José Cesar Rosa Neto
Efeito do exercício exaustivo sobre aspectos inflamatórios no
músculo esquelético e tecido adiposo de ratos.
Tese apresentada à Universidade
Federal de São Paulo - Escola
Paulista de Medicina, para obtenção
do Título de doutor em Ciências.
São Paulo
2010
Efeito do exercício exaustivo sobre aspectos inflamatórios no músculo
esquelético e tecido adiposo de ratos.
Tese apresentada à Universidade Federal
de São Paulo - Escola Paulista de
Medicina, para obtenção do Título
de doutor em Ciências.
Orientador: Profa. Dra. Cláudia Maria Oller do
Nascimento
Co-orientadores: Profa. Dra. Lila missae Oyama
Profa. Dra. Marília Cerqueira Seelaender
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
Campus São Paulo
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
― A ciência exercita a capacidade, não o saber.- O valor de praticar com rigor, por algum tempo, uma ciência rigorosa não está propriamente em seus
resultados:pois eles sempre serão uma gota ínfima ante o mar das coisas dignas de saber. Mas isso produz um aumento de energia, de capacidade dedutiva,de tenacidade; aprende-se a alcançar um fim de modo pertinente. Neste sentido é valioso, em vista de tudo o que se fará depois, ter sido homem da ciência.‖
AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar à toda minha família. Em especial, meu pai, minha mãe (in memorian) que apesar de ter ido cedo foi capaz de passar inumeráveis valores, principalmente por sua prática e aos meus irmãos Nando (in memorian), Carlos e Rita, já que todos juntos foram e ainda são fundamentais para o meu desenvolvimento cultural, intelectual e emocional. Devo ainda, o meu interesse pela ciência e meus preceitos éticos nessa atividade ao meu irmão Nando.
À Luciana, que me auxiliou durante toda essa parte em que estive no doutorado, me aturando e aturando os experimentos em datas como Natal, Ano Novo e fins de semana; agradeço sua fiel companhia.
Aos meus familiares, como tios em especial ao Tio Junior (in memorian), tias em especial a Lisete e primos. A minha avó Maria, que infelizmente já se foi, assim como a minha bisa, mas que foram muito importantes na minha infância. Aos avôs Chico e Zeca. A minha vó Vira, que todo sábado realiza um almoço para a família inteira, com um vasto número de pratos sempre querendo agradar a algum neto ou bisneto e claro pela sua companhia. Aos meus sobrinhos Isabel, Felipe, Marina, Cecília, Marcos e Chicão, aqui descritos em ordem cronológica que, como crianças, nos ajudam a agüentar os momentos difíceis do dia a dia. Aos cunhados Marília, Gaby e Rafael.
Aos meus amigos, desde os que vêm desde a escola como é o caso do Rodrigo, que desde pequeno, é companheiro fiel nas mais diversas e adversas situações. Aos amigos que conhecemos na praia e que hoje temos uma grande amizade Marcão, Lu, Léo, Paulo, Negão, Fábio, Gú. Aos amigos de laboratório que também são de diferentes fases e que me ajudaram em diferentes etapas, mas que jamais esquecerei, como o Eivor, Ronaldo, Érico, Tubarão e Alex, no antigo laboratório do GG, do Fio, Emília e Nelo no laboratório da Marília, e nessa última etapa do Cláudio, Gustavo, Ricardo e Cabeça já na UNIFESP.
A todos os colegas de laboratório envolvidos nessa fase, de todos esses laboratórios já citados. Assim como a todos aqueles que me ajudaram, e aqui faço questão de citar Ana Lúcia, Dona Carmo, Fabíola e Emília.
Agradeço especialmente à Professora Cláudia que me aceitou em um momento difícil e topou um grande desafio, que foi a execução desse projeto, me apoiando nas minhas decisões, me questionando e corrigindo quando necessário, mas sempre de maneira delicada e respeitosa, acrescentando muito na minha formação acadêmica, assim como humana.
Aos meus cachorros que são parte essencial para o meu dia-a-dia. Sendo eles desde o Pituca, Fritz, Sofia, Tico, Teco, Galileo, Luna, Maggie, Hércules, Lisa, Carlitos, Bebel e Uvinha.
SUMÁRIO
1. Introdução 1
2. Revisão de Literatura
2.1 Citocinas 3
2.2 Citocinas e exercício 4
2.3 IL-6 5
2.4 TNF-α 9
2.5 IL-10 10
2.6 IL-2 e IL-4 11
2.7 TLR-4 12
2.8 Papel do músculo esquelético e tecido adiposo como
órgãos endócrinos 13
3. Objetivos
3.1 Objetivo Geral 16
3.2 Objetivo Específico 16
4. Materiais e Métodos
4.1 Animais 17
4.2 Desenho Experimental 17
4.3 Protocolo de exercício 17
4.4 Procedimentos gerais para amostras que foram
usadas para PCR 17
4.5 Quantificação da expressão dos genes das
citocinas teciduais 17
4.6 Quantificação das citocinas teciduais 20
4.7 Western Blotting 22
4.8 Análise estatística 23
5. Apresentação dos resultados e discussão 24
6. Considerações Finais 82
Lista de Abreviaturas e Símbolos
AKT Proteína Quinase B
AMPK Quinase Adenosina Monofosfato
Ca2+ Cálcio
EDL Extensor Digitorius Longus
GLUT-4 Transportador de Glicose 4
HSL Lipase Hormônio Sensível
IkB inibidor do NFkB
IL Interleucina
IL-1ra receptor antagonista de IL-1
IL-10R Receptor de IL-10
INF Intérferon
kDa kiloDálton
LPL Lipase Lipoprotéica
MAPKp38 proteína Quinase Ativadora de Mitógeno p38
MCP-1 Proteína Quimioatraente de Monócito 1
RNA Ácido Ribonucléico
mRNA Ácido Ribonucléico mensageiro
MYD88 Myeloid differentiation primary response gene (88)
NFkB Fator de transcrição Nuclear kappa B
PCR Reação em Cadeia Polimerizada
RTNFI Receptor do Fator de Necrose Tumoral-α tipo I
RTNFII Receptor do Fator de Necrose Tumoral-α tipo II
TLR-4 Toll Like Receptor 4
TNF Fator de Necrose Tumoral
TRAFF Fator da família do Toll Like Receptor
Resumo
Objetivo: Verificar o efeito inflamatório do exercício agudo exaustivo sobre diferentes depósitos de tecido adiposo branco (mesentérico e retroperitoneal), assim como, sobre músculos esqueléticos (sóleo: fibra muscular tipo I; EDL: fibra muscular tipo II). Métodos: os animais (ratos Wistars) foram submetidos a uma sessão exaustiva de exercício, após período de adaptação. Os depósitos de tecido adiposo branco, retroperitoneal e mesentérico, como, os músculos EDL e sóleo, foram retirados logo após o sacrifício e analisados para a expressão gênica (PCR-real time) e protéica (ELISA) da citocinas IL-6, IL-10, TNF-α, IL-2 e IL-4. O sacrifício foi realizado logo após a sessão de exercício, duas e seis horas após, e o grupo controle não foi submetido à sessão exaustiva de exercício. Por Western Blotting foi analisado o conteúdo de TLR-4, e sua via de sinalização TRAF6 e MYD88. Resultados: As citocinas IL-6, IL-10 e TNF-α foram encontradas elevadas em todos os tecidos e grupos dos ratos exercitados. No entanto, a razão IL-10/TNF-α foi maior no músculo e encontrou-se diminuída no tecido adiposo. O TLR-4, assim como sua via (TRAF6 e MYD88), foi aumentada nos depósitos de tecido adiposo branco de ratos submetidos ao exercício exaustivo, sem alteração no EDL e sóleo. Já as citocinas IL-2 e IL-4 tiveram suas concentrações alteradas no sóleo e EDL, mas não foram moduladas no tecido adiposo pelo protocolo de exercício exaustivo. Conclusão: O exercício exaustivo apresentou um aumento da resposta antiinflamatória no músculo esquelético, pelo aumento da razão IL-10/TNF-α. Já o tecido adiposo observado (mesentérico e retroperitoneal) apresentou um aumento da resposta inflamatória, evidenciada pela diminuição da razão IL-10/TNF-α e pelo aumento da expressão protéica do TLR-4. Além disso, a IL-4 foi aumentada 6 horas após o protocolo de exercício no EDL, concomitante com o aumento do MyoD. Esse aumento pode levar a um aumento da hiperplasia muscular.
Abstract
Aim: to verify the inflammatory effects of exhaustive exercise on adipose tissue (mesenteric and retroperitoneal), and skeletal muscle (sóleus: fiber type I, EDL: Fyber type II). Methods: Wistar rats were randomly assigned to four groups: group control and group exercised until exhaustion, these rats were sacrificed in three different times, after the exhaustion, two hours after and six hours after exhaustive exercise. Cytokines IL-2, IL-4, TNF-α, IL-6 and IL-10 were analyzed by mRNA (PCR Real Time) and protein (ELISA) expression. TLR-4 and your inflammatory via (TRAF6, MYD88), were analyzed by Western Blotting. Results: IL-6, IL-10 and TNF-α were elevated in all tissues and groups compared with control group. However, IL-10/TNF-α ratio was higher in skeletal muscle, and opposite response was found in adipose tissue. TLR-4 and your via was elevated in adipose tissue, but not altered in skeletal muscle after exhaustive exercise. The concentrations of IL-2 and IL-4 were altered in skeletal muscle, but were not modulated in adipose tissue, after exercise protocol. Conclusion: exhaustive exercise showed one increased in anti-inflammatory response in skeletal muscle, by increased of IL-10/TNF-α ratio. On the other hand, adipose tissue showed increased in inflammatory response, evidenced by decreased in IL-10/TNF-α ratio and increased in TLR-4 content. Moreover, the IL-4 was increased in EDL, concomitant with raised in Myod. This results could showed one increased in hyperplasia in skeletal muscle.
1 1. Introdução
O exercício físico agudo causa mudanças na homeostasia corporal, que geram respostas adaptativas a nova necessidade fisiológica (Tharp, 1975). Estas respostas fisiológicas a uma única sessão de exercício exercem efeitos em diversos parâmetros imunológicos e inflamatórios (Sprenger et al, 1992; Schuls et al 2004). Sendo, desta forma, o exercício físico agudo considerado um excelente modelo para estudar as adaptações fisiológicas a um estresse agudo (Costa Rosa, 2004).
Hoje em dia, as expressões atividade física e exercício físico são muito utilizadas, várias vezes inclusive, como sinônimo. No entanto, essas são duas expressões que conceituam duas atividades distintas. O conceito de atividade física é uma expressão genérica, que pode ser definida como qualquer movimento corporal, produzido pelos músculos esqueléticos, que resulta em gasto energético maior do que os níveis de repouso. O exercício físico é uma atividade física planejada, estruturada e repetitiva que tem como objetivo final ou intermediário aumentar ou manter a saúde/aptidão física (Caspersen et al 1985).
Atualmente, sabe-se que o exercício agudo é capaz de causar, ainda, um quadro sub clínico da síndrome inflamatória sistêmica, caracterizada por um grande aumento de moléculas inflamatórias liberadas no plasma, assim como ativação de células do sistema imunológico (neutrófilos) (Suzuki et al, 2002).
Essas alterações provocadas pelo exercício físico nos parâmetros imunológicos e inflamatórios dependem da intensidade, duração, tipo de contração muscular predominante, nível de treinamento e disponibilidade de substrato (Singh et al, 1994; Keast et al, 1995; Pedersen et al, 2004).
Como reportado por vários autores desde a década de 1950, é conhecido que o estresse ativa o sistema nervoso autônomo e o eixo endócrino hipotálamo-hipófise-adrenal, elevando a concentração plasmática de adrenalina e cortisol (em humanos) ou de corticosterona (em ratos) (Mastorakos e Pavlatou, 2005). Atualmente, com o avançar das pesquisas na área, ampliou-se o conhecimento dos efeitos estimuladores do exercício agudo com o intuito de reequilibrar a homeostase de forma dinâmica. Conforme relatado por Costa Rosa (2004) o exercício ativa o eixo psico-neuro-imune-endócrino.
2 A adaptação fisiológica gerada pelo exercício agudo leva em conta o aumento da necessidade de substrato para o músculo esquelético. A resposta hormonal tem como intuito provocar a regulação metabólica para o suprimento energético, regulando a homeostasia da glicose, assim como dos ácidos graxos e proteínas necessários para a execução do exercício agudo (Steinacker et al, 2005).
No entanto, o exercício físico exaustivo é um importante insulto inflamatório, seja para sujeitos treinados ou não. Acredita-se que parte dessa resposta se deva ao grande número de lesões musculares, provocada por provas longas de atletismo, como maratonas, ultra-maratonas em sujeitos treinados (Nieman et al, 2006). No entanto, esse efeito também pode ser visto em exercícios de menor duração, em sujeitos destreinados. Além da lesão muscular, o alto grau de necessidade energética provocada por esse tipo de exercício, aumenta a liberação de marcadores inflamatórios no plasma que possuem uma importante função na mobilização de substrato energético (Pedersen et al, 2007).
Não obstante, esses estímulos estressores provocados pelo exercício físico agudo, quando são aplicados de forma planejada, seguindo a teoria do treinamento desportivo, parecem trazer inúmeros benefícios ao sujeito, evitando o acúmulo de gordura visceral e aumentando o gasto energético, além de diminuir a inflamação crônica provocada por diferentes morbidades como diabetes, câncer, síndrome metabólica, arteriosclerose, entre outras (Wilund 2007; Pedersen 2009 ).
3 2. Revisão de Literatura
O exercício físico agudo e/ou exaustivo promove um grande aumento em marcadores inflamatórios. As citocinas são uma classe desses fatores inflamatórios que atuam como mediadores importantes da complexa rede de comunicação entre os sistemas neuroendócrino, imunológico e psicológico, sendo extremamente importante na visão atual de um único sistema psico-neuro-imune-endócrino (Pedersen et al, 2007).
2.1 Citocinas
As citocinas são polipeptídeos (8-60 κDa) que agem como mediadores solúveis, regulando crescimento, diferenciação e função de muitos tipos celulares. A origem dessa classe de moléculas foi estabelecida, principalmente, nos estudos das células do sistema imunológico. Por isso, no início acreditava-se que esses peptídeos teriam como função a modulação do sistema imune (Turnbull and Rivier, 1999). No entanto, hoje se sabe que vários tipos celulares são capazes de produzir e responder fisiologicamente a essas citocinas (mioblastos, adipócitos, fibroblastos, neurônios, células da glia e muitos outros).
Esses peptídeos podem ser divididos em sub-classes, dependendo da sua função, tipo de receptor e origem celular (Kishimoto et al, 1994). Em geral, uma característica importante das citocinas é ser pleiotrópica, ou seja, podem provocar uma grande quantidade de efeitos diferentes, dependendo do tipo celular, bem como da quantidade que se liga ao receptor dessas citocinas no tecido alvo (Cohen e Cohen, 1996).
As citocinas modulam diferentes situações fisiológicas como o sono (Opp e Krueger, 1994), a homeostase energética (Febbraio e Pedersen, 2002; Pedersen et al, 2007) a ovulação (Cannon e Dinarello, 1985), embora a expressão dessas citocinas em sujeitos saudáveis seja muito baixa (Turnbull e Rivier, 1999). Por outro lado, em situações que envolvam agentes estressores, tais como: infecções, trauma, queimaduras, e durante o exercício físico extenuante, a produção dessas citocinas é aumentada de maneira dramática, para que o organismo possa restabelecer a homeostase (Turnbull e Rivier, 1999; Pedersen and Fischer, 2007).
De acordo com a resposta inflamatória desencadeada, as citocinas são divididas em dois grandes sub-grupos:
1. as citocinas pró-inflamatórias: o TNF-α, IL-1β, a família dos intérferons, IL-2, IL-8 dentre outras (Mastorakos e Ilias, 2006), e
4 De forma geral, esta classificação contempla todas as citocinas até hoje descritas, com exceção da IL-6.
A IL-6 foi, por muito tempo, classificada como uma citocina pró-inflamatória, pois o seu aumento na circulação estava ligado a uma resposta pró-inflamatória de fase aguda (Sprenger et al, 1992; Nehlsen-Cannarela et al, 1997; Starkie et al, 2000). No entanto, estudos mostraram muitos efeitos anti-inflamatórios gerados pela IL-6, como diminuição da expressão de citocinas pró-inflamatórias e aumento da produção de citocinas anti-pró-inflamatórias (Ostrowski et al, 1999; Pedersen et al, 2004; Starkie et al, 2003;). Atualmente, acredita-se que a IL-6 exerce papel pró ou anti-inflamatório, dependendo do tipo celular que essa citocina se liga, da sua concentração plasmática ou tecidual e do tempo que persiste esse aumento (Spangenburg et al, 2007).
2.2 Citocinas e exercício
Os primeiros relatos do aumento de citocinas circulantes após uma sessão aguda de exercício surgiram em 1991, quando Northoff e Berg observaram um aumento substancial no conteúdo de IL-6 no plasma de atletas, ao final de uma maratona. Ainda nesse ano, Weight e colaboradores encontraram os níveis séricos de IL-1 aumentados após atletas realizarem uma maratona.
Os dados da literatura têm demonstrado que a secreção de IL-6 é, dentre as citocinas, sem dúvida a que sofre o maior estimulo pelo exercício. Atletas após corrida de 100 quilometros apresentaram aumento da ordem de 121% nos níveis séricos de IL-6 (Kim et al, 2007). Neste mesmo sentido, Margeli et al (2005) verificaram em atletas que correram 217 quilometros, que o aumento da concentração plasmática de IL-6 foi da ordem de 8000 vezes, logo após a prova.
Está bem estabelecido que exercício de longa duração, como maratonas e ultramaratonas, é capaz de modificar os níveis circulantes da IL-6, IL-10, IL-1ra e IL-8 (Ostrowski et al, 1999; Nieman et al, 2004; Suzuki et al, 2002). No entanto, as variações séricas dessas citocinas são muito rápidas, voltando em poucas horas a níveis circulantes similares ao período pré-exercício (Ostrowski et al 1999).
5 sedentários, os quais apresentaram expressão gênica de TNF-α nas fibras musculares esqueléticas do tipo II, mas não do tipo I (Plomgaard et al, 2005).
Na década de 1990, acreditava-se que a elevação dessas citocinas estava condicionada a um aumento da lesão provocada pelo exercício. Por isso, atividades como corrida e musculação com ênfase na fase excêntrica, aumentariam preferencialmente, a quantidade plasmática de citocinas. No entanto, posteriormente, observou-se que os níveis plasmáticos desses peptídeos estão mais correlacionados com a intensidade do exercício do que com o tipo de ação muscular (Malm et al, 2004; Suzuki et al, 2006). Assim sendo, exercícios que utilizam preferencialmente a contração concêntrica do músculo, como o ciclismo, geram também um importante aumento nos níveis plasmáticos de citocinas (Suzuki et al, 2006).
Existem ainda outros fatores importantes que aumentam a concentração sérica das citocinas no sangue durante o exercício, como o volume do exercício físico, as reservas de substrato e a aptidão física do sujeito (Fischer 2006).
2.3 IL-6
A IL-6 é uma glicoproteína com peso molecular entre 21 a 28 κDa, produzida por uma grande variedade de tipos celulares (Turnbull e Rivier, 1999). A primeira ação descrita foi o estímulo do crescimento e diferenciação dos linfócitos B (Curfs et al, 1997). Hoje, sabe-se que a IL-6 é capaz de produzir as mais diversas ações em diferentes tecidos. O seu aumento no plasma é capaz de elevar a resposta de fase aguda a estímulos agressores (Turnbull e Rivier, 1999); alterar a homeostase energética (Fischer 2006); induzir a liberação do hormônio adrenocorticotrófico, febre, anorexia e fadiga (Robson 2003).
A IL-6, assim como outras citocinas da sua família (IL-11, fator neurotrófico ciliar, cardiotrofina-1, fator inibitório de leucemia, neuropoietina e a oncostatina M), age via um receptor complexo que contem pelo menos uma sub-unidade da proteína transdutora de sinal gp130.
A IL-6 liga-se ao seu receptor na célula alvo e o complexo IL-6-receptor associa-se a proteína transmembrana gp130, permitindo a transdução de sinal (Taga e Kishimoto 1997; Derouet et al, 2004). Entretanto, a IL-6 pode também se ligar a receptores solúveis presentes no sangue. Desta forma, como todas as células até hoje estudadas expressam a proteína gp130 em seus domínios transmembrana, pode-se inferir que a IL-6 atue em todas as células do organismo (Althoff et al, 2000; Althoff et al, 2001).
6 Desta feita, alguns pesquisadores passaram a questionar qual seria a origem celular desse aumento de IL-6 na circulação. A primeira idéia foi que a lesão muscular seria a responsável por desencadear o aumento dessa citocina via a ativação de monócitos e macrófagos, que seriam os principais responsáveis pela produção e liberação de IL-6 (Nieman et al, 1998). No entanto, estudos que investigaram a expressão gênica de IL-6 após a atividade física de longa duração, demonstraram que não havia aumento na expressão gênica dessa citocina nos monócitos (Ullum et al, 1994; Starkie et al, 2000).
Em 1998, Ostrowski e colaboradores mostraram um aumento da expressão gênica de IL-6 no músculo esquelético de atletas participantes de uma maratona. Surge, então, a primeira evidência que essa citocina poderia ser produzida pela fibra muscular e sua expressão modulada pelo exercício físico agudo. Corroborando com esses resultados, observou-se um aumento de IL-6 nas fibras musculares detectada por imuno-histoquímica, de sujeitos submetidos a três horas de atividade física, mostrando que era realmente o miócito o principal responsável pela produção dessa citocina e não outro tipo de célula imune infiltrada, como neutrófilo ou macrófago (Penkowa et al, 2003).
Essa observação foi, também, confirmada em um modelo animal, onde o músculo esquelético de ratos foi estimulado eletricamente, gerando então contração muscular, mostrando então que a contração muscular, per se, é capaz de aumentar a expressão gênica de IL-6 (Jonsdottir et al, 2000).
Alguns estudos tentaram avaliar qual seria o fator que promoveria o aumento da IL-6 durante o exercício. Acreditava-se que o aumento dos hormônios, provocado pelo exercício físico, seria o responsável pela indução da expressão gênica de IL-6, no músculo esquelético. No entanto, observou-se que a infusão de adrenalina foi incapaz de provocar as alterações na concentração sérica de IL-6 detectadas durante e logo após a sessão de exercício físico (Steensberg et al, 2001). Somente em 2007, Banzet e colaboradores mostraram que a ativação da enzima calcineurina dentro do miócito, provocada pela necessidade do aumento de influxo de Ca2+, para possibilitar a contração muscular, é uma etapa essencial para estimular a produção de mRNA e proteína IL-6. A produção desta citocina pelo miócito parece ser tipo de fibra dependente, aumentando mais nas fibras tipo I e IIa (Banzet et al, 2005).
7 A ação da IL-6 dentro do músculo esquelético está associada ao aumento do metabolismo de carboidrato no músculo esquelético (Pedersen et al, 2004).
Dados da literatura demonstram que a IL-6 aumenta a glicogenólise no músculo esquelético (Glund et al, 2007). Entretanto, verificou-se uma forte correlação negativa entre os estoques de glicogênio muscular e o aumento da IL-6 circulante durante o exercício físico (Chan et al, 2004), sendo a disponibilidade de glicogênio muscular considerada um importante modulador da intensidade do aumento da IL-6 durante o exercício físico (Febbraio e Pedersen, 2002).
A elevação de IL-6 durante o exercício aumenta a captação de glicose por elevar a translocação do transportador do citoplasma para membrana plasmática, além de aumentar a oxidação deste substrato, propiciando disponibilidade de energia para a contração muscular (Carey et al, 2006). Em incubação de músculo esquelético humano, na presença de IL-6 recombinante humana, em concentrações semelhantes às encontradas no exercício, detectou-se a fosforilação de diversas enzimas associadas ao aumento da captação e oxidação intramuscular de glicose e ácidos graxos, entre elas a Akt, AMPK e MAPKp38, (Al-Khalili et al, 2006).
A IL-6 também estimula a glicogenólise e a gliconeogênese hepática (Pedersen et al 2002, Blumberg et al, 1995), provavelmente pelo seu efeito inibidor da sinalização de insulina nos hepatócitos. Desta forma, a glicose deixa de ser armazenada no hepatócito, ficando uma quantidade maior de glicose na circulação para ser captada pelo músculo esquelético. Uma enzima importante nessa inibição da cascata de sinalização da insulina gerada pela IL-6 é a SOCS-3 (Senn et al, 2003).
8 Figura 1
Alguns estudos mostraram então que a suplementação com carboidrato pode ser um mecanismo importante para amenizar o aumento na produção de IL-6 durante o exercício físico agudo (Nehlsen-Cannarella et al, 1997; Nieman et al, 1998).
A IL-6 é capaz de atuar sobre o metabolismo lipídico, promovendo lipólise e liberação de ácidos graxos livres no tecido adiposo (Stouhardt et al, 1996), estimulando a secreção hepática de triacilglicerol (Nonogaki et al, 1995) e aumentando a oxidação de ácidos graxos em humanos (Van Hall et al, 2003). No entanto, em casos de aumento crônico, como na obesidade e síndrome metabólica, a IL-6 pode ser um dos fatores responsáveis pelo aumento de ácidos graxos livres nesses pacientes (Pedersen, 2009).
9 Pelo acima descrito, verifica-se que a IL-6 é produzida por diversos tipos celulares e é capaz de regular diferentes processos metabólicos em muitos órgãos. Sendo, portanto, considerada uma citocina chave para a melhor compreensão da interação entre os diferentes tecidos no intuito da manutenção da homeostase (Pedersen e Fischer, 2006).
2.4 TNF-α
O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) é uma citocina caracterizada por um potente efeito pró-inflamatório, induzindo a expressão de várias citocinas inflamatórias, como IL-1, IL-8, MCP-1, dentre outras. O nome dessa citocina deriva da ação deste peptídeo sobre células tumorais, provocando a necrose desse tipo celular. Esta citocina foi primeiramente descrita em 1975 e denominada de caquexina. Devido à potente ação contra as células tumorais, posteriormente passou a ser conhecida como TNF-α (Beyaert e Fiers, 1998).
Produzida em diversos tipos celulares, o TNF-α é expresso, inicialmente, associado a moléculas da membrana celular, com um peso inicial de 26 kDa. Posteriormente, sofre clivagem obtendo-se então uma forma ativa e hidrossolúvel de 17kDa (Turnbull e Rivier, 1999).
A ação fisiológica do TNF-α depende de sua ligação aos seus receptores. Foram até hoje descritos dois tipos de receptores, o tipo I (RTNF-I, p55) e o tipo II (RTNF-II, p75) (Bazzoni e Beutler, 1996). Esses receptores são proteínas transmembrana. A porção extracelular dos dois tipos de receptores para TNF-α possuem arquitetura bem similar, e os domínios intracelulares são bem diferentes (Lewis et al, 1991).
A ativação de ambos os receptores pelo TNF-α leva a um aumento na atividade do NFkB, no entanto, por vias diferentes. Enquanto o RTNF-II ativa esse fator nuclear via transdução de sinal pela ação das enzimas TRAF1 E TRAF2, o RTNFI age recrutando a enzima TRADD induzindo uma via de transdução de sinalização diferente, que também estimula a sinalização apoptótica via protease ICE-like (Darnay e Aggarwal, 1997).
10 Por outro lado, os dados relativos ao efeito do exercício em aumentar a expressão gênica de TNF-α na musculatura esquelética são mais consistentes. Tanto o treinamento de força, como o exercício aeróbio agudo aumentaram a expressão gênica de TNF-α na musculatura esquelética sem promover alterações do conteúdo dessa citocina no plasma (Nieman et al, 2003; Louis et al, 2007). Esta expressão gênica parece ser dependente do tipo de fibra muscular. Em sedentários verificou-se que apenas fibras do tipo II foram capazes de expressar TNF-α (Plomgaard et al, 2005).
O aumento da expressão gênica e protéica de TNF-α no músculo esquelético pode ser uma importante resposta inicial, provocada pelas micro-lesões do exercício físico agudo, já que o aumento desta citocina no músculo esquelético promove o acúmulo de neutrófilos e macrófagos no seu interior, que irão auxiliar no remodelamento da fibra muscular (Pelosi et al, 2007). No entanto, parece que se o TNF-α permanecer elevado após esse período inicial, ele irá prejudicar a ativação dos mecanismos de regeneração (Peterson et al, 2006).
O TNF-α pode ser um importante regulador de processos metabólicos durante o exercício. Foi mostrado que o TNF-α induz a fosforilação de IRS-1 e IRS-2 em resíduos de serina e treonina, causando prejuízo na sinalização da insulina, tanto em adipócitos como em miócitos (Kirwan e Del Aguila, 2003; Nieto-Vazquez et al 2009). Corroborando com a tese do aumento da resistência a insulina associado ao TNF-α, esta citocina parece prejudicar o acoplamento do IRS-1 com o receptor de insulina (Kirwan e Del Aguila, 2003).
Além disso, o TNF-α é capaz de atuar sobre o metabolismo lipídico, aumentando a disponibilidade de ácidos graxos livres na circulação por estimular a lipólise, via mecanismo dependente da HSL e modificar o padrão de perilipinas (Cawthorn et al, 2008) no tecido adiposo.
Do descrito acima, podemos deduzir que a elevação do TNF-α no tecido adiposo e também no músculo esquelético, durante e após o exercício, parece contribuir para o desenvolvimento muscular e manutenção da homeostase metabólica.
2.5 IL-10
A IL-10 foi isolada, em 1989, por Fiorenzo e colaboradores. Como ocorreu com a maioria das citocinas, o primeiro efeito observado foi sobre as células do sistema imune, mais propriamente sobre os linfócitos T. Observou-se que essa citocina era capaz de inibir fatores pró-inflamatórios produzidos por este tipo celular.
11 (intermediários) e aumenta a liberação dos receptores solúveis do TNF-α, os quais podem antagonizar os efeitos do TNF- dificultando sua ligação nos receptores celulares (Nozaki et al., 1998).
A atividade biológica da IL-10 depende de sua ligação com o receptor de membrana (IL-10R), que pertence ao subgrupo de receptores similares ao intérferon (INF), da família dos receptores de citocinas classe II (Moore et al., 2001).
Dois mecanismos foram propostos para explicar o aumento da concentração plasmática de IL-10 no exercício agudo. Primeiro: o aumento da IL-6 no exercício induz a expressão e produção de IL-10 (Petersen e Pedersen, 2005; Pedersen et al, 2007). Segundo: o exercício ativa AMPK, que estimula a produção de IL-10 em diferentes tipos celulares (Eigler et al,1998).
O aumento da IL-10, provocado pelo exercício físico agudo, é um dos efeitos antiinflamatórios do exercício mais bem estudado (Petersen e Pedersen 2005). Como já discutido acima, a IL-10 exerce um papel importante na contra-regulação da resposta pró-inflamatória. A IL-10 age como um antagonista natural do TNF-α, promovendo a preservação do IkB, provocando com isso, inibição do NF-kB (Schottelius et al 1999) e é capaz de inibir, por exemplo, a expressão gênica e protéica do TNF-α em diversos tipos celulares (Malefyt et al, 1991; Daftarian et al, 1996).
A atividade metabólica da IL-10 ainda não está totalmente esclarecida. Estudo recente mostrou que a sensibilidade à insulina no músculo esquelético foi maior em camundongos que super-expressavam IL-10 no músculo esquelético, quando comparados com ratos controle, após tratamento com dieta rica em gordura (Hong et al, 2009).
Hoje em dia, utiliza-se a razão IL-10/TNF-α como marcador do estado inflamatório, pois se considera essa razão mais importante na avaliação do quadro inflamatório do que a concentração isolada de cada uma dessas citocinas. Redução nessa razão é correlacionada com pior prognóstico e diminuição na expectativa de vida de pessoas que possuem diferentes morbidades (Kaur et al, 2006; Leonidou et al, 2007). Além disso, essa razão é um importante marcador de esteatose hepática, mostrando uma forte correlação negativa (Hashem et al, 2008).
2.6 IL-2 e IL-4
12 A IL-4, ao contrário, é considerada uma citocina anti-inflamatória, principalmente por reduzir a resposta de monócitos, aumentar a produção de fatores antiinflamatórios, como, 10 e IL-13 e ao mesmo tempo, suprimir a produção de TNF-α e IL-1β (Curfs et al. 1997) e atuar como um importante fator de crescimento de linfócitos do tipo B. A IL-4 pode ser produzida em diversos tecidos, como fígado, cérebro e células musculares (Lowenthal et al, 1998, Jacquenim et al, 2007).
Os resultados das pesquisas que avaliaram a concentração plasmática destas citocinas, IL-2 e IL-4, após a execução de um protocolo de exercício exaustivo são controversos. As pesquisas mostraram, nos diversos protocolos de exercício testado, aumento, diminuição ou nenhuma alteração (Nieman et al, 2004; De la Fuente et al. 2005; Meksawan et al. 2004; Romeo et al. 2008; Sellar et al. 2006; Suzuki et al. 2003).
Após análise sistemática da literatura, não encontramos nenhum estudo relacionado com a modulação dessas citocinas no tecido adiposo, após exercício físico agudo. Detectamos apenas um trabalho que descreveu o efeito do treinamento de força, por 8 semanas, sobre a produção de IL-4 e seu receptor no músculo esquelético. Os pesquisadores verificaram, neste protocolo, elevação na quantidade de receptor para IL-4 sem alteração no conteúdo proteico desta citocina (Prokopchuk et al, 2007).
2.7 TLR-4
O TLR-4 pertence a uma família de 11 receptores que apresentam resposta específica a diferentes antígenos de microorganismos (Pasare and Medzhitov, 2003). Portanto, esses receptores são ferramentas importantes para a resposta imunológica, contribuindo no combate a patógenos microbicidas (Alexoupolou et al, 2002).
O principal ligante do TLR-4 é a parte da membrana da bactéria constituída de lipopolissacarídeos, que ativa a cascata de sinalização desse receptor, tendo como resultado final o aumento da expressão de marcadores inflamatórios, entre elas as citocinas (Hoshino et al, 1999), que também regulam a expressão e atividade desses receptores (Krutzik et al, 2003).
13 O tecido adiposo expressa esse receptor, que pode ser ativado tanto por lipopolissacarídeos, como por ácidos graxos livres (Shi et al, 2006). A ativação desse receptor nas células adiposas aumenta a expressão e liberação de citocinas pelos adipócitos via NFkB (Schaeffler et al, 2009). A elevação persistente de ácidos graxos livres no plasma, como ocorre muitas vezes no indivíduo obeso, pode aumentar a secreção de citocinas via TLR-4 (Francaux 2009). Assim, como o tecido adiposo, o músculo esquelético também expressa esse receptor (Lang et al, 2003).
O treinamento físico parece diminuir a expressão desse receptor em monócito (Lancaster et al 2005). Por outro lado, verifica-se na revisão de Gleeson e colaboradores (2006), que os resultados do efeito de uma sessão aguda de exercício físico sobre a expressão do TLR-4 em monócitos são divergentes.
2.8 Papel do músculo esquelético e tecido adiposo como órgãos endócrinos
14 partir de meados da década de 90 que esses dois tecidos são extremamente importantes na interação entre o metabolismo, o sistema endócrino e o sistema imune.
O músculo esquelético durante o exercício físico é capaz de produzir diversas citocinas responsáveis por regular o metabolismo energético durante o exercício, no entanto, essas citocinas podem agir em outros centros afastados, agindo como um hormônio e sendo capazes de modular diversas ações nos mais diferentes tipos celulares. Essas citocinas e outros fatores liberados pelo músculo esquelético ganharam o nome de miocinas (Pedersen e Fischer 2007).
Algumas patologias, como a obesidade, insuficiência cardíaca congestiva, caquexia, entre outras também podem levar a um aumento da expressão de mediadores inflamatórios pelo músculo esquelético, podendo acentuar o caso de inflamação crônica sistêmica, além de piorar o quadro de resistência a insulina ( Lancaster e Febbraio, 2009).
O treinamento é capaz de promover um aumento da liberação de fatores antiinflamatórios pelo músculo esquelético, sendo hoje um dos principais tratamentos para diminuir a inflamação crônica sistêmica (Pedersen, 2009). Inclusive, em humanos, o treinamento parece ser mais eficaz na diminuição dos parâmetros inflamatórios do que a restrição calórica em obesos (Lambert et al, 2008).
No entanto, pouco se sabe sobre o efeito do exercício agudo na produção de citocinas pró e antiinflamatórias pelo músculo esquelético.
O tecido adiposo branco é outro órgão que teve seu papel fundamental modificado mais precisamente em 1994. Com a descoberta do hormônio denominado leptina (Zhang et al, 1994), o tecido adiposo deixou de ser um órgão que servia meramente para estoque energético, para ter um papel fundamental no metabolismo energético, assim como no gasto calórico e consumo alimentar.
Com isso o tecido adiposo branco passou a ser considerado o maior órgão endócrino, extremamente importante no controle metabólico e fisiológico do corpo como um todo (Trayhurn 2005).
Essa função complexa do tecido adiposo é executada através da liberação de inúmeros fatores, como citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, hormônios entre outros. Todos esses fatores liberados pelo tecido adiposo branco, capaz de produzir efeito autócrine, parácrino ou endócrino, passaram a ser chamados de adipocinas (Trayhurn e Wood 2004).
16 3. Objetivos
3.1 Objetivo geral
Analisar a resposta inflamatória no músculo esquelético e tecido adiposo branco, provocada pelo exercício físico agudo em diferentes tempos: logo após, duas e seis horas a última sessão de exercício exaustivo.
3.2 Objetivos específicos
3.21 Analisar a expressão gênica das citocinas IL-6, IL-10 e TNF-α, logo após, duas e seis horas depois da sessão de exercício exaustivo em dois músculos que apresentam a composição da fibra muscular bem diferente. Um essencialmente oxidativo (sóleo) e um preferencialmente glicolítico (EDL).
3.22 Avaliar a expressão protéica dessas mesmas citocinas no sóleo e EDL, além de realizar a razão IL-10/TNF-α.
3.23 Analisar a expressão protéica das citocinas IL-6, Il-10 e TNF-α, logo após, duas e seis horas depois da sessão de exercício exaustivo em dois depósitos heterogêneos do tecido adiposo branco (mesentérico e retroperitoneal). Além disso, analisar a razão IL-10/TNF-α nesses dois depósitos.
3.24 Analisar a expressão protéica das citocinas IL-2 e IL-4 no sóleo, EDL, tecido adiposo retroperitoneal e tecido adiposo mesentérico.
17 4. Materiais e Métodos
4.1 Animais
Os procedimentos experimentais estão de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação animal adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), tendo sido o protocolo para o uso de animais em experimentação (1600/06) aprovado pela Comissão de Ética da Universidade Federal de São Paulo.
Foram utilizados ratos Wistar machos, com idade entre 6 a 8 semanas. Durante o período experimental, foram mantidos em gaiolas coletivas para 5 ratos em biotério com ciclo claro/escuro de 12/12 horas, com início do período claro às 7 horas, do Departamento de Fisiologia da Nutrição da Universidade federal de São Paulo. A temperatura ambiente da sala foi mantida em 25 ± 2C. A umidade do ar foi mantida em 60 ± 5%. Para todos os grupos foi oferecida ração comercial balanceada (NUVILAB CR1 - Nutrivital Nutrientes Ltda.) e água ad libitum. O início do protocolo de exercício ocorreu após uma semana de adaptação dos ratos no biotério.
4.2 Desenho Experimental
Os ratos foram sacrificados por decapitação logo após, duas e seis horas após a sessão exaustiva de exercício. O grupo controle não foi submetido a nenhum tipo de exercício físico. Os tecidos (EDL, sóleo, gastrocnemius, tecido adiposo retroperitoneal e mesentérico) foram retirados e imediatamente colocados no nitrogênio líquido, e estocados em freezer -80C para análise posterior.
4.3 Protocolo de exercício
Os ratos foram submetidos a uma semana de adaptação a corrida na esteira. Consistindo de 10 minutos por dia, com uma intensidade bem leve (5-10 metros/minuto). No quinto dia, os animais corriam por 50 minutos a uma velocidade de 20 metros/minuto, e após esse período havia o incremento de carga de 1 metro/minuto a cada minuto até a exaustão. Essa exaustão foi definida como o momento em que os ratos não conseguissem mais correr, com mudanças drásticas no padrão motor.
4.4 Procedimentos gerais para amostras que foram usadas para PCR
Para reduzir a presença das ribonucleases (RNAses), foram adotados os seguinte procedimentos: utilização de material descartável; esterilização da vidraria (em forno, a 250 C, por 4 minutos); manipulação de amostras e materiais com luvas; utilização de água tratada com dietil-pirocarbonato (Sigma-DEPC 0,01% vol/vol, sob agitação magnética, por 12 horas, autoclavada).
18 4.51 Extração de RNA
Para isolar o RNA total do músculo sóleo e EDL (pata posterior direita), as amostras pesando entre 0,1 e 0,15g foram homogeneizadas em TRIzol®Reagent. A partir desta etapa, seguiu-se o protocolo de extração de RNA, conforme instruções do fabricante. O RNA total extraído foi tratado com 10 U de deoxiribonuclease ribonuclease (RNase)-free por 1 hora a 37C. Após o tratamento, foi realizado uma extração com igual volume de mistura contendo fenol-clorofórmio-álcool isoamílico na proporção de 25:24:1, seguida por precipitação com 0,2 M de acetato de sódio e 2 volumes de etanol absoluto. O RNA precipitado foi lavado com etanol 70% para eliminar resíduos de fenol e sal, e solubilizado em água tratada com DEPC.
Para a quantificação do RNA foram feitas alíquotas equivalentes a 2 g acrescida de água para totalizar a diluição de 1:150. A concentração das amostras de RNA total foi determinada por espectrofotometria no comprimento de onda de 260 nm (correspondente ao pico de absorção de RNA) e 280 nm (correspondente ao pico de absorção de proteínas). A integridade das amostras foi verificada através de eletroforese em gel de agarose 1%, contendo 0,5 g/mL de brometo de etídeo. O gel foi imerso em tampão TAE 1X e a eletroforese realizada a 100 Volts por aproximadamente 45 minutos. O TRIzol®Reagent, uma solução monofásica de fenol e guanidina isotilcianato corresponde a uma variação do método desenvolvido por (Chomczynski e Sacchi, 1987).
4.52 - Transcrição Reversa (RT)
As amostras de RNA foram transcritas para DNA em um termociclador (Techne, Cambridge, UK). Para a síntese do cDNA foram utilizados 2 g de RNA total de cada amostra. As amostras foram incubadas com 0,5 g/mL de oligo dT12-18 (Invitrogen, USA) a 65C por 5 minutos, para se obter a primeira fita de cDNA. A transcrição reversa das amostras foi realizada em um volume total de 20 L contendo 10 mM de dNTPs, 0,1 M de DTT, 1X tampão da enzima, 3U de RNAsin e 2,5U de transcripatase reversa (AMV-RT). Após incubação por 1 hora a 37C, a temperatura foi elevada a 95C por 5 minutos e as amostras rapidamente colocadas em gelo para denaturação de híbridos RNA-cDNA formados e inativação da enzima utilizada na reação. Em alguns tubos, a transcriptase reversa não foi adicionada, a fim de se controlar a contaminação ou amplificação de DNA genômico. O cDNA obtido foi estocado a -20C até que fosse realizada a reação de PCR.
4.53 Seleção dos primers
19 comprimento entre 18 e 24 pares de base (bp)., com comprimento ótimo de 20-22 bases, Tm entre 58 e 62C, com temperatura ótima de 60C e comprimento do produto amplificado entre 100 a 150 bp. O conteúdo de C + G foi entre 40 a 60%, com conteúdo ótimo acima de 50%, e neste caso, seqüências e bases repetidas (> 3 bases idênticas) foram evitadas (Marone et al., 2001). Para determinar a especificidades, todas as seqüências foram comparadas com o Genbank usando o programa Blast disponível no sitio da National center for Biotecchnology Information (www.ncbi.nlm.gov). Quando ambas as seqüências dos primers demonstraram homologia para o mesmo gene, diferente daquele de interesse, esta foi descartada. Todos os primers selecionados para o PCR foram configurados de maneira que o produto amplificado fosse sintetizado em exons diferentes, evitando desta forma a contaminação do DNA genômico.
Tabela 1 - Sequência dos primers do RT-PCR.
20
TGGCTAA3` ACAAAC3`
GI :7549768
4.54 - Reações de PCR em tempo real
A expressão dos genes (Tabela 2) foi quantificada por PCR em tempo real (Higuchi et al, 1992) utilizando o aparelho (descrever) e SYBER green como marcador de fluorescência (n 11744-500, Invitrogen, USA). As reações foram realizadas em 25 µL de uma mistura contendo 1 µL do cDNA da amostra, 0,5 µL dos primers (ajustados de acordo com a concentração abaixo), 10,5 µL de água DEPEC e 12,5 µL do mix SYBER green master (dNTP. Tampão de reação, Taq DNA polmerasee SYBER Green I). As condições do PCR em tempo real foram: primeiro ciclo (único) a 95C por 15 minutos para ativação da enzima e 40 ciclos com fases de desnaturação a 95C por 15 segundos e anelamento a 60C por 30 segundos (7500 Fast Real-Time PCR, Applied Biosystems, USA). A sequência de primers utilizada está demonstrada na Tabela 2, de acordo com as seguintes concentrações; músculo sóleo - TNF- e IL-10 (200 nM) , IL-6 e 18S (300 nM) e para EDL - TNF-, IL-10 (200 nM) e 18S (200 nM).
A quantificação da expressão dos genes foi determinada usando o método da Ct comparativa (Ct=threshold cycle; número de ciclo no qual o produto do PCR atinge um limiar de detecção), tendo a expressão da 18S como padrão interno (Livak e Schmittgen, 2001). A Ct da 18S, gene constitutivo foi semelhante tanto no grupo controle (Sham e IM) como no grupo exercitado.
4.6 Quantificação das citocinas teciduais
4.61 Homogeneização dos tecidos para ELISA
Imediatamente após o sacrifício, os tecidos (músculo sóleo e EDL e os depósitos mesentérico e retoperitoneal do tecido adiposo branco) foram removidos, pesados, congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80 C para dosagens posteriores.
21 tecidos foram homogeneizados em desmembrador ultrasônico (modelo 100, Fischer Scientific, Pittsburg, USA) a 4C em três pulsos rápidos (< 1 seg. cada). Findo os dois procedimentos de homogeneização, as amostras foram centrifugadas a 4500 x g, durante 15 minutos a 4C, e o sobranadante coletado armazenado a -80 C para dosagens posteriores.
4.62 Determinação da concentração de proteínas totais do homogeneizado
A quantificação das proteínas totais nos tecidos avaliados foi determinada através do kit Protein Assay-Bradford Method Biotechnology Grade (E535, AMRESCO, Inc. USA). Este procedimento foi baseado no método colorimétrico descrito por Bredford et al. (1976), o qual utiliza o corante Coomassie Brilliant Blue G-250, que induz alteração de cor após a ligação com as proteínas desconhecidas, através da formação de um complexo que pode ser detectado por spectrofotometria de luz em comprimento de onda a 595 nm. Os valores da proteína desconhecida foram então comparados com a curva padrão de albumina (0,05 – 0,5 g / L).
As amostras (diluídas em 100 vezes) e os pontos da curva foram plaqueados em triplicatas, com 10 L por poço. Após este procedimento, acrescentou-se 190 L de Coomassie Brilliant Blue G-250, diluído em 10 vezes. A leitura foi realizada em espectofotômetro (Hitachi) a 595 nm. Os dados de absorbância foram (eixo x) foram plotados junto aos valores referentes às diferentes concentrações da curva-padrão (eixo y), e após a elaboração da curva da reta (regressão linear), os valores foram expressos em g / L de proteína tecidual (Bradford, 1976).
4.63 - Enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA)
22 Após o bloqueio, foram adicionados 100 µL por poço das amostras e dos padrões diluídos previamente em reagente de diluição (1% BSA em PBS, pH 7.2 - 7.4, 0.2 µm filtrado), e cobertos com fita adesiva . Em dois poços foram colocados somente o reagente de diluição para caracterização do branco. A placa foi incubada por 2 horas em temperatura ambiente. Após este período, os poços foram lavados por 3 vezes com tampão de lavagem (0.05% Tween 20 em PBS, pH 7.2 - 7.4).
Após as lavagens, foram adicionados 100 µL do anticorpo de detecção (Anticorpo anti-rato Biotinilado) diluídos previamente em reagente de diluição (1% BSA em PBS, pH 7.2 - 7.4, 0.2 µm filtrado) na concentração estabelecida, cobertos com fita adesiva e incubado por 2 horas em temperatura ambiente. Findo este prazo, os poços foram lavados novamente como descrito acima. Posteriormente, foram adicionados 100 µL de Streptoavidina-HRP (1:250) por poço, cobertos com fita adesiva e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente. Assim, evitou-se o contato direto da placa com a luz. Findo este prazo, os poços foram lavados novamente como descrito acima. Posteriormente, foi adicionado a solução de substrato (mistura dos reagentes de cores A - H2O2 e B - Tetrametilbenzidina), na diluição de 1:1, por poço e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente, onde evitou-se o contato direto da placa com a luz. A reação foi interrompida com 50 µL de H2SO4 30% por poço sob agitação lenta. A leitura foi feita em leitor de ELISA (Power Wave, Bio-tek) utilizando filtro de 450 nm.
4.7 Western Blotting
4.71 Extração dos tecidos para Western Blotting
Os tecidos (EDL, sóleo, tecido adiposo retroperitoneal e mesentérico) foram colocados em 1,0 ml de tampão específico, preparado e aquecido no dia do experimento, para extratos totais tendo a seguinte composição:
Trizma base 100 mM pH 7.5, EDTA 10 mM, SDS 10%, fluoreto de sódio 100 mM, pirofosfato de sódio 10 mM, ortovanadato de sódio 10 mM.
Os tecidos foram rapidamente homogeneizados no gelo, utilizando seringa e agulha de calibre 23 gauge. Em seguida, o homogenato foi centrifugado por 20 minutos a 12000 rpm a 4°C. O sobrenadante foi coletado.
4.72 Determinação da concentração de proteínas totais do homogeneizado
A determinação do conteúdo total de proteínas no homogentao, foi realizada pelo método de Bradford, como já descrito no 4.62.
23 As amostras foram adicionadas ao tampão de Laemmli (azul de bromofenol 0,01%, fosfato de sódio 50mM, glicerol 25%, SDS 1%) na proporção de 1:1, contendo 200mM de DTT. O volume de 70g de proteína foi submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante a 10%. Após eletroforese, as amostras foram transferidas para membrana de nitrocelulose por 2 horas à temperatura ambiente. Após a transferência a membrana foi bloqueada a noite inteira em 15 ml de solução bloqueadora, composta de solução basal (Trizma base 10 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 50 l/ml) contendo 1%BSA e azida sódica 0.02%. Em seguida, foi feita a incubação com o anticorpo primário específico por 2 horas a temperatura ambiente, com o anticorpo dissolvido em solução basal com azida sódica 0,02% e BSA 1%. A seguir, a membrana foi incubada por uma hora com anticorpo secundário associado a peroxidase. O anticorpo secundário foi sempre de uma anti-imunoglobulina dirigida contra o animal produtor de anticorpo primário. A membrana foi revelada por quimioluminescência após adição do reagente de revelação (ECL da Amersham) e exposta a filme de raio X. As bandas de interesse foram quantificada por densitometria, utilizando-se o programa Scion Image.
4.74 Diluições e anticorpos utilizados no Western Blotting
Os anticorpos primários para TLR-4, TRAF6 e MYD88 foram comprados da empresa Santa Cruz biotechnology. Esses anticorpos foram produzidos em coelho. Foi utilizado a diluição 1:1000 dos anticorpos primários e 1:5000 do anticorpo secundário contra coelho, produzido pela empresa Sigma.
4.8 Análise estatística
24 5.Resultados
Os resultados desta tese estão apresentados na forma de 3 trabalhos científicos:
1. Exhaustive exercise causes an anti-inflammatory effect in skeletal muscle and a pro-inflammatory effect in adipose tissue in rats. José C Rosa Neto, Fábio S Lira, Lila M Oyama, Nelo E Zanchi, Alex S Yamashita, Miguel l Batista Jr, Cláudia M Oller do Nascimento, Marília Seelaender. Publicado no European Journal Applied Physiology, 2009.
2. Acute exhaustive exercise regulated protein levels of IL-2, IL-4 and Myod in skeletal muscle, but not in adipose tissue in rats. José C Rosa Neto, Fábio S Lira, Alex S Yamashita, Nelo E Zanchi, Lila M Oyama, Ronaldo V T dos Santos, Marco Túlio de Mello, Sérgio Tufik, Ana R Dâmaso, Marília Seelaender, Cláudia M Oller do Nascimento (submetido).
25
26 Exhaustive exercise causes an anti-inflammatory effect in skeletal muscle and a pro-inflammatory effect in adipose tissue in rats
José C Rosa Neto1, Fábio S Lira1,2,Lila M Oyama1, Nelo E Zanchi3, Alex S Yamashita2, Miguel L Batista
Jr2, Cláudia M Oller do Nascimento1, Marília Seelaender2 .
1Department of Physiology of Nutrition – Federal University of São Paulo – São Paulo, Brazil. 2Molecular Cell Biology Study Group – Department of Cell Biology and Development – Institute o
Biomedical Sciences I - University of São Paulo, Brazil. 3School of Physical Education and Sports -
University of São Paulo – São Paulo, Brazil. Corresponding Author:
Cláudia Maria Oller do Nascimento
Department of Physiology of Nutrition – Federal University of São Paulo – São Paulo, Brazil. Address: Rua Botucatu 862, 2º andar, São Paulo, SP, Brazil. CEP: 04023-060.
27 Abstract
It is well known that exhaustive exercise increases serum and skeletal muscle IL-6 concentrations.
However, the effect of exhaustive exercise on the concentrations of other cytokines in the muscle and in
the adipose tissue is controversial. The purpose of this study was to evaluate the effect of exhaustive
exercise on mRNA and protein expression of IL-10, TNF-α and IL-6 in different types of skeletal muscle (EDL, soleus) and in two different depots of white adipose tissue (mesenteric - MEAT and retroperitoneal
- RPAT). Rats were killed by decapitation immediately (E0 group, n=6), 2 (E2 group, n=6) and 6 (E6
group, n=6) hours after the exhaustion protocol, which consisted of running on a treadmill (approximately
70% VO2max for fifty minutes and then subsequently at an elevated rate that increased at one m/min every
minute, until exhaustion). The control group (C group, n=6) was not subjected to exercise. Cytokine
protein expression increased in EDL, soleus, MEAT and RPAT from all exercised groups, as detected by
ELISA. EDL IL-10 and TNF-α expression was higher than that of the soleus. The IL-10/TNF-α ratio was
increased in the skeletal muscle, especially in EDL, but it was found to be decreased in the adipose tissue.
These results show that exhaustive exercise presents a different effect depending on the tissue which is
analysed: in the muscle, it induces an anti-inflammatory effect, especially in type 2 fibres, while the
pro-inflammatory effect prevails in adipose tissue, possibly contributing to increased lipolysis to provide
energy for the exercising muscle.
28 Introduction:
Exercise represents a physical stress that challenges homeostasis (Mastorakos and Pavlatou
2005). Therefore, a single bout of exercise is a mild physical stressor that exerts an array of effects on
immune parameters (Sprenger et al. 1992; Schulz et al. 2004). The body reacts to physical activity as it
does during an acute, subclinical inflammatory response to a perceived pathological insult (Bury et al.
1996; Camus et al. 1998).
Most studies in humans indicate that during and following prolonged exercise, plasma cytokine
concentrations (e.g., IL-6, IL-10, CSF, MIP, TNF) peak at the end of exercise (Starkie et al. 2000; Suzuki
et al. 2003; Chan et al. 2004), with the exception of IL-1ra, which peaks 1-2 hours post-exercise
(Ostrowski et al 1999). IL-6 is generally considered to be inflammation-responsive and to induce
anti-inflammatory effects (via its actions in stimulating cortisol, secreting IL-10 and IL-1ra, and inhibiting
TNF- production) rather than pro-inflammatory effects (Steensberg et al, 2003; Pedersen and Fischer
2007).
During the past few years, it has been demonstrated that the contraction of human and rat
skeletal muscle produces and releases IL-6 into the circulatory system (Jonsdottir et al. 2000; Febbraio et
al. 2003). Myofibres can, per se, be a source of IL-6 production during exercise (Penkowa et al. 2003;
Hiscock et al. 2004). A few studies examined which specific fibre type is involved in IL-6 production
under the stimulus of exercise, from which some showed a marked increase in production from type 1
fibres (Plomgaard et al. 2005; Banzet et al. 2005). However, Hiscock et al (2004) reported a higher
increase in mRNA and protein expression of IL-6 in type 2 fibres.
Several studies have shown an increase in serum TNF-α concentration after strenuous exercise
(Hirose et al. 2004; Zaldivar et al. 2006). However, this concentration increase during exercise is very
small compared to the magnitude of increases in IL-6, IL-10 and IL-1ra. It has been shown that skeletal
muscle is able to express this protein (Plomgaard et al. 2005; Meador et al. 2008) in a process that is
enhanced by resistance exercise (Raue et al. 2007). Plomgaard et al. (2005) demonstrated with
immunohistochemistry that TNF-α is only expressed by type 2 fibres in resting human muscle.
Exhaustive exercise is capable of raising the concentration of anti-inflammatory cytokines in
serum, such as IL-10 (Ostrowski et al. 1999; Suzuki et al. 2006). The IL-10/TNF-α ratio has been adopted
as an indicator of inflammatory status and disease-associated morbidity, with lower values associated
29 evaluated TNF-α and IL-10 production in different muscle fibre types after strenuous exercise in healthy rats.
The adipose tissue actively secretes various bioactive peptides, termed ―adipokines‖, which act
both locally and distally and have autocrine, paracrine, and endocrine effects (Pond 1999). The
physiology, metabolism, and function of white adipose tissue vary in a depot-specific manner, as
reviewed by Lafontan and Berlan (2003). Therefore, marked differences in gene expression amongst
depots are reported both for rodents (Gesta et al. 2006) and humans (Vohl et al. 2004), and cytokine
secretion is also heterogeneous (Lafontan et al. 2003). Recently, increases in TNF-α, IL-10 and the IL-10/TNF-α ratio have been shown in white adipose tissue after a rest period of 24 hours following an endurance exercise training protocol (Lira et al. 2009). However, Gomez-Merino et al (2007) did not find
a significant increase in IL-10 from white adipose tissue following endurance training.
The aim of this study was to examine the effects of acute exhaustive exercise on the time course
30 MATERIALS AND METHODS:
Animals:
The Experimental Research Committee of the São Paulo Federal University approved all
procedures for the care of the animals used in this study. A total of 24 male Wistar rats ranging in age
from 6 wk (weighing ~250 g) were used. They were housed four per cage, receiving a chow diet and
water ad libitum, in an animal room under a 12 h light-dark cycle, at 22 1 C and 60 5% humidity.
The experiments were carried out after an acclimation period of one week.
Exercise protocol
All animals were accustomed to running on a rodent treadmill for 10 min per day for 4 days at a
moderate level (5-10 m/min). On the fifth day, animals ran on the treadmill (20 m/min for fifty minutes
and then subsequently at an elevated rate that increased at one m/min every minute) until exhaustion,
defined as the moment where animals were unable to keep in pace with the treadmill.
Experimental Design
Rats were killed by decapitation immediately (E0 group, n=6), 2 (E2 group, n=6) and 6 (E6
group, n=6) hours after the exhaustion exercise protocol. The control group (C group, n=6) was not
subjected to the exercise protocol. Following sacrifice, the soleusandEDL muscles and mesenteric and
retroperitoneal white adipose tissue were removed, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at –80 °C. Glycogen content in the soleus and EDL muscles was measured as described by Sjorgreen et al. (1938).
TNF-, IL-10, IL-6, protein and mRNA level determination
Frozen tissues (0.1– 0.3 g) were homogenised in RIPA buffer (0.625% Nonidet P-40, 0.625% sodium deoxycholate, 6.25 mM sodium phosphate, and 1 mM ethylene-diamine tetraacetic acid at pH
7.4) containing 10 µg/ml of a protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri).
Homogenates were centrifuged at 12.000 g for 10 min at 4°C, the supernatant was saved, and protein
concentration was determined using the Bradford assay (Bio-Rad, Hercules, California) with bovine
serum albumin as a reference. Quantitative assessment of TNF-a, IL-6 and IL-10 proteins was carried out
31 of the IL-10 kit was 2.0–4.2%, and its inter-assay variability was 3.3–6.4%. All samples were run as duplicates, and the mean value was reported.
Total RNA was isolated from soleus and EDL samples using Trizol (Invitrogen, Carlsbad,
California) following the manufacturer’s recommendations. Concentrations of RNA were determined by
measuring absorbance at 260 nm. The purity of the RNA was determined by calculating the absorbance
ratio at 260 nm and 280 nm, as well as by ethidium bromide staining. Isolated RNA was stored at -80°C
until analysis by real-time polymerase chain reaction (PCR). For reverse transcription, 1 µg of total RNA
was typically used in a reaction containing a random primer (500 µg/ml), 10 mM of each dNTP, 5x
first-strand buffer, 0.1 M dithiothreitol, and 200 U of reverse transcriptase (SuperScript II, Invitrogen).
Reverse transcription was performed at 70°C for 10 min, followed by incubation at 42°C for 60 min and
at 95°C for 10 min. Primer sets for rat TNF- (sense: 5`-TCT CAA AAC TCG AGT GAC AAG C-3`,
and antisense: 5`-GGT TGT CTT TGA GAT CCA TGC-3`), IL-10 (sense: 5`GAG AGA AGC TGA
AGA CCC TCT G3`, and antisense: 5`-TCA TTC ATG GCC TTG TAG ACA C-3`) were designed using
Primer Express software v2.0 (Applied Biosystems, Foster City, California). The results for mRNA
concentrations are expressed as ratios over 18S-ribosomal ribonucleic acid (rRNA), which was amplified
as a house-keeping gene using the following primers for β-actin: sense: 5`ACCAGTTCGCCATGGATGA3` and antisense: 5`TGCCGGAGCCGTTGTC3`. For each sample,
PCR was performed in duplicate in a 25-µl reaction volume of 5–20 ng of cDNA, 12.5 µl Syber Green Master Mix (Applied Biosystems), and 100–200 nM of each primer. PCR analyses were carried out using the following cycle parameters: 50°C for 2 min, 95°C for 10 min, followed by 40 cycles of 95°C for 15 s,
and 60°C for 1 min. Fluorescence was quantified, and analyses of amplification plots were performed
with the ABI Prism 7700 Sequence Detector System (Applied Biosystems). Results were expressed using
the comparative cycle threshold (Ct) method as described by the manufacturer.
Statistical analysis
The statistical analysis was performed using a commercially available statistical package from
SigmaStat (version 3.1, SigmaStat, SYSTAT, Point Richmond, CA). The data are expressed as the means
SE. Implementation of the Kolmogorov-Smirnov test revealed that the results of experiments were
distributed normally. Intergroup comparisons were performed by using the one-way ANOVA test.
Post-hoc comparison tests between groups were made using the Holm-Sidak test. A p-value of less than 0.05
32 Results:
The mean exhaustion time was 61.88 ± 2.24 min, without differences between groups. The
glycogen content was decreased significantly (p<0.005) after exhaustion exercise in both the soleus
muscle (C= 0.184 ± 0.046; E0 = 0.038 ± 0.008 mg/g protein) and in the EDL (C=0.205 ± 0.064; E0=
0.049 ± 0.011 mg/g protein) as compared to the control groups.
IL-6 protein content.
Figure 1 shows that IL-6 content was increased in all studied tissues in the E0, E2 and E6 groups
as compared to the control group. Also, in RPAT, the IL-6 concentration at E6 was higher than at E0 and
E2. This protein content was lower in MEAT than in RPAT (E0-1.60; E2-1.58 and E6- 2.74 times,
p<0.05).
The IL-6 protein content was higher in the EDL muscle in relation to the soleus muscle at E0
(58.42 ± 3.46 vs. 22.3 ± 3.48; pg/µg protein, p<0.001), at E2 (54.98 ± 3.55 vs. 39.63 ± 11.70; pg/µg
protein, p<0.05), and at E6 (53.47 ± 9.01 vs. 25.08 ± 5.76; pg/µg protein, p<0.05).
TNF-α mRNA and protein expression.
The mRNA content was increased in the EDL and soleus at E0, E2 and E6 in relation to the
control group (Figure 2). Figure 3 shows that the exhaustion exercise increased TNF-α content in all
studied tissues (E0, E2, E6 vs. C). This protein content was higher in EDL muscle in relation to soleus
muscle at E0 (31.24 ± 3.74 vs. 12.70 ± 0.63; pg/µg protein, p<0.01) and E6 (26.64 ± 1.78 vs. 12.21 ±
1.04; pg/µg protein, p<0.001).
IL-10 mRNA and protein expression.
Figure 2 shows that IL-10 mRNA in EDL muscle was increased at E0 and became similar to
control levels in the E2 and E6 groups. In contrast, the IL-10 mRNA in soleus muscle was higher in the
E0, E2 and E6 groups than in the control group. Figure 4 shows that IL-10 content increased in all studied
tissues of the E0, E2 and E6 groups as compared to the control group. The IL-10 content in EDL muscle
was greater than that in soleus muscle at E0 (77.32 ± 9.32 vs. 20.83 ± 1.26; pg/µg protein, p<0.001), E2
(83.83 ± 10.88 vs. 28.8 ± 6.85; pg/µg protein, p<0.01), and E6 (92.96 ± 7.47 vs. 17.59 ± 1.51; pg/µg
protein, p<0.001).
33 In EDL and soleus muscles, the IL-10/TNF-α ratio was, respectively, 2.5 and 1.5 times higher at E0, E2 and E6 than in the control group. However, in both adipose tissue depots, this ratio was decreased
