ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA COSTA
ESTUDO DE GENES DE
Candida albicans
COM FUNÇÃO
DESCONHECIDA QUANTO À FORMAÇÃO DE BIOFILME,
CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS E INTERAÇÃO
PATÓGENO- HOSPEDEIRO
ANNA CAROLINA BORGES PEREIRA DA COSTA
ESTUDO DE GENES DE Candida albicans COM FUNÇÃO DESCONHECIDA QUANTO À FORMAÇÃO DE BIOFILME, CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS E INTERAÇÃO PATÓGENO-
HOSPEDEIRO
Tese apresentada ao curso de Odontologia do Instituto de Ciência e Tecnologia, UNESP- Univ Estadual Paulista, Campus de São José dos Campos, como parte dos requisitos para obtenção do título de DOUTOR, pelo programa de Pós-Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área Microbiologia / Imunologia.
Orientadora: Profa. Dra. Graziella Nuernberg Back Brito
Campos: ICT/UNESP; 2014.
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Prof. Achille Bassi e Seção Técnica de Informática, ICMC/USP com adaptações - STATi e STI do ICT/UNESP. Dados fornecidos pelo autor.
AUTORIZAÇÃO
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, desde que citada a fonte.
São José dos Campos, 25 de maio de 2015 E-mail: carol_biolog@yahoo.com.br
Assinatura: ______________________________ Costa, Anna Carolina Borges Pereira da
Estudo de genes de Candida albicans com função desconhecida
quanto à formação de biofilme, características biológicas e interação patógeno- hospedeiro / Anna Carolina Borges Pereira da Costa. - São José dos Campos : [s.n.], 2015.
169 f. : il.
Tese (Doutorado em Biopatologia Bucal) - Pós-graduação em Biopatologia Bucal - Instituto de Ciência e Tecnologia de São José dos Campos, UNESP - Univ Estadual Paulista, 2015.
Orientadora: Graziella Nuernberg Back Brito.
1. Candida albicans. 2. Biofilme. 3. Antifúngicos. 4.
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Graziella Nuernberg Back Brito (Orientadora) Instituto de Ciência e Tecnologia UNESP- Univ Estadual Paulista Campus de São José dos Campos
Prof. Dr. Adolfo José da Mota
Faculdade de Ciências Agrárias Universidade Federal do Amazonas
Prof. Adj. Ricardo Sérgio Couto de Almeida
Centro de Ciências Biológicas Universidade Estadual de Londrina
Profa. Dra. Renata Falchete do Prado
Instituto de Ciência e Tecnologia UNESP- Univ Estadual Paulista Campus de São José dos Campos
Profa. Dra. Samira Esteves Afonso Camargo
Instituto de Ciência e Tecnologia UNESP- Univ Estadual Paulista Campus de São José dos Campos
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Simone e Roberto, meu irmão Gustavo e meu tio Alaor por todo apoio, carinho e incentivo. Muito obrigada.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À minha orientadora Profa. Dra. Graziella Nuernberg Back Brito pelos conhecimentos transmitidos, paciência, empatia, sensibilidade, amizade e comprometimento. Profissional e pessoa admirável. Muito obrigada!!!
I am very thankful to my supervisor Dr. Duncan Wilson for all shared knowledge, patience, friendship, empathy and careful consideration. It was a great opportunity to work with such a brilliant and humble researcher. I also want to thank Duncan's wife, Anna, for hospitality and friendship. Thank you all for making my stay in Germany so sweet.
Ich möchte mich auch bei meinem Betreuer Prof. Dr. Bernhard Hube für die grossartige Gelegenheit bedanken, in seinem Labor gearbeitet haben zu können, sowie für sein mit mir geteiltes Wissen, seine Geduld, Einfühlungsvermögen, Zuversicht und Rücksichtnahme. Danke, dass Deine Tür immer offen stand und Du mich in Deine faszinierende Forschung eingebunden hast. Ich möchte mich auch bei Prof. Hubes Abteilung dafür bedanken, mich mit offenen Armen empfangen zu haben und mir ein Gefühl von zu Hause gegeben zu haben. Nochmals vielen Dank!
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", na pessoa do diretor Prof. Dr. Carlos Augusto Pavanelli e do vice-diretor Prof. Dr. Estevão Tomomitsu Kimpara do Instituto de Ciência e Tecnologia do Câmpus de São José dos Campos.
Ao Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal, na coordenação da Profa. Adj. Cristiane Yumi Koga Ito e atual coordenação pelas Profa. Adj. Juliana Campos Junqueira e Profa. Dra. Ana Lia Anbinder.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de estudo concedida no início deste caminho.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de estudo concedida (processo 2011/21346-7).
Ao Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge pela orientação parcial, conhecimentos transmitidos e desafios gerados.
Ao Carlos Guedes, pela paciência e competência em nos ajudar quanto aos processos da FAPESP.
À Rebeca Mendonça do DAAD e Vânia Escobar da CAPES pela ajuda e orientações quanto ao processo do doutorado sanduíche.
Aos secretários da Seção de Pós-Graduação Rosemary de Fátima Salgado, Bruno Shiguemitsu Marques Tanaka e Ivan Oliveira Damasceno por serem sempre solícitos.
Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal.
À minha amiga, mais que amiga, Dra. Cristiane Aparecida Pereira Correia, por compartilhar sonhos e conhecimentos. Muito obrigada pelo incentivo, amizade e carinho.
Aos amigos feitos em Jena, Carla Arce, Ricardo Ruiz Machado e Paulo Cristaldo, pelo convívio, amizade e ajuda. Muito obrigada.
À minha amiga Inês Correia pelo convívio no laboratório, amizade e carinho. Muito obrigada.
Ao Prof. Dr. Ricardo Sérgio Couto de Almeida docente da Universidade Estadual de Londrina pelos conselhos e incentivo. Muito obrigada.
Ao Prof. Dr. Adolfo José da Mota docente da Universidade Federal do Amazonas pelos conselhos, conhecimento compartilhado e incentivo. Muito obrigada.
À Dra. Renata Falchete do Prado pela ajuda e conhecimentos transmitidos. Muito obrigada.
À pós-doutoranda Daniela Campos Granato por me ajudar a entender a metodologia do projeto e incentivo. Muito obrigada.
Ao Prof. Dr. Ivan Balducci por toda ajuda e conhecimentos transmitidos quanto a análise dos resultados.
I am very grateful to the secretary of the laboratory in Jena Mrs. Petra Flemming for the help and support given during my stay in Germany. Thank you so much.
Aos técnicos de laboratório Sérgio Giovanny Alves e Domingos Gonçalves Pontes, pela amizade e auxílio.
Às bibliotecárias, em especial Silvana Alvarez e Ana Paula Mattozo Durante, pela disponibilidade em atender sempre que necessário.
Michelle Peneluppi Silva, Mirian Marcolan de Mello, Rafaella Braga Santos, Fernanda Freire, Isabel Chaves Silva Carvalho e aos demais colegas do Programa de Biopatologia Bucal, pela convivência e amizade.
I also want to thank all students and technicians of my group in Jena, specially François Mayer, Pedro Miramón, Volha Skrahina, Sarah Höfs, Melanie Polke, Stephanie Wisgott, and Prof. Dr. Ilse Denise Jacobsen for the help, shared knowledge, friendship and patience.
I need to thank the Leibniz- Institute for Natural Product Research and Infection Biology- Hans Knoell Institute (HKI), em Jena. Alemanha, for the opportunity.
"A gente se diverte com os outros. Ama com os outros. Viaja com os outros. Mas quando fica doente, tem muita coisa que precisa encarar sozinho. A cirurgia. O medo. A iodoterapia. O risco é sobre o seu pescoço e ninguém pode trocar com você. Nem sua mãe, que provavelmente está
sofrendo mais ainda. Depois de um câncer, a gente descobre que certas vivências são solitárias, como nascer e
morrer. Cada um tem um caminho, e por melhores que sejam seus amigos, eles não podem tirar você do seu. Mas não é culpa do câncer. Ele só faz a gente perceber a nossa
SUMÁRIO
RESUMO...
ABSTRACT...
1 INTRODUÇÃO... 12 14 16
2 REVISÃO DE LITERATURA... 19
2.1 Candida albicans... 19
2.2 Biofilme de Candida albicans... 22
2.3 Fatores de virulência de Candida albicans... 33
2.4 Interação patógeno- hospedeiro... 38
2.5 Modelos experimentais de candidose... 43
3 PROPOSIÇÃO... 50
4 MATERIAL E MÉTODOS... 51
4.1 Construção das cepas mutantes de Candida albicans... 4.2 Desenvolvimento do biofilme... 4.2.1 Quantificação de células viáveis... 4.2.2 Atividade metabólica (XTT)... 4.2.3 Quantificação de células desprendidas do biofilme...
4.3 Análise da biomassa (peso seco)...
4.4 Construção das cepas complementadas de Candida albicans... 4.5 Avaliação do comportamento do biofilme frente ao etanol, farnesol e zinco...
4.6 Crescimento sob limitação de nutrientes e agentes estressantes...
4.7 Ensaio de filamentação...
4.8 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)...
4.10 Testes antifúngicos em células planctônicas e biofilmes....
4.11 Quantificação de quitina em biofilme...
4.12 Extração e quantificação da concentração de β-1,3 glucana...
4.13 Células epiteliais bucais: aderência, invasão e dano...
4.14 Patogenicidade em ovo embrionado de galinha...
4.15 qPCR: interação com células epiteliais e biofilme...
4.16 Análise estatística...
5 RESULTADOS...
6 DISCUSSÃO...
7 CONCLUSÃO...
8 REFERÊNCIAS...
APÊNDICE... 68 70
Costa ACBP. Estudo de genes de Candida albicans com função desconhecida quanto à formação de biofilme, características biológicas e interação patógeno- hospedeiro [tese]. São José dos Campos (SP): Instituto de Ciência e Tecnologia, UNESP - Univ Estadual Paulista; 2015.
RESUMO
Candida albicans é um fungo oportunista capaz de causar infecções superficiais e até sistêmicas. A maioria das infecções é mediada pela formação de biofilme que confere resistência aos agentes antifúngicos e ao sistema imune, porém os mecanismos de desenvolvimento do biofilme e patogenicidade ainda não foram completamente elucidados. No presente estudo foram selecionados 9 genes de C. albicans com função desconhecida, dentre 34 cepas mutantes que apresentaram fenótipo alterado para formação de biofilme. Os biofilmes foram formados em placas de 96 poços ou discos de poliestireno e avaliados em diferentes tempos de desenvolvimento. A seguir foram construídas 4 cepas complementadas que foram avaliadas quanto à susceptibilidade a agentes estressantes, crescimento sob limitação de nutrientes e testes de filamentação. A arquitetura dos biofilmes foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os biofilmes também foram avaliados quanto à quantidade de β-1,3-glucana e quitina. Para os modelos de infecção, células epiteliais bucais (TR-146) foram utilizadas para análise de aderência, invasão e dano. A patogenicidade das cepas foi avaliada em ovos embrionados de galinha durante 7 dias, após a inoculação das cepas. Células planctônicas e biofilmes foram submetidos a testes antifúngicos com os agentes fluconazol, anfotericina B e caspofungina. A reação em cadeia da polimerase quantitativa foi realizada para verificar a
expressão dos genes MRV8 e NDT80 em células fúngicas em interação
com células epiteliais e MRV8, MRV1 e MRV6 em células crescidas em biofilme. Os resultados foram analisados por teste t de Student, ANOVA, Tukey e testes de Log-rank (Mantel-Cox) (p < 0,05). Foram construídas 4
cepas complementadas para os genes selecionados ORF19.823,
ORF19.7170, ORF19.6847 e MRV8. A função de ORF19.823 ainda permanece desconhecida, pois não foi observado fenótipo significativo para a cepa mutante quanto aos testes realizados. A cepa mutante para
ORF19.7170 causou menos dano as células epiteliais, porém o resultado não foi significante e o gene foi dispensável para a formação de biofilme.
ORF19.6847 mostrou participação no acúmulo de biomassa no biofilme e dano epitelial e significativa redução da produção de β-1,3-glucana. O
participação na formação de biofilme de 24 h, acúmulo de biomassa, organização da arquitetura do biofilme, modulação da resposta a caspofungina em altas concentrações, dano epitelial e tamanho das microcolônias com recuperação do fenótipo pela cepa complementada. O
gene MRV8 destacou-se como alvo promissor para o desenvolvimento de
novos agentes antifúngicos com mecanismos específicos contra as espécies C. albicans e C. dubliniensis.
COSTA ACBP. Study of unknown function genes of Candida albicans as to biofilm formation, biological characteristics, and host-pathogen interaction [doctorate]. São José dos Campos (SP): Institute of Science and Technology, UNESP - Univ Estadual Paulista; 2015.
ABSTRACT
with phenotype recovered by the complemented strain. The MRV8 gene stood out as a promising target for developing new antifungal drugs with specific mechanisms against the C. albicans and C. dubliniensis species.
1 INTRODUÇÃO
Candida albicans é uma levedura comensal encontrada na superfície das mucosas (Ganguly, Mitchell, 2011). Entretanto, esta levedura é um patógeno oportunista comum que pode causar uma variedade de infecções severas e recorrentes na mucosa, como também infecções invasivas e fatais, em pacientes imunocompetentes e imunocomprometidos (Samaranayake LP et al., 2009; Ganguly, Mitchell, 2011).
As infecções de mucosa são caracterizadas por candidose bucal e vaginal decorrentes de fatores de risco como uso de agentes imunossupressores, antibióticos, estrogênios, xerostomia, uso de prótese e má higienização bucal (Jorge et al., 1993; Naglik et al., 2008; de Souza et al., 2009).
Para causar infecção, C. albicans dispõe de fatores de virulência como aderência as células do hospedeiro, hidrofobicidade, mudança morfológica (dimorfismo), secreção de aspartil proteinase, produção de fosfolipase e capacidade de formação de biofilme (Schaller et al., 2005; Nobile, Mitchell, 2006; Costa et al., 2012a).
aos antifúngicos convencionais (Kuhn et al., 2002; Samaranayake LP et al., 2009).
A formação do biofilme ocorre, inicialmente, com a aderência das leveduras ao substrato, seguida por coagregação das células e colonização que caracterizam a fase inicial (1-11 h) (Seneviratne et al., 2008a; Nobile, Mitchell, 2006). A presença das leveduras é importante para o ancoramento do biofilme a superfície (Douglas LJ, 2002). A seguir, ocorrem crescimento e proliferação das células permitindo a formação da camada basal, ancoragem das células e produção de material da matriz extracelular, caracterizando a fase intermediária (12-30 h), e finalmente, ocorre maturação com o crescimento de pseudohifas e concomitante extensão das hifas a partir de tubos germinativos com posterior disseminação das células que definem a fase de maturação (31-72 h) (Douglas LJ, 2002; Nobile, Mitchell, 2006; Seneviratne et al., 2008a; Ramage et al., 2009).
Os mecanismos moleculares de regulação da formação de biofilme iniciam-se com a aderência conferida pelos genes da família
ALS, HWP1, EAP1 e CSH1 (Chaffin, 2008; ten Cate et al., 2009; Karkowska-Kuleta et al., 2009). A seguir, ocorre a transição morfológica de levedura para hifa mediada principalmente pelo gene EFG1 e outros, como CPH1, TEC1, SUV3, NUP85, UME6, MDS3 e KEM3 (Blankenship, Mitchell, 2006; Ramage et al., 2009). As células são envolvidas pela matriz extracelular decorrente da expressão dos genes ADH1, GCA1 e
GCA2 (Blankenship, Mitchell, 2006; Finkel, Mitchell, 2011). O dano celular causado pelo estabelecimento do biofilme deve-se a expressão de genes para as enzimas hidrolíticas aspartil proteinase secretoras (SAPs) e fosfolipases (PLBs) (Zhu, Filler, 2010). Os 1061 genes alvos envolvidos na formação do biofilme são regulados pelos fatores de transcrição codificados pelos genes BCR1, TEC1, EFG1, NDT80, ROB1 e BRG1
Embora, os mecanismos moleculares de desenvolvimento do biofilme sejam bem descritos, Nett JE et al. (2009) avaliaram o perfil de transcrição de biofilme de C. albicans formado in vivo em cateter venoso central e descreveram que 44% dos genes "up" regulados no biofilme intermediário e 40% dos genes "down" regulados no biofilme maduro apresentam função desconhecida. Além disso, sabe-se que C. albicans
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Candida albicans
Candida albicans é um fungo diplóide e assexual que produz blastoconídeos, pseudohifas e hifas semelhantes ao micélio dos ascomicetos mostrando septos com um simples poro (McCullough, Savage, 2005; Klis et al., 2009). Este fungo também é denominado dimórfico, pois se encontra como blastoconídeo na fase infectante e filamentoso na fase parasitária. Embora a invasão tecidual seja desencadeada pelas hifas, as duas formas são encontradas nos tecidos infectados (Jayatilake, 2011).
O blastoconídeo é esférico e oval medindo cerca de 2- 5 µm (Jayatilake, 2011). O crescimento da levedura ocorre por brotamento assimétrico, em que o septo surge antes do brotamento aparecer e o núcleo divide-se na constrição do brotamento dando origem a uma célula filha. As leveduras podem formar pseudohifas e hifas em um processo reversível (Berman, 2006, Giacometti et al., 2011). A forma vegetativa unicelular é favorecida a 30 oC e pH ácido (4,0) (Kim, Sudbery, 2011).
(Whiteway, Bachewich, 2007). A diferenciação em formas filamentosas é favorecida por fatores do ambiente como incubação a 37 oC, presença de
soro, pH neutro ou pH alcalino, concentração aumentada de CO2,
embebimento em substrato e presença de N- acetilglicosamina, devido à expressão dos genes EFG1, CPH1, MYO5 e HGC1 (Berman, 2006; Whiteway, Bachewich, 2007; Kim, Sudbery, 2011; Mayer et al., 2012a).
As pseudohifas representam a forma de crescimento entre leveduras e hifas, formando cadeias de brotamentos alongados com constrições nos septos e colônias rugosas em condições de pH de 5,5 e temperatura igual a 35 oC (Kim, Sudbery, 2011). O núcleo também se
divide na constrição do brotamento (Berman, 2006; ten Cate et al., 2009). As pseudohifas coexistem entre leveduras e hifas em culturas vegetativas e durante infecções. A ausência da estrutura Spitzenkörper e a posição nuclear no cruzamento da junção mãe-filha sugere que o crescimento da pseudohifa esteja mais próximo da levedura do que da hifa (Whiteway, Bachewich, 2007).
C. albicans é capaz de produzir clamidoconídeos que são estruturas formadas em condições adversas do ambiente mostrando morfologia esférica, refringentes, com parede grossa ligada a pseudohifa ou hifa. O clamidoconídeo difere do blastoconídeo por seu tamanho grande, forma esférica e aparência refringente em microscópio de luz (Jayatilake, 2011). Os mecanismos moleculares para sua formação são mediados pela expressão dos genes SUV3, SCH9 e ISW2 (Whiteway, Bachewich, 2007).
similares associadas com retículo endoplasmático, chamadas plasmalemassomos. Também foram encontradas vesículas na parede celular, chamadas lomassomos. Estas duas parecem ter função secretora (Jayatilake, 2011).
No núcleo são abrigados 8 pares de cromossomos (chr1, chr2, chr3, chr4, chr5, chr6, chr7 e chrR) contendo 13,3- 13,4 milhões de pares de bases e 6524 genes, dos quais 19,2% são únicos para a espécie
C. albicans (Braun et al., 2005; Kim, Sudbery, 2011; Wilson D et al., 2014). O genoma de C. albicans apresenta algumas particularidades, pois cromossomos homólogos mostram divergências substanciais, em que muitas vezes genes estão presentes em 2 alelos diferentes (Braun et al., 2005). Outra particularidade é o códon CUG que é traduzido em serina ao invés de leucina (Kim, Sudbery, 2011). Além disso, um grande número (acima de 73%) dos genes identificados no genoma de C. albicans é classificado como genes com função desconhecida, dos quais 19% destes não compartilham sequências homólogas significativas com outros seres vivos (Braun et al., 2005; d' Enfert et al., 2005).
Externamente a membrana citoplasmática situa-se a parede celular responsável por manter a integridade da célula e interagir com o ambiente externo, composta, principalmente, por manoproteínas, β-1,3-glucana, β-1,6-glucana e quitina (Chaffin, 2008). A parede celular de
GPI). A segunda forma é a ligação com proteínas com repetições internas (proteins with internal repeats- Pir) ligadas a β-1,3-glucana que auxiliam na arquitetura da parede celular. Além disso, também existem as proteínas que não estão fixadas a matriz polissacarídica (Chaffin, 2008; ten Cate et al., 2009).
As proteínas da parede celular apresentam importantes funções para a adaptação e virulência, como: manter a integridade da parede celular, evitar detecção por dectina-1, promover a formação de biofilme, mediar à aderência as células do hospedeiro e a dispositivos médicos abióticos, promover a invasão das camadas epiteliais, proteger contra o ataque do sistema imune inato, promover a aquisição de ferro e propriedades relacionadas com permeabilidade e carga (Klis et al., 2009). Existe por volta de 20 CWPs que podem estar fixadas a parede celular como as 8 adesinas da família ALS, HWP1, EAP1 e PGA30 (Klis et al., 2009). Além destas, existem também CWPs não fixadas covalentemente a parede celular apresentando função enzimática, como as enzimas hidrolíticas que tem a capacidade de hidrolisar complexos substratos e transportá-los para dentro da célula como fonte de nutrientes. Podem agir como fatores de virulência degradando os tecidos do hospedeiro, facilitando a colonização ou invasão, como as proteínas da família da aspartil proteinase secretoras, quitinase, proteínas para biossíntese de β-1,6-glucana e enzimas com atividade para glucanase (Chaffin, 2008).
2.2 Biofilme de Candida albicans
sendo implicado nas candidoses bucais (Seneviratne et al., 2008a; Costa et al., 2011).
A formação do biofilme ocorre, inicialmente, com a aderência das leveduras ao substrato, seguida por coagregação das células e colonização que caracterizam a fase inicial (0-11 h) (Seneviratne et al., 2008a; Nobile, Mitchell, 2006). A presença das leveduras é importante para o ancoramento do biofilme a superfície (Douglas LJ, 2002). A seguir, ocorrem crescimento e proliferação das células permitindo a formação da camada basal, ancoragem das células e produção de material da matriz extracelular, caracterizando a fase intermediária (12-30 h), e finalmente, ocorre maturação com o crescimento de pseudohifas e concomitante extensão das hifas a partir de tubos germinativos com posterior disseminação das células que definem a fase de maturação (31-72 h) (Douglas LJ, 2002; Nobile, Mitchell, 2006; Seneviratne et al., 2008a; Ramage et al., 2009).
Os mecanismos moleculares de regulação da formação do biofilme já foram descrito por alguns autores (Blankenship, Mitchell, 2006; Ramage et al., 2009; Nobile et al., 2009; Nailis et al., 2009). A aderência é o primeiro passo para a formação do biofilme e é conferida pelos genes da família ALS responsáveis por aderência e agregação a outros micro-organismos e são expressos por leveduras e hifas. O gene
HWP1 codifica uma adesina expressa somente por hifas, o gene EAP1
confere aderência a poliestireno e o gene CSH1 confere aderência relacionada com hidrofobicidade da superfície celular da levedura, além de outras adesinas menos conhecidas (Chaffin, 2008; ten Cate et al., 2009; Karkowska-Kuleta et al., 2009). Após aderência, segue-se a maturação com a formação de hifas e expressão do gene EFG1 envolvido na regulação da transição morfológica e habilidade de formar estrutura aderente ao poliestireno, poliuretano e vidro. Outros genes também são requeridos para a diferenciação morfológica como CPH1, TEC1, SUV3,
al., 2009). A produção de matriz extracelular é mediada pela expressão dos genes ADH1, GCA1 e GCA2 (Blankenship, Mitchell, 2006; Finkel, Mitchell, 2011). Após o estabelecimento do biofilme, ocorrem invasão e dano celular por meio da expressão de genes para as principais enzimas histolíticas, aspartil proteinase secretoras (SAPs) e fosfolipases (PLBs) (Zhu, Filler, 2010). O último processo do biofilme é a dispersão das células para a formação de outras comunidades regulada negativamente pelos genes UME6 e SUR7 e positivamente pelos genes PES1 e NRG1
(Bernardo, Lee, 2010; Uppuluri et al., 2010b; Finkel, Mitchell, 2011). A mudança de expressão ou atividade destes genes durante a maturação do biofilme parece ser controlada em resposta ao acúmulo de moléculas do quorum-sensing (Uppuluri et al., 2010b; Finkel, Mitchell, 2011). Os genes relacionados à filamentação e aderência são regulados principalmente pelos fatores de transcrição EFG1, BCR1 e TYE1
(Ganguly, Mitchell, 2011; Dwivedi et al., 2011).
Nobile et al. (2012) avaliaram 165 reguladores transcricionais quanto à formação de biofilme de C. albicans, dos quais 6 mutantes foram selecionados para estudo da rede de circuito de controle transcricional: bcr1∆/∆, tec1∆/∆, efg1∆/∆, ndt80∆/∆, rob1∆/∆ e brg1∆/∆. Foi demonstrado que 1061 genes foram regulados por pelo menos um dos 6 reguladores de biofilme. Além disso, foi observado que os 6 reguladores controlam a expressão dos outros reguladores: os 6 reguladores ligam-se as regiões promotoras de BCR1, TEC1, EFG1 e BRG1; Tec1, Efg1, Ndt80 e Rob1 ligam-se a ROB1; Efg1 e Ndt80 liga-se a NDT80; sendo que a regulação entre os reguladores é positiva. Bcr1, Efg1, Ndt80, Rob1 e Brg1 são ativadores e repressores de seus genes alvos, enquanto que Tec1 age somente como ativador de genes envolvidos com a formação de biofilme. Assim, considerando todos os genes alvos dos 6 reguladores, a rede de genes do biofilme compreende 15% do genoma de C. albicans.
superfícies inanimadas, como dispositivos médicos e odontológicos com aderência facilitada devido à presença de saliva e soro (Douglas LJ, 2002; Dongari- Bagtzoglou et al., 2009; da Silva et al., 2010; Estivil et al., 2011).
A organização em biofilme apresenta vantagens que incluem proteção no ambiente, resistência à remoção física e química, cooperação metabólica e regulação da expressão de genes baseados na comunidade. As principais implicações clínicas devem-se a redução da susceptibilidade aos agentes antimicrobianos e proteção contra as defesas do hospedeiro (Jabra-Rizk et al., 2004; Ramage et al., 2009).
As células do biofilme de C. albicans têm habilidade de comunicar-se e coordenar o comportamento da comunidade via secreção de moléculas de sinalização em um fenômeno definido como quorum-sensing (Ramage et al., 2009). O quorum - sensing beneficia o biofilme, pois previne a superpopulação desnecessária, controla a competição por nutrientes e tem importantes implicações no processo infeccioso particularmente para disseminação e estabelecimento de outros sítios de infecção (Ramage et al., 2005). As principais moléculas identificadas são o farnesol e o tirosol. O farnesol foi identificado originalmente como um inibidor da morfogênese inibindo a transição de levedura para hifa promovendo a dispersão das células (Ramage et al., 2009; Finkel, Mitchell, 2011). Possui também outras funções importantes como promoção da resistência ao estresse oxidativo, ativação da formação de clamidoconídeos em condições favoráveis para o seu desenvolvimento, inibição da aderência das leveduras a superfície, germinação das leveduras em biofilme maduro e redução da produção de IL-12 pelo hospedeiro. O tirosol apresenta efeito contrário ao farnesol, induzindo a transição de levedura para hifa nos primeiros estágios de desenvolvimento do biofilme. A morfogênese e consequentemente a secreção de moléculas do quorum-sensing é influenciada pela densidade de células na população, em que em concentrações menores que 106
concentração ocorre predominância de leveduras (Kruppa, 2009; Ramage et al., 2009).
O uso do farnesol para controlar a formação de biofilme de C. albicans surge como um novo mecanismo de ação que poderá ser utilizado como opção terapêutica, como descrito por Hisajima et al. (2008) que verificaram o efeito protetor do farnesol em candidose bucal experimental induzida em camundongo imunossuprimido, mostrando redução das lesões e células de C. albicans e análise histológica com poucos micélios e células inflamatórias devido à prevenção da invasão do fungo na mucosa.
Outras moléculas também foram descritas com efeito na população. Feniletil álcool e triptofol agem inibindo a filamentação, porém em concentrações mais altas de células, enquanto que a substância autoreguladora morfogênica (MARS) induz a morfogênese da hifa. Assim como o farnesol, o ácido farnesóico inibe a transição de levedura para hifa (Kruppa, 2009). Outra molécula recentemente relacionada ao quorum-sensing é uma proteína-reguladora dependente de zinco codificada pelo gene ZAP1 que funciona como repressora da maturação do biofilme através da regulação negativa da produção de β-1,3- glucana solúvel, o componente mais prevalente da matriz extracelular (Nobile et al., 2009).
pseudohifa de C. dubliniensis, com atividade inter e intraespécie, porém não houve restrição do crescimento.
As camadas mais internas do biofilme maduro criam um ambiente pobre em oxigênio o que requer a expressão de determinados genes para a manutenção da estrutura. Assim, Bonhomme et al. (2011) observaram que o gene TYE7, que codifica um ativador transcricional de genes glicolíticos em crescimento planctônico e biofilme, é requerido para a coesividade do biofilme. Este gene regula negativamente a transição de levedura para hifa induzida por condições de hipóxia que quando deletado forma um biofilme menos aderente, fácil de ser removido, enfraquecido e com maior número de formas filamentosas em condições de hipóxia que a cepa selvagem mostrando que Tye7p mantém a produção de ATP por expressar genes glicolíticos necessários à adaptação a hipóxia gerada durante a maturação do biofilme, destacando-se como um alvo atrativo para o desenvolvimento de antifúngicos.
células planctônicas aos antifúngicos anfotericina B, fluconazol e 5-fluorocitosina, porém menos resistentes que a organização em biofilme, mostrando que o tratamento de infecções causadas por biofilme de C. albicans vai além da erradicação da comunidade séssil (Baillie, Douglas, 1998a, 1998b).
Em outro estudo realizado por Uppuluri et al., (2010b) foi investigada a função do gene NRG1 de C.albicans, uma proteína ligadora de DNA com um domínio de zinco, que funciona como regulador negativo de filamentação, quanto ao desenvolvimento do biofilme. A cepa super expressando Nrg1p formou um biofilme monocamada constituído por leveduras e pseudohifas aderidas ao substrato e menos robusto que o biofilme formado pela cepa de C. albicans SC5314. Em adição, este biofilme teve pelo menos 10 a 18 vezes mais células dispersas. Os resultados indicaram que a regulação da expressão de NRG1 poderia
potencialmente levar ao controle do biofilme e apontaram o gene NRG1
como um alvo atrativo para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos.
As substâncias da matriz extracelular são secretadas durante a fase de maturação com função de proteger as células da fagocitose, manter a integridade do biofilme e limitar a difusão de substâncias (Douglas LJ, 2003; Seneviratne et al., 2008a). A matriz extracelular é constituída por polissacarídeos, como glicose, manose, ramnose e N-acetilglicosamina, proteínas, hexosaminas, fósforo e ácido urônico (Al-Fattani, Douglas, 2006; Lal et al., 2010; Martins et al., 2010).
extracelular, diminuição da taxa de crescimento das células dentro do biofilme e diferença de expressão de genes (Nobile, Mitchell, 2006; Bonhomme, d'Enfert, 2013).
O biofilme de C. albicans apresenta resistência intrínseca aos azóis, devido à expressão de bombas de efluxo codificadas pelos genes da superfamília de proteínas ABC (cassete-ligadora de ATP) e MFS (facilitador maior). ABC codifica os genes CDR1 e CDR2 e MFS
codifica MDR1. A superexpressão destes genes ocorre na fase
intermediária e madura, porém se inicia na fase inicial da formação do biofilme (Prasad, Kappor, 2005; Chandra et al., 2005).
Kuhn et al. (2002) relataram diminuição da suscetibilidade de biofilmes de C. albicans e C. parapsilosis formados in vitro aos antimicrobianos fluconazol, voriconazol, clorexidina, anfotericina B, nistatina, terbinafina e ravuconazol em relação às células planctônicas. Mas por outro lado, foi demonstrado que o antifúngico caspofungina pode ser usado para prevenção e redução de biofilme de C. albicans,
demonstrado no tratamento de biofilme formado in vivo em cateter colocado em camundongo. Os resultados mostraram que o tratamento reduziu, aproximadamente, 4 log10 de células do biofilme e 99% de
células disseminadas para os rins. A prevenção da formação do biofilme reduziu quase 3 log10 de células e a disseminação para os rins, indicando
que a caspofungina constitui importante agente na prevenção e tratamento de infecções causadas por biofilmes de C. albicans e disseminação para órgãos distantes (Lazzell et al., 2009).
Outro fato que contribui para a redução da suscetibilidade aos antifúngicos é a presença de células "persistentes" que representam uma menor população do biofilme. Estas células são protegidas das defesas do hospedeiro pela matriz extracelular e após a exposição ao antimicrobiano podem repovoar o biofilme, representando outro mecanismo de resistência (d´Enfert, 2009). Sugere-se que as células "persistentes" não sejam programadas para a morte celular, favorecendo a tolerância aos agentes antimicrobianos e a escassez de nutrientes no biofilme (Jabra-Risk et al., 2004).
O crescimento em biofilme também contribui para a evasão do sistema imune por diferentes mecanismos, como a expressão de proteínas de superfície, como Pra1p e Gpd2p, que se ligam aos fatores H e FHL1 mimetizando as células do hospedeiro resultando em proteção contra o sistema complemento e o uso da citocina IL-17A que parece aumentar a formação de biofilme de C. albicans in vitro (Mathé, Van Dijck, 2013). Além disso, a presença de células do sistema imune, como células mononucleares do sangue periférico, durante o desenvolvimento do biofilme aumenta significativamente a espessura e atividade metabólica do biofilme em resposta à secreção diferenciada de citocinas anti-inflamatórias (Chandra et al., 2007).
Existem diversos modelos de formação de biofilme descritos na literatura que permitem estudar sua complexidade estrutural, expressão gênica, comportamentos frente a diferentes substratos, condições de estresse, como comportamento a diferentes agentes antifúngicos e outros compostos químicos (Martins et al., 2010; Estivil et al., 2011; Costa et al., 2013a). Seneviratne et al. (2009) desenvolveram um modelo de biofilme de Candida crescido no fundo da placa de 96 poços de poliestireno em meio de cultura Yeast Nitrogen Base (YNB) suplementado com 100 mM de glicose para a avaliação de biofilmes de C. albicans e C. glabrata, o qual foi observado que 1-7 x 105 células/mL
mostrou valores altos para a atividade metabólica para as duas espécies alcançando o valor máximo após 48 h e declinando depois. C. albicans
formou um biofilme grosso e complexo composto por blastoconídeos, pseudohifas e hifas embebidas em matriz polissacarídica extracelular. O biofilme formado por C. glabrata foi fino, desigual e bastante compacto, formado por blastoconídeos embebidos em matriz polissacarídica extracelular. Após 48 h, os biofilmes atingiram a maturidade e alcançaram um platô de 0,3-2,2 x 108 células/mL e declinaram e desintegraram a 72 h.
Foi demonstrado que biofilme de C. albicans de 48 h e 72 h apresentaram 7,6% e 28% de células mortas, respectivamente (Seneviratne et al., 2008b). A formação de biofilme por esta metodologia foi avaliada pelos métodos de contagem de células viáveis, atividade metabólica, microscopia confocal de varredura a laser e microscopia eletrônica de varredura rendendo resultados importantes para a compreensão das comunidades (Seneviratne et al., 2009)
Nett JE et al. (2009) avaliaram a expressão gênica de biofilmes de C. albicans formados in vivo em cateter venoso central inserido em camundongos, mostrando que para os biofilmes na fase intermediária e de maturação houve super expressão de 124 genes, os quais estão envolvidos na síntese de carboidratos e processamento (10%), transcrição e síntese de proteínas (13%) e produção de energia e metabolismo (12%). Embora os mecanismos moleculares de regulação da formação do biofilme sejam bem descritos, neste estudo foi observado que 44% dos genes "up" regulados no biofilme intermediário e 40% dos genes "down" regulados no biofilme maduro apresentam função desconhecida, destacando a necessidade de estudos que descrevam a função destes genes para compreensão do biofilme, fornecimento de ferramentas diagnósticas e desenvolvimento de novos agentes antifúngicos.
correspondem à aderência das leveduras ao substrato utilizando uma nova metodologia chamada nanostring profiling, mais sensível que o método microarray e que usa sondas que se ligam diretamente aos RNAs. Os autores observaram que 29 fatores de transcrição controlam grupos diferentes de genes envolvidos no crescimento de hifas, virulência, secreção de proteínas e parede celular, captura de zinco e produção da matriz extracelular. Cinco destes fatores de transcrição, Ace2p, Bcr1p, Cas5p, Snf5p e Met4p, controlam genes ligados à via que regula Ace2p e morfogênese polarizada apresentando papel na formação de biofilme. Também foi destacado o importante papel de Bcr1p na primeira fase de desenvolvimento do biofilme no controle do gene de aderência ALS1
crucial para a aderência célula-substrato.
participação na estrutura de glucosilfosfatidilinositol que ancora adesinas na superfície celular. Por último, talvez o glicerol seja importante para gerar o turgor necessário para a penetração no tecido. Os autores destacaram o papel da síntese de glicerol para a expressão das principais adesinas envolvidas na formação de biofilme e o achado de uma importante via metabólica como alvo terapêutico que pode causar prejuízos para ambas as funções fisiológicas e regulatórias (Desai et al., 2013).
2.3 Fatores de virulência de Candida albicans
endotélio e coagregação célula-célula, respectivamente (Karkowska-Kuleta et al., 2009). Além disso, estas adesinas agem em conjunto com outras adesinas, em que Als1p e Eap1p medeiam à ligação célula-substrato e Als3p e Hwp1p medeiam à ligação célula- célula (Finkel, Mitchell, 2011). A adesina Als3p, expressa somente por hifas, apresenta características multifatoriais mediando à aderência as células endoteliais e epiteliais bucais, gelatina, fibronectina, fibrinogênio, colágeno tipo IV, laminina e película salivar. Esta adesina ainda é responsável pela formação de biofilme e constitui importante invasina, pois se liga a N-caderina e E-N-caderina na superfície das células epiteliais e endoteliais promovendo a endocitose das hifas. Almeida et al. (2008) descreveram outra função da adesina Als3p na aquisição de ferro a partir de estoques intracelulares na forma de ferritina destacando seus múltiplos atributos como fator de virulência.
Green et al. (2006) avaliaram a expressão de genes ALS
por cepas isoladas de pacientes com HIV em modelo de candidose bucal em ratos com hipossalivação mostrando que houveram diferenças no perfil de expressão entre as aglutininas e para o tempo de infecção, onde o gene ALS2 foi expresso para todas as cepas e o início da infecção foi marcado pela expressão do gene ALS1 seguida pelos outros genes da família das aglutininas, porém não foi observada a expressão do gene
ALS7 para a infecção em ratos.
Outra adesina importante expressa somente por hifas é a Hwp1p que medeia aderência as células epiteliais bucais, induz reposta de anticorpo salivar e sistêmico e contribui para a formação de biofilme (Ramage et al., 2009; Naglik et al., 2011). A interação de Hwp1p com as aglutininas Als1p e Alsp3p tem papel complementar na formação do biofilme in vitro e in vivo, o qual ocorre coagregação das células pela ligação Hwp1p- Als3p (Nobile et al., 2008).
sobre substrato de poliestireno e a segunda é responsável pela hidrofobicidade da parede celular da levedura conferida por proteína manosilada que medeia aderência as células do hospedeiro e superfícies inanimadas de forma inespecífica (de Souza et al., 2009; Klis et al., 2009; Ramage et al., 2009).
Outras proteínas da superfície da célula codificadas pelos
genes HYR1, ECE1, IFF4, MP65, PHR1 e HGC1 também estão
relacionadas à aderência as células do hospedeiro, porém suas funções exatas ainda não foram bem descritas (Wilson D et al., 2009; Naglik et al., 2011; Finkel, Mitchell, 2011). Vitkov et al. (2002) levantaram a hipótese de que a aderência às células do epitélio bucal também pode ser mediada por fímbrias, as quais estão integradas as adesinas. As fímbrias de C. albicans são compostas por 80-85% de carboidratos (D- manose) e 10-15% de proteínas.
A aderência é o primeiro passo para a formação do biofilme, o qual constitui importante fator de virulência de C. albicans, como demonstrado por Hasan et al. (2009) que mostraram que cepas com maior capacidade de formação de biofilme foram mais virulentas em candidose sistêmica induzida em camundongos, visto por mortalidade mais rápida (1-4 dias) que cepas com baixa formação de biofilme (8-10 dias).
susceptível por um processo chamado tigmotropismo, definido como um mecanismo de orientação da hifa por contato físico especialmente em superfície sólida e rígida (Jayatilake, 2011).
A filamentação é desencadeada pela expressão dos genes EFG1, TEC1, SUV3, CPH1, NUP85, e UME6, o qual o gene EFG1
também age como fator de transcrição para estes genes agindo na ativação e repressão (Ramage et al., 2009; Whiteway, Bachewich 2007). Foi demonstrado que o gene TPK2 também participa da extensão da pseudohifa (Giacometti et al., 2011). O gene EED1 expresso somente por
C. albicans e C. dubliniensis, mostrou-se necessário para formar hifa e manter esta morfologia impedindo que ocorra o processo reversível de transição hifa- levedura. Este gene também age como regulador positivo de ECE1, SOD5 e HYR1 (Martin et al., 2011). O transportador de sódio presente na membrana de C. albicans codificado pelo gene DUR31
também foi recentemente descrito mostrando ser importante para a alcalinização do meio extracelular que contribui para a autoindução de formação de hifas (Mayer et al., 2012a).
epiteliais bucais e enterócitos, mostrando que as Saps podem estar envolvidas na penetração ativa e indução de endocitose.
Embora sejam semelhantes, as Saps apresentam substratos diferentes e condições de expressão diferentes. Sap9p e Sap10p são constitutivamente expressas quebrando proteínas em aminoácidos básicos e dibásicos sem exclusividade (Schaller et al., 2005; Schild et al., 2011). Sap2p é expressa por C. albicans a 30-37 oC em meio
contendo proteínas como única fonte de nitrogênio, degradam extrato córneo humano, colágeno, laminina, fibronectina, mucina, proteínas de defesa como lactoferrina salivar, α-2-microglobulina, enzimas da explosão respiratória de macrófagos e quase todas as imunoglobulinas incluindo IgA secretora (Schaller et al., 2005). Sap1p e Sap3p são requeridas para a infecção na mucosa expressas somente por células opacas e Sap4p-6 para infecção sistêmica (Schaller et al., 2005; Albrachet et al., 2006). Os transcritos de Sap8p são mais expressos a 25 oC (Schaller et al., 2005).
Kuriyama et al. (2003) descreveram que cepas isoladas de lesões de candidoses foram mais proteolíticas que as cepas isoladas de indivíduos saudáveis, porém não houve diferença proteolítica entre as cepas isoladas de diferentes lesões (candidose pseudomembranosa, eritematosa crônicas e agudas e hiperplásica), destacando que as Saps constituem importante fator de virulência para casos de candidose bucal, sendo mais proteolíticas para cepas isoladas de lesões.
Além das fosfolipases, existem as lipases e esterases que hidrolisam ligações ester de mono, di e triacilgliceróis ou mesmo fosfolipídios. A lipase hidrolisa substratos insolúveis e a esterase age em substratos solúveis. Existem 10 genes para LIP responsáveis por codificar estas enzimas (Schaller et al., 2005).
Uma manoproteína denominada fator hemolítico participa da aquisição de ferro a partir de hemácias lisadas, permitindo o crescimento em soro do hospedeiro (Mishra et al., 2007). Outras enzimas com função de fosfatase ácida, trealose, glicoamilase, hialuronidase, condroitin sulfatase e metalopeptidases, são manoproteínas catalíticas que agem nos substratos do hospedeiro causando dano (Mishra et al., 2007).
2.4 Interação patógeno- hospedeiro
A aderência de C. albicans às células epiteliais é o primeiro passo crítico para o processo de infecção (Zhu, Filler, 2010; Naglik et al., 2011). As células epiteliais estão em constante contato com
induzida no início da infecção, nas primeiras 4 h (Dalle et al., 2010; Naglik et al., 2011).
são peptídios antimicrobianos capazes de limitar o super crescimento e colonização de Candida, cuja expressão pode ser inibida pela formação da hifa por mecanismos ainda não descritos (Lu et al., 2004). Sugere-se que o farnesol possa diminuir a proliferação e induzir apoptose em células epiteliais bucais (Alburquerque, Casadevall, 2012).
A ativação e dano nas células epiteliais e endoteliais é mediada pela capacidade de filamentação associada com a captura de nutrientes da célula hospedeira, como demonstrado por Citiulo et al. (2012). A hifa invasora de C. albicans é capaz de adquirir zinco dentro da célula endotelial através da secreção de um "zincoróforo" codificado pelo gene PRA1 que sequestra zinco da célula hospedeira e reassocia com a parede da hifa via co-expressão de um transportador de zinco, Zrt1 (Citiulo et al., 2012).
As citocinas e quimiocinas secretadas pelas células epiteliais recrutam neutrófilos, células dendríticas e células T. Os neutrófilos reconhecem C. albicans através de seus receptores CR3 e Fcγ e moderadamente através de receptores Toll-like (TLR). Neutrófilos fagocitam células opsonizadas, seguida de degranulação e morte e também através dos recém-descobertos Neutrophils Extracelular Traps
(NETs) que são formas especializadas de neutrófilos com fibras de cromatina cobertas com serina proteases, proteínas antimicrobianas e outros constituintes que capturam e matam C. albicans (Netea et al., 2008; Moyes, Naglik, 2011). Por outro lado, C. albicans produz enzimas como superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase, glutationa S- transferase e tioredoxina contra as espécies reativas de oxigênio produzidas por neutrófilos (Wilson D et al., 2009).
desnaturação proteica e agregação não específica, levando a morte celular. O estudo da cepa mutante hsp21Δ/Δ revelou sua importância na evasão do sistema imune, adaptação ao estresse térmico e oxidativo, bem como patogenicidade. As cepas mutantes foram mais suscetíveis à morte por neutrófilos, causaram menos danos às células epiteliais e endoteliais in vitro e foram significativamente menos patogênicas para o modelo de ovo embrionado de galinha e durante candidemia induzida em camundongo.
Os macrófagos reconhecem C. albicans opsonizada e não opsonizada por seus receptores TLR2, TLR4 e dectina-1 resultando em resposta inflamatória como secreção de TNFα, produção de superóxido e aumento da atividade fungicida (Filler, 2006). Gantner et al. (2005) observaram que o macrófago só se liga aos blastoconídeos e tubos germinativos, pois estas estruturas apresentam cicatriz de brotamento de nascimento expondo β-glucana que é então reconhecida pela dectina-1. Esta ligação resulta na produção de TNFα, ácido araquidônico e aumento da expressão de COX2 (Filler, 2006). TNFα é liberado no sítio de fagocitose estimulando a membrana a fazer fagocitose matando a célula por processos oxidativos e não- oxidativos (Netea et al., 2008). Macrófagos têm dificuldade em destruir blastoconídeos in vitro, pois estes inibem a fusão dos lisossomos aos fagossomos e também podem produzir hifas que penetram na membrana da célula matando o fagócito. Além disso, o aumento da expressão do gene SOD5 pelo fungo, que codifica uma superóxido dismutase extracelular, contra-ataca a queima oxidativa das células fagocíticas sobrevivendo ao ataque de monócitos, macrófagos e neutrófilos (Filler, 2006; Seider et al., 2010; Jacobsen et al., 2012).
sugeriu que seja possível que Hyr1p contribua para a resistência a morte por fagócitos prevenindo o contato com estas células ou interferindo nos mecanismos de morte oxidativos ou não- oxidativos. Por ser expresso na superfície das hifas e, então, exposto ao sistema imune, os autores também avaliaram seu potencial como candidato a vacina. A vacinação com Hyr1p recombinante significativamente protegeu camundongos contra candidose disseminada hematogenicamente e o tratamento com anti-rHyr1p policlonal aumentou a atividade dos neutrófilos de camundongos por agir diretamente neutralizando os efeitos in vitro de rHyr1p.
Além dos mecanismos celulares inatos de defesa, o hospedeiro também conta com a participação do sistema complemento para destruir C. albicans. O micro-organismo pode ativar as três vias do sistema complemento: via alternativa, via clássica e via da lectina, culminando com a deposição do fragmento C3b e formação do complexo de ataque à membrana (MAC). Em contrapartida, Gropp et al. (2009) relataram que Sap1p-3 degradaram os componentes C3b, C4b e C5, inibiram as vias alternativas e clássicas e consequentemente a formação do MAC, reduziram a deposição de C3b e geração de C5a. Além disso, também foi observado que a quebra do fragmento C3b ocorreu devido ao recrutamento do fator H e fator I fixados a superfície de C. albicans.
al., 2010; Naglik et al., 2011). Linfócitos Th1 protegem contra infecção bucal e gastrointestinal secretando IFN-γ e IL-2 que induzem a produção de óxido nítrico pelos macrófagos (Molero et al., 1998; Naglik et al., 2011). Linfócitos Th17 secretam IL-17A, IL-17F e IL-22 que estão associadas à defesa da mucosa contra candidose bucal. IL-17A e IL-17F agem sobre células epiteliais e neutrófilos induzindo a produção de peptídios antimicrobianos, metaloproteases e outros mediadores inflamatórios e
também podem aumentar ou diminuir a carga de C. albicans através de
várias vias e direcionar a resposta por IgA que inibe a aderência de C. albicans às células epiteliais, fazendo uma ponte entre as respostas adaptativas e inatas. IL-22 tem efeito similar a IL-17 sobre células epiteliais, mas também pode controlar o crescimento de leveduras e a integridade da camada epitelial durante a infecção (Naglik et al., 2011; Moyes, Naglik, 2011).
2.5 Modelos experimentais de candidose
Para compreensão da etiopatologia da candidose, controle da doença, desenvolvimento de novos antifúngicos e diagnósticos são requeridos estudos de interação patógeno - hospedeiro em modelos experimentais in vivo.
métodos histológicos, microscópicos, celular e molecular, relatando que houve formação de hifa e subsequente aderência ao epitélio nas primeiras 3 h. A invasão ocorreu nas próximas 12 h levando ao moderado dano tecidual e em 24 h foi observada destruição severa dos tecidos. Os autores também observaram que o gene EED1 ainda desconhecido foi superregulado na infecção em RHE, o qual foi essencial para a manutenção da extensão da hifa.
O uso de modelo mamífero, em particular camundongo, é considerado padrão ouro para o estudo da interação patógeno- hospedeiro (Jacobsen et al., 2011). Este animal apresenta como vantagens baixo custo, sistema imune mais semelhante ao do ser humano, é facilmente obtido em grande número, disponibilidade, existência de linhagens geneticamente modificadas, não possui Candida
spp. como constituinte da microbiota bucal e resposta imune secundária contra este organismo (Samaranayake YH, Samaranayake LP, 2001; Naglik et al., 2008). Concomitantemente, o rato também é um modelo útil para o estudo de candidose bucal experimental, apesar de poder apresentar leveduras do gênero Candida na cavidade bucal (Naglik et al., 2008). Porém para o estabelecimento de infecção persistente deve-se interferir na fisiologia dos animais provocando mudanças na ecologia da cavidade bucal com o uso de antibióticos e indução de sialoadenectomia para ratos e indução de imunossupressão para camundongos (Totti et al., 2004; Green et al., 2006; Junqueira et al., 2009; Costa et al., 2013b).
mediada por eritrosina e LED verde sobre a candidose bucal, obtendo redução da viabilidade das células e ausência de efeitos adversos sobre os tecidos. O modelo foi útil para análises de viabilidade das leveduras, análise macroscópica e histológica e microscopia eletrônica de varredura (MEV).
Hayama et al. (2012) utilizaram o mesmo modelo para avaliar a combinação do composto RC21v3, inibidor da bomba de efluxo Cdr1p, com fluconazol e itraconazol para tratamento de candidose bucal causada por cepa de C. albicans resistente aos azóis, demonstrando que houve efeito sinérgico entre o inibidor e os antifúngicos levando a redução das lesões macroscópicas e viabilidade das células.
A necessidade de estudar a patogenicidade de infecções fúngicas e testar novos compostos antifúngicos tem despertado o interesse por modelos de hospedeiros invertebrados, pois estes não necessitam de aprovação ética, são relativamente simples e baratos, podem ser usados em grande escala e apresentam correlação entre os fatores de virulência requeridos para causar doença em camundongos e matar Galleria mellonella, por exemplo, formando uma ponte entre estudos in vitro e em mamíferos (Mylonakis, 2008).
Borghi et al. (2014) avaliaram o potencial patogênico de cepas de C. albicans produtoras e não produtoras de biofilme no modelo invertebrado G. mellonella no estágio larval. Foi observado que a sobrevivência da larva foi dependente do número de células fúngicas injetadas, sendo a concentração de 105 unidades formadoras de colônias
(UFC)/ larva o resultado mais significativo. O grupo infectado por cepas produtoras de biofilme apresentaram significativa redução de
sobrevivência. Os autores confirmaram que o modelo de infecção em G.
Caenorhabiditis elegans é um verme de vida livre que
apresenta vantagens para o screening de novos compostos
antimicrobianos e simultânea avaliação de toxicidade (Okoli et al., 2009; Desalermos et al., 2012). Okoli et al. (2009) verificaram a sobrevivência de C. elegans infectado por C. albicans frente a 3228 compostos, dos quais 19 destes conferiram aumento da sobrevivência de C. elegans. Este teste também possibilitou a avaliação da toxicidade de diferentes concentrações dos compostos.
O uso de G. mellonella apresenta como vantagens em
relação ao C. elegans a indução de candidose usando concentração de
inoculo conhecida, pois para G. mellonella o inoculo é injetado e para C. elegans ele deve ser ingerido, incubação de 25-37 oC e fácil manutenção
em qualquer laboratório (Fuchs et al., 2010; Desalermo et al., 2012).
G. mellonella apresenta algumas desvantagens, pois em camundongo a infecção sistêmica leva a rápida indução de várias citocinas, infiltração neutrofílica nos órgãos afetados e finalmente choque séptico progressivo. Esta imunopatologia é a principal diferença entre modelos murinos e insetos, visto que os modelos de insetos produzem resposta imune defensiva à infecção por C. albicans baseadas em células fagocíticas e superregulação de peptídios antimicrobianos, mas não desenvolvem choque séptico (Jacobsen et al., 2011). Uma maneira possível de fazer uma ponte entre o hospedeiro invertebrado e mamífero é usar ovo embrionado de galinha como uma alternativa de modelo de infecção (Jacobsen et al., 2010). A diferença primordial entre o modelo mamífero e o ovo embrionado de galinha é que o primeiro é imunocompetente e o ovo pode ser considerado imunocomprometido, devido à incompleta maturação do sistema imune (Jacobsen et al., 2010, 2011).
ectoderma, mesoderma e endoderma (Jayatilake et al., 2010). Após a fertilização do ovo de galinha, os capilares aparecem dentro de 48 h e então ocorre o rápido crescimento do saco vitelínico nos próximos 6 - 8 dias. A MCA desenvolve-se nos primeiros 11 dias, representando a primeira metade do período de 21 dias do ovo de gestação, substituindo o saco vitelínico na realização das funções excretoras e respiratórias. Até 10 dias, o suprimento de oxigênio é feito quase que exclusivamente via MCA. As proteínas de coagulação do sangue, fibrinogênio e protrombina não aparecem até 12 ou 13 dias, moléculas do complemento e linfócitos verdadeiros não aparecem até o dia 17 e resposta de células T não ocorrem até o dia 20. A resposta inflamatória da MCA é limitada aos pseudoeosinófilos. Não existem células equivalentes ao macrófago humano ou linfócito ou anticorpos na MCA. Os ovos fertilizados com 7-10 dias são utilizados para os testes de patogenicidade, sendo que nesta fase apresentam sistema imune imaturo (Gow et al., 2003).
Gow et al. (2003) utilizaram o modelo de ovo embrionado de galinha para analisar a expressão de genes e patogenicidade. Os ovos foram inoculados com suspensão de C. albicans sobre MCA e também foi colocado um disco embebido com a suspensão. Para a cepa selvagem foi observada formação de tubo germinativo e leveduras após 2 h de inoculação na camada externa da MCA. As hifas penetraram a MCA e também os vasos sanguíneos, mas não foram encontradas no embrião. Os embriões morreram após 12-24 h quando inoculados com suspensões de 105 a 108 células/mL. Cem por cento dos ovos inoculados com 105
células/ mL de cepas mutantes efg1∆/cph1∆ sobreviveram após 24 h, enquanto que aqueles infectados com a cepa selvagem apresentaram taxa de sobrevivência de 50%. Os ovos infectados com cepas mutantes únicas para SAP1-3 e mutantes triplos para SAP1-3 e SAP4-6 na concentração de 107 células por ovo não apresentaram redução da taxa
de mortalidade. Foi observada expressão dos genes SAP1, SAP2, SAP4
patogênese da cepa, ou seja, o modelo não foi afetado. O modelo demonstrou ser útil para ser usado anteriormente aos testes de virulência em modelo murino ou como modelo alternativo.
O modelo de ovo embrionado de galinha também foi utilizado por Jacobsen et al. (2010) para avaliação de cepas de
Aspergillus fumigatus inoculados na MCA e intraperitoneal. Os ovos foram utilizados no tempo de desenvolvimento de 10 dias, pois são mais tolerantes a manipulação da casca. A dose de inoculo de conídeos de 104
a 107/ ovo foram 100% letais dentro de 2 a 4 dias. Na membrana foi
observado micélio a partir do dia 2 e esporulação a partir dos dias 4 e 6 de infecção, também foram observadas alterações nos vasos sanguíneos. O acúmulo de resposta imune local nos embriões nos estágios tardios do desenvolvimento coincidiu com a redução da mortalidade após infecção com A. fumigatus. Os autores ressaltaram que a inoculação na MCA apresenta vantagens como: característica translúcida consistindo em duas camadas epiteliais separadas por tecido conectivo frouxo, alta vascularização para mediar o transporte de oxigênio da albumina e saco vitelínico para o embrião e trocas gasosas durante os dois últimos terços de desenvolvimento, possibilidade de aplicação asséptica da solução e manipulação bem tolerada pelo embrião.
O mesmo grupo avaliou a patogenicidade de 15 cepas mutantes de C. albicans em ovo embrionado de galinha inoculadas na MCA, mostrando que 10 destas cepas apresentaram virulência atenuada para o modelo e induziram menos citocinas inflamatórias que a cepa selvagem. A dose letal100 (LD) para a cepa selvagem de C. albicans
SC5314 foi de 107 células/mL e a LD50 foi de 105 células/mL. Foi
para os órgãos internos foi rara, sugerindo que a imunopatologia seja responsável pela patogênese. O padrão de produção de citocinas foi semelhante ao modelo murino, exceto pelo efeito de IL-10 que apresentou efeito protetor no modelo de ovo embrionado. Além disso, foi observada presença de granuloma nas lesões, enquanto que no modelo murino a infecção por Candida leva a formação de abscessos, pois em aves a infecção é combatida por heterófilos (homólogo de neutrófilos nas aves) que são cercados por células epitelióides e fibroblastos, ao invés da infiltração de neutrófilos como ocorre para os mamíferos. Este modelo mostrou ser útil para o screening de virulência de cepas mutantes de C. albicans (Jacobsen et al., 2011).
3 PROPOSIÇÃO
Os objetivos deste trabalho foram:
a) analisar a função de 34 genes de C. albicans
com função desconhecida quanto à formação de biofilme;
b) selecionar 9 cepas mutantes que apresentaram fenótipo alterado para formação de biofilmes e construir as cepas complementadas para estes genes;
c) avaliar as cepas mutantes e complementadas na presença de agentes estressantes, crescimento sob limitação de nutrientes, ensaios de filamentação e interação com células epiteliais;
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Construção das cepas mutantes de Candida albicans
A cepa parental e as cepas mutantes foram cedidas pelo Prof. Dr. Bernhard Hube chefe do Departamento de Mecanismos de Patogenicidade Microbiana do Hans-Knöll-Institute (HKI) associado a Friedrich-Schiller-University (FSU), em Jena, Alemanha.
Figura 1- Esquema de construção das cepas mutantes. 1o passo: construção do cassete
ARG4 flanqueado por áreas de preservação permanente de 100 pares de bases homólogas a região alvo e transformação na cepa parental BWP17 auxotrófica para os genes ARG4, HIS1 e URA3 gerando o mutante heterozigoto. 2o passo: construção do
cassete HIS1 e transformação na cepa mutante heterozigota gerando a cepa mutante homozigota auxotrófica para o gene URA3. 3o passo: transformação da cepa mutante
Quadro 1- Cepas de C. albicans usadas no estudo. Cepas selvagem, parental e mutantes construídas e cedidas pelo Prof. Dr. Bernhard Hube e as cepas complementadas construídas neste estudo
(continua) Identificação
das cepas Genótipos Referências
SC5314 Cepa selvagem de C. albicans Gillium et al. (1984) BWP17 +
CIp30 arg4ura3::::hisG/arg4imm434/ura3 ::hisG his1:: imm434 ::hisG/his1::hisG + CIp30 Zakikhany et al. (2007) M1552 ++orf19.1150∆::ARG4/orf19.1150∆::HIS1 + CIp10
(URA3) Este estudo
M1490 orf19. 2204∆::ARG4/orf19. 2204∆::HIS1 + CIp10
(URA3) Este estudo
M1405 orf19.2959.1∆::ARG4 /orf19.2959.1∆::HIS1 + CIp10
(URA3) Este estudo
M1554
(mrv8Δ/Δ) orf19.3908∆::ARG4/orf19.3908∆::HIS1 + (URA3) CIp10 Este estudo
M1555
(mrv1Δ/Δ) orf19.4691∆::ARG4/orf19.4691∆::HIS1 + (URA3) CIp10 Este estudo
M1486 orf19. 4970∆::ARG4/orf19. 4970∆::HIS1 + CIp10
(URA3) Este estudo
M1556
(dot5Δ/Δ) orf19.5417∆::ARG4/orf19.5417∆::HIS1 + (URA3) CIp10 Este estudo
M1532
(bna4Δ/Δ) orf19.5443∆::ARG4/orf19.5443∆::HIS1 + (URA3) CIp10 Este estudo
M1558 orf19.5848∆::ARG4/orf19.5848∆::HIS1 + CIp10
(URA3) Este estudo
M1535 orf19.5857∆::ARG4/orf19.5857∆::HIS1 + CIp10
(URA3) Este estudo
M1493 orf19. 6492∆::ARG4/orf19.6492∆::HIS1 + CIp10
(URA3) Este estudo
M1544 orf19.6501∆::ARG4/orf19.6501∆::HIS1 + CIp10
(URA3) Este estudo
M1408
(dur31ΔΔ) orf19.6656∆::ARG4 /orf19.6656∆::HIS1 + (URA3) CIp10 Mayer et al. (2012a) M1557 orf19.6847∆::ARG4/orf19.6847∆::HIS1 + CIp10
(URA3) Este estudo
M1496 orf19.7170∆::ARG4/orf19.7170∆::HIS1 + CIp10
(URA3) Este estudo
M1393 orf19.7670∆::ARG4 /orf19.7670∆::HIS1 + CIp10
(URA3) Este estudo
M1402
