Estudo da via Wnt no endométrio normal e no câncer de endométrio, em mulheres após a menopausa

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ESTUDO DA VIA WNT NO ENDOMÉTRIO NORMAL E NO CÂNCER DE

ENDOMÉTRIO, EM MULHERES APÓS A MENOPAUSA

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Titulo de Doutor em Ciências.

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ESTUDO DA VIA WNT NO ENDOMÉTRIO NORMAL E NO CÂNCER DE

ENDOMÉTRIO, EM MULHERES APÓS A MENOPAUSA

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Titulo de Doutor em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. Wagner José Gonçalves Co-orientadores: Profa_{. Dra. Celina}

T. F. Oshima Prof. Dr. João Norberto Stávale

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Menezes, Marina de Pádua Nogueira

Estudo da via Wnt no endométrio normal e no câncer de

endométrio, em mulheres após a menopausa. / Marina de Pádua Nogueira Menezes. -- São Paulo, 2011.

vii, 63f.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Ginecologia Oncológica.

Título em inglês: The role of Wnt pathway in the normal endometrium and in the endometrial cancer the post menopause women.

1. Neoplasias do endométrio. 2. Proteinas Wnt. 3. Pós-menopausa. 4. Endométrio. 5. Mulheres.

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DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA

Chefe do Departamento: Prof. Dr. Afonso Celso Pinto Nazário

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ESTUDO DA VIA WNT NO ENDOMÉTRIO NORMAL E NO CÂNCER DE ENDOMÉTRIO, EM MULHERES APÓS A MENOPAUSA

Presidente da banca: Prof. Dr. Wagner José Gonçalves

BANCA EXAMINADORA:

Prof. Dr. Levon Badiglian Filho Prof. Dr. Sérgio Mancini Nicolau Prof. Dr. Roberto Euzébio dos Santos Prof. Dr. Paulo Kassab

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Aos meus pais, pelo amor e apoio incondicionais! Pelas oportunidades que me proporcionaram e pelo incentivo e dedicação diários. Meu porto seguro, que estavam sempre juntos de mim, apesar da distância.

Ao meu esposo, Marcos Vinícius, pelo amor, amizade e apoio. Por estar sempre ao meu lado, entendendo-me e respeitando-me todos os dias.

A minha querida irmã e amiga, Adriana, pelo seu amor imensurável, fundamental em todos os momentos de minha vida!

Às minhas sobrinhas, Maria Clara e Bruna, pelo amor único e verdadeiro, e por entenderem a minha ausência em algumas fases de nossas vidas!

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À Deus, pela oportunidade de estar terminando mais esta etapa da minha formação pessoal e profissional.

A meu tio querido Dr. Antônio Fortes de Pádua Filho, presente desde o início da minha formação, sempre com bons conselhos e orientações, um exemplo de dedicação, amizade e primor profissional.

Ao Professor Doutor Wagner José Gonçalves pela colaboração e pela oportunidade de realizar esta tese. Por seus ensinamentos, paciência e dedicação sempre oferecidos, em todos os momentos necessários.

Ao Professor Doutor Sérgio Mancini Nicolau que contribuiu enormemente com a sua amizade e dedicação, somando os seus ensinamentos muito importantes nesta etapa da minha formação.

À Professora Doutora Celina Oshima pelo auxílio na confecção deste trabalho.

Ao Doutor Levon Badiglian Filho por toda a amizade, paciência, dedicação e incentivo na realização desta tese e ainda pelo seu apoio científico imprescindível para a elaboração e revisão deste trabalho.

Aos Doutores, Robério de Sousa Damião e Roney Signorini Filho por toda a amizade e companheirismo, e a toda equipe da Disciplina de Oncologia Ginecológica da Escola Paulista de Medicina – UNIFESP, pela participação e colaboração na realização desta tese.

Às pacientes, colaboradoras fundamentais para a elaboração deste estudo.

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Dedicatória...iii

Agradecimentos...iv

Resumo...vi

Abstract...vii

1. INTRODUÇÃO...1

2. PROPOSIÇÕES...8

3. METODOLOGIA......10

4. RESULTADOS...15

5. DISCUSSÃO...24

6. CONCLUSÕES...29

7. ANEXOS...31

8. BIBLIOGRAFIAS....52

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endométrio, em mulheres após a menopausa [tese]. São Paulo: “Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo”; 2010. 42p.

Resumo

A família de genes Wnt está envolvida na carcinogênese de diversos tecidos e na embriogênese. Para avaliar as vias Wnt canônica e não-canônica no endométrio atrófico e no câncer de endométrio, avaliamos a expressão imuno-histoquímica do Wnt1, Frizzled-1 (FZD1), Wnt5a, Frizzled-5 (FZD5) e β-catenina. O tecido endometrial foi retirado de peças cirúrgicas de pacientes operadas entre 1995 e 2005 na Escola Paulista de Medicina – UNIFESP e foram divididas em dois grupos: grupo A, endométrio atrófico (n=15) e grupo B, adenocarcinoma de endométrio (n=45). A imunorreação do Wnt1, FZD1, Wnt5a, FZD5 and β-catenina foi analisada em escores em cada grupo, individualmente. A expressão do Wnt1, FZD1 e Wnt5a não teve associação significante entre os grupos. Associação significante foi observada entre os grupos para a expressão do FZD5 (p = 0,001). A proporção do FZD5 positivo foi significativamente maior no grupo A (80,0%) comparado ao grupo B (31,1%). Analisando a curva de sobrevida para o FZD5 no grupo B, não encontramos associação significante entre as mulheres positivas e negativas. A expressão da ß-catenina não foi significante, sendo a expressão para os grupos A e B 100% e 95.6%, respectivamente (p = 1,000). FZD5 tem menor expressão no adenocarcinoma de endométrio tipo I quando comparado ao endométrio atrófico.

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endometrial cancer in the post menopause women [tese]. São Paulo: “Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo”; 2010. 42p.

Abstract

The Wnt family is involved in tumorigenesis of several tissues as well in embriogenesis. In order to analize the canonical and noncanonical Wnt pathway in atrophic endometrium and endometrial adenocarcinoma, we evaluated the immunohistochemical expression of Wnt1, Frizzled-1 (FZD1), Wnt5a, Frizzled-5 (FZD5) and β-catenin. Endometrial specimens were obtained from surgeries performed between 1995 and 2005 and the patients were divided in two groups: Group A, atrophic endometrium (N = 15); Group B, endometrial adenocarcinoma (N = 45). Immunoreactivity for Wnt1, FZD1, Wnt5a, FZD5 and β-catenin was scored for each group. For the expression of Wnt1, FZD1 and Wnt5a, no significant association was observed between the groups. A significant association was observed between the groups for the FZD5 expression (p = 0.001). The proportion of FZD5 positive women was significantly higher for group A (80.0%) compared to group B (31.1%). Regarding the survival curve for FZD5 at group B, we found no significant association between positive and negative women. No significant association was observed between ß-catenin expression and the patient group since the expression for groups A and B were 100% and 95.6%, respectively (p = 1.000).

FZD5 is downregulated in type I endometrial adenocarcinoma when compared to atrophic endometrium.

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Introdução

O câncer de endométrio é a neoplasia genital mais freqüente em países desenvolvidos. Nos Estados Unidos é a sétima neoplasia maligna mais comum, com incidência variando em cada região (1). A Sociedade Americana de Câncer estima que tenham ocorrido 43.470 novos casos de câncer de endométrio em 2010 (5).

No Brasil, a distribuição de casos novos de câncer é desigual, sendo as maiores taxas nas regiões Sul e Sudeste. Na região Sudeste, o câncer de endométrio é o terceiro câncer ginecológico mais freqüente, perdendo, apenas, para o câncer de mama e o câncer de colo do útero (INCA) (4).

Existem diversos fatores relacionados à ocorrência do câncer de endométrio, como maior longevidade, menor paridade, obesidade, uso abusivo do estrogênio no climatério, ovários policísticos, hipertensão arterial, diabetes melittus, sedentarismo, uso de tamoxifeno, antecedente pessoal de câncer de mama, e outros fatores ainda desconhecidos (1, 3, 4, 5).

É uma neoplasia de maior incidência entre as sexta e sétima décadas e, em apenas 5 a 30% dos casos é detectada antes dos 50 anos (2, 4, 5).

O câncer de endométrio é subdividido em dois tipos, baseado em um modelo dualista proposto, em 1983, por Bokhman. O adenocarcinoma endometrióide representa 70-80% dos carcinomas do endométrio, designado como carcinomas do tipo I. Outros subtipos histopatológicos, menos incidentes (10-20%) incluem adenoescamoso, adenoacantoma, seroso papilífero, secretor e células claras, também, chamados de carcinomas do tipo II (1,4, 5, 62).

O carcinoma endometrióide (Tipo I) está relacionado à hiperplasia endometrial e ao hiperestrogenismo, sendo tipicamente tumores bem diferenciados, com bom prognóstico, e geralmente de baixo grau. Ao contrário, o tipo II é pouco diferenciado, não relacionado ao estrogênio e mais frequentemente do tipo seroso e de células claras, com curso clínico agressivo e prognóstico sombrio (1, 4, 5, 37, 38, 39, 40, 62).

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Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO), desde 1988 (82). Devem ser analisados o grau de invasão miometrial, a presença e o grau de comprometimento do colo, da vagina, dos anexos e dos paramétrios; o acometimento dos linfonodos, a citologia peritoneal, invasão de bexiga ou de reto e a presença de metástase à distância (1, 4, 5).

A forma de tratamento mais importante para o câncer de endométrio é a cirurgia. O procedimento inclui lavado peritoneal, histerectomia total, anexectomia bilateral, omentectomia e a linfadenectomia pélvica e para-aórtica (1, 4, 5). A radioterapia adjuvante é realizada de acordo com os achados cirúrgicos e histopatológicos (1, 4, 5). A quimioterapia tem avançado no tratamento adjuvante do câncer de endométrio ou na recorrência, sendo, atualmente, as drogas mais usadas o Paclitaxel e a Cisplatina (1, 36).

A sobrevida, em cinco anos, estabelecida, pela FIGO, é em torno de 85% para o estádio I; 75% para o II; 45% para o III e 25% para o IV (1, 82). Além do estadiamento, existem critérios que modificam a sobrevida, como o grau de invasão miometrial, tipo histológico, grau de diferenciação do tumor, idade, paridade e diagnóstico de diabetes (1).

Atualmente, os carcinomas do endométrio tipos I e II são caracterizados por tipos distintos de receptores hormonais e dos oncogenes envolvidos (1, 62). Os receptores de estrogênio e de progesterona no tumor podem ser detectados pela técnica de imuno-histoquímica. A presença deles está relacionada com tipos histológicos bem diferenciados, menor invasão de profundidade, raras metástases regionais e à distância e maior sobrevida (11, 12).

A relação entre a instabilidade microsatélite e o câncer de endométrio tem sido mostrada em muitos estudos. Esta ploidia do DNA é determinada por defeito no gene MMR que não corrige os erros durante a replicação do DNA, resultando em mutação do genoma humano e consequentemente o fenótipo da instabilidade microsatélite. Está presente em cerca de 25% dos tumores de endométrio, sendo mais freqüente nos tumores estrogênio-dependentes (20 a 35%) (11, 12, 35, 39,40, 62, 63).

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comprovadamente envolvidos na carcinogênese endometrial, como: p53, o PTEN e a

β-catenina (1, 6, 7, 9, 37, 38, 39, 40).

O gene supressor de tumor p53 encontra-se envolvido no câncer de humanos e é o mais bem estudado. Observa-se em torno de 10 a 25% dos casos de câncer de endométrio. Alguns estudos o relacionam a estadios avançados do câncer de endométrio, tumores pouco diferenciados e subtipos histológicos mais agressivos (6, 7, 9, 37, 62).

O PTEN (Phosphatase and tension homolog) é outro gene supressor de tumor e consiste na alteração genética mais freqüente do câncer de endométrio, encontrada em 30 a 80 % dos casos. Também está presente em 15 a 55 % das hiperplasias endometriais com ou sem atipias, o que sugere relacionar-se a um evento precoce da carcinogênese endometrial, permitindo a evolução do endométrio normal para hiperplasia e, depois, ao carcinoma (1, 7, 37, 38, 39, 40, 63).

A β-catenina é uma proteína codificada pelo gene CTNNB1 (Cadherin-associated protein, beta 1), localizado no cromossomo 3p21. Pode agir na membrana da célula, mantendo a polaridade da mesma, e, no citoplasma, interagindo com proteinas APC (Adenomatous polyposis coli protein), funciona como fator de transcrição (38, 39, 40).

O acúmulo nuclear anormal de β-catenina pode ocorrer como resultado de mutações no gene CTNNB1 e nos genes relacionados à ativação da transcrição através da via LEF/ Tcf. As proteínas APC regulam a quantidade de β-catenina através da glicogênio sintase quinase- 3β (GSK-3β), induzindo a fosforilação dos resíduos da

serina-treonina codificadas no exon 3 do gene CTNNB1 e é degradado pela via da ubiquitina. A ativação desta via está presente em diversos tumores humanos, estando presente em 14 a 44 % dos carcinomas endometriais relacionados ao estrogênio (24, 37, 39, 52, 53, 74, 75). Os tumores de endométrio associados a β-catenina são caracteristicamente tumores diagnosticados em estádios precoces e com prognóstico favorável (37,39, 43, 52, 62, 77).

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em 1991, sugeriram a mudança do nome do gene Int-1 para Wnt1 por ele ser ao mesmo tempo um gene Int e homólogo do gene wingless da drosófila (15, 19).

Em mamíferos, há muitos tipos de genes Wnt conhecidos como: Wnt1, Wnt2, Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 e Wnt16 (41, 42).

Podem-se isolar homólogos dos genes Wnt em diversas espécies como Drosophila, Xenopus, galinhas e humanos (21). No entanto, há diversas razões que dificultam o conhecimento sobre a via Wnt como a diversidade de tipos de genes e de frizzled, a difícil purificação do Wnt e a existência de muitas moléculas extracelulares e de superfície envolvidas nesta via (42, 44).

Os genes Wnt regulam o processo de desenvolvimento, incluindo o crescimento, a proliferação, a diferenciação, a motilidade e a apoptose celulares, e relacionam-se a embriogênese, podendo estar envolvidos com diversos tipos de câncer (13, 17, 21, 23, 24, 34, 41, 45). Acredita-se que o Wnt tem diversas funções dependendo do receptor com o qual se liga (41, 42). Alguns tipos de câncer estão envolvidos com o Wnt, como o câncer de mama, de ovário, colorretal, renal e de pâncreas (10, 16, 54, 64).

A via Wnt é bastante complexa, sendo dividida em três tipos: canônica, não-canônica e Wnt-Ca2+ (Figura 1) (24, 26, 27, 61). Existe uma via inicial comum em que as glicoproteínas secretadas pelos genes Wnt ligam-se ao Frizzled (Fz-uma família de dez receptores da superfície celular), e a LRP-5 ou LRP-6(co-receptores das lipoproteínas de baixa densidade), localizados na superfície das células (13, 24, 26). Através desta interação, um sinal é enviado ao citoplasma da fosfoproteína Dishevelled (Dsh) que consiste na chave transmissora do sinal Wnt (13, 24, 26). Existem três proteínas Dsh nos mamíferos (Dsh-1, Dsh-2 e Dsh-3) que contém fortes domínios: o amino-terminal DIX (nomeado pelo Dsh e Axin), o central PDZ (nomeado pelo Postsynaptic density-95, Discs-large e Zonula) e o carboxi-terminal DEP (nomeado pelo Dsh, Egl-10 e Pleckstrin) (24, 28). A este nível, as vias separam-se, seguindo caminhos distintos, sendo que alguns autores descrevem a via não canônica e a via wnt-Ca2+ como única (24).

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Na via canônica, o sinal Wnt utiliza os domínios DIX e PDZ da Dsh para induzir a estabilização da β-catenina no citoplasma. A regulação da estabilidade da β-catenina é mediada pelo complexo de proteínas, incluindo Axina, glicogênio sintase quinase 3 (GSK3), proteína ligadora GSK-3 (GBP) e caseína quinase 1 (CK1). Quando não há o

estímulo Wnt, a β-catenina é degradada pelo β-TrCP (β-transducin repeat containing protein). Porém, se ocorre o estímulo Wnt, a fosforilação da β-catenina pela GSK-3 é

inibida. Consequentemente, a β-catenina não é degradada e se acumula no citoplasma e no núcleo, onde se liga aos fatores de transcrição TCF/LEF e a outros fatores (co-ativadores p300, creb-binding protein-CBP), levando à transcrição de genes alvos Wnt como o c-myc e cyclin D1 (24, 25, 26, 37, 39).

A via não-canônica participa da polaridade celular, dos movimentos celulares durante a gastrulação e de outros processos por transdução através dos domínios PDZ e DEP da Dsh, levando à modificação do esqueleto da actina. A este nível, duas vias, independentes e paralelas, ativam pequenas GTPases, Rho e Rac (24).

A ativação do Rho requer a proteína Daam1 que se liga ao domínio PDZ da Dsh, levando a ativação quinase Rho-associada ROCK, mediando a reorganização do citoesqueleto. A ativação do Rac é independente da proteína Daam1 e requer o domínio DEP da Dsh, simulando a ativação da Jun-N-terminal quinase (JNK) (24).

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A via Wnt-Ca2+ é importante para a adesão celular e movimentos celulares durante a gastrulação e recebe influência das vias canônica e não-canônica. A sinalização ocorre através dos receptores Frizzled, levando ao acúmulo de cálcio intracelular, processo regulado pelas proteínas G heterotrimericas e outras numerosas moléculas, incluindo a fosfolipase C (PCL), cálcio-calmodulina-dependente quinase 2 (GamK2), proteína quinase (PKC), Jun-N-terminal quinase (JNK) (24, 26).

Alguns genes Wnt podem ativar tanto uma via quanto a outra, como o Wnt3a. Já o Wnt5a ativa apenas a via não-canônica e os genes Wnt1 e 7a, a via canônica (24, 29, 30, 31, 55, 56).

A expressão do gene Wnt no útero humano foi estudada pela primeira vez por Bui et al, em 1997, em Oxford (14). Ele observou forte expressão do gene Wnt7a no endométrio humano normal, principalmente na fase secretora do ciclo menstrual, e dos genes Wnt7a e 7b no câncer de endométrio (14,30).

A partir daí, a expressão da via Wnt no endométrio passou a ser investigada por outros autores. Em 2003, Tulac et al. demonstraram que o gene Wnt7a no epitélio endometrial mantém a expressão do gene Wnt5a (13). Sabe-se que o gene Wnt5a contém cinco exons e está mapeado em 3p14.2-p21.1 (32). Diversos estudos apontam-no como um importante regulador da proliferação e diferenciação celular (46, 47, 48, 49, 50) e, por esta razão, algumas evidências mostram que variações na sua expressão podem estar associadas a diversos tipos de cânceres, como os de fígado, mama, próstata e pâncreas (54, 64). No câncer de endométrio, o Wnt5a tem expressão diminuída e acredita-se que seja antagonista do Wnt1 (33, 57). O Wnt1 está localizado no cromossomo 12q13 (51) e consiste em um importante fator de transformação e tumorigênese celulares (33).

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Proposições

Propõe-se no estudo:

1. Estudar a expressão das proteínas Wnt1, Frizzled1, Wnt5a, Frizzled5 e β -catenina em tecidos de endométrio atrófico e no câncer do endométrio de mulheres menopausadas, pela técnica de imuno-histoquímica.

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Metodologia

Pacientes

Estudo retrospectivo de tecidos endometriais, blocados em parafina, de mulheres na pós-menopausa com diagnóstico histopatológico de endométrio atrófico ou adenocarcinoma endometrióide de endométrio, atendidas na Disciplina de Ginecologia Oncológica da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM), no período de 1993 a 2005.

Os blocos e lâminas corados pela Hematoxilina-eosina (HE) pertinentes às casuísticas de interesse foram recuperados do Arquivo de Blocos do Departamento de Patologia da UNIFESP/EPM. A revisão histopatológica foi realizada e foram selecionadas as áreas de interesse ao estudo imuno-histoquímico.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de ética em Pesquisa da UNIFESP/EPM sob o número 0226/06.

Foram formados dois grupos: A – endométrio atrófico (n=15) e B – câncer do endométrio (n=45).

Critérios de Inclusão

Foram incluídos os blocos de pacientes com diagnóstico de endométrio atrófico ou adenocarcinoma endometrióide de endométrio sem tratamento (quimioterápico ou radioterápico), pré-cirúrgico, maiores de 40 anos e nos quais o material histopatológico encontrava-se adequado para montagem do TMA (Tissue microarray).

Critérios de Exclusão

Pacientes com qualquer outro tipo histológico de câncer endometrial, menores de 40 anos, com tratamento pré-cirúrgico. Não foram utilizados blocos que apresentaram material inadequado para a confecção do TMA.

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Para a confecção do TMA os blocos com material embebido em parafina foram selecionados oriundos do arquivo do Departamento de Patologia da UNIFESP/EPM. Posteriormente, cortes histológicos foram efetuados e corados pelo HE. Foram analisados por patologista que selecionou e delimitou área representativa do tumor. A seguir, esta área foi delimitada no “bloco doador” com uma caneta de marcação

permanente, que serviu de guia para a retirada dos fragmentos tumorais do local exato.

Após marcação, o bloco doador foi puncionado e retirado fragmentos com 1.0 mm de diâmetro que foi transferido para o bloco receptor. Foi confeccionado o bloco receptor com imagem em espelho, sendo incluídos 220 cilindros de adenocarcinoma de endométrio e 30 cilindros de endométrio atrófico. Tecido hepático foi acrescentado no bloco para auxiliar na localização inicial de cada seqüência utilizada.

Os blocos receptores foram colocados na estufa a 35° por 15 minutos, a fim de permitir a aderência entre a parafina do bloco e os cilindros. Após a aderência, os blocos receptores foram retirados da estufa e cortados com espessura de 4 µm. Foi colocada fita adesiva em cima do bloco antes de ser cortado, para auxiliar na aderência entre o corte e a lâmina. Para manter esta aderência, a lâmina foi submetida à luz ultravioleta por 15 minutos, depois em solução (TPC Solvent) novamente por 15 minutos. Para retirada da fita, a lâmina foi deixada em temperatura ambiente até secarem, e posteriormente, a fita foi retirada com o auxilio de uma pinça e a lâmina estocada no freezer.

Por meio de planilha elaborada no programa Excel® (Windows® - Microsoft® Office) foi possível organizar e localizar cada caso nas lâminas do TMA.

Imuno-Histoquímica

O método imuno-histoquímico foi empregado para a detecção das proteínas Wnt1, Wnt5a, Frizzled1, Frizzled5 e β-catenina em um total de 60 amostras (45 de câncer do endométrio e 15 de endométrio atrófico).

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localizado e o segundo pelo anticorpo conjugado à biotina com capacidade para ligar-se especificamente ao anticorpo primário. O terceiro é o complexo peroxidaligar-se conjugado à biotina associada à estreptavidina. Por último, utilizou-se um substrato e agente cromogênico que permitiu visualizar o antígeno pela formação de precipitado marrom estável na região correspondente a membrana e citoplasma da célula.

Como controle positivo, foi utilizado corte histológico de carcinoma de cólon comprovadamente positivo para as proteínas de interesse. Para o controle negativo o anticorpo primário foi substituído por PBS. A imuno-expressão correspondeu à coloração acastanhada do núcleo, da membrana ou do citoplasma, dependendo das características de cada proteína.

Critérios de Avaliação

Em relação às proteínas Wnt 1, Wnt 5a, Frizzled 1 e Frizzled 5, a interpretação dos resultados seguiu a seguinte padronização:

- Pontuação 0: nenhuma coloração ou coloração de menos de 10% das células. Reação considerada negativa;

- Pontuação 1+: fraca coloração em mais de 10% das células. Células coradas apenas em parte da membrana. Reação considerada negativa;

- Pontuação 2+: Coloração de fraca a moderada. Membrana corada completamente em mais de 10% das células. Reação considerada positiva;

- Pontuação 3+: Coloração forte e completa da membrana em mais de 10% das células. Reação considerada positiva.

Já a interpretação da β-catenina foi feita conforme a seguinte pontuação:

- Pontuação 1: Coloração de até 4% do núcleo e do citoplasma da célula. Reação considerada negativa;

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- Pontuação 3: Coloração de 30% a 49% do núcleo e do citoplasma da célula. Reação considerada moderada;

- Pontuação 4: Coloração de mais de 50% do núcleo e do citoplasma da célula. Reação considerada forte.

Análise estatística

Neste teste, considerou-se duas hipóteses:

- Hipótese da nulidade: As populações estudadas não diferem em relação à frequência com que ocorre uma característica (independente entre as variáveis).

- Hipótese experimental: As diferenças amostrais refletem diferenças reais na população (dependência entre as variáveis). Se as diferenças entre as frequências obtidas e as esperadas forem suficientemente grandes, rejeita-se a hipótese de nulidade e afirma-se que há uma diferença real na população.

O impacto de determinadas variáveis sobre o prognóstico foi medido analisando-se a sobrevida global que é definida como o tempo, em dias, desde a data da cirurgia, ou da biópsia, até o óbito, ou a última informação objetiva do seguimento. No acompanhamento, considerou-se como perdida a paciente que não retornou à consulta, ou da qual não se obteve qualquer informação após o intervalo estipulado pelo médico para sua reavaliação.

O cálculo dos estimadores de sobrevida foi realizado pela técnica de Kaplan-Meier. As comparações entre distribuições de sobrevida para as categorias de uma mesma variável foram realizadas pelo teste de Log-Rank, quando não houve cruzamento entre as curvas, ou pelo teste de Wilcoxon, quando houve cruzamento entre elas (KAPLAN & MEIER, 1958).

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Resultados

Os resultados foram avaliados nos dois grupos estudados: grupo A - endométrio atrófico e grupo B - câncer do endométrio.

No grupo B, a média de idade foi 65,9 anos e a doença foi mais incidente na raça branca (88,9%) (tabela 1) e o estadiamento mais encontrado foi o IB e IC (tabela 2).

Tabela 1: Média de Idade e Raça das Pacientes com Câncer de Endométrio

Variáveis (n = 45)

Idade (anos)

média (dp) 65,9 (8,6)

mediana 65

mínimo – máximo 51 – 88

Raça– n (%)

Branca 40 ( 88,9%)

Negra 5 ( 11,1%)

Tabela 2: Estadiamento Clínico das Pacientes com Câncer de Endométrio

EstadioClínico – n (%) n = 44

IB 13 ( 29,5%)

IC 16 ( 36,4%)

IIA 2 ( 4,5%)

IIB 5 ( 11,4%)

IIIA 5 ( 11,4%)

IIIB 1 ( 2,3%)

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Em todos os casos, a expressão dos marcadores Wnt1, Wnt5a, Frizzled1,

Frizzled 5 e β-catenina foi encontrada praticamente somente no citoplasma (figura 2).

Figura 2: Expressão dos Marcadores das proteínas Wnt1, Wnt5a, Frizzled1,

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Nenhuma diferença significante foi observada na expressão da ß-catenina entre os grupos A e B, com positividade de 100% e 95.6%, respectivamente (p = 1.000) (tabela 3 e gráfico 1).

Tabela 3 – Distribuição da Expressão da β-catenina e do sublocal nas pacientes segundo o grupo

Escore de Beta catenina– n (%)

Grupo

Tumor (n = 45) Atrófico (n = 15)

Negativo 2 ( 4,4%) 0 ( 0,0%)

Positivo 43 ( 95,6%) 15 (100,0%)

Comparação p = 1,000

Sublocal

0 2 ( 4,4%) 0 ( 0,0%)

2 43 ( 95,6%) 15 (100,0%)

Gráfico 1 –Distribuição da expressão de β-catenina nas pacientes segundo o grupo

4,4

0

95,6 100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tumor Atrófico

Beta catenina negativo Beta catenina positivo p = 1,000

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Com relação à expressão do Wnt1, FZD1 e Wnt5a, nenhuma diferença significante foi observada entre os grupos (tabelas 4, 5, 6 e gráficos 2, 3, 4).

Tabela 4– Distribuição da Expressão de Wnt 1 e do sublocal nas pacientes segundo o grupo

Escore de Wnt 1 n (%)

Grupo

Negativo 2 ( 4,4%) 0 ( 0,0%)

Positivo 43 ( 95,6%) 15 (100,0%)

Sublocal

0 1 ( 2,2%) 0 ( 0,0%)

1 1 ( 2,2%) 0 ( 0,0%)

2 43 ( 95,6%) 15 (100,0%)

Gráfico 2 – Distribuição da expressão de Wnt 1 nas pacientes segundo o grupo

4,4

0,0

95,6 100,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tumor Atrófico

WNT 1 negativo WNT 1 positivo p = 1,000

(30)

Tabela 5– Distribuição da Expressão de FZD1 e do sublocal nas pacientes segundo o grupo

Escore de FZD1– n (%)

Grupo

Maligno (n = 35) Benigno (n = 21)

Negativo 1 ( 2,2%) 0 ( 0,0%)

Positivo 44 ( 97,8%) 15 (100,0%)

Sublocal

2 45 (100,0%) 15 (100,0%)

Gráfico 3 – Distribuição da expressão de FZD1 nas pacientes segundo o grupo

2,2 _0,0

97,8 100,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tumor Atrófico

FZD 1 negativo FZD 1 positivo p = 1,000

(31)

Tabela 6– Distribuição da Expressão de Wnt 5a e do sublocal nas pacientes segundo o grupo

Escore de Wnt 5a–

n (%)

Grupo

Negativo 0 ( 0,0%) 0 ( 0,0%)

Positivo 45 (100,0%) 15 (100,0%)

Comparação p = ---

Sublocal

2 45 (100,0%) 15 (100,0%)

Gráfico 4 – Distribuição da expressão de Wnt 5a nas pacientes segundo o grupo

Em contrapartida, houve diferença significante entre os grupos com relação à expressão do FZD5 (p = 0.001). A proporção das mulheres FZD5 positivas foi maior no grupo A (80.0%) comparado ao grupo B (31.1%) (tabela 7 e gráfico 5).

0,0 0,0

100,0 100,0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tumor Atrófico

WNT 5a negativo WNT 5a positivo

(32)

Tabela 7– Distribuição da Expressão de FZD5 nas pacientes segundo o grupo

Escore de FZD5– n (%)

Grupo

Negativo 31 ( 68,9%) 3 ( 20,0%)

Positivo 14 ( 31,1%) 12 ( 80,0%)

Comparação p = 0,001 *

Gráfico 5 – Distribuição da expressão de FZD5 nas pacientes segundo o grupo

Quanto à curva de sobrevivência para FZD5, no grupo B, não se observou diferença entre mulheres positivas e negativas (p= 0,301) (gráfico 6).

68,9 20,0 31,1 80,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Tumor Atrófico

FZD 5 negativo FZD 5 positivo p = 0,001 *

(33)

Gráfico 6 – Curva de Sobrevida FZD5

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Tempo de Seguimento (meses)

FZD 5 negativo FZD 5 positivo

P

rob

ab

ili

da

de

S

ob

rev

ida

(34)

(35)

Discussão

Via Canônica

O adenocarcinoma endometrióide está relacionado ao câncer do endométrio tipo I, o qual está associado, diretamente, ao hiperestrogenismo (1). Portanto, a chave para entender o papel da via de sinalização Wnt no câncer do endométrio tipo I, é encontrar a ligação entre Wnts e a sinalização do estrogênio.

Muitos autores sugerem que a mutação da β-catenina/CTNNB1 no endométrio levaria ao seu acúmulo no núcleo, resultando no câncer do endométrio (74, 75, 76). Pijnenborg et al encontraram o acúmulo nuclear de β-catenina em 38% dos cânceres do endométrio (43). Kariola et al encontraram 53% (17) e Schlosshauer et al, 47% (71).

Em nosso trabalho, não encontramos diferença significante na expressão da β -catenina, quando comparamos o endométrio atrófico com o câncer do endométrio.

Bansal et al (2009) pontuaram que a β-catenina tem menor associação com o câncer endometrial, embora significante, quando comparada a outras alterações genéticas (65). Segundo estes autores, a mais freqüente alteração genética do câncer do endométrio é o PTEN, conforme também demonstrado em outros trabalhos (1, 7, 8, 37, 38, 65, 72). Por outro lado, parece que as mutações do PTEN não causam acúmulo

nuclear de β-catenina em carcinomas do endométrio, como foi demonstrado por Wappenschmidt et al (72). Assim, conjecturamos que, em nossa pesquisa, este pode ter sido o motivo de não termos achado diferença entre os grupos estudados.

Além disso, a expressão da β-catenina pode estar envolvida com o desenvolvimento das lesões precursoras do câncer do endométrio, sendo menos importante para o desenvolvimento do câncer endometrial. Nei et al encontraram a β -catenina nuclear em 70% das amostras de hiperplasia endometrial e 56,7% das amostras do câncer do endométrio. Entretanto, eles também demostraram que existe

acúmulo nuclear da β-catenina nas fases pré-proliferativa e pós-proliferativa, e na fase secretora inicial do endométrio normal durante o ciclo menstrual. Neste período, observaram que 12 dos 15 casos estudados (80,0%) apresentaram acúmulo nuclear da

(36)

Há relatos que correlacionam estrógenos com a via canônica Wnt, sugerindo que esta seja capaz de regular o crescimento celular uterino dependente do estrogênio, através da estabilização nuclear da β-catenina. Mostram, também, que o aumento do número de receptores estrogênicos promove a inibição do Wnt5 e Frizzled5, levando ao desenvolvimento do câncer (77,79).

Os estudos realizados em células epiteliais mamárias e no câncer de mama

revelaram que a baixa concentração da β-catenina em células com elevado nível de MTA1s (antígeno metastático do tumor) foi acompanhada por redução correspondente na expressão do gene Wnt1 (73). Assim, conforme exemplificado por Kumar et al, destaca-se que outros fatores podem coexistir, interferindo na sinalização da via Wnt.

Em relação aos resultados encontrados para o Wnt1, observamos que os dois grupos estudados foram Wnt1 positivos (endométrio atrófico 100%; adenocarcinoma 95,6%), sem diferença estatística entre eles. Olson et al afirmaram que o Wnt1 está relacionado com a tumorigênese, enquanto o Wnt5a não (33, 78, 80, 81). Propuseram, ainda, que existe uma relação antagonista entre estes dois genes, podendo um suprimir o outro (13, 33, 57). Sugere-se então que em nosso estudo o Wnt5a pode ter inibido o Wnt1 no endométrio atrófico e não no adenocarcinoma do endométrio, conforme explicaremos a seguir. Por outro lado, Topol et al demonstraram que o Wnt1 pode também ser inibido por diversos mecanismos, incluindo a expressão de proteínas APC e Siah2 (Seven-in-Absentia Homolog 2) (54).

Segundo os resultados da nossa pesquisa, o Frizzled1 foi positivo em ambos os grupos, não existindo diferença significante.

O Frizzled1 constitui receptor da superfície celular, que se liga a diversos co-receptores, podendo ativar diferentes vias Wnt. É responsável pela diferenciação, proliferação e apoptose celular, e sua função depende do Wnt a que está ligado (59). Evidências sugerem que o Frizzled 1 pode ser estimulado a partir dos Wnt3a, Wnt3 e Wnt1 e, dessa forma, em nosso estudo, o Frizzled1 pode ter seguido várias alternativas, mostrando resultados semelhantes em ambos os grupos (58, 60).

(37)

Via Não-Canônica

Em nosso estudo, encontramos o Wnt5a positivo (100%) em ambos os grupos. Entretanto, a expressão do FZD5 foi significativamente maior no grupo A – endométrio atrófico (80,0%), quando comparado ao grupo B – adenocarcinoma (31,1%).

É possível que a semelhança entre os grupos em relação ao Wnt5a seja causada pela expressão natural do Wnt5a no endométrio normal e no câncer do endométrio. Pode-se conjecturar, ainda, que o mesmo padrão hormonal entre os dois grupos, levam a fenótipos parecidos, havendo interferência na expressão do Wnt e permitindo resultados iguais e positivos 100 % em ambos os grupos (13, 14).

Infere-se dos estudos de Olson et al que o Wnt5a é inibido no câncer de endométrio e no câncer de mama, por regular o crescimento e a proliferação celular. Isto sugere que a diminuição da expressão do Wnt5a é importante na progressão dos eventos que levam ao desenvolvimento do câncer. Por outro lado, podemos, ainda, considerar o fato de que o Wnt5a se ligou ao FZD5. Dessa forma, acredita-se que, em nosso estudo, devido à baixa frequência do FZD5 no grupo do adenocarcinoma, a sinalização não-canônica pode não ter funcionado adequadamente, possibilitando o desenvolvimento do câncer, pela ação tumorigênica do Wnt1.

Corroborando com as idéias explanadas, Ishitani et al e Topol et al propuseram que a sinalização não-canônica pode inibir a sinalização canônica através de diversos mecanismos (54, 66).

Singleton et al descobriram que o Wnt5a e o FZD5 são inibidos pelo bisfenol-A (um antagonista do receptor de estrogênio) e pelo estradiol (67). Estas descobertas estão de acordo com a fisiopatologia do adenocarcinoma do endométrio do tipo I. Semelhante ao câncer de endométrio, o câncer de mama também é estimulado por estrogênios (67). Jonsson et al descobriram que a perda de expressão do Wnt5a foi significativamente associada à um alto grau histológico, recidivas da doença e morte (68). Semelhantes achados foram descritos por outros autores em seus estudos sobre o câncer de mama e a via Wnt (43, 68,69,70).

Recentemente, o nosso serviço defendeu a idéia de que a via Wnt não-canônica tem papel importante no câncer de ovário, relacionado ao pior prognóstico. Em

(38)

carcinoma endometrióide do ovário. Esta neoplasia tem um padrão molecular semelhante ao adenocarcinoma do endométrio, no que concerne a via Wnt. Dessa forma, pode-se sugerir que a baixa atividade da via Wnt não-canônica, por não

degradar a β-catenina, permitiria o desenvolvimento do adenocarcinoma do endométrio do tipo I. Isto reflete a complexidade da via Wnt, em que o conceito de genes supressores e promotores de tumores é inconstante (64).

No presente estudo, não encontramos diferença entre os grupos referentes ao Wnt5a. No entanto, outras pesquisas acharam-no inibido em carcinomas do endométrio quando comparado ao tecido normal (14).

(39)

CONCLUSÕES

(40)

Conclusões

1) Observou-se grande expressão do Wnt1, Frizzled1, Wnt5a e β -catenina, tanto no câncer do endométrio quanto no endométrio atrófico, não havendo diferença entre os grupos. Em contrapartida, verificou-se que a expressão do Frizzled5 foi maior no endométrio atrófico do que no câncer do endométrio.

(41)

(42)

(43)

(44)

Anexo 2: Identificação das Pacientes com neoplasia do endométrio

Caso

n0 _(Iniciais)Nome Identificação_(RG_–_HSP) Número da _lâmina _(Anos)Idade Raça

01 EOV 817.086 B93/8.625 58 BRANCA

02 HF 825.219 B93/9.662 62 BRANCA

03 MCMS 840.454 B93/11.278 56 NEGRA

04 AZC 415.180 B93/11.711 66 BRANCA

05 DLRLP 674.443 B94/4.636 53 BRANCA

06 TA 860.632 B94/11.605 63 BRANCA

07 EMA 901.106 B95/10.045 69 BRANCA

08 EMT 889.383 B95/10.904 61 BRANCA

09 NR 903.933 B95/12.993 68 BRANCA

10 MA 916.948 B95/19.081 75 BRANCA

11 AJML 937.128 B96/12.867 57 BRANCA

12 ESP 943.134 B96/15.094 79 BRANCA

13 MFP 939.872 B96/16.992 71 BRANCA

14 PPP 722.129 B96/17.766 78 BRANCA

15 EMJP 935.374 B97/656 62 NEGRA

16 DAS 966.405 B97/17.163 70 BRANCA

17 GP 850.066 B98/1.022 64 BRANCA

18 AS 434.048 B98/14.541 83 NEGRA

19 IBO 334.851 B98/17.246 69 BRANCA

20 RAM 1.004.840 B98/21.981 72 BRANCA

21 RZGFP 1.012.705 B99/5.228 59 BRANCA

22 DAFA 951.933 B99/6881 62 BRANCA

23 GAG 893.799 B01-12530 78 BRANCA

24 SSD 1.134.962 B01-14369 72 BRANCA

25 RNP 1.113.914 B01-18651 63 BRANCA

26 WT 1.116.275 B01-18816 53 BRANCA

27 CS 648.097 B01-21662 56 BRANCA

28 MAC 1.164.898 B01-22453 63 NEGRA

29 GNS 818.247 B01-23356 59 BRANCA

30 MJM 684.434 B03-00987 69 BRANCA

31 AAM 10.022.817 B03-14689 70 BRANCA

32 IBP 847.374 B03-19803 78 BRANCA

33 RMTF 1.100.903 B03-26792 54 BRANCA

34 LAM 10064489 B03-30535 55 BRANCA

35 RJR 772.992 B01-20544 69 BRANCA

36 NCO 356.909 B03-22720 64 BRANCA

37 TNL 902.480 B03-28421 66 BRANCA

38 IVCS 10.020.491 B02-16746 70 BRANCA

39 MFNSC 1.051.409 B00-13456 56 BRANCA

40 EAA 10.040.681 B02-39361 70 BRANCA

41 EPO 1.201.218 B01-23352 65 NEGRA

42 DFB 601.299 B01-40704 63 BRANCA

43 RFC 1.062.508 B00-30897 73 BRANCA

44 MFRM 10.020.893 B02-13071 51 BRANCA

(45)

Anexo 3: Antecedentes Ginecológicos e Obstétricos: Idade da Menarca e da Menopausa , Tempo de Menopausa (Anos), Número de Gestações (G), Partos (P) e Abortamentos (A) das enfermas com neoplasia endometrial.

Caso n0 Menarca Menopausa Tempo de

pós-menopausa G P A

01 13 54 4 0 0 0

02 13 52 10 0 0 0

03 11 52 4 7 6 1

04 14 50 16 3 3 0

05 11 46 7 4 3 1

06 14 54 9 3 1 2

07 14 50 19 3 3 0

08 13 46 15 3 1 2

09 11 45 23 1 1 0

10 12 53 20 5 4 1

11 13 50 7 3 3 0

12 15 45 34 2 1 1

13 12 50 11 1 1 0

14 14 51 17 3 2 1

15 12 52 10 6 5 1

16 13 53 17 4 4 0

17 12 50 14 0 0 0

18 11 55 28 8 7 1

19 11 45 24 2 1 1

20 12 45 27 2 1 1

21 13 40 19 3 3 0

22 13 57 5 2 2 0

23 13 48 30 2 2 0

24 13 48 30 3 3 0

25 14 53 10 3 3 0

26 12 47 6 1 1 0

27 15 45 26 11 11 0

28 12 48 40 4 3 1

29 12 49 14 3 3 0

30 12 48 22 9 9 0

31 18 36 34 1 1 0

32 12 53 16 4 4 0

33 17 52 26 3 2 1

34 11 49 5 2 2 0

35 11 50 19 6 6 0

36 16 52 26 5 3 2

37 14 43 21 4 4 0

38 12 50 13 1 1 0

39 13 47 9 0 0 0

40 13 50 1 3 3 0

41 11 48 8 3 3 0

42 16 55 10 2 2 0

43 14 53 20 7 7 0

44 14 53 6 2 2 0

(46)

Anexo 4: Dados Clínicos: Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS), Índice de Massa Corpórea (IMC) e o Valor da Glicemia de Jejum (mg/dl) das enfermas com câncer de endométrio.

Caso No HAS IMC Glicemia de jejum

01 Ausente 30,82 93

02 Presente 28,98 84

03 Presente 25,47 130

04 Presente 24,77 159

05 Ausente 31,24 94

07 Presente 35,58 106

08 Ausente 28,84 86

09 Ausente 24,58 99

11 Ausente 33,46 91

12 Presente 25,15 241

13 Presente 24,21 124

14 Presente 27,05 102

17 Ausente 24,97 88

19 Presente 34,04 103

20 Ausente 25,47 204

21 Ausente 23,29 112

22 Presente 37,39 143

23 Presente 29,68 157

24 Presente 31,11 235

25 Presente 25,77 100

28 Ausente 27,11 93

30 Ausente 29,08 116

31 Presente 32,41 125

34 Ausente 34,37 90

35 Presente 31,11 154

36 Ausente 33,20 100

37 Presente 36,71 102

38 Presente 27,55 129

39 Ausente 29,29 100

40 Ausente 27,15 100

41 Ausente 22,27 140

42 Presente 24,44 111

43 Presente 27,55 202

44 Ausente 26,95 87

(47)

Anexo 5: Diagnóstico Anatomopatológico e Estadiamento Clínico-Cirúrgico das Pacientes com Adenocarcinoma de Endométrio.

Caso No Número da lâmina Diagnóstico

Anatomopatológico Estadio Clínico Sobrevida (Meses)

01 B93/8.625 Adenocarcinoma endometrióide IC G2 > 60

02 B93/9.662 Adenocarcinoma endometrióide IIA G1 > 60

03 B93/11.278 Adenocarcinoma endometrióide IB G1 > 60

06 B94/11.605 Adenocarcinoma endometrióide IIIA G1 > 60

09 B95/12.993 Adenocarcinoma endometrióide IIIC G1 > 60

15 B97/656 Adenocarcinoma endometrióide IC G1 > 60

16 B97/17.163 Adenocarcinoma endometrióide IIA G1 > 60

18 B98/14.541 Adenocarcinoma endometrióide IB G2 60

19 B98/17.246 Adenocarcinoma endometrióide IIB G2 60

20 B98/21.981 Adenocarcinoma endometrióide IB G2 >60

22 B99/6881 Adenocarcinoma endometrióide IIB G3 > 60

23 B01-12530 Adenocarcinoma endometrióide IC G2 > 60

25 B01-18651 Adenocarcinoma endometrióide IIIA G2 > 60

26 B01-18816 Adenocarcinoma endometrióide IB G2 > 60

27 B01-21662 Adenocarcinoma endometrióide IIB G2 50

29 B01-23356 Adenocarcinoma endometrióide IIIA G3 15

32 B03-19803 Adenocarcinoma endometrióide IC G1 38

34 B03-30535 Adenocarcinoma endometrióide IIIC G2 > 60

41 B01-23352 Adenocarcinoma endometrióide IIIB G3 60

42 B01-40704 Adenocarcinoma endometrióide IIB G2 > 60

43 B00-30897 Adenocarcinoma endometrióide IIB G3 24

(48)

Anexo 6: Técnica Imuno-histoquímica

Para o método Imuno-histoquímico foram obtidos cortes histológicos de 4µm de espessura depositados em lâminas previamente tratadas com o adesivo 3-aminopropyl-triethoxysilane (Sigma-USA) (Burns & Mcgee, 1988).

As lâminas com os cortes foram levadas para a estufa a 60°C, por um período de 24 horas, para melhor adesão do tecido e desparafinização.

Inicialmente realizamos a desparafinização em três banhos de xilol à temperatura ambiente por 5 minutos cada e passagem por três banhos de etanol absoluto por 1 minuto cada.

As lâminas foram lavadas em água corrente por 5 minutos, e submetidas ao calor (recuperação antigênica) em panela a vapor, submersas em tampão citrato 10mM pH 6,0 por 30 minutos.

Após resfriamento por 20 minutos à temperatura ambiente e posterior lavagem em água corrente por 5 minutos, foi realizado bloqueio da peroxidase endógena, utilizando-se solução de peróxido de hidrogênio a 3% em quatro banhos de 5 minutos cada. As lâminas novamente foram lavadas em água corrente por 5 minutos e posteriormente com tampão PBS pH 7,2 - 7,6, também por 5 minutos.

A incubação com os anticorpos primários foi realizada em câmara úmida à temperatura de 4°C por um período mínimo de 16 a 18 horas (overnight). Foram utilizados os anticorpos primários: monoclonal mouse anti-human p53 protein (clone DO7-Dako) (1:100), monoclonal mouse anti-human p27kip1_{protein (Clone} SX53G8-Dako) (1:100), monoclonal mouse anti-human p21wafi/cip1_{protein (Clone SX118-Dako)} (1:50).

Após três lavagens em tampão PBS pH 7,2 - 7,6 foi realizada a incubação com o anticorpo secundário biotinilado (kit LSAB–Dako, Glostrup, Denmark) em câmara úmida, à temperatura ambiente, por 30 minutos.

Posteriormente, após três lavagens em tampão PBS pH 7,2 - 7,6, foi realizada incubação com o complexo estreptavidina-biotina-peroxidase (kit LSAB-Dako, Glostrup, Denmark) em câmara úmida à temperatura ambiente, por 30 minutos.

(49)

acrescido de 2 mL de peróxido de hidrogênio a 3% à temperatura ambiente, por 5 minutos.

(50)

(51)

Anexo 8: Artigo original

PDF gerado em: 13/10/2010 as 15:52:47

Protocol: SPMJ000187/2010 (4th submission: January 31, 2011)

Original article

Canonical and noncanonical Wnt pathways: a comparison

between endometrial cancer type I and atrophic endometrium in

Brazil

Vias Wnt canônica e não canônica: uma comparação entre o câncer endometrial

tipo I e endométrio atrófico no Brasil

Gynecological Oncology Sector, Department of Gynecology, Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina (Unifesp-EPM), São Paulo, Brazil

Autores

Marina de Pádua Nogueira MenezesI, Celina Tizuko Fujiyama OshimaII, Levon Badiglian

FilhoI, Thiago Simão GomesIII, Luis Fernando Mesias BarrezuetaIV, João Norberto StávaleII,

Wagner José GonçalvesV

I

MD. Gynecologist and Gynecological and Obstetric Surgeon, Gynecological Oncology Sector,

Department of Gynecology, Universidade Federal de São Paulo — Escola Paulista de Medicina

(Unifesp-EPM), São Paulo, Brazil.

II

MD, PhD. Adjunct Professor, Department of Pathology, Universidade Federal de São Paulo —

Escola Paulista de Medicina (Unifesp-EPM), São Paulo, Brazil.

III

MSc. Biologist, Department of Pathology, Universidade Federal de São Paulo — Escola Paulista de

Medicina (Unifesp-EPM), São Paulo, Brazil.

IV

MSc. Pathologist, Department of Pathology, Universidade Federal de São Paulo — Escola Paulista

de Medicina (Unifesp-EPM), São Paulo, Brazil.

V

MD, PhD. Adjunct Professor, Head of the Gynecological Oncology Sector, Department of

Gynecology, Universidade Federal de São Paulo — Escola Paulista de Medicina (Unifesp-EPM), São

(52)

KEY WORDS:

Wnt proteins.

Endometrial neoplasms.

Women.

Postmenopause.

Endometrium.

ABSTRACT

CONTEXT AND OBJECTIVE: The Wnt pathway is involved in tumorigenesis of several

tissues. For this reason, we proposed to evaluate Wnt gene expression in endometrial cancer

type I.

DESIGN AND SETTING: Cross-sectional study on materials gathered from the tissue bank

of the Department of Pathology, Universidade Federal de São Paulo.

METHODS: Endometrial specimens were obtained from surgeries performed between 1995

and 2005 at São Paulo Hospital, Universidade Federal de São Paulo. The material was

divided in two groups according to tissue type: Group A, atrophic endometrium (n = 15); and

Group B, endometrial adenocarcinoma (n = 45). We compared the immunohistochemical

expression of Wnt1, Frizzled-1 (FZD1), Wnt5a, Frizzled-5 (FZD5) and beta-catenin between

endometrial cancer type I and atrophic endometrium.

RESULTS: Regarding Wnt1, FZD1 and Wnt5a expression, no significant association was

observed between the groups. A significant association was observed between the groups in

relation to FZD5 expression (P = 0.001). The proportion of FZD5-positive samples was

significantly higher in group A (80.0%) than in group B (31.1%). Regarding the survival

curve for FZD5 in group B, we did not find any significant association between atrophic

endometrium and endometrial adenocarcinoma. We also did not find any significant

association regarding beta-catenin expression (P = 1.000).

CONCLUSION: FZD5 is downregulated in endometrial adenocarcinoma, in comparison

with atrophic endometrium.

PALAVRAS-CHAVE:

Proteínas Wnt.

Neoplasias do endométrio.

(53)

Pós-menopausa.

Endométrio.

RESUMO

CONTEXTO E OBJETIVO: A via Wnt está envolvida na tumorigênese de diversos tipos

de tecidos. Por esta razão, propusemo-nos a avaliar a expressão de genes da família Wnt no

câncer endometrial tipo I.

TIPO DE ESTUDO E LOCAL: Estudo transversal com coleta de materiais do banco de

tecidos do Departamento de Patologia da Universidade Federal de São Paulo.

MÉTODOS: Amostras endometriais foram obtidas de cirurgias que ocorreram entre 1995 e

2005 no Hospital São Paulo, Universidade Federal de São Paulo. Foram separados dois

grupos segundo o tipo de tecido obtido: grupo A, com endométrio atrófico (n = 15); e grupo

B, com adenocarcinoma endometrial (n = 45). Comparamos a expressão imunoistoquímica

de Wnt 1, Frizzled-1 (FZD1), Wnt 5a, Frizzled-5 (FZD 5) e beta-catenina entre câncer

endometrial tipo I e endométrio atrófico.

RESULTADOS: Na expressão do Wnt1, FZD1 e Wnt5a, não observamos associação

significante entre os grupos. Na expressão do FZD5, encontramos associação significante

entre os grupos (P = 0,001). A proporção de positividade do FZD5 foi significantemente

maior no grupo A comparado ao grupo B (31,1%). Em relação à curva de sobrevida para o

FZD5 no grupo B, não tivemos associação significante entre endométrio atrófico e

adenocarcinoma do endométrio. Também não observamos associação significante na

expressão da beta-catenina (P = 1,000).

CONCLUSÃO: FZD5 é downregulated no adenocarcinomaendometrial quando comparado

ao endométrio atrófico.

Corpo do texto INTRODUCTION

The Wnt family has an important role in tumorigenesis and embryogenesis.1-5 Wnts

are an evolutionarily highly conserved family of genes/proteins that act through three

signaling pathways.6 The canonical pathway involves regulation of beta-catenin. Briefly, in

the absence of Wnt signaling, a multiprotein complex, that includes adenomatous polyposis

coli (APC), glycogen synthase kinase-3 (GSK3) and axin, ensures degradation of

beta-catenin, thereby limiting the freeintracytoplasmic pool of beta-catenin. The presenceof Wnt

signaling through the Frizzled (FZD) receptor and the low-density lipoprotein

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dissociation from axin, thereby preventing phosphorylation of beta-catenin. The

intracytoplasmic pool of beta-catenin thus increases, and it translocates to the nucleus, where

it complexes with members of the T-cell factor/lymphocyte enhancement factor (LEF/TCF)

family of transcription factors to mediate transcriptional induction of target genes such as

c-myc, cyclin D, vascular endothelial growth factor (VEGF) and others.1-5

In noncanonical or planar cell polarity (PCP) signaling, Wn.t signaling is transduced

through FZD, independent of LPR5/6. This pathway mediates cytoskeletal changes through

activation of the small GTPases Rho and Rac. Another noncanonical Wnt signaling pathway

is WntCa2+. Wnt signaling via FZD mediates activation of heterotrimeric G-proteins, which

engage Dsh, phospholipase C calcium-calmodulin kinase 2 (CamK2) and protein kinase C

(PKC). This pathway modulates cell adhesion and motility.7

A fourth Wnt signaling pathway can be envisaged, since Chen et al. demonstrated that

adenylyl cyclase signaling via protein kinase A (PKA) and its target transcription factor

cAMP-responsive element-binding protein (CREB) are required for Wnt-directed myogenic

gene expression. They also showed that Wnt proteins can also stimulate CREB-mediated

transcription.6,8

In relation to endometrial cancer, most of the studies that have linked Wnt signaling

to this disease focused on the role of beta-catenin. However, other components of Wnt

signaling have been highlighted in recent published papers.

OBJECTIVE

To investigate the role of the expression of the proteins Frizzled-1, Wnt5a, Frizzled-5

and beta-catenin on atrophic endometrial tissues and endometrial cancer, using

immunohistochemical techniques on tissue microarrays obtained from postmenopause

women.

METHODS

Endometrial specimens were obtained from some way operations performed between

1995 and 2005 in the Gynecological Oncology Sector of the Universidade Federal de Sao

Paulo (Unifesp), from patients who underwent laparotomy to treat endometrial cancer or

hysterectomy to treat benign disease. All tissue samples obtained in that period were included

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preoperative therapy. We did not have any sample losses because this was a cross-sectional

study.

The patients were divided into two groups: Group A, atrophic endometrium (n = 15);

and Group B, endometrial adenocarcinoma (n = 45).

All the patients had menopausal status at the time of diagnosis. All the patients in

group B had the endometrioid histological subtype of endometrial adenocarcinoma, of a

variety of tumor grades. The cases of atrophic endometrium (group A) were compared with

the endometrial cancer cases Group B, using parameters that avoided hormonal interference

during the tissue analysis such as menopausal women.

The clinical and surgical staging and histological typing were performed in

accordance with the classification of the International Federation of Gynecology and

Obstetrics.9 The study was approved by the Institutional Ethics Committee (Unifesp).

RESULTS

Most of the patients in group B were staged as IB and IC (Table 1). In all cases, expression of the markers was found practically only in the cytoplasm (Figure 1).

Regarding Wnt1, FZD1 and Wnt5a expression, no significant association was

observed between the groups.

A significant association was observed between the groups in relation to FZD5

expression (P = 0.001). The proportion of FZD5-positive women was significantly higher in

group A (80.0%) than in group B (31.1%). Regarding the survival curve for FZD5 in group

B, we did not find any significant association between positive and negative women (Figure 2).

No significant association was observed between beta-catenin expression and patient

group, since the expressions for groups A and B were 100% and 95.6%, respectively (P =

1.000).

DISCUSSION

Canonical pathway

Endometrioid endometrial adenocarcinoma is essentially connected with type I

endometrial cancer, which in turn correlates with hyperestrogenism status. Hence, the key to

understanding the role of Wnt signaling in type I endometrial cancer is to find the link

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beta-catenin/CTNNB1 in the endometrium would lead to nuclear accumulation of beta-catenin and

then result in uterine endometrioid cancer.1-3

Pijnenborg et al.3 found nuclear accumulation of beta-catenin in 38% of their

endometrioid endometrial cancer cases, while Kariola et al. found 53% and Schlosshauer et

al. found 47%.4,5 On the other hand, we found no difference in beta-catenin expression

between cases of atrophic endometrium and endometrial cancer, since both groups stained

almost equally in the cytoplasm. This may be explained by the fact that beta-catenin has a

low level of association with endometrial cancer, compared with loss of PTEN (phosphatase

and tensin homologue protein).6 Furthermore, it seems that PTEN mutations do not cause

nuclear beta-catenin accumulation in endometrial carcinomas.7

It is possible that beta-catenin has a more important role in relation to precursor

lesions than in uterine cancer itself. Hideyuki et al. found nuclear beta-catenin in 70% of

their endometrial hyperplasia samples and 56.7% of their endometrial cancer samples.

However, they also showed that nuclear staining of beta-catenin occurred in the

mid-proliferative, late proliferative and early secretion phases of the normal endometrium during

the menstrual cycle. Twelve out of 15 cases (80.0%) during these periods showed nuclear

staining.8

All these findings are concordant with reports that correlate estrogens with the

canonical Wnt pathway, thus suggesting that estrogens or estrogen receptors are capable of

stimulating beta-catenin accumulation.10,11

Comparing lean and obese rats, Zhang et al. found that estrogen more strongly

induced the antiproliferative genes retinaldehyde dehydrogenase-2 and secreted

frizzled-related protein-4 (a negative regulator of Wnt signaling) in lean rats, but had little or no

effect on obese rats.12

Noncanonical pathway

Both groups reached total staining for Wnt5a, and the proportion of FZD5-positive

women was significantly higher in group A (80.0%) than in group B (31.1%).

It is known that noncanonical signaling can inhibit canonical signaling through a

variety of mechanisms.13 We suggest that because of the low proportion of FZD5 positivity

in the adenocarcinoma group, the noncanonical signaling could not function properly and

that this subsequently led to development of hyperplasia and cancer.

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estrogen receptor agonist) and estradiol.14,15 These findings are concordant with the

physiopathology of type I endometrial adenocarcinoma.

Breast cancer is comparable with endometrial cancer in that it is also stimulated by

estrogens. Jönsson et al. found that loss of Wnt5a protein expression was significantly

associated with higher histological grade, recurrent disease, early relapse and death.16

Similar findings have been reported by others.16-18

Recently, we advocated the idea that the noncanonical Wnt pathway has an important

role in ovarian cancer and would lead to a worse prognosis. Furthermore, we advocated that

beta-catenin would not play an important role in epithelial ovarian cancer.19 However,

endometrioid ovarian cancer is an exception to this. This neoplasia has a molecular pattern

similar to that of endometrial adenocarcinoma, with regard to the Wnt pathway. In fact, in

this respect, we suggest that low activity of the noncanonical Wnt pathway would lead to

type I endometrial adenocarcinoma. This would reflect the complexity of the Wnt pathway,

in which the concepts of tumor suppressors and promoters are fickle. Although we did not

find any difference between the groups regarding Wnt5a, others have found that it was

downregulated in endometrial carcinomas, in comparison with normal tissue.20

Regarding the survival curve for FZD5, there was a tendency towards better

prognosis for FZD5-positive women, but this association was not significant. This also

strengthens the idea that the noncanonical Wnt pathway has a protective function in relation

to endometrial carcinoma. The more we learn about the Wnt family and its interactions, the

more we obtain new insights into old problems.

CONCLUSION

Wnts can produce different effects depending on the context. Here, we showed that

FZD5 is downregulated in type I endometrial adenocarcinoma, compared with atrophic

endometrium.

REFERENCES

1. Fukuchi T, Sakamoto M, Tsuda H, et al. Beta-catenin mutation in carcinoma of the

uterine endometrium. Cancer Res. 1998;58(16):3526-8.

2. Schlosshauer PW, Pirog EC, Levine RL, Ellenson LH. Mutational analysis of the

(58)

2000;13(10):1066-71.

3. Pijnenborg JM, Kisters N, van Engeland M, et al. APC, beta-catenin, and E-cadherin and

the development of recurrent endometrial carcinoma. Int J Gynecol Cancer.

2004;14(5):947-56.

4. Kariola R, Abdel-Rahman WM, Ollikainen M, et al. APC and beta-catenin protein

expression patterns in HNPCC-related endometrial and colorectal cancers. Fam Cancer.

2005;4(2):187-90.

5. Schlosshauer PW, Ellenson LH, Soslow RA. Beta-catenin and E-cadherin expression

patterns in high-grade endometrial carcinoma are associated with histological subtype. Mod

Pathol. 2002;15(10):1032-7.

6. Bansal N, Yendluri V, Wenham RM. The molecular biology of endometrial cancers and

the implications for pathogenesis, classification, and targeted therapies. Cancer Control.

2009;16(1):8-13.

7. Wappenschmidt B, Wardelmann E, Gehrig A, et al. PTEN mutations do not cause nuclear

beta-catenin accumulation in endometrial carcinomas. Hum Pathol. 2004;35(10):1260-5.

8. Nei H, Saito T, Yamasaki H, et al. Nuclear localization of beta-catenin in normal and

carcinogenic endometrium. Mol Carcinog. 1999;25(3):207-18.

9. Pecorelli S, Ngan HYN, Hacker NF. Staging Classifications and Clinical Practice

Guidelines for Gynaecological Cancers. Available from:

http://www.figo.org/files/figo-corp/docs/staging_booklet.pdf. Accessed in 2010 (Set10).

10. Hou X, Tan Y, Li M, Dey SK, Das SK. Canonical Wnt signaling is critical to

estrogen-mediated uterine growth. Mol Endocrinol. 2004;18(12):3035-49.

11. Kouzmenko AP, Takeyama K, Ito S, et al. Wnt/beta-catenin and estrogen signaling