encontram-se, também, no Anexo 5.
Após avaliação clínica inicial, todas as pacientes submeteram-se à investigação da cavidade uterina. Realizou-se o diagnóstico de adenocarcinoma no estudo do endométrio obtido por biópsia, com cureta de Novak modificada, orientada pela histeroscopia ambulatorial (Anexo 6).
fresco (imediatamente após retirada da peça operatória – útero) e armazenado em gelo seco para análise biomolecular.
Os fragmentos de mucosa uterina, na sala cirúrgica, foram rapidamente conservados em gelo seco e, no mesmo período do dia, congelados em nitrogênio líquido para extração de RNA.
A extração de RNA foi realizada no Laboratório de Biologia Molecular e Ginecologia Experimental do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina.
3.2. Métodos
3.2.1. Método Anátomo-patológico
Processou-se o material obtido por biópsia ambulatorial e da peça operatória no Departamento de Patologia da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP-EPM).
O material obtido foi colocado em frasco contendo formol tamponado a 10%. Posteriormente, as peças foram desidratadas em concentrações crescentes de etanol, diafanizadas em xilol e incluídas em parafina.
Os blocos parafinados foram cortados com espessura aproximada de três micrômetros e, as lâminas, coradas pela técnica de hematoxilina-eosina. Desta forma, determinou-se o tipo histopatológico da neoplasia de endométrio e graduou-se a diferenciação.
3.2.2. Método Biomolecular
Extração de RNA, síntese das sondas e hibridização em membranas de cDNA
13
Para extração de RNA total utilizou-se fragmento de 200 mg de tecido, o qual foi pulverizado em nitrogênio líquido, sendo o macerado resultante imediatamente imerso em tubo de 2,0 ml contendo 1,0 ml de Trizol, seguindo-se agitação vigorosa do tubo em vortex. Logo após, acrescentou-se 200 microlitros de clorofórmio ao referido tubo, com nova agitação em vortex.
Os tubos foram centrifugados em equipamento refrigerado da marca Eppendorf por 15 minutos a 14000 rpm a uma temperatura de 4°C. A solução, assim tratada, apresentou-se em três fases. A fase superior, contendo o RNA, foi então removida e colocada em outro tubo de 2,0 ml contendo 500 microlitros de isopropanol. Após homogenização por inversão, a referida solução foi colocada para precipitação em freezer –20°C por um período de 12 horas. Transcorrido esse período, o tubo foi removido do freezer e submetido a nova centrifugação por 20 minutos a 14000 rpm em temperatura de 4°C. Observou-se, neste momento, a presença de um precipitado (pellet) de RNA no fundo do tubo. O RNA foi lavado em solução de etanol a 75% por 3 vezes e seco à temperatura ambiente por 20 minutos. Adicionou-se 50 microlitros de água milliQ autoclavada e tratada com dietilpirocarbonato (DEPC). O RNA, em solução, foi imediatamente armazenado em freezer a –80°C.
A pureza do RNA isolado foi avaliada espectrofotometricamente pela razão de absorbância A260/A280. A qualidade do RNA total foi avaliada pela eletroforese em gel de agarose/formaldeído. Previamente à transcrição reversa, dois pools de RNA foram obtidos misturando-se 2 µg do RNA total de cada amostra individual em dois tubos representando os grupos I (tecido normal) e II (tecido tumoral).
Para se obter sondas de cDNA radiomarcadas, os dois pools de RNA contendo 5,0 µg de RNA cada, foram submetidos a transcrição reversa na presença de primers oligodT e α- [33 P] dATP (2000 Ci/mmol), usando o kit Superscript II (Invitrogen), seguindo instruções do fabricante. As sondas foram purificadas utilizando-se as microcolunas Probe Quant G 50 (Amersham Pharmacia Biotech).
Para analisar a expressão diferencial de genes entre os grupos I e II, quatro membranas de microarray de cDNA humano contendo 2000 genes foram
usadas (duas vezes).
(Brentani et al.,2003). Sempre que possível, cada gene foi representado por duas cópias correspondendo a regiões diferentes do cDNA completo e cada cópia do cDNA foi marcada em duplicata sobre as membranas de nylon.
A hibridização ocorreu em 42°C em reação por 12 horas, contendo citrato salino (SSC) 20x, solução de Denhardt 50x, formamida 50%, sulfato dodecil sódico (SDS) 10x e 100 µg/ml de DNA de esperma de salmão.
Os filtros foram lavados a 50°C em 1x SSC/0,1% SDS por 15 minutos.
As imagens foram obtidas utilizando-se o scanner da marca Cyclone TM – Packard BioScience Company (Meriden, CT, USA).
As imagens assim obtidas foram, então, analisadas em software Array Vision.
3.3. Análise dos dados
Por análise estatística, foram selecionados genes com expressões que diferiam por pelo menos três vezes com relação ao pool de referência em 30% das pacientes.
Esta abordagem nos assegura a identificação apropriada de genes com alta possibilidade de se encontrarem diferencialmente expressos.
Para encontrar um grupo de genes que sejam diferencialmente expressos nos dois grupos, foi usado o teste de Welch, que não requer divergências iguais entre os grupos (Miller,1977). Entretanto, porque foram testados muitos genes para expressão diferencial, necessitou-se levar em conta múltiplos testes para evitar um número excessivo de resultados falso-positivos. Assim, utilizou-se o método step-down maxT (Westfall et al.,1993; Dudoit et al., 2002).
15
3.4. RT-PCR (Transcrição Reversa – Reação em Cadeia de Polimerase)
A validação dos dados da membrana, pela RT-PCR semiquantitativa, foi realizada usando quantidades iguais do RNA total de cada paciente individualmente (tecido normal e tumoral). As amostras foram então submetidas a transcrição reversa, usando-se a transcriptase reversa RNAse H do Superscript II (Invitrogen) em um volume final de 20 µl de acordo com as instruções do fabricante.
Os primers foram desenhados pelo programa Prime 3 (http://www-genome.wi.mit.edu/cgibin/primer/primer3.cgi/primer3_www.cgi).
O gene beta actina citoplasmático (ACTB) foi usado para normalizar as reações. Dois microlitros do cDNA transcrito reversamente foi amplificado em um volume final de 100 µl pela PCR sob condições padrão: 1,5 mM MgCl2, 125 µM dNTP e 2,5 U taq polimerase usando primers específicos em concentração de 10 µM. Os primers e parâmetros de ciclagem foram: beta actina citoplasmática (375bp); 32 ciclos (94°C, 1 min/ 55°C, 30 seg/ 72°C, 30 seg). Senso: 5’- CGTGACATTAAGGAGAAGCTG -3’; Antisenso: 3’ CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGA -5’. MAP3K8/Cot: 225 bp; 25 ciclos(94oC,1 min / 55oC,30 seg / 72oC,30 seg) S: 5’- GTC CAT TTT GGG GAG TGA TG -3’; AS: 3’- GAG GAT TTG CTT GCT TTT GC -5’.
Os produtos da amplificação por PCR foram separados em gel de agarose a 2% contendo 0,1 µg/ml de brometo de etídio. As bandas visualizadas foram analisadas semiquantitativamente, usando o software para análise densitométrica (Kodak EDAS 120) (Figura 1).
3.5. Sequenciamento automático de DNA
Esta etapa da pesquisa foi realizada no Centro de Pesquisas do Genoma “José Fernando Perez” da UNIFESP-EPM. Utilizou-se o kit BigDye (Applied Biosystems) conforme preconizado pelo fabricante em seqüenciador de DNA ABI
(Applied Biosystems). Esta etapa teve como objetivo a confirmação de que a banda
17
Os achados clínicos e histopatológicos das pacientes estão dispostos na tabela 1.
A partir das amostras pareadas identificadas como fragmentos do tumor e os respectivos endométrios atróficos de cada caso, efetuou-se após a extração do RNA, os estudos microarray e RT-PCR como, esquematicamente, mostra a figura 1.
Neste estudo, foram encontrados cinqüenta genes diferencialmente expressos (figura 2) quando comparou-se endométrio atrófico com seu correspondente tumoral.
A figura 3 mostra o seqüenciamento automático de DNA com o objetivo de confirmar que a banda amplificada tratava-se realmente de fragmento do RNA mensageiro do gene MAP3K8.
O gene MAP3K8 encontrou-se superexpresso em 3 das 10 amostras tumorais.
Duas pacientes entre as três que mostraram superexpressão deste gene morreram durante dois anos de seguimento e duas delas apresentavam mais que 50% de invasão miometrial.
TABELA 1 - DIAGNÓSTICO ANÁTOMO-PATOLÓGICO, ESTADIAMENTO CLÍNICO-CIRÚRGICO, SUPEREXPRESSÃO DO MAP3K8 E SEGUIMENTO DAS PACIENTES.
Caso
nº lâmina* N° da Diagnóstico anátomo-patológico
Estádio
clínico Miometrial Infiltração Linfovascular Invasão Comprometimento Linfonodal Superexpressão do MAP3K8 Seguimento
1
B01-21662 Adenocarcinoma endometrióide IIB G2 <50% 0 0 SIM ÓBITO
2
B01-14369 Adenocarcinoma endometrióide IC G1 >50% 0 0 SIM ÓBITO
3
B00-13456 Adenocarcinoma endometrióide IC G1 >50% 0 0 SIM EM SEGUIMENTO
4
B00-30897 Adenocarcinoma endometrióide IIB G3 <50% 0 0 NÃO EM SEGUIMENTO
5
B01-16055 Adenocarcinoma endometrióide IB G1 <50% 0 0 NÃO EM SEGUIMENTO
6
B00-25760 Adenocarcinoma endometrióide IIIA G3 <50% 0 0 NÃO EM SEGUIMENTO
7
B01-23352 Adenocarcinoma endometrióide IIIB G3 >50% 1 0 NÃO EM SEGUIMENTO
8
B01-20544 Adenocarcinoma endometrióide IC G2 >50% 0 0 NÃO EM SEGUIMENTO
9
B01-12530 Adenocarcinoma endometrióide IC G2 >50% 1 0 NÃO EM SEGUIMENTO
10
B01-23356 Adenocarcinoma endometrióide IIIA G3 >50% 1 0 NÃO ÓBITO
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FIGURA 1 – Identificação de genes diferencialmente expressos em tumores endometriais. Representação esquemática do nosso modelo experimental (tumor/atrófico). Representação da amostra onde apenas a porção invasiva do adenocarcinoma foi extraída e processada para extração de RNA. Cada amostra de RNA foi hibridizada com duas membranas idênticas. Imagem representativa da membrana de nylon após hibridização com o cDNA marcado com [α-33P]dCTP. Sinais foram capturados em scanner específico e os dados foram adquiridos pelo software
Array Vision usando os arquivos gerados na etapa anterior. RT-PCR semi-quantitativa
FIGURA 2 – Genes com expressão diferencial em tumores endométrióides. Baseado em dados apresentados os genes são listados (com respectivas diferenças indicadas entre parênteses) com diferenças na expressão maiores que três vezes. Em verde, genes com baixa expressão em tecido tumoral; em vermelho, genes com alta expressão.
Genes de baixa expressão
21
23
O câncer do corpo uterino é, como vimos, a neoplasia maligna mais comum da pelve em vários países. Nos Estados Unidos da América constitui o quarto mais comum câncer da mulher, das quais 75 a 80% encontram-se na pós-menopausa (Disaia e Creasman, 1993). Assim, o seu estudo reveste-se de importância, pois, além do aumento de sua incidência, é responsável por considerável taxa de morbidade e de mortalidade (Rakar e Kovacic, 1990).
Por várias décadas, apenas os parâmetros clínicos foram disponíveis para determinar o planejamento terapêutico no câncer de endométrio. Entretanto, em 1988, a FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics),
introduziu o estadiamento cirúrgico, aprimorando os critérios já existentes na estimativa do risco de recidivas e da sobrevida.
No tratamento do câncer de endométrio procura-se, rotineiramente, identificar as doentes com alto risco para recidivas e metástases (Gebrim et al., 1999). Igualmente importante é a identificação das pacientes com baixo risco, evitando-se os custos e a morbidade decorrente de medidas terapêuticas excessivas e desnecessárias (Evans e Podratz, 1996).
Constituem fatores de risco bem estabelecidos para o envolvimento linfonodal, no adenocarcinoma endometrióide, estádio clínico I, o grau de diferenciação histopatológico e a profundidade da invasão miometrial. Entretanto, há casos onde não há invasão miometrial profunda ou mesmo de tumores bem diferenciados que apresentam metástases linfonodais, e vice-versa. Por outro lado, há pacientes rigorosamente estadiadas pela cirurgia, com amostragem linfonodal normal, que desenvolvem recidivas, falecendo pelo câncer (Bell, 1997).
A explicação para o aparecimento de recidivas poderia advir de algumas hipóteses; entre elas a de que o tumor era aparentemente limitado ao útero mas, é provável, já haviam metástases ocultas. Entretanto, o desenvolvimento de metástases ocultas requer, de início, a invasão do espaço linfovascular; eventualmente, esta passa desapercebida na peça operatória (Nazeer et al., 1995).
Outrossim, a identificação de fatores prognósticos em pacientes nos estádios iniciais é de suma importância, pois a maioria destas é atendida nesta fase (Nazeer et al., 1995).
A propósito, no Setor de Oncocirurgia do Departamento de Ginecologia da UNIFESP-EPM, 70,7% das pacientes com câncer de endométrio encontravam-se no estádio I por ocasião do atendimento inicial (Rodrigues de Lima et al., 1999).
Por outro lado, detectar o maior potencial de agressividade de neoplasias de endométrio em estádios precoces, selecionando o subgrupo de pacientes de maior risco, que receberiam a terapia adjuvante é um dos objetivos príncipes da oncologia ginecológica na atualidade (Gebrim et al., 1999).
Assim, nestes últimos lustros, procurou-se investigar o real valor prognóstico dos parâmetros obtidos pela histopatologia da peça operatória. Todavia, há limitações e também ocorre subjetividade na interpretação destes parâmetros (Evans e Podratz, 1996).
Por outro lado, os estudos de biologia molecular demonstraram, na última década, que a progressão desde a célula normal até o câncer requer a alteração de vários oncogenes e genes supressores de tumor (Lukes et al., 1994). Muitos oncogenes, ou seja, genes capazes de induzir ou manter a divisão celular são versões alteradas de genes normais que controlam o crescimento celular (Weinberg, 1985).
Há várias provas de que a maior parte das neoplasias malignas tem origem em alterações ou desordens genéticas que codificam proteínas envolvidas na regulação da proliferação celular (Bishop,1991). Por isso, a identificação de uma ou mais variáveis moleculares, que direta ou indiretamente estão envolvidas com a biologia do tumor, auxiliar-nos-ia caracterizar as pacientes com elevado risco e a selecionar, de forma mais adequada, as opções terapêuticas (Evans e Podratz, 1996).
Na seleção de pacientes para este estudo não incluímos pacientes no menacme, pois o estrogênio e a progesterona poderiam interferir na expressão deste oncogene e sucitar inúmeras dúvidas quando da análise dos resultados.
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Para Baker (1996), os hormônios esteróides poderiam atuar de diferentes formas na carcinogênese do endométrio. Sabe-se que a estimulação prolongada aumenta o risco de neoplasia como conseqüência de maior atividade proliferativa. O número de células em mitose é mais alto e, assim como a possibilidade de mutação em um ou mais genes durante a replicação do DNA. Quando um número crítico de genes sofreram mutação, as transformações celulares podem culminar com o desenvolvimento de neoplasia.
Assinala-se, ainda, que os hormônios esteróides poderiam modular a expressão do gene pelo direto envolvimento no sítio do DNA, realçando ou ativando a transcrição. Sabe-se que os esteróides podem, também, exercer seu efeito por mecanismos pós-transcricionais pela estabilização do RNAm transcrito, prevenindo a sua degradação citoplasmática (Brock e Shapiro, 1983).
Quanto à idade acrescenta-se, ainda, que o câncer de endométrio, assim como outras neoplasias epiteliais malignas, geralmente ocorre em mulheres mais idosas. Justifica-se este fato, pois as mutações em vários destes genes reguladores e em oncogenes podem acumular-se, sucessivamente, até que uma simples célula inicia a transformação (Berchuck e Boyd, 1995). A idade média de 60 anos de nossa amostra endossou esta assertiva.
No presente estudo, com intuito de identificar-se novos genes envolvidos no surgimento e/ou manutenção do processo carcinogênico endometrial, decidimos estudar a expressão diferencial de genes envolvidos no processo de carcinogênese humana.
A técnica selecionada para este estudo foi o “cDNA array” pelo fato
de fornecer um amplo painel simultâneo e quantitativo da expressão genética naqueles tecidos.
Foram estudados dez pares de carcinoma endometrial e seus respectivos tecidos normais adjacentes.
O principal objetivo deste estudo foi identificar diferenças na expressão de genes em tecidos tumorais usando seus correspondentes adjacentes normais.
As amostras tumorais foram previamente analisadas a fim de se incluir apenas aquelas com pelo menos 70% de células tumorais.
Para validar a expressão diferencial de genes foi escolhido o MAP3K8 (COT ou Tpl-2), pois, na investigação de genes superexpressos, não encontramos relatos do mesmo no câncer endometrial.
A validação foi executada individualmente em todas as amostras (figura 1), tornando possível a identificação da superexpressão deste gene em 30% das amostras tumorais.
Pela análise de células somáticas híbridas e pela fluorescência em hibridização in situ, o gene MAP3K8 foi mapeado no cromossoma 10p11.2 (Chan et al., 1993) e foi inicialmente descrito como uma proteína truncada em sua região carboxiterminal, recebendo o nome de COT (Câncer Osaka Tireóide). O referido gene foi originalmente identificado no DNA de tumor de tireóide humano como um gene capaz de transformar células SHOK (Syrian Hamster Osaka Kanazawa) (Miyoshi et al., 1991).
Após seqüenciamento do referido gene, observaram que tratava-se de gene responsável pela codificação de uma proteína de 415 aminoácidos com características de serina treonina quinase.
Outros pesquisadores em datas muito próximas isolaram o mesmo gene MAP3K8 e o designaram, desta vez, como est (Ewing Sarcoma Transforming) ao
estudarem o potencial oncogênico do MAP3K8 em células NIH 3T3 (Chan et al., 1993). De modo geral, o MAP3K8 é um gene que se encontra expresso em grande número de tecidos como baço, timo, fígado, pulmão e mama (Patriotis et al., 1993; Sourvinos et al., 1999).
Entretanto, as funções fisiológicas desse gene bem como aquelas responsáveis pela transformação neoplásica ainda não se encontram esclarecidas. O gene MAP3K8 tem sido encontrado como elemento que participa da regulação de uma série de genes como fator de necrose tumoral alfa e IL-2 (Ballester et al., 1997, 1998).
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O MAP3K8 foi identificado como um gene transformador do adenocarcinoma de pulmão humano e tem uma mutação na região 3’ caracterizada em seu cDNA. A mutação foi localizada no exon 8 do MAP3K8 e confirmada no DNA do tumor primário.
Ambos os tipos selvagem e mutante de cDNAs de MAP3K8 transformaram células NIH3T3, mas a atividade transformadora do mutante foi muito maior que a da forma selvagem. Este foi o primeiro relato da mutação deste gene ocorrendo em um tumor primário, mas os autores concluíram que a ativação mutacional do gene é um evento muito raro (Clark et al., 2004).
Esta é a primeira vez que este oncogene foi encontrado superexpresso em carcinoma de endométrio, ainda que em apenas 30% dos casos. Deve ser enfatizado que a maioria dos oncogenes, como, por exemplo, os conhecidos oncogenes c-myc e o c-erbB2, foram encontrados superexpressos em porcentagens muito similares às observadas neste estudo.
Ao analisar-se a expressão do referido gene através de Northern Blot virtual no site SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE/index.cgi?cmd=tagsearch&org=Hs&tag=AATCTTT CAT&anchor=NLAII do NCBI, encontrou-se a expressão do MAP3K8 presente em número grande de tecidos, inclusive em carcinoma mamário, sugerindo um eventual papel deste gene neste tipo de tumor. Entretanto, a referida análise virtual, não mostrou expressão do MAP3K8 em endométrio, reforçando a originalidade dos nossos resultados.
A confirmação dos resultados da expressão diferencial fornecidos pela membrana através de RT-PCR, ou outro método confirmatório, deve ser sempre realizada em estudos onde trabalhou-se com pools. Este refinamento, confirmando a
expressão diferencial, foi realizado individualmente em um total de 10 casos de adenocarcinoma de endométrio.
A importância desta confirmação baseia-se em dois aspectos: primeiro, o encontro, com precisão, do número de casos onde existe a expressão diferencial; segundo, valida os demais resultados da membrana.
Entretanto, devido ao pequeno número de casos, os resultados necessitam ser confirmados por estudos com maior casuística.
Neste momento, achamos de igual importância ressaltar também as dificuldades técnicas em se trabalhar com as membranas de cDNA array, as quais em
1- Encontramos em nossa amostra 50 genes diferencialmente expressos quando comparado o tecido endometrial e o tecido neoplásico da mesma paciente.
2- Verificou-se a superexpressão do gene MAP3K8 em 30% dos casos de adenocarcinoma de endométrio.
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ANEXO 3 – IDENTIFICAÇÃO DAS PACIENTES
Caso nº Nome
(iniciais) Identificação (RG – HSP)* Número da lâmina** (anos) Idade Raça
1 CS 648.097 B01-21662 56 BRANCA
2 SSD 1.134.962 B01-14369 70 BRANCA
3 MFNSC 1.051.409 B00-13456 56 BRANCA
4 RFC 1.062.508 B00-30897 70 BRANCA
5 ATS 1.165.357 B01-16055 68 BRANCA
6 MFGG 808.626 B00-25760 55 BRANCA
7 EPO 1.201.218 B01-23352 65 NEGRA
8 RJR 772.992 B01-20544 69 BRANCA
9 GAG 893.799 B01-12530 70 BRANCA
10 GNS 818.247 B01-23356 59 BRANCA
ANEXO 4 – ANTECEDENTES GINECOLÓGICOS E OBSTÉTRICOS: IDADE DA MENARCA, MENOPAUSA E TEMPO DE MENOPAUSA (ANOS). NÚMERO DE GESTAÇÕES (G), PARTOS (P) E ABORTAMENTOS (A).
Caso nº Menarca Menopausa Tempo de
pós-menopausa G P A
1 11 48 8 3 3 0
2 13 55 15 3 3 0
3 13 47 9 0 0 0
4 14 53 17 7 7 0
5 12 50 18 3 2 1
6 13 44 11 1 1 0
7 16 55 10 2 2 0
8 11 50 19 6 6 0
9 13 48 22 2 2 0
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ANEXO 5 – DADOS CLÍNICOS: HIPERTENSÃO ARTERIAL SISTÊMICA (HAS), ÍNDICE DE MASSA CORPÓREA (IMC) E O VALOR DA GLICEMIA DE JEJUM (mg/dl)
Caso nº HAS IMC Glicemia de jejum
1 ausente 22,27 140
2 presente 31,11 235
3 ausente 29,29 100
4 presente 27,55 202
5 ausente 25,39 88
6 presente 23,11 103
7 presente 24,44 111
8 presente 31,11 154
9 presente 29,68 157
ANEXO 6 – DIAGNÓSTICO ANÁTOMO-PATOLÓGICO E ESTADIAMENTO CLÍNICO-CIRÚRGICO DAS PACIENTES COM ADENOCARCINOMA DE ENDOMÉTRIO.
Caso nº Número da
lâmina* Diagnóstico anátomo-patológico Estádio clínico 1 B01-21662 Adenocarcinoma
endometrióide IIB G2
2 B01-14369 Adenocarcinoma
endometrióide IC G1
3 B00-13456 Adenocarcinoma
endometrióide IC G1
4 B00-30897 Adenocarcinoma
endometrióide IIB G3
5 B01-16055 Adenocarcinoma
endometrióide IB G1
6 B00-25760 Adenocarcinoma
endometrióide IIIA G3
7 B01-23352 Adenocarcinoma
endometrióide IIIB G3
8 B01-20544 Adenocarcinoma
endometrióide IC G2
9 B01-12530 Adenocarcinoma
endometrióide IC G2
10 B01-23356 Adenocarcinoma
endometrióide IIIA G3
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Afshari CA, Nuwaisir EF, Barret JC. Application of Complementary DNA Microarray, Technology to Carcinogen, toxicology and drug safety evaluation. Cancer Res. 1999; 59: 4759-60.
Ambros RA & Kurman RJ. Combined assessment of vascular and myometrial invasion as a model to predict prognosis in Stage I endometrioid adenocarcinoma of the uterine corpus. Cancer. 1992a; 69: 1424-31.
Ambros RA & Kurman RJ. Identification of patients with stage I uterine endometrioid adenocarcinoma at high risk of recurrence by DNA ploidy, myometrial invasion, and vascular invasion. Gynecol. Oncol. 1992b; 45: 235-9.
Baker VV. The molecular biology of endometrial adenocarcinoma. Clin. Obstet. Gynecol. 1996; 39(3): 707-15.
Ballester A, Tobena R, Lisbona C, Alvo V, Alemany S. Cot kinase regulation of IL-2 production in Jurkat T cells. J. Immunol. 1997; 159:1613-1618.
Ballester A, Velasco A, Tobena R, Alemany S. Cot kinase activates tumor necrosis factor-alpha gene expression in a cyclosporin A-resistant manner. J. Biol. Chem.1998; 273:14099-14106.
Baracat EC. Aspectos morfológicos e morfométricos do endométrio humano na pós- menopausa, antes e após estrogenioterapia oral e transdérmica. São Paulo, 1991. [Tese- Livre Docência – Escola Paulista de Medicina].
Barakat RR, Park RC, Grigsby PW, Muss HD, Norris HJ. Corpus: Epithelial Tumors. In: Hoskins WJ, Perez CA, Young RC, ed. Principles and Practice of Gynecologic
Oncology. 2 ed. Philadelphia, Lippincott-Raven Publishers; 1997. p.859-96. Bell JG, Minnick A, Reid GC, Judis J, Brownell M. Relationship of nonstaging pathological risk factors to lymph node metastasis and recurrence in clinical stage I endometrial carcinoma. Gynecol. Oncol.1997; 66(3): 388-92.
Berchuck A & Boyd J. Molecular basis of endometrial cancer. Cancer.1995; 76 (suppl.10): 2034-40.
Bishop JM. Molecular themes in oncogenesis. Cell. 1991; 64:235-48.
Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria Nacional de Assistência à Saúde. Instituto Nacional do Câncer. Coordenação de Programas de Controle do Câncer - Pró-Onco. Estimativa da incidência e mortalidade por câncer no Brasil - 1998. Rio de Janeiro, Pro-Onco, 1998. 18p.
Brentani H, Caballero OL, Camargo AA, et al . The generation and utilization of a cancer-oriented representation of the human transcriptome by using expressed sequence tags. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100(23):13418-23.
Brock ML & Shapiro DJ. Estrogen stabilizes vitellogenin mRNA against cytoplasmic degradation. Cell. 1983; 34: 207-14.
Chan AML, Chedid M, Mcgovern E S, Popescu NC, Miki T, Aaronson SA. Expression cDNA cloning of a serine kinase transforming gene. Oncogene. 1993; 8: 1329-1333.
Chiariello M, Marinissen MJ, Gutkind J S. Multiple Mitogen-Activated Protein Kinase Signaling Pathways Connect the Cot Oncoprotein to the c-jun Promoter and to Cellular Transformation Molecular and Cellular. Biology. 2000; 20 (5):1747-1758.
Clark MA, Reynolds SH, Anderson M, Wiest JS. Mutational activation of the MAP3K8 protooncogene in lung cancer. Genes, Chromosomes &Cancer. 2004; 41:99-108. Disaia PJ & Creasman WT. Adenocarcinoma of the uterus. In: Clinical Gynecologic Oncology. 4.ed. St. Louis, Mosby- year book; 1993. p.156-93.
Druker BJ, Mamon HJ, Roberts TM. Oncogenes, growth factors, and signal transduction. N. Engl. J. Med. 1989; 321(20): 1383-91.
Dudoit S, Yang YH, Callow MJ, Speed TP. Statistical methods for identifying
differentially expressed genes in replicated cDNA microarray experiments. Stat. Sin. 2002; 12:111-139.
Esteller M, Garcia A, Martinez-Palones JM, Xercavins J, Reventós J. Clinicopathologic features and genetic alterations in endometrioid carcinoma of the uterus with
villoglandular differentiation. Am. J. Clin. Pathol. 1999; 111(3): 336-42.
Evans MP & Podratz KC. Endometrial neoplasia: prognostic significance of ploidy status. Clin. Obstet. Gynecol.1996; 39(3): 696-706.
Friend SH, Dryja TTP, Weinberg RA. Oncogenes and tumor-suppressing genes. N. Engl. J. Med.1988; 318(10): 618-22.
Gal D, Recio FO, Zamurovic D. The new International Federation of Gynecology and Obstetrics surgical staging and survival rates in early endometrial carcinoma.
Cancer.1992; 69: 200-2.
Gebrim LH, Rodrigues de Lima G, Gonçalves WJ. Fatores prognósticos . In : Rodrigues de Lima G, Gebrim LH, Cintra e Oliveira V, Martins NV. Ginecologia Oncológica. São Paulo, Atheneu; 1999. p.42-54.
49
Homesley HD & Zaino R. Endometrial cancer: prognostic factors. Sem. Oncol. 1994; 21(1): 71-8.
International Federation of Gynecology and Obstetrics - Announcements. FIGO Stages. 1998 Revision. Definitions of the Corpus Cancer Staging. Gynecol. Oncol.1989;
35:125-7.
International Federation of Gynecology and Obstetrics - Annual report on the results of treatment in Gynecological cancer. Stockholm, Sweden, Editorial Office,
Radiumhemmet; 1995. v. 22.
Junqueira LC & Carneiro J. Biologia celular e Molecular. 6ª ed. Rio de Janeiro, Guanabara Koogan; 1997. p. 299.
Kao L C, Tulac S, Lobo S, Imani B, Yang J P, Germeyer A et al. Global gene profiling in human endometrium during the window of implantation. Endocrinology. 2002; 143: 2119.
Keys A, Fidanza F, Karvonen MJ, Kimura N, Taylor HL. Indexes of relative weight and obesity. J. Chron. Dis. 1972; 25:329-43.
Kurian KM, Watson CJ, Wyllie A. DNA Chip technology. J. Pathol. 1999; 187: 267-71. Lukes AS, Kohler MF, Pieper CCF, Kerns BJ, Bentley R, Rodriguez GC, Soper JT, Clarke-Pearson DL, Bast JR RC, Berchuck A. Multivariable analysis of DNA ploidy, p53, and HER-2/neu as prognostic factors in endometrial cancer. Cancer. 1994; 73(9): 2380-5.
Miller RG, JR. Beyond ANOVA: Basics of Applied Statistics. New York: Chapman & Hall, 1977.
Miyoshi J, Higashi T, Mukai H, Ohuchi T, Kakunaga T. Structure and transforming potential of the human cot oncogene encoding a putative protein kinase. Molec. Cell. Biol. 1991; 11: 4088-4096.
Nazeer T, Ballouk F, Malfetano JH, Figge H, Ambros RA. Multivariate survival analysis of clinicopathologic features in surgical stage I endometrioid carcinoma including analysis of HER-2/neu expression. Am. J. Obstet. Gynecol. 1995; 173(6): 1829-34. Patriotis C, Makris A, Bears E, Tsichlisp N. Tumor of rodent cell lymphomas and in T-cell activation. Proc. Natl. Acad. Sci. 1993; 90:2251-2255.
Rakar S & Kovacic J. Prognostic factors in endometrial Cancer. Eur. J. Gynecol. Oncol. 1990; 11(3): 233-5.
Rodrigues de Lima G, Gonçalves WJ, Cintra e Oliveira V, Bortoletto CCR. Endométrio. In: Rodrigues de Lima G, Gebrim LH, Cintra e Oliveira V, Martins NV. Ginecologia Oncológica. São Paulo, Atheneu, 1999. p.326-52.
Schene M, Shalon D, Heller, Chai A, Brown PO, Davis RW. Parallel human genome analysis microarray – based expression monitoring of 1000 genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 1996; 93: 10614-619.
Stávale JN. Aspectos morfológicos do câncer de endométrio. In: Rodrigues de Lima G, Gebrim LH, Cintra e Oliveira V, Martins NV. Ginecologia Oncológica. São Paulo,
Atheneu, 1999. p. 328-32.
Tornos C, Silva EG, El-Naggar A, Burke TW. Agressive Stage I grade 1 endometrial carcinoma. Cancer. 1992; 70: 790-8.
Weinberg RA. The action of oncogenes in the cytoplasm and the nucleus. Science. 1985; 230: 770-6.
Westfall P H, Young S S. Resampling-based Multiple Testing: Examples and Methods for P-Value Adjustment. New York: John Wiley & Sons, 1993.
Gene microarray technology is highly effective in screening for differential gene expression and has hence become a popular tool in the molecular investigation of cancer.
In the present study, cDNA microarrays containing 2000 different genes were used to analyze gene expression profiles in 10 human postmenopausal endometrioid-paired carcinomas specimens versus corresponding adjacent normal tissue to identify differentially expressed genes.
In our study several genes were found differentially expressed. One of them was the MAP3K8, a gene that was never described to be overexpressed in this kind of malignancy.
To validate the differential expression of this gene as well as the membrane array, we performed semiquantitative reverse transcription-PCR analysis. The MAP3K8 was found overexpressed in 30% of endometrial carcinomas samples.
Dicionário Aurélio Eletrônico 2000 [CD-ROM]. São Paulo: Nova Fronteira; 2000.Sumário.
