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ELLOOIIZZAA HHEELLEENNAA CCAAMMPPAANNAA
Freqüência de Enterobactérias Produtoras de β-Lactamases
AmpC Plasmidiais Isoladas em Infecção de Corrente
Sangüínea
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
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ELLOOIIZZAA HHEELLEENNAA CCAAMMPPAANNAA
Freqüência de Enterobactérias Produtoras de β-Lactamases AmpC Plasmidiais Isoladas em Infecção de Corrente Sangüínea
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Cristina Gales Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP
Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro fornecido pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (2006/58267-9 e 2008/10287-7).
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CAMPANA, Eloiza Helena
Frequência de Enterobactérias Produtoras de β-Lactamases AmpC Plasmidiais Isoladas em Infecção de Corrente Sangüínea - Eloiza Helena Campana - São Paulo, 2009.
xviii, 138f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia
Título em inglês: Frequency of Plasmid-mediated AmpC in Enterobacteriaceae isolated from Bloodstream Infections
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Angelo Amato Vicenzo de Paola
Coordenador do Curso de Pós-graduação:
Ricardo Sobieh Diaz
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iv
ELOIZA HELENA CAMPANA
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BANCA EXAMINADORA:
Titular: Profa. Dra.Elsa Mazae Mamizuka
Titular: Profa. Dra. Antonia Maria de Oliveira Machado Titular: Profa. Dra. Marinês Dalla Valle Martino
Suplente: Profa. Dra. Elizabeth de Andrade Marques
vi
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Dra. Ana Cristina Gales, muito obrigada pela excelente orientação, pelo apoio, pelos ensinamentos e paciência. Muito obrigado por ter confiado em mim, reconhecido minha dedicação e por me proporcionar várias oportunidades de crescimento profissional. Você é um exemplo de ética, caráter e dedicação.
À minha mãe Gilda e minha irmã Mayla, por todo amor, apoio e carinho inestimáveis. Obrigada por estarem sempre ao meu lado e me apoiarem incondicionalmente sempre.
Às queridas amigas e companheiras de laboratório Adriana Nicoletti, Lorena Fehlberg, Paula Peraro e Raquel Girardello, que me ajudaram muito na realização deste trabalho e o tornaram muito mais fácil e agradável. Obrigada pela amizade e carinho. Sem vocês não chegaria onde estou.
À Dra. Mariana Castanheira, que apesar do curto tempo de convivência me ensinou muito.
Ao Prof. Dr. Antônio Carlos Campos Pignatari meu respeito e admiração.
Às minhas grandes amigas Beatriz Balducci Coelho, Francielli M. Vasconcellos, Nancy R. Guetti e Sarita S. Rossato, pelo incondicional companheirismo, incentivo e por acreditar tanto na minha vitória.
Ao meu grande amigo e companheiro de laboratório Danilo E. Xavier, obrigado pela sua incrível personalidade, sinceridade e companheirismo. Você me proporcionou muitos momentos alegres.
vii
jamais esquecerei. Obrigada pela ajuda, conselhos, momentos de convívio e de descontração.
A todos os amigos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC), Adryella Luz, Alinne Guimarães, Amilton Mouro, André Doi, Andrea Pereira, Anna Carolina Rockskroh, Cynthea Zanetti, Fernanda Inoue, Fernanda Marques, Jéssica Sanches, Jussimara Monteiro, Karen Bauab, Kátia Kiyota, Kelly Santiago, Liana Carballo, Loren Paschoal, Maria Cecília Novella, Martha Rivero, Paulo Bispo, Roberto Chirotto, Rodrigo Cayô, Rosana Capecce, Soraya Sgambatti, Thaís Ávila, Thomas Chagas Neto, Vinicius Gomes e Marco Zonta por todo apoio, convivência e também pelas alegres conversas. Adoro todos vocês.
À minha amiga, vizinha, colega de laboratório e companheira de corrida Talita Trevizani por compartilhar todos os momentos de alegria e dificuldade, por toda a ajuda e pelo carinho e amizade.
Ao Ivo Marguti e toda a família Marguti por todos os momentos de convívio e todo carinho. Obrigada por dividirem comigo muitos momentos importantes nesses últimos anos.
Aos autores George A. Jacoby, Eva Tzelepi e Ronald N. Jones por terem fornecido as amostras controles utilizadas neste estudo.
A todas as pessoas que participaram direta ou indiretamente do meu trabalho, o meu muito obrigado.
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ix SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ... vi
ÍNDICE DE FIGURAS ... xiii
ÍNDICE DE TABELAS ... xiv
ÍNDICE DE QUADROS ... xv
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... xvi
RESUMO ... xviii
1 INTRODUÇÃO ... 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 5
2.1 β-Lactamases do Tipo AmpC ... 8
2.1.1 β-Lactamases do tipo AmpC, cujo genes codificadores são carregados por plasmídeos ... 11
CMY ... 14
MIR ... 17
MOX ... 17
LAT ... 18
FOX ... 18
DHA ... 19
x
ACC ... 20
CFE ... 21
Epidemiologia no Brasil ... 24
2.1.1.1 Localização e mobilização dos genes codificadores de pAmpC... 25
2.1.1.2 Detecção fenotípica e genotípica de β-lactamases do Tipo AmpC plasmidiais ... 26
3 OBJETIVOS ... 31
3.1 Objetivo principal ... 31
3.2 Objetivos secundários ... 31
4 MATERIAL E METÓDOS ... 32
4.1 Amostras bacterianas ... 32
4.2 Avaliação do perfil de sensibilidade in vitro aos antimicrobianos ... 32
4.3 Avaliação da freqüência de amostras produtoras de ESβL ... 34
4.3.1 Detecção fenotípica por disco aproximação ... 35
4.4 Avaliação da freqüência de amostras produtoras de pAmpC ... 36
4.4.1 Detecção fenotípica pelo Teste Tri-dimensional modificado ... 36
4.4.2 Detecção fenotípica pelo Teste de Hodge modificado ... 38
xi
4.4.3.1 Identificação dos genes por reação da polimerase em cadeia (PCR)
multiplex ... 40
4.4.3.2 Identificação dos genes por reação da polimerase em cadeia (PCR) ... 42
4.4.3.3 Reação de seqüenciamento e interpretação dos resultados ... 44
4.5 Análise da transferência dos genes codificadores de pAmpC ... 45
4.6 Avaliação da localização dos genes de pAmpC ... 45
5 RESULTADOS ... 48
5.1 Amostras bacterianas ... 48
5.2 Avaliação do perfil de sensibilidade in vitro aos antimicrobianos ... 48
5.3 Avaliação da freqüência de amostras produtoras de ESβL ... 52
5.3.1 Detecção fenotípica por disco aproximação ... 52
5.4 Avaliação da freqüência de amostras produtoras de pAmpC ... 55
5.4.1 Detecção fenotípica pelo Teste Tri-dimensional modificado ... 55
5.4.2 Detecção fenotípica pelo Teste de Hodge modificado ... 56
5.4.3 Confirmação da produção de β-lactamases pAmpC por métodos moleculares ... 58
xii
5.4.3.2 Identificação dos genes por reação da polimerase em cadeia (PCR)
... 59
5.4.3.3 Reação de seqüenciamento e interpretação dos resultados ... 60
5.5 Análise da transferência dos genes codificadores de pAmpC ... 60
5.6 Avaliação da localização dos genes de pAmpC ... 60
6 DISCUSSÃO ... 61
7 CONCLUSÕES ... 74
8 ANEXOS ... 76
9 REFERÊNCIAS ... 90
ABSTRACT ... 109
xiii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura química dos principais grupos de β-lactâmicos...6
Figura 2. Representação esquemática da interligação da via de indução das β-lactamases AmpC e a reciclagem da mureina...9
Figura 3. Representação esquemática da estrutura da enzima AmpC de E. coli ligada a uma molécula de ceftazidima...11
Figura 4. Placa modelo de disco aproximação utilizada para a detecção fenotípica da produção de ESβL...36
Figura 5. Placa modelo do teste tridimensional utilizada para a detecção fenotípica da produção de AmpC...38
Figura 6. Placa modelo do teste de Hodge utilizada para a detecção fenotípica da produção de AmpC...39
Figura 7. Porcentagem de sensibilidade das amostras de enterobactérias...50
Figura 8. Detecção fenotípica por disco aproximação para detecção de ESβL...53
Figura 9. Teste tri-dimensional...56
Figura 10. Teste de Hodge...57
Figura 11. PCR multiplex para detecção de pAmpC...58
xiv
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Cronologia da identificação e similaridade com a AmpC cromossomal das β-lactamases pAmpC...13
Tabela 2. Triagem para ESβL segundo o CLSI...34 Tabela 3. Iniciadores utilizados para amplificação dos genes codificadores de β-lactamases AmpC pela PCR multiplex...41
Tabela 4. Iniciadores utilizados para reações de PCR e sequenciamento neste estudo...43 Tabela 5. Distribuição dos isolados de acordo com a espécie...48
xv
ÍNDICE DE QUADROS
xvi
ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATCC - American Type Cuture Collection CIM - Concentração Inibitória Mínima
CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute DNA - Ácido desoxidoribonucléico
EDTA - Ácido Etileno-Diamino-Tetracético ESβL - Extended Spectrum β-Lactamase EUA – Estados Unidos da América
HSP - Hospital São Paulo IMP - Imipenemase
IRAS - Infecções Relacionadas à Assistência a Saúde IS - Insertion Sequence
ITU – Infecção do Trato Urinário
LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica MβL - Metalo-β-Lactamase
NNIS - National Nosocomial Infection Surveillance System OMP - Outer Membrane Protein
OXA - Oxacilinase
pAmpC – AmpC plasmidial PBP - Penicillin Binding Protein PCR - Polymerase Chain Reaction TBE - Tris-Borato-EDTA
xvii UFC - Unidade formadora de colônia
UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo UTI - Unidade de Terapia Intensiva
UV - Ultravioleta
xviii RESUMO
xix
classificadas fenotipicamente como produtoras de ESβL pela metodologia de disco aproximação. Foi observada discordância entre os resultados dos testes fenotípicos para detecção de pAmpC. A produção de pAmpC foi observada em seis isolados de acordo com o teste tri dimensional, enquanto, o método de Hodge modificado classificou 19 isolados como produtores de pAmpC. Além disso, resultados duvidosos foram observados em ambas as técnicas. Um único isolado de K. pneumoniae foi identificado como produtor de CMY-2. Este isolado foi corretamente
1 Introdução
1 INTRODUÇÃO
Bacilos Gram negativos pertencentes à família das enterobactérias são importantes causas de infecções do trato urinário, infecções de corrente sanguínea, pneumonias tanto comunitárias como hospitalares e várias infecções intra-abdominais (145). As cefalosporinas de amplo espectro, como ceftriaxona, ceftazidima e cefepima, são consideradas alternativas úteis para o tratamento das infecções causadas por bacilos Gram-negativos. No entanto, nos últimos anos o isolamento de bactérias Gram-negativas resistentes também a essas drogas tem se tornando mais comum (90). O aumento da prevalência de multirresistência entre os bacilos Gram negativos isolados no ambiente hospitalar é um problema que tem se mostrado cada vez mais freqüente em todo o mundo (51;161).
O mecanismo de resistência aos β-lactâmicos mais importante em bactérias Gram-negativas é a produção de lactamases. Nos anos 80, foram introduzidos β-lactâmicos com grande estabilidade frente a essas enzimas, tais como as cefalosporinas, os carbapenens e os monobactâmicos. Contudo, a utilização desses agentes favoreceu o surgimento e a seleção de bactérias resistentes produtoras de β-lactamases com maior espectro hidrolítico, as β-lactamases de espectro ampliado (ESβL) (150).
-2 Introdução
lactâmicos, como cefoxitina; as cefalosporinas de 1ª, 2ª e 3ª gerações; e aztreonam. Estas enzimas são fracamente inibidas pelos inibidores de β-lactamases disponíveis clinicamente. Entretanto, hidrolisam pobremente as cefalosporinas de quarta geração, como, cefepima e cefpiroma, e os carbapenens (86;139).
Os genes que codificam as cefalosporinases do tipo AmpC são constitutivamente encontrados no cromossomo de vários membros da família das enterobactérias, incluindo Enterobacter spp., Shigella spp., Providencia spp., Citrobacter freundii, Morganella morganii, Serratia marcescens e Escherichia coli. Na
maioria dessas espécies a expressão das AmpCs é induzível, exceto em E. coli e Shigella spp., nas quais a expressão ocorre em baixos níveis (47).
Na última década, houve um aumento nos relatos de enzimas derivadas dos genes AmpC cromossomais de microrganismos Gram-negativos, como C. freundii,
Enterobacter cloacae e Aeromonas spp. que foram mobilizados por plasmídios e
transferidos para cepas de enterobactérias naturalmente desprovidas de AmpC cromossomais, como Klebsiella pneumoniae e K. oxytoca, Salmonella spp. e
Proteus mirabillis (6;13;18;48;114;136;154). Algumas dessas enzimas também têm
sido encontradas em amostras de E. coli e Shigella spp. (31;78;82). Desde o primeiro relato de pAmpC, ocorrido em 1989, a partir de uma amostra de K. pneumoniae isolada na Coréia, essas enzimas vem sendo reportadas em todo o
mundo com uma freqüência cada vez maior (15).
3 Introdução
aminoglicosídeos, cloranfenicol, tetraciclina, trimetoprim e quinolonas (19;20;34;40;142). Além disso, isolados clínicos frequentemente produzem outras β-lactamases, como OXA e SHV (73;113), aumentando, assim, a dificuldade na detecção e tratamento de infecções causadas por essas bactérias. Alguns estudos sugerem, que a associação de pAmpC com perda de porinas determinam a resistência aos carbapenens (24;34;169).
A maioria das pAmpCs são expressas constitutivamente, entretanto, algumas pAmpCs carregam o gene regulador ampR assim como o gene ampC, por isso podem ser induzíveis. As enzimas DHA-1 e DHA-2, derivadas da AmpC cromossomal de M. morganii e ACT-1, derivada de E. cloacae, são exemplos de AmpCs plasmidiais induzíveis (13;61;158). Recentemente, foi descrita pela primeira vez uma pAmpC, denominada CMY-13, oriunda de C. freundii com um gene ampR. (122).
Embora existam vários relatos de surtos causados por organismos produtores de pAmpC, a descrição da epidemiologia e das características clínicas associadas a essas infecções ainda é escassa (139), principalmente no Brasil, onde até o momento há apenas dois relatos de isolados com cefalosporinases do tipo pAmpC. Os genes blaFOX-5 e blaCMY-2 foram detectados em isolados de E. coli em duas
regiões distintas do país (40;147).
4 Introdução
5 Revisão Bibliográfica
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Os β-lactâmicos representam a classe de antimicrobianos mais variada e amplamente utilizada na prática médica para o tratamento de infecções hospitalares e comunitárias causadas por bacilos Gram negativos (33). Os antibióticos deste grupo, que inclui as penicilinas, as cefalosporinas de 1ª, 2ª, 3ª e 4ª gerações, os monobactâmicos e os carbapenens, possuem em comum uma estrutura central contendo um anel β-lactâmico (Figura 1). A resistência a esses agentes dificulta o tratamento e aumenta a morbidade/mortalidade dos pacientes e os custos hospitalares (41). A resistência bacteriana aos β-lactâmicos pode ser devida à: I - produção de β-lactamases; II - falta e/ou expressão reduzida das proteínas de membrana externa ou pela hiperexpressão de bombas de efluxo; III - alteração do sítio alvo (PBPs) (10).
De modo geral, as β-lactamases são a principal causa de resistência bacteriana aos β-lactâmicos e tem sido objeto de extensas investigações microbiológicas, bioquímicas e genéticas (38).
6 Revisão Bibliográfica
Adaptado de Babic et al., 2006 (10)
Figura 1. Estrutura química dos principais grupos de β-lactâmicos.
Algumas β-lactamases utilizam íons de zinco (Zn2+) como cofatores enzimáticos, entretanto, a maioria das β-lactamases opera via produção de ésteres de serina (110). Por esta razão, de modo prático, as β-lactamases são classificadas como serino-β-lactamases e metalo-β-lactamases.
-7 Revisão Bibliográfica
lactamases pode estar localizado no DNA cromossômico ou extracromossômico, como plasmídios e transposons (110).
Diferentes tipos de β-lactamases já foram descritos e inúmeras tentativas de estabelecer um sistema de classificação para essas enzimas foram propostas ao longo dos anos. Atualmente, duas classificações têm sido consideradas como de maior importância: a de Ambler e a de Bush, Jacoby e Medeiros (7;38). A classificação proposta por Ambler em 1980 foi desenvolvida com base na estrutura molecular das β-lactamases, de acordo com a seqüência de aminoácidos que as constituiam. Somente quatro classes moleculares principais de β-lactamases foram descritas: A) ESβLs, penicilinases e carbenicilinases; B) metalo-β-lactamases (MβLs); C) cefalosporinases cromossomais e D) oxacilinases.
8 Revisão Bibliográfica
2.1 ββββ-Lactamases do Tipo AmpC
As β-lactamases do tipo AmpC pertencem ao grupo 1 de Bush (38) e à classe molecular C de Ambler (7), sendo encontradas tanto no cromossomo bacteriano como em plasmídeos. As enzimas cromossomais pertencentes a este grupo já foram descritas em uma variedade de microrganismos, principalmente nos membros do grupo CESP (C. freundii, Enterobacter spp., S. marcescens, Providencia stuartii,
Pseudomonas aeruginosa e M. morganii), podendo ser induzíveis ou não. Na
ausência de β-lactâmicos, AmpC é normalmente produzida em níveis basais, mas na presença de β-lactâmicos indutores, como, por exemplo, cefoxitina e imipenem, sua produção pode aumentar até 1000 vezes (90;150).
9 Revisão Bibliográfica
dos três fenótipos conhecidos (hiperinduzido, desreprimido, e parcialmente desreprimido), os quais estão associados com diferentes mutações ou, talvez, dependam da regulação de genes desconhecidos (168).
Adaptado de Jacoby et al., 1997 (83)
Figura 2. Representação esquemática da interligação da via de indução das β-lactamases AmpC e a reciclagem da mureina.
GluNac-1,6-10 Revisão Bibliográfica
anhMurNac-L-Ala–D-Glu-meso-Dap-D-Ala-D-Ala), um muropeptídeo periplasmático que é convertido em uma molécula sinalizadora citoplasmática para indução da β-lactamases AmpC (52). Sem o gene ampG, nem a indução e nem os altos níveis de expressão de β-lactamases seria possível (53;98).
A proteína AmpR atua como um ativador transcricional pela ligação na regiões do DNA localizada imediatamente à montante da região promotora do gene
ampC (83). Na ausência de um lactâmico indutor, AmpR reprime a síntese de
β-lactamases em 2,5 vezes, enquanto que a expressão é induzida de 10 a 200 vezes na presença do β-lactâmico indutor (106).
Tanto S. sonnei e E. coli carregam o gene ampC (23), mas o gene regulatório ampR está ausente nestas espécies. Assim o gene ampC é normalmente expresso
em baixas quantidades.
