Caracterização fenotípica e molecular de
Pseudomonas
aeruginosa
resistentes a carbapenêmicos e produtoras de
Metalo-beta-lactamase, isoladas em hemoculturas de crianças e
adolescentes com câncer
São Paulo
2008
Caracterização fenotípica e molecular de
Pseudomonas
aeruginosa
resistentes a carbapenêmicos e produtoras de
metalo-beta-lactamase, isoladas em hemoculturas de crianças e
adolescentes com câncer
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari Universidade Federal de São Paulo
Co-orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Pires Pereira Universidade Federal de São Paulo
São Paulo
2008
FERNANDES, Thaís Ávila
Caracterização fenotípica e molecular de Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenêmicos e produtoras de metalo-beta-lactamase, isoladas em hemoculturas de crianças e adolescentes com câncer – Thais Ávila Fernandes - São Paulo, 2008.
xvi, 88f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia
Título em inglês: Molecular epidemiology of blood stream isolates of Pseudomonas aeruginosa resistant to carbapenems and metalo-betalactamase producers from children and teenagers with cancer 1. Pseudomonas aeruginosa 2. Metalo-Beta-Lactamase
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento: Profa. Dra. Emilia Inoue Sato
Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. Ricardo Sobie Diaz
THAIS AVILA FERNANDES
Caracterização fenotípica e molecular de cepas de
Pseudomonas aeruginosa
resistentes a carbapenêmicos e
produtoras de metalo-beta-lactamase, isoladas em hemoculturas de
crianças e adolescentes com câncer
BANCA EXAMINADORA:
Profa. Dra. Luci Corrêa
Prof. Dr. Antônio Sérgio Petrilli
Profa. Dra. Lycia Mimica
Prof. Dr. Fernando Gongora Rubio
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais,
Paulo Cesar e Iveta Maria e ao meu irmão
Tiago pelo amor e apoio incondicionais,
não apenas neste trabalho, mas em todos
os momentos da minha vida.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Iveta e Paulo, irmão Tiago e tios Geny e Rodolfo que me
apoiaram em todos os momentos da minha vida e especialmente a realizar
esse sonho meu de ser mestre.
A Alexandre Lichtenberger Catan pelo apoio, conselhos e paciência que
foram importantes para mim em todos os momentos desta fase.
Ao meu orientador que acreditou no meu potencial para a realização
deste trabalho. Professor é aquele que consegue passar seus
conhecimentos de maneira clara e objetiva e orientador é aquele que
verdadeiramente orienta seus orientandos com precisão e inteligência. O
senhor professor Pignatari, é um ótimo professor orientador! Tenho orgulho
de ser sua orientanda!
Aos Professores Doutores Carlos Alberto Pires Pereira e José Carlos
Longo (In memory) pelo apoio e confiança ao me indicar para fazer parte do
grupo LEMC em 2003. Principalmente ao Dr Carlinhos, meu co-orientador,
pelos sábios conselhos que me ajudaram muito na realização deste
trabalho.
Aos meus amigos Andrea Pereira, Rodrigo Cayô e Amilton Moro pela
imensa ajuda, disponibilidade e amizade que sem eles esse trabalho não
seria possível. Queridos, muito obrigada!
A Jussimara Monteiro muito obrigada pelos ensinamentos e momentos
de alegria e descontração que passamos quando eu estava na tipagem
molecular. Ju, você é uma ótima pessoa e amiga!
Aos meus queridos amigos dos laboratórios LEMC/ALERTA Kelly Aline,
Capecce, Andréia Penteado, Alinne, Danilo, Renata, Eloísa, Anderson, Ana
Paula, Liana, Pedro, Mariana, Rodrigo Mendes muito obrigada pela
compania e pelos ótimos momentos que passamos nos laboratórios durante
todos esses anos.
Aos professores e funcionários de Disciplina de Doenças Infecciosas da
Escola Paulista de Medicina – UNIFESP, especialmente ao Charlys, pelo
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Classificação esquemática das beta-lactamases bacterianas.
Tabela 2: Primers utilizados pela técnica de PCR.
Tabela 3: Perfil de sensibilidade para os 10 antimicrobianos avaliados no
estudo contra as 56 amostras de P.aeruginosa pela técnica de disco-difusão.
Tabela 4: Perfil de sensibilidade para os 10 antimicrobianos avaliados no estudo
das 18 amostras de P. aeruginosa produtoras de MBL pela técnica de
disco-difusão.
Tabela 5: Resumo das características clínicas e epidemiológicas dos 49
pacientes com isolamento de P. aeruginosa em hemoculturas.
Tabela 6: Sensibilidade de P. aeruginosa aos diferentes antimicrobianos
testados de acordo com a resistência a carbapenêmicos.
Tabela 7: Resumo dos resultados obtidos das amostras de P.aeruginosa
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Distribuição mundial dos diferentes tipos de MBLs.
Figura 2: Amostra de P. aeruginosa apresentando teste fenotípico positivo
para a produção de MBL. A seta indica o disco de papel filtro estéril contendo 3
µL de uma solução pura de ácido 2-mercaptopropiônico a 1,2 g/mL.
Figura 3: Amostra de P. aeruginosa apresentando teste fenotípico positivo
para a produção de MBL. A seta indica o disco de papel filtro estéril contendo
5µL de uma solução de EDTA a 100mM.
Figura 4: Reação de PCR utilizando-se o primer blaSPM-1.
Figura 5: Resultados obtidos pela técnica PFGE das oito amostras que
possuem o mesmo perfil de similaridade genética.
Figura 6: Dendograma de amostas de P. aeruginosa de acordo com a técnica
de PFGE.
Figura 7: Características clínicas e epidemiológicas dos 49 pacientes dos
quais foram isoladas P. aeruginosa em hemoculturas.
Figura 8: Características clínicas e epidemiológicas dos 17 pacientes dos
quais foram isoladas P. aeruginosa produtoras de MBL (blaSPM-1) em hemoculturas.
Figura 9: Características clínicase epidemiológicas dos 15 pacientes dos quais
foram isoladas P. aeruginosa resistentes aos carbapenêmicos não produtoras
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...1
2. OBJETIVOS...3
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...4
3.1. Agente Etiológico...4
1.3. Epidemiologia das infecções causadas por P. aeruginosa...5
1.4. Mecanismos de resistência antimicrobiana em P. aeruginosa...10
1.4.1. Alteração de permeabilidade com alteração de proteínas de membrana externa (porinas)...12
1.4.2. Alteração do sítio de ligação do antimicrobiano...13
1.4.3. Mecanismo ativo de efluxo de antimicrobianos...14
1.4.4. Produção de enzimas inativadoras de antimicrobianos...15
1.4.4.2. Produção de beta-lactamase...15
1.4.4.3. Produção de Metalo-beta-lactamase (MBL)...20
1.5. Tipagem Molecular...27
4. MATERIAL E MÉTODO...29
4.1. Local do estudo...29
4.2. Delineamento do estudo...29
4.3. Critérios de inclusão...29
4.4. Critérios de exclusão...30
4.6. Avaliação de Susceptibilidade in vitro aos antimicrobianos...31
4.6.1. Teste de disco difusão...31
4.7. Detecção das amostras de P. aeruginosa produtoras de MBL...32
4.7.1. Testes fenotípicos...32
4.7.1.1. Disco-aproximação...32
4.7.2. Testes genotípicos...33
4.7.2.1. Pesquisa de genes relacionados à produção de MBL pela técnica de reação da polimerase em cadeia....33
4.8. Avaliação da similaridade genética das amostras de P. aeruginosa resistentes a carbapenêmicos...36
4.8.1. Pulsed-Field Gel Electrophoresis – PFGE……...…………...37
4.9. Análise Clínica e Epidemiológica...39
5. RESULTADOS...40
5.1. Amostras Bacterianas ...40
5.2. Avaliação da sensibilidade in vitro a antimicrobianos das amostras de P. aeruginosa pelo método de disco-difusão...40
5.3. Detecção do mecanismo de resistência aos carbapenêmicos...42
5.3.1. Detecção fenotípica da produção de metalo-beta-lactamase pelo teste de disco-aproximação...42
5.4. Tipagem Molecular...46
5.5. Análise Clínica e Epidemiológica...47
6. DISCUSSÃO...53
7. CONCLUSÕES...61
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...62
RESUMO
Pseudomonas aeruginosa é um importante patógeno oportunista em
pacientes hospitalizados, particularmente em pacientes oncológicos e que apresentam neutropenia. Uma das principais características desta bactéria é o desenvolvimento de resistência a múltiplos antimicrobianos, incluindo os antibióticos carbapenêmicos. A primeira amostra produtora da metalo-beta-lactamase (MBL) blaSPM-1 reportada na literatura foi isolada de paciente hospitalizado no Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP/GRAACC/UNIFESP) no ano 2000. Objetivo: Avaliar a prevalência de P. aeruginosa resistente aos
carbapenêmicos e produtoras de metalo-beta-lactamase, isoladas de hemoculturas coletadas no período de 2000 à 2005 de pacientes admitidos no IOP; caracterizar essas MBLs e avaliar sua disseminação através de tipagem molecular e caracteristicas clínico/epidemiológicas dos pacientes. Métodos:
Foram testadas 56 amostras de P. aeruginosa isoladas de 49 pacientes contra
10 antimicrobianos diferentes por disco difusão. As amostras que foram resistentes aos carbapenêmicos foram submetidas a testes fenotípicos (disco-aproximação) e genotípicos (PCR) para a confirmação da presença de MBLs. As amostras produtoras de MBL foram submetidas a tipagem molecular através da técnica de PFGE. A análise clínica/epidemiológica foi realizada a partir de dados obtidos dos prontuários dos pacientes. Resultados: Durante o período entre 2000 e 2005, 32 das 56 amostras de P. aeruginosa, foram classificadas
como resistentes aos carbapenêmicos pela técnica de disco difusão. Dezoito das 32 (56,2%) amostras avaliadas carreavam o gene blaSPM-1. Sendo que oito (44,4%) das 18 amostras produtoras de blaSPM-1, apresentaram o mesmo perfil genético. Não foi observada a presença de outras metalo enzimas blaIMP-1,
blaSPM-1 que persistiu no período entre novembro/2000 a dezembro/2005 em hemoculturas de pacientes do IOP-GRAACC. Observamos uma maior letalidade dos pacientes com bacteremia por P. aeruginosa com essa
ABSTRACT
Pseudomonas aeruginosa is an important opportunist pathogen,
particularly for oncologic and neutropenic hospitalized patients. One of the main
characterisitic of this bacteria is the development of multiple antibiotic
resistance, including the carbapenems. The first metallo-beta-lactamase (MBL)
encoding the gene blaSPM-1 reported in the literature was isolated in the year 2000 from a patient admitted to the Instituto de Oncologia Pediatrica
(IOP/GRAAC - UNIFESP). Objective: To evalute the prevalence of P.
aeruginosa carbapenem resistant and MBL producers isolated from
blood-stream samples collected from patients admitted to the IOP in the period
2000-2005; to describe the dissemination of these enzymes by molecular typing and
clinical/epidemiological data. Methods: 56 P. aeruginosa isolates from 49
patients were tested against 10 different antibiotics by disc diffusion. The
isolates resistant to carbapenems were tested by disc-approximation method
and submitted to PCR reaction for detection of MBLs genes. The isolates
producers of blaSPM-1 were molecular typed by PFGE. The clinical and epidemiological data were obtained from the patiens charts. Results: From
2000 to 2005, 32 out of 56 P. aeruginosa isolates were classified as
carbepenem reistant by disc diffusion. Eighteen out of 32 (56,2%) isolates
carried blaSPM-1 and revealed the same molecular typing profile. We did not detected other MBL blaIMP-1, blaVIM-1 and blaVIM-2. The antibiotic therapy was considered adequate in only 17,7% of the patients with P. aeruginosa
letality of patients with P. aeruginosa bacteremia resistant to carbapenems but
not carring MBL. Conclusion: We detected the presence of a P. aeruginosa
clone resistant to carbapenems and carrying the gene blaSPM-1 that persisted in blood stream isolates of patients admitted to the IOP from 2000 to 2005. A high
letality rate and inadequacy of initial antibiotic treatment was observed justifying
a strict epidemiologic surveillance and re-evalutation of antibiotic treatment
1. INTRODUÇÃO
Infecções por bactérias Gram-negativas em ambiente hospitalar constituem
grave problema de saúde pública, devido a sua freqüência, morbidade,
mortalidade e custo do tratamento. Pseudomonas aeruginosa é considerada um
importante patógeno em ambiente hospitalar, pois são freqüentemente isoladas
em infecções de corrente sangüínea e com freqüência apresentam
multirresistência aos antimicrobianos, inclusive aos carbapenêmicos.
P. aeruginosa multirresistentes têm se tornado motivo de alerta quando
detectados em pacientes hospitalizados, pois possuem a capacidade de
sobreviver em soluções aquosas como desinfetantes, sabões, pomadas,
equipamentos de quimioterapia, etc, além de estarem presentes nas mãos de
profissionais de saúde. Além disso, infecções causadas por esses
microrganismos permanecem como principal causa de óbito em pacientes
oncológicos, devido a alterações no mecanismo de defesa do hospedeiro
decorrentes a própria doença de base e / ou tratamento quimioterápico.
No período ente novembro de 2000 e março de 2001, observou-se um
aumento de pacientes com infecção de corrente sanguínea causada por P.
aeruginosa no Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP – GRAACC) vinculado a
Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina
(UNIFESP-EPM) especializado no tratamento de crianças e adolecentes com câncer. Nesse
período os pacientes apresentaram hemoculturas positivas para P. aeruginosa
metalo-beta-lactamase (MBL), e na maioria resistentes a todos os antimicrobianos com
exceção da polimixina B. Posteriormente foi confirmada a presença de MBL no
Laboratório Especial em Microbiologia Clínica (LEMC) da UNIFESP – EPM com
caracterização de uma nova enzima denominada SPM (Toleman et al, 2002).
O presente estudo tem como objetivo principal avaliar a prevalência e a
disseminação destes microrganismos, através de estudos epidemiológicos e
utilização de técnicas de tipagem molecular (PCR e PFGE) no período de
2. OBJETIVOS
• Avaliar a persistência de P. aeruginosa resistentes aos
carbapenêmicos produtoras de metalo-beta-lactamase, de hemoculturas
coletadas no período de 2000 à 2005 de pacientes admitidos no Instituto de
Oncologia Pediátrica (IOP), Universidade Federal de São Paulo/ Escola Paulista
de Medicina (UNIFESP/EPM).
• Caracterizar as metalo-beta-lactamases e avaliar sua disseminação
através de tipagem molecular e caracteristicas clínicas e epidemiológicas dos
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Agente Etiológico
Pseudomonas spp. são bacilos Gram-negativos não fermentadores de
glicose, com aproximadamente 1,5 a 5,0 µm de comprimento e 0,5 a 1,0 µm de
largura; são estritamente aeróbios, ou seja, têm o oxigênio como aceptor final de
elétron no metabolismo respiratório. Encontradas em diversos lugares da
natureza, são mais frenqüentes no solo, na água, nas plantas e nos animais
(incluindo os seres humanos) (Koneman et al, 2001).
São bactérias que podem crescer em condições de anaerobiose utilizando
nitrato ou arginina como aceptor final de elétron. Não formam esporos e contém
um ou mais flagelos polares. Apresentam a prova da oxidase positiva, exceto P.
luteola e P. oryzihabitans, e são catalase positiva. A maioria degrada glicose
oxidativamente e converte nitrato em nitrito. Crescem em ágar MacConkey, onde
observa-se que não são fermentadoras de lactose, e crescem em temperaturas
que variam de 5°C a 42°C, sendo 37°C a temperatura considerada ideal. Estes
microrganismos são metabolicamente versáteis, pois são capazes de utilizar
carboidratos simples ou complexos, álcoois e aminoácidos como substratos
(Koneman et al, 2001).
Duas divisões foram propostas para classificar os microrganismos desta
família: i) O esquema, desenvolvido por Palleroni (1984), é baseado em estudos
de homologia genética do RNA ribossômico e do DNA, classificando estes
fenotípicas e dividiu os microrganismos em sete grandes grupos: fluorescens,
stutzeri, alcaligenes, pseudomallei, acidovorans, facili-delafieldii e diminuta.
Estudos filogenéticos, baseados na análise das seqüências de nucleotídeos da
porção 16S do RNA ribossômico, levaram a uma nova descrição do gênero
Pseudomonas e limitaram as espécies de acordo com a homologia do RNA
ribossômico em cinco grupos. Atualmente, o gênero Pseudomonas pertence ao
grupo I, que inclue as espécies P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida (Kersters
et al,1996; Anzai et al, 2000).
Colônias de Pseudomonas spp. apresentam-se de diferentes formas,
variando desde uma colônia plana, difusa (característica da maioria dos isolados
clínicos) até colônias extremamente pequenas. Colônias com aspecto mucóide
são comuns em amostras isoladas de infecções do trato respiratório,
principalmente, de pacientes com fibrose cística. A maioria das amostras de P.
aeruginosa pode ser identificada de acordo com a sua pigmentação
verde-azulada, devido à produção de piocianina e odor de frutas (Gillardi et al, 1980).
1.3. Epidemiologia das infecções causadas por P. aeruginosa
P. aeruginosa é uma causa rara de infecção no ser humano sadio apesar
do microrganismo ser encontrado na microbiota intestinal de 7 a 25% dos
adultos (Dogget, 1979). A hospitalização aumenta a quantidade de pacientes
infectados, particularmente na pele dos queimados, no trato respiratório dos
pacientes que se submeteram à ventilação mecânica, no trato gastro-intestinal
dos pacientes que recebem quimioterapia e em qualquer sítio dos que foram
O papel das mãos dos profissionais da saúde na disseminação de
microrganismos no ambiente hospitalar é um dos mais importantes e
valorizados aspectos da epidemiologia das infecções hospitalares. Isso
direciona boa parte das atividades educacionais das Comissões de Controle de
Infecções Hospitalares (CCIH). Em relação a P. aeruginosa, vários estudos
enfatizam que ela tem um papel importante na disseminação de isolados
clínicos provenientes das mãos dos profissionais da saúde (Kerr et al, 2002;
Waters et al, 2004).
Devido à sua freqüência, à gravidade e ao custo no tratamento, as infecções
por bacilos Gram-negativos adquiridos no hospital são consideradas hoje como
um dos maiores problemas de saúde pública (Pittet et al, 1993). P. aeruginosa é
principalmente um patógeno nosocomial e se destaca pela freqüência, pelo
custo, e pela morbi-mortalidade relacionada às suas infecções (Carmeli et al,
1999; Martins, 2002). Sua frequência varia segundo a região, o tipo de
hospital, de paciente e mesmo dentro da mesma instituição, segundo a
unidade (Jones & Masterton, 2001; Gales et al, 2001). Portanto, o
conhecimento da epidemiologia local é uma das ferramentas mais importantes
para a abordagem precisa destas infecções.
Existem sistemas de vigilância específicos para monitorização da
sensibilidade aos antimicrobianos dos principais patógenos relacionados a
diversas infecções. Esses estudos fornecem importantes informações sobre a
freqüência de tais patógenos (Jones & Masterton, 2001). Conforme os dados do
National Nosocomial Infection Surveillance System (NISS) e do Center for
Diseases Control and Prevetion (CDC), obtidos entre 1986 e 1998, P. aeruginosa
hospitalares e de infecções do trato urinário, respectivamente; além de ocupar o
sétimo lugar no “rank” dos patógenos mais freqüentemente isolados em corrente
sanguínea (NNISS, 2002).
O Programa de Vigilância de Resistência a Antimicrobianos SENTRY avaliou
70.067 amostras clínicas provenientes de paciente internados em hospitais da
Ásia, Europa, Estados Unidos, Canadá e América Latina, no período de 1997 a
1999, e demonstrou que 9% das amostras clínicas eram P. aeruginosa. A
ocorrência de infecções causadas por P. aeruginosa foi maior na América Latina
(11,4%) e Ásia (11,4%) quando comparada à Europa (9,3%), Estados Unidos
(8,7%) e Canadá (8,6%). O trato respiratório foi o sítio que apresentou a maior
prevalência de infecção por P. aeruginosa (Gales et al, 2001).
No Brasil segundo o SENTRY, P. aeruginosa foi a causa mais freqüente
de infecções do trato respiratório (32%), seguido por infecções do trato
urinário, ferida cirúrgica, e o sexto patógeno mais comumemnte isolado em
infecções da corrente sanguínea (7%) no período de 1997 a 2001 (Sader et al,
2002).
Além da alta freqüência, infecções por P. aeruginosa são motivo de
preocupação pelo custo e elevada mortalidade. Analisando apenas pacientes
com bacteremia, Gómez mostrou que em 211 episódios, nos anos de 1992 a
1998, ocorreu cerca de 28% de mortalidade que estava relacionada à
gravidade do quadro inicial e à presença de complicações (Gómez et al, 2004).
Comparando com bacteremias causadas por Staphylococcus aureus,
observaram que a mortalidade por P. aeruginosa foi maior do que aquela por
P. aeruginosa apresenta uma facilidade de desenvolver resistência aos
antimicrobianos, e a associação da resistência com o aumento de taxas de
mortalidade, morbidade e custos, tem sido controversa. Comparando entre
amostras resistentes e sensíveis aos carbapenêmicos, o grupo The Brooklyn
Antibiotic Resistance Task Force demonstrou que a resistência a esta classe
de antimicrobianos contribuiu com o aumento da permanência dos pacientes
no hospital, mais não com a mortalidade hospitalar (Anonymous, 2004).
Entre 1996 e 2000 foram estudadas prospectivamente 924 infecções
causadas por bactérias Gram-negativas consideradas multirresistentes, e
foram observados vários fatores relacionados à maior mortalidade (APACHE II,
presença de co-morbilidades, infecção pulmonar ou relacionada a cateter
vascular, co-infecção por bactéria Gram-negativa multirresistente ou fungo),
além da resistência. A resistência não se mostrou associada à mortalidade,
demonstrando que a espécie da bactéria é mais importante do que a sua
resistência (Raymond et al, 2003). Velasco et al (2004) avaliaram 112
bacteremias hospitalares consecutivas de pacientes cirúrgicos oncológicos,
entre 2000 e 2002, no Instituto Nacional do Câncer, no Rio de Janeiro. Eles
observaram que a mortalidade não foi diferente segundo a resistência, mas sim
entre as doenças de base do paciente (tipo de tumor e de cirurgia) e a origem
da bacteremia.
O custo direto das infecções hospitalares causadas por P. aeruginosa e A.
baumannii sensíveis, apenas a Polimixina foi avaliada no Brasil, na UTI do
Hospital São Paulo, nos anos de 1997 e 1998. Em estudos do tipo
caso-controle, concluíram que a média de permanência na unidade foi maior e com
infecção hospitalar (valor estimado: US$ 20.795,16 versus US$ 2.774,46,
respectivamente). A permanência extra atribuída ao evento infeccioso foi de
24,26 dias em média, com um custo extra de US$ 11.209,17, em média, por
paciente (Martins, 2002).
As crianças prematuras têm um risco aumentado de desenvolver infecção
após colonização por P. aeruginosa (Grundmann et al, 1993). Foca et al (2000)
descreveram um surto de colonização e infecção por P. aeruginosa em uma
UTI neonatal de 50 leitos, em 1998, onde 5% dos médicos e 10% dos
profissionais de enfermagem apresentaram este agente em suas mãos. Foi
observado sepse tardia em prematuros de muito baixo peso causada por
Pseudomonas spp., e que a mortalidade dentro de três dias foi 12,3 vezes
maior do que a causada por outros agentes (Makhoul et al, 2005).
Além dos casos já citados, infecções por P. aeruginosa possuem lugar de
destaque em duas situações: surtos e acometimentos de pacientes graves. O
modo de transmissão dessa bactéria seria através de líquidos contaminados,
por meio de contato direto, aerossóis, ou através das mãos que tocaram
superfícies úmidas (Sehulster & Chinn, 2003). Identificar a fonte de infecção de
um surto não é fácil. Na literatura encontramos várias fontes de surto
relacionadas com P. aeruginosa como: brinquedos (Buttery et al, 1998),
equipamentos de limpeza de ambiente, pias (Engelhart et al, 2002), lavadora
automática de endoscópios (Schelenz & French, 2000), pasteurizadora de leite
(Gras-Le-Guen et al, 2003), vegetais (Kominos et al, 1972), gaze para curativo
(Vilar-Compte et al, 2003), endoscópios (Fraser et al, 2004), broncoscópios
potável (Kolmos et al, 1993; Ferroni et al, 1998), soluções antissépticas e
vasos de flores, entre outras (Sehulster & Chinn, 2003).
Os profissionais da saúde já foram classificados como fonte dos surtos
relacionados, por exemplo, ao uso de unha postiça e natural (Widmer et al,
1993; Moolenaar et al, 2000). Quando as técnicas assépticas recomendadas e
padronizadas são seguidas pelos profissionais de saúde, a transmissão ocorre
com menor freqüência. Geralmente as amostras de P. aeruginosa isoladas de
pacientes hospitalizados, onde foram realizadas as assepcias adequadamente,
eram originadas da própria microbiota do trato gastro-intestinal do paciente
(Arnow & Flaherty, 1996).
A prevenção e o controle da colonização e infecção por P. aeruginosa
requer o uso adequado de antimicrobianos, adesão dos profissionais de saúde
às práticas da higienização das mãos, precauções de contato para amostras
multirresistentes, bem como adesão as técnicas de limpeza do ambiente e dos
equipamentos médicos e hospitalares (Goldmann & Huskins, 1997).
1.4. Mecanismos de resistência antimicrobiana em P. aeruginosa
Um aumento da prevalência da resistência bacteriana aos antimicrobianos
vem sendo relatado mundialmente. Este acúmulo reflete o surgimento de novos
mecanismos de resistência, a transferência epidêmica dos genes de resistência
entre as bactérias, e a propagação epidêmica das linhagens resistentes entre os
espécie e do antimicrobiano, mas cada processo é determinado pela pressão
seletiva do uso de antimicrobianos (Livermore & Dudley, 2000a).
Quatro processos contribuíram para o acúmulo da resistência: i) espécies
com resistência intrínseca são favorecidas; ii) mutantes resistentes de linhagens
previamente sensíveis são selecionados; iii) genes de resistência transferíveis
disseminam entre os isolados clínicos, carreados por plasmídeos, transposons e
integrons; iv) algumas linhagens resistentes propagam-se de modo epidêmico
entre pacientes, hospitais e países. A importância relativa destes processos varia
de acordo com o patógeno e com o local (Livermore & Dudley, 2000a).
Resistência é uma causa significante de excesso de morbidade, mortalidade
e custo. Numerosos relatos têm enfatizado a necessidade do uso de
antimicrobianos em menor quantidade e de forma adequada, a melhora no
controle de infecções e o desenvolvimento de novos agentes. Entretanto, a
redução no uso de antimicrobianos nem sempre leva a redução da resistência,
talvez porque as bactérias estejam bem adaptadas ao carreamento de
resistência. É simples antecipar o alcance do controle da resistência, e os
esforços devem ser de manutenção ao invés de eliminação, com o objetivo de
diminuir o desenvolvimento de novas resistências, enquanto continua-se a
desenvolver novos agentes em uma velocidade suficiente para manter-se à frente
da bactéria (Livermore, 2003).
A emergência e disseminação de organismos multirresistentes revelam uma
variedade de fatores responsáveis pelo aumento de resistência bacteriana a
antimicrobianos. Alguns desses fatores podem ser por mutação em genes de
genéticas entre os microrganismos permite que os genes de resistência sejam
disseminados pelo ambiente sendo transmitidos para novos hospedeiros. Além
disso, as condições no meio hospitalar e da comunidade levam a uma pressão
seletiva, que facilita o desenvolvimento e disseminação de clones bacterianos
multirresistentes (Tenover, 2001).
Existem muitos problemas de resistência bacteriana nos hospitais brasileiros
(Arruda et al, 1999, Sader et al, 1999). Vários estudos multicêntricos têm
mostrado altas taxas de resistência aos carbapenêmicos em isolados clínicos;
cerca de 10 a 20% das amostras são resistentes a praticamente todos os
antimicrobianos disponíveis comercialmente e os estudos têm demonstrado a
disseminação de P. aeruginosa multirresistente cresce a cada dia (Gales et al,
1997, Sader et al, 1998, Sader et al, 1999, Gales et al, 2000).
Os principais mecanismos de resistência aos antimicrobianos desenvolvidos
por P. aeruginosa podem ser: alteração da permeabilidade de membrana externa
(porinas); alteração do sítio de ligação do antimicrobiano; mecanismo ativo de
efluxo; e produção de enzimas inativadoras de antimicrobianos.
1.4.1. Alteração de permeabilidade com alteração de proteínas de
membrana externa (porinas)
As proteínas de membrana externa, porinas, são estruturas protéicas
tridimensionais presentes na membrana externa formando canais preenchidos por
água, e que permitem a entrada por difusão de moléculas hidrofílicas e de baixo
2001a), e a extrusão de produtos não utilizados pela célula bacteriana (Nikaido et
al, 1994).
Dentre as diferentes porinas, OprC, OprD, OprE e OprF que se encontram na
membrana externa da P. aeruginosa, a maior e mais abundante é a porina OprF,
um polipeptídeo de 36-kDa. Provavelmente, esta é a mais utilizada pela maioria
dos beta-lactâmicos para penetrar no interior da bactéria (Vila & Marco et al, 2002).
As porinas OprC e OprE são canais inespecíficos, no entanto, são utilizadas para
entrada na célula bacteriana pelos antimicrobianos, beta-lactâmicos, cloranfenicol,
fluorquinolonas e gentamicina (Yoneyama et al, 1995; Vila & Marco et al, 2002).
A proteína OprD, inicialmente chamada de D2, presente em P. aeruginosa, é
também permeável aos carbapenêmicos, mas não a outros beta-lactâmicos
(Huang & Hancock et al, 1996; Livermore et al, 2001). A alteração na porina OprD,
seja diminuindo seu número ou sua expressão, acarreta à resistência ao imipenem
e à diminuição da sensibilidade ao meropenem (Livermore et al, 2001; Vila &
Marco et al, 2002).
1.4.2. Alteração do sítio de ligação do antimicrobiano
As proteínas ligadoras de penicilina (PBP) situadas na face externa da
membrana citoplasmática apresentam atividade enzimática de transglicosidase,
transpeptidase, carboxipeptidases e endopepetidases, participando na terceira
etapa da biossíntese do peptideoglicano (Spratt & Cromie et al, 1988). Os
antimicrobianos beta-lactâmicos são análogos estereoquímicos das subunidades
infrequentes em isolados clínicos de P. aeruginosa, a resistência a estas drogas
pode ocorrer devido a alterações nas PBPs (Godfrey, Bryan & Rabin et al, 1981).
A alteração no sítio de ação constitui o principal mecanismo de resistência às
fluorquinolonas. As topoisomerases são enzimas capazes de alterar o estado
topológico do DNA. A DNA girase, topoisomerase II, é um tetrâmero que possui
duas subunidades GyrA e GyrB codificadas respectivamente pelos genes gyrA e
gyrB. A topoisomerase IV possui as subunidades ParC e ParE codificadas pelos
genes parC e parE, os quais são homólogos aos genes gyrA e gyrB. A resistência
às quinolonas ocorre de maneira gradual e cumulativa. Altos graus de resistência
às fluoroquinolonas estão associadas à mutação nos genes gyrA e parC às quais
levam a alteração nas subunidades GyrA e ParC (Hooper et al, 2001). Em P.
aeruginosa mutações nas topoisomerases do tipo II associadas à expressão de
bombas de efluxo, pode levar ao alto grau de resistência a esses antimicrobianos
(Nakajima et al, 2002).
1.4.3. Mecanismo ativo de efluxo de antimicrobianos
O sistema de efluxo confere resistência a vários antimicrobianos, tornando
assim um significante determinante de bactérias multirresistentes intrínseca e
adquirida. Existem cinco grandes famílias de sistemas de efluxo descritos: a)
família de grandes facilitadores (major facilitator family - MFS), b) família da
resistência nodulada (resistance-nodulation-division family - RND), c) família de
pequena multirresistência (small multidrug resistance family ou multirresistente), d)
família extrusão de compostos tóxicos e multidrogas (multidrug and toxic
compound extrusion family - MATE) (Poole et al, 2004).
O sistema de efluxo é organizado por três componentes: i) transportador
presente na membrana citoplasmática; ii) por uma proteína de fusão com
membrana periplasmática (MFP), presente no espaço periplasmático iii) e um
canal extrusor (OMF) presente na membrana externa (Poole et al, 2001).
Em P. aeruginosa são descritos os sistemas de efluxo da família RND como:
MexAB-OprM, MexCD–OprJ, MexEF-OprN e, MexXY–OprM (Livermore et al,
2002). O sistema MexXY-OprM desempenha um papel muito importante na
resistência intrínseca da P. aeruginosa aos aminoglicosídeos, tetracilina e
eritromicina (Aires et al, 1999; Masuda et al, 2000).
1.4.4. Produção de enzimas inativadoras de antimicrobianos
1.4.4.2. Produção de beta-lactamase
As beta-lactamases são um grupo de enzimas capazes de inativar
antimicrobianos lactâmicos, por hidrolisarem a ligação amida do anel
beta-lactâmico, causando, assim, a destruição irreversível do antimicrobiano
(Livermore et al,1995). A atividade enzimática é variável de acordo com o tipo, a
quantidade de lactamase produzida, e os diversos substratos
A codificação para a produção das beta-lactamases pode estar situada no
DNA cromossômico, ou no DNA extracromossômico (plasmídeos e “transposons”)
bacteriano (Livermore et al, 1991; Livermore et al, 1993).
Um grande número de beta-lactamases codificadas por genes plamidiais já
foram descritas em bactérias Gram-negativas (Medeiros,1984; Bush et al, 1989).
Essas beta-lactamases podem ser transferidas horizontalmente entre as
diferentes espécies bacterianas, ao contrário do que ocorre com as
cromossômicas que são transmitidas verticalmente.
A primeira classificação fenotípica destas enzimas foi proposta em 1973 por
Richmond & Sykes, que dividiram as beta-lactamases em cinco grandes grupos (I,
II, III, IV e V), baseando-se no perfil enzimático.
Em 1980 Ambler propôs a classificação molecular dessas enzimas, de acordo
com a seqüência de aminoácidos, descrevendo quatro principais classes
moleculares. A classificação de Bush (1989) foi a primeira a correlacionar o
substrato preferencial e propriedades inibitórias com a estrutura molecular da
enzima.
Atualmente a classificação mais utilizada combina características estruturais
e funcionais das beta-lactamases, sendo uma versão mais atualizada da
classificação anterior proposta por Bush em 1989 como mostra a. Tabela 1 (Bush,
Tabela 1: Classificação esquemática das beta-lactamases bacterianas.
Bush, Jacoby, Medeiros(104)
Bush(110) Rychmond &
Sykes(107) Mitsuashi & Inoue(112) Classe
Molecular(109)
Substratos enzimáticos preferenciais
Inibição pelos inibidores de
beta-lactamases
Enzimas representativas
Ác. Clav. MPA EDTA
1 1 Ia, Ib, Id CSase C Cefalosporinas - - Enzimas AmpC (Bactérias gram-negativas)
2a 2a N.I. PCase V A Penicilinas + - PCases gram-positivas
2b 2b III PCase I A Penicilinas,
Cefalosporinas
+ - TEM-1, TEM-2, SHV-1
2be 2b’ N.I. CXase A Penicilinas,
cefalosporinas de amplo espectro e monobactans
+ - TEM-3 a TEM-26, SHV-2 a SHV-6,
Klebsiella oxytoca K1
2br N.I. N.I. N.I. A Penicilinas +/- - TEM-30 a TEM-36, TRC-1
2c 2c II, V PCase IV A Penicilinas (carbenicilina) + - PSE-1, PSE-3, PSE-4
2d 2d V PCase I, III D Penicilinas (cloxacilina) +/- - OXA-1 a OXA-11, PSE-2
2e 2e Ic CXase A Cefalosporinas + - CSase induzíveis do Proteus vulgaris
2f N.I. N.I. N.I. A Penicilinas,
cefalosporinas e carbapenêmicos
+ - Enterobacter cloacae
(NMC-A),Serratia marcescens (Sme-1)
3 3 N.I. N.I. B maioria dos
beta-lactâmicos + carbapenêmicos
- + Stenotrophomonas Maltophilia (L1), Bacteriodes fragilis (Ccra)
As beta-lactamases do grupo 1 de Bush, Jacoby e Medeiros (1995), ou da
classe molecular C de Ambler (1980), são conhecidas como beta-lactamase
AmpC. Este grupo de enzimas é produzido por várias bactérias como P.
aeruginosa, Proteus vulgaris, Morganella morganii, Serratia marcescens,
Providencia spp. e Enterobacter cloacae (Livermore et al, 1991).
Estas são enzimas codificadas, geralmente, por genes cromossomais
induzíveis, e hidrolizam todos os beta-lactâmicos exceto os carbapenêmicos e
cefalosporinas de 4ª geração. Normalmente são produzidas em pequenas
quantidades, porém, na presença de beta-lactâmicos, principalmente cefoxitina e
imipenem, a produção desta enzima pode aumentar de 100 a 1000 vezes (Lodge
et al, 1991). Estas enzimas são inibidas competitivamente pela cloxacilina,
entretanto, não são inibidas pelo ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam
(Babini & Livermore, 2000).
A expressão da beta-lactamase AmpC em P. aeruginosa é similar aos
mecanismos regulatórios encontrados em enterobactérias (Langaee et al., 2000;
Bagge et al, 2002). Em amostras de P. aeruginosa a produção de
beta-lactamases AmpC é codificada por um gene estrutural ampC. Estas são de
origem cromossômica, podendo ser induzíveis ou constitutivas. A indução desta
enzima ocorre na presença de beta-lactâmicos, tendo assim sua produção
aumentada, e quando o antimicrobiano é retirado estas enzimas voltam a ser
sintetizadas em níveis basais (Livermore et al, 1995; Medeiros et al, 1997).
Os lactâmicos, cefoxitina e imipenem, são potentes indutores das
beta-lactamases AmpC; entretanto, o imipenem, apesar de ser potente indutor, é um
ceftazidima é um fraco indutor, e apesar de ser hidrolisado por estas enzimas
podem permanecer ativos quando a produção das beta-lactamases é pequena,
ou seja, a bactéria é sensível a este agente porque a quantidade de enzima
produzida não é suficiente para hidrolisar a quantidade total de antimicrobiano
que penetra na célula bacteriana (Livermore et al, 1995; Medeiros et al, 1997).
Em uma população de P. aeruginosa a freqüência de mutações que leva à
hiperprodução de beta-lactamases AmpC, ou seja à desrepressão do gene
AmpC, é de 10-7 a 10-9 / UFC (Livermore et al, 1995).
No grupo 2 da classificação de Bush, Jacoby e Medeiros (1995) estão as
beta-lactamases mediadas por plasmídios e que, geralmente, são inibidas pelos
inibidores de beta-lactamase como o ácido clavulânico, o tazobactam e o
sulbactam. Elas estão divididas segundo a classificação molecular de Ambler
(1980) em duas classes A e D.
As beta-lactamases da classe molecular A de Ambler (1980), e pertencentes
ao grupo 2 de Bush, Jacoby e Medeiros (1995) são conhecidas como
beta-lactamases de espectro ampliado (“Extended Spectrum Beta-Lactamases” -
ESBL). Elas conferem resistência à ampicilina, à carbenicilina, à ticarcilina e às
cefalosporinas e monobâctamicos; no entanto, geralmente mantêm a
sensibilidade às cefamicinas e aos carbapenêmicos dentre outros. São,
geralmente, produzidas por Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae, mas podem
ser produzidas por qualquer bactéria Gram-negativa. As ESBLs encontram-se
disseminadas por todo o mundo e a maioria delas são estruturalmente
relacionadas às beta-lactamases do tipo TEM-1, TEM-2, SHV-1 e PSE-1
ampliado derivadas do gene blaCTX-M também são freqüentemente encontradas (Winokur et al, 2001).
Ainda dentro da classe molecular A, a enzima pertencente ao grupo 2f,
GES-1 foi inicialmente descrita em GES-1998 em amostras de K. pneumoniae (Poirel et al,
2000a). A produção desta enzima foi reportada em amostras K. pneumoniae
isolada de hospitais na Guiana Francesa (Poirel et al, 2000a) e em Portugal
(Duarte et al, 2003). Esta enzima também foi relatada em amostras de P.
aeruginosa e, mais recentemente, isolada de uma amostra de P. aeruginosa no
Brasil (Castanheira et al, 2004a). A enzima GES-2 foi isolada, em 2000, na África
do Sul em amostras de P. aeruginosa, e apresenta fraca atividade hidrolítica
contra os carbapenêmicos. A análise cinética de enzima mostrou que esta
apresenta atividade catalítica contra imipenem 100 vezes maior que a GES-1. No
entanto, a atividade da GES-2 permanece 1000 vezes menor do que outras
enzimas pertencentes a classe A, capazes de hidrolisar os carbapenêmicos
como, da SME-1 e NMC-A, enzimas identificadas em amostras de S. marcescens
e E. cloacae, respectivamente (Poirel et al, 2000a).
1.4.4.3. Produção de Metalo-beta-lactamase (MBL)
Na classe molecular B ou Grupo 3, estão presentes as
metalo-beta-lactamases que são um grupo de enzimas que possuem a capacidade de
hidrolisar todos os beta-lactâmicos, exceto monobactans, e não são inibidas pelo
ácido clavulânico (Bush, 1998). Inicialmente codificadas por genes cromossomais
em várias bactérias, incluindo Bacillus cereus (Sabath et al, 1966),
al, 1986), Chryseobacterium spp. (Bellais et al, 2000). Este grupo apresenta-se
dividido em três subgrupos funcionais: 3a, 3b e 3c (Bush et al, 1998).
O subgrupo 3a apresenta enzimas que hidrolisam penicilinas tão ou mais
rápido que o imipenem. As cefalosporinas também são hidrolisadas por estas
enzimas, porém mais lentamente que o imipenem. As principais representantes
deste subgrupo são as enzimas produzidas por Bacillus cereus. No segundo
subgrupo 3b estão incluídas as enzimas de Aeromonas spp., as verdadeiras
carbapenemases. Essas enzimas apresentam alta especificidade pelos
carbapenêmicos e não são detectadas com o uso de nitrocefin. Já o subgrupo 3c
foi proposto apenas para incluir a metalo-beta-lactamase produzida por Legionella
gormanii. Esta enzima apresenta grande capacidade de hidrolisar cefalosporinas
e apresenta propriedades bioquímicas distintas das outras enzimas do grupo 3
(Bush et al,1998).
Uma característica importante que distingue o subgrupo 3b do subgrupo 3a
é o efeito da adição do zinco (Zn++) no sítio ativo da enzima. Todas as metalo-beta-lactamases são enzimas que apresentam como cofator o íon Zn++, sendoa atividade catalítica da enzima aumentada na presença deste cátion. Ao contrário
do observado para as enzimas do subgrupo 3a, três enzimas do subgrupo 3b
(ASA-1, AsbM1 e ACP) são inibidas por baixas concentrações de Zn++ (Bush et al, 1998).
As enzimas da classe B somente são inibidas pelo EDTA e pelos
compostos derivados do ácido tiolático, como por exemplo, o ácido
disponíveis clinicamente como o ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam
(Bush et al, 2001).
A primeira MBL, IMP-1 (Imipenemase), cuja produção é mediada por um
gene situado em um plasmídio, foi reportado em uma amostra de S.marcescens,
isolada em um hospital de Osaka, em 1991 (Osano et al, 1994). No mesmo ano,
Watanabe et al relataram uma cepa de P.aeruginosa isolada em 1988, no Japão,
que produzia uma MBL transferível e mediada por plasmídio. Segundo Livermore
& Woodford (2000b), provavelmente, tratava-se da enzima IMP-1, a qual foi
formalmente isolada e seqüenciada também no Japão, em 1991.
Como outras metalo-beta-lactamases (MBLs), a IMP-1 apresenta um perfil
de substratos preferenciais bastante amplos, incluindo cefalosporinas de amplo
espectro e carbapenêmicos. O aztreonam apresenta estabilidade à hidrólise pelas
enzimas IMP-1; entretanto, os microrganismos que produzem essa enzima são
freqüentemente resistentes ao aztreonam por apresentarem outros mecanismos
de resistência (Watanabe et al, 1991; Osano et al, 1994; Ito et al, 1995). Esta
enzima é zinco-dependente, sensível ao EDTA, e não é inibida pelos inibidores de
beta-lactamases (Haruta et al, 2000). O gene blaIMP-1 freqüentemente ocorre em um cassete inserido em um integron da classe 1 (Laraki et al, 1999). Além de
incluir a resistência a todos os beta-lactâmicos, os integrons que carreiam o gene
blaIMP-1 também carreiam outros genes que codificam a resistência cruzada aos aminoglicosídeos (Arakawa et al, 1995). Apesar da IMP-1 ser bastante freqüente
em amostras isoladas no Japão, tem sido recentemente identificada em isolados
de outros países, especialmente da Europa (Nordmann & Poirel, 2002). Em 2003
de MBL tipo IMP-1 no Brasil, isolada de uma secreção traqueal de um paciente
internado na UTI do Hospital São Paulo (Gales et al, 2003a).
A enzima IMP-2 foi isolada de uma amostra de Acinetobacter baumannii na
Itália, em 1997 (Riccio et al, 2000). Esta enzima apresenta 85% de homologia
entre os aminoácidos com IMP-1. Os parâmetros cinéticos de IMP-2 são similares
aos da IMP-1 para a maioria dos substratos beta-lactâmicos, porém, diferem
particularmente para ampicilina, carbenicilina, cefaloridina e meropenem
(Nordmann & Poirel, 2002).
A IMP-3, previamente denominada MET-1, foi identificada em um isolado de
Shigella flexneri no Japão (O’Hara et al, 1998) e difere da enzima IMP-1 por duas
substituições de aminoácidos, o que parece restringir o perfil de substratos
preferenciais. Sendo assim, a IMP-3 hidrolisa fracamente benzilpenicilina,
ampicilina, ceftazidima e imipenem.
A MBL IMP-4 foi identificada em amostras de Acinetobacter spp. e em
Citrobacter youngae ambos isoladas em Hong Kong (Chu et al, 2001; Hawkey et
al, 2001). Outras enzimas derivadas da família IMP foram identificadas em várias
amostras clínicas de Gram-negativos em várias regiões geográficas. A enzima
IMP-5 foi isolada em A. baumannii em Portugal (Da Silva et al,2002); a enzima
IMP-6 foi relatada em S. marcescens no Japão (Yano et al, 2001). A IMP-7 foi
isolada em uma cepa de P. aeruginosa que estava envolvida em um surto
hospitalar no Canadá (Gibb et al, 2002); a IMP-8 foi isolada em K. pneumoniae de
Taiwan (Yan, et al, 2001a); a IMP-9foi reportada em uma cepa de P. aeruginosa
isolada na China (Nordmann et al, 2002); a IMP-10 foi isolada em duas amostras
al, 2002); a IMP-11 ainda não publicada, mas segundo dados do site
www.lahey.org e acesso no “genebank” AB074437, foi encontrada em uma
amostra de P. aeruginosa no Japão; a IMP-12 foi isolada em uma amostra de P.
putida na Itália (Docquier et al, 2003); a IMP-13 isolada, em 2001, em uma
amostra de P. aeruginosa isolada também na Itália (Toleman et al, 2003).
Recentemente uma nova MBL, IMP-16, foi isolada, no Brasil, em uma amostra de
P. aeruginosa proveniente do Hospital de Base de Brasília (Mendes et al, 2004).
O primeiro relato da IMP-17 foi observado em 2007 na Rússia, a IMP-18 foi em
2006 nos Estados Unidos da América, e da IMP-19 ocorreu na França em 2007
(Hanson et al, 2006; Mikha litsyn & Fedianina, 2007; Neuwirth et al, 2007). Ainda
não foram descritas as MBL IMP-14 e 15. Mais recentemente uma nova MBL,
IMP-20, foi isolada no Japão em uma amostra de P. aeruginosa (Shibata et al,
2005, “in press”).
Tanto os genes da família IMP como da família VIM foram encontrados em
genes cassetes móveis inseridos em integrons da classe 1. Os integrons da
classe 1 são as vias mais comuns, pela quais os genes cassetes de resistência
mobilizam-se de uma bactéria para a outra (Livermore et al,2000b).
Uma outra família de beta-lactamase da classe B foi identificada
inicialmente em uma amostra de P. aeruginosa na Itália em 1997, com menos
de 30% de homologia com as enzimas da família IMP, esta enzima foi
designada como VIM-1 e deu origem à família VIM (Lauretti et al, 1999). A MBL
VIM-2, codificada pelo gene blaVIM-2, foi identificada por Poirel et al (2000b), em uma amostra de P. aeruginosa sensível à polimixina e aztreonam, isolada em
em Marselha, França. O gene blaVIM-2 apresenta 90% de homologia com o gene blaVIM-1.
A enzima VIM-3, presente em gene cromossomal, foi reportada em amostras
de P. aeruginosa isoladas em Taiwan. A seqüência de aminoácidos da enzima
VIM-3 difere da seqüência de VIM-2 pela mudança de somente dois aminoácidos
(Yan et al, 2001b). Recentemente, a enzima VIM-4 foi isolada em uma amostra de
P. aeruginosa na Grécia, apresentando uma mutação que resultou na substituição
da serina pela arginina na posição 175 em comparação à seqüência de
aminoácidos da enzima VIM-1 (Pournaras et al, 2002).
Ainda não publicadas, mas já descritas no site www.lahey.org foram
reportadas novas enzimas da família VIM: VIM-5 com acesso no “gene bank”
AY144612, isolada de K. pneumoniae, na Turquia e VIM-6 acesso no “gene bank”
AY165025, isolada de P. putida, em Singapura. A enzima VIM-7 foi isolada de
uma amostra de P. aeruginosa nos Estados Unidos da América como parte do
programa de vigilância de resistência CANCER (Toleman et al, 2004). O gene
blaVIM-7 encontrava-se em um plasmídio podendo ser facilmente transferível para outras espécies de enterobactérias e Pseudomonas (Toleman et al,
2004).
Mais recentemente foi identificado o gene blaVIM-8 em amostras de P.
aeruginosa isoladas na Colômbia, apresentando homologia de 90,2% com o
gene blaVIM-1 (Crespo et al, 2004). As MBLs VIM-9 e VIM-10 foram isoladas em amostras de P. aeruginosa no Reino Unido, e quando comparada a VIM-1
apresentavam 90,2% e 90,6% de homologia, respectivamente (Woodford et al,
Itália, o gene blaVIM-11 apresenta 90,2% de homologia com o gene blaVIM-1 (Mazzariol et al, 2004, “in press”; Pasteran et al, 2004).
Em 2001, uma metalo-beta-lactamase foi identificada no Instituto de
Oncologia Pediátrica (IOP) do Complexo Hospitalar do Hospital São Paulo,
São Paulo, que mostrava uma homologia de 35,5% com a IMP-1 (Toleman et
al, 2002). A nova MBL denominada, SPM-1, São Paulo metalo-beta-lactamase,
identificada em uma cepa de P. aeruginosa isolada inicialmente na urina e depois
na hemocultura de uma criança de quatro anos, portadora de leucemia. A SPM-1
hidrolisa todos os beta-lactâmicos com exceção do aztreonam, e é inibida pelo
EDTA.
Mais recentemente foi identificada uma nova MBL, GIM-1, em amostras
de P. aeruginosa isoladas na Alemanha. O gene blaGIM-1 apresenta 43,1% de homologia com o gene blaIMP-1, 28,8% com gene blaVIM-1 e apenas 28,0% com o gene blaSPM-1. Mostrou uma atividade hidrolítica 10 vezes maior para o imipenem, em comparação ao meropenem. (Castanheira et al, 2004b).
Finalmente, em 2005 Lee et al (2005) descreveram uma nova MBL adquirida
em sete isolados clínicos de A. baumannii em Seul na Coréia. A enzima SIM-1 é a
MBL que apresenta maior identidade com as enzimas do tipo IMP, 69% com
IMP-12 e 64% com IMP-9.
Figura 1: Distribuição mundial dos diferentes tipos de MBLs.
1.5. Tipagem Molecular
A tipagem molecular utiliza técnicas de biologia molecular para evidenciar
uma possível relação genética entre os isolados clínicos de uma mesma espécie.
O acompanhamento e a avaliação do comportamento de determinadas
cepas dentro de uma população ao longo do tempo podem determinar a evolução
de cepas bacterianas de importância clínica e auxiliar na implementação de
estratégias para controlar o aparecimento de novas infecções (Gales et al, 2001;
Pfaller et al, 2001a). A caracterização de cepas bacterianas usando técnicas de
tipagem molecular pode auxiliar na avaliação de surtos hospitalares causados por
global de bactérias multirresistentes aos antimicrobianos (Struelens et al, 1993;
Sader et al, 1995; Pfaller et al, 2001b).
A técnica de eletroforese em campo elétrico variado (“Pulsed-Field Gel
Eletroforesis” - PFGE) se caracteriza por ser um sistema de eletroforese que
utiliza múltiplos eletrodos dispostos de forma hexagonal, por exemplo, gerando
um campo elétrico homogêneo e uma alternância na direção da corrente elétrica
que gera um perfil migratório em linha reta (Chu et al, 1986) e permite, assim, a
separação de moléculas de DNA de até duas megabases, que foram previamente
digeridas por enzimas de restrições. Embora existam no mínimo sete sistemas
distintos empregando a técnica da eletroforese pulsada para a separação do
DNA, o sistema CHEF é o mais popular, sendo utilizado com sucesso em estudos
epidemiológicos e para traçar surtos hospitalares (Sader et al, 1993; Livesley et
al, 1998; D'Agata et al, 2000).
Vários estudos utilizando técnicas de tipagem molecular são realizados,
sendo que muitos destes estudos ajudam a esclarecer a dinâmica das infecções,
principalmente em bacilos Gram-negativos não fermentadores de glicose, que
representam um grande problema nas infecções hospitalares (Pfaller et al,
2001b). Surtos ocasionados por P. aeruginosa mutirresistentes aos
antimicrobianos são freqüentemente relatados em unidades de queimados,
unidade de neurocirurgia, unidades de terapia intensiva, entre pacientes com
fibrose cística nas unidades oncológicas (Sader et al, 1993; Barth & Pitt et al,
4. MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi submetido à avaliação e aprovação pelo Comitê de Ética
em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de
Medicina (UNIFESP-EPM).
4.1. Local do estudo
O estudo foi realizado com amostras de hemoculturas provenientes de
pacientes admitidos ao Instituto de Oncologia Pediátrica – IOP – GRAACC,
com um total de 30 leitos, localizado no município de São Paulo, vinculado ao
Departamento de Pediatria da Universidade Federal de São Paulo
(UNIFESP-EPM). A Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) do Instituto está
estruturada de acordo com as normas da portaria 2616. O núcleo executivo é
formado por um médico infectologista e uma enfermeira epidemiologista que
tornam avigilância da infecção ativa.
4.2. Delineamento do estudo
Trata-se de um estudo retrospectivo tendo início no mês de novembro de
2000 e término no mês de dezembro de 2005, onde foram incluídas crianças e
adolecentes com câncer que desenvolveram bacteremia causada por P.
aeruginosa.
4.3. Critérios de inclusão
a) Presença de bacteremia e neutropenia.
c) Foram considerados óbitos, os falecimentos ocorridos no período de 30
dias após a bacteremia.
d) Os critérios abordados para definir a adequação do tratamento foram:
adequado, inadequado e corrigido.
e) Os pacientes encontravam-se nos seguintes locais: unidade de terapia
intensiva, ambulatório, enfermaria e setor de transplante de medula óssea.
•Neutropenia: contagens de neutrófilos menor que 500 células/mm3, ou
uma contagem menor que 1000 células/mm3, porém com tendência a cair para menos que 500 células/mm3 num período igual ou inferior a 48 horas.
•Hemocultura: pesquisa de bactérias no sangue através do uso de meios
de cultura específicos.
•Bacteremia: é a presença de bactérias no sangue podendo ser
classificadas como primária ou secundária.
4.4. Critérios de exclusão
a) Bacteremia do mesmo paciente em um intervalo inferior a um mês.
4.5. Amostras bacterianas
Foram encaminhadas ao Laboratório Especial de Microbiologia Clínica
(LEMC) 120 P. aeruginosa provenientes de hemocultura do IOP segundo
protocolo de vigilância de hemoculturas pré-estabelecido. Estas amostras
foram identificadas pelo Laboratório Central do Hospital São Paulo
(UNIFESP/EPM), e posteriormente encaminhadas ao LEMC e armazenadas
em água destilada estéril a temperatura ambiente ou em TSB acrescido com
4.6. Avaliação de Susceptibilidade in vitro aos antimicrobianos
Os testes de sensibilidade aos antimicrobianos foram realizados no LEMC
através da técnica de disco difusão. Para o controle de qualidade foram
utilizadas as cepas da “American Type Culture Collection”, Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853 e E. coli ATCC 25922.
4.6.1. Teste de disco difusão
Com o auxílio de uma alça bacteriológica, em torno de cinco colônias de
P. aeruginosa foram suspensas em 5 mL de caldo Müeller-Hinton (Oxoid®,
Basingstoke, Inglaterra), para obter uma turvação correspondente a 0,5 da
escala de McFarland. Após a homogeneização da amostra foi introduzido um
“swab” estéril dentro do tubo, e em seguida este foi comprimido contra a
parede do tubo para a remoção do excesso de líquido. Com auxílio do “swab”,
a inoculação da amostra foi realizada em forma de estrias na superfície da
placa de Müeller-Hinton ágar (Oxoid®, Basingstoke, Inglaterra) em três direções, girando a placa em ângulo de 60° antes da mudança de sentido na
inoculação. Antes da aplicação dos discos as placas semeadas foram deixadas
em temperatura ambiente por aproximadamente 5 minutos, para absorver o
excesso de umidade na superfície do ágar.
Os discos foram retirados do freezer uma hora antes de sua aplicação, e
deixados à temperatura ambiente. A aplicação foi realizada com auxílio de uma
pinça estéril, pressionando-se os discos suavemente contra a superfície do
ágar. As distâncias de 30 mm (centro a centro) entre os discos e de 15 mm da
de inibição. Os discos de antimicrobianos (Oxoid®, Basingstoke, Inglaterra)
utilizados foram: aztreonam (30µg), ceftazidima (30µg), cefepima (30µg),
imipenem (10µg), meropenem (10µg), piperacilina (30µg),
piperacilina/tazobactam (30µg/10µg), amicacina (5µg), gentamicina (10µg),
ciprofloxacina (5µg) e polimixina B (300U).
As placas foram incubadas a 37°C por 18 a 24 horas em estufa. Após este
período foi realizada a leitura dos halos de inibição com auxílio de um
paquímetro, os quais foram interpretados de acordo com os critérios de
sensibilidade estabelecidos pelo Clinical Laboratory Standard Institute para
bacilos Gram-negativos não-fermentadores de glicose ((CLSI, 2005). A
interpretação do halo da polimixina B foi baseada no estudo de Gales et al
(2001).
4.7. Detecção das amostras de P. aeruginosa produtoras de MBL
4.7.1. Testes fenotípicos
4.7.1.1. Disco-aproximação
As amostras de P. aeruginosa confirmadas como resistentes aos
carbapenêmicos foram submetidas ao teste de triagem para avaliação
fenotípica da produção de MBL de acordo com o teste de Arakawa modificado
(2000). Foram testadas diferentes distâncias (1 - 3 cm) entre os discos
comerciais contendo antimicrobianos, ceftazidima (30µg) e imipenem (30µg)
(Oxoid®, Basingstoke, Inglaterra), e os discos estéreis de papel de contendo inibidores de MBL, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e o ácido
