SÍNTESE DE BIODIESEL A PARTIR DO FARELO
DE ARROZ
VIA
CATÁLISE ENZIMÁTICA
JOSÉ EVANDRO SARAIVA PEREIRA
QUÍMICO INDUSTRIAL E LICENCIADO EM QUÍMICA
DISSERTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM ENGENHARIA E TECNOLOGIA DE MATERIAIS
Porto Alegre
Agosto, 2013
FACULDADE DE ENGENHARIA
SÍNTESE DE BIODIESEL A PARTIR DO FARELO
DE ARROZ
VIA
CATÁLISE ENZIMÁTICA
JOSÉ EVANDRO SARAIVA PEREIRA
QUÍMICO INDUSTRIAL E LICENCIADO EM QUÍMICA
ORIENTADORA: PROF. Dra. ROSANE ANGÉLICA LIGABUE COORIENTADORA: PROF. Dra. JEANE ESTELA DE LIMA DULLIUS
Dissertação de Mestrado realizada no Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Tecnologia de Materiais (PGETEMA) da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Engenharia e Tecnologia de Materiais.
Porto Alegre
Agosto, 2013
FACULDADE DE ENGENHARIA
“Você só poderá crescer de verdade se estiver fora da sua zona de conforto. Para avançar até o máximo de seu potencial, é necessário que você viva o
limite das suas possibilidades”.
Primeiramente, agradeço a Deus por todas as minhas conquistas, minha família, amigos, trabalho e por não deixar-me nunca esmorecer diante das adversidades nesta caminhada.
Aos meus pais, Galvão e Marli, por terem me dado a vida, amor e carinho. Ensinado princípios e valores, assim como me mostrarem que a vida nos possibilita vários caminhos, e quem escolhe qual seguir, somos nós.
Agradeço à orientação da professora Rosane Ligabue e coorientação da professora Jeane Dullius, pelo incentivo, oportunidade de aprendizado pessoal e profissional, desde a graduação, passando pela iniciação científica e neste mestrado. A vocês, minha eterna gratidão e meu muito obrigado!
Agradeço, aos professores Tiziano Dalla Rosa, André Arigony, Luiz Ernani, Marcus Seferin e Carlos Carone, pela ajuda e ensinamentos no laboratório ou em sala de aula. Muito obrigado!
A todos os funcionários da Faculdade de Química (Almoxarifado: Luciane, Roberto, Marcos, Paulo e Fernando, Vidreiro: Nelson e Secretaria: Nilza, Neiva e Luciana) pela amizade e colaboração no desenvolvimento deste trabalho.
Ao meu grande amigo e colega Leonardo Moreira dos Santos, pela troca de conhecimentos.
Ao professor Rogério Lourega, Lia, Andressa e Flávio do Centro de Excelência em Pesquisa e Inovação em Petróleo, Recursos Minerais e Armazenamento de Carbono (CEPAC) da PUCRS.
Ao professor Carlos Alexandre, aos técnicos Sérgio Alegre e Mozart Macagnan do Laboratório de Metalurgia e Tratamento Térmico (LAMETT) da PUCRS.
Ao pessoal do Laboratório de Processos Ambientais (LAPA) da PUCRS, a doutoranda Aline e ao Prof. Eduardo Cassel.
Ao Centro de Microscopia e Microanálises (CEMM) da PUCRS e a professora Vanusca Dalosto da Universidade Feevale.
Ao professor Dr. João Feliz Duarte de Moraes de Bioestatística da Faculdade de Matemática da PUCRS.
A todos meus amigos e colegas do CSE - Ala “A”. Quero agradecer a estas pessoas que sempre me ajudaram e acreditaram em meu trabalho. Tatiane Pinheiro, Jair Cordeiro, João Fabian, Everson Costa, João Agnaldo, Rosane Bento e Thomas Marmett.
Aos funcionários do PGETEMA (Secretaria: Claudia e Viviane), FAQUI pela estrutura oferecida e a CAPES pela bolsa concedida.
D
EDICATÓRIA... 5
A
GRADECIMENTOS... 6
S
UMÁRIO... 8
L
ISTA DEF
IGURAS... 11
L
ISTA DET
ABELAS... 14
L
ISTA DES
ÍMBOLOS... 15
RESUMO ... 17
ABSTRACT ... 18
1.
INTRODUÇÃO ... 19
2.
OBJETIVOS ... 21
2.1. Objetivos Específicos ... 21
3.
REVISÃO
BIBLIOGRÁFICA ... 22
3.1. Aminoácidos ... 22
3.2. Enzimas ... 23
3.2.1. Sítio ativo das lipases ... 25
3.2.2. Especificidade das lipases ao substrato ... 27
3.3. Biotransformação ... 27
3.3.1. Biorefinaria ... 28
3.3.2. Produção de arroz ... 28
3.3.3. Farelo de Arroz ... 30
3.4. Reações catalisadas por lipases ... 32
3.4.1. Reação de hidrólise ... 32
3.4.2. Reação de transesterificação ... 32
3.4.3. Reação de esterificação ... 33
3.4.4. Mecanismo da reação de transesterificação na produção de biodiesel ... 34
3.4. Fatores que influenciam a atividade enzimática ... 35
3.5. Escolha da lipase ... 37
3.6. Substratos... 37
3.6.2. Álcool ... 38
3.7. Sistemas de solvente ... 41
3.7.1. Solvente orgânico ... 41
3.7.2. Co-solvente ... 43
3.7.3. Sistema isento de solvente ... 44
3.8. Relação entre solvente e álcool ... 45
3.9. Temperatura... 46
3.10. Influência da água ... 47
3.11. pH ... 48
3.12. Transferência de massa ... 49
3.13. Concentração do glicerol ... 50
3.14. Cinética enzimática ... 51
3.15. Aditivos ... 52
4.
MATERIAIS
E
MÉTODOS ... 53
4.1. Amostra ... 53
4.1.1. Análise da constituição do grão de arroz ... 53
4.1.2. Análise granulométrica ... 53
4.1.3. Teor de umidade ... 54
4.1.3.1.Análise gravimétrica ... 54
4.1.3.2.Análise termogravimétrica... 55
4.1.4. Teor de óleo no farelo de arroz ... 55
4.2. Caracterização microestrutural e química ... 55
4.2.1. Microscopia eletrônica de varredura e ótica ... 55
4.2.2. Espectrometria de emissão ótica com plasma indutivamente acoplado ... 56
4.2.3. Avaliação da atividade enzimática em função da hidrólise dos triglicerídeos ... 57
4.2.3.1.Cinética da reação de formação dos AGL via catálise enzimática .. 58
4.2.3.2.Análise estatística ... 58
4.2.4. Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier ... 58
4.3. Catálise enzimática no farelo de arroz ... 59
4.3.1. Efeito da relação solvente e álcool na catálise enzimática ... 59
4.3.3. Influência do pH na síntese do biodiesel a partir do óleo bruto extraído do
farelo de arroz ... 60
4.3.4. Etapa de purificação dos ésteres metílicos ... 60
4.4. Caracterização por cromatografia gasosa ... 61
4.4.1. Fator de resposta relativo ... 61
4.4.2. Quantificação do biodiesel ... 62
5.
RESULTADOS
E
DISCUSSÕES ... 64
5.1. Constituição do grão de arroz... 64
5.2. Análises granulométrica, gravimétrica e termogravimétrica ... 65
5.3. Análise termogravimétrica ... 66
5.4. Teor de óleo ... 68
5.5. Microscopia eletrônica de varredura ... 69
5.6. Espectrometria de emissão ótica com plasma indutivamente acoplado .... 70
5.7. Espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier ... 72
5.8. Atividade enzimática da lipase no farelo de arroz ... 75
5.9. Cinética da reação de formação de AGL e análise estatística ... 77
5.10. Determinação do fator de resposta relativo ... 78
5.11. Efeito do solvente versus álcool na conversão do óleo presente no farelo de arroz em ésteres... 80
5.12. Efeito do metóxido de potássio na síntese do biodiesel do óleo presente no farelo de arroz em ésteres ... 82
5.13. Efeito do metóxido de potássio na síntese do biodiesel do óleo bruto extraído do farelo de arroz em ésteres ... 84
6.
CONCLUSÕES ... 87
7.
PROPOSTAS
PARA
TRABALHOS
FUTUROS ... 90
8.
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS ... 91
Figura 3.1. Sequência de quatro resíduos de aminoácidos Met, Asp, Leu e Tyr formando uma cadeia polipeptídica. ... 23
Figura 3.2. Estrutura cristalográfica da enzima lipase Candida antarctica B. ... 24
Figura 3.3. Representação esquemática de uma sequência de aminoácidos (Ser, Arg, Gly, Glu, Thr e Ser) formando o sítio ativo de uma enzima, que estabelece ligações de hidrogênio e iônicas com a molécula de monofosfato cíclico de adenosina. ... 25
Figura 3.4. Produção global de arroz com casca (colunas verdes) e área ocupada (linha vermelha). ... 29
Figura 3.5. Representação esquemática da constituição do grão de arroz. ... 30
Figura 3.6. Percentual de AGL versus tempo de armazenamento do farelo de arroz nas temperaturas de 5, 30, 50 e 70ºC. Percentual de AGL inicial 6,6% e teor de umidade de 10,3% em peso. ... 31
Figura 3.7. Representação esquemática da reação de hidrólise catalisada através da
lipase. ... 32
Figura 3.8. Representação esquemática de duas das reações catalisadas pelas
lipases: (a) transesterificação e (b) esterificação. ... 33
Figura 3.9. Mecanismo da reação de transesterificação de triglicerídeos via catálise enzimática. ... 35
Figura 3.10. Fluxograma dos parâmetros reacionais que influenciam a atividade enzimática na síntese do biodiesel. ... 36
Figura 3.11. Influência da razão molar (metanol:óleo) na conversão dos triglicerídeos em biodiesel. ... 40
Figura 3.12. Influência da razão molar álcool:óleo na transesterificação do óleo de soja. Novozym 435 (-■- metanol), Lipozyme TL-IM (-o- etanol) e Lipozyme RM-IM (-▲- butanol), 30°C, 15% de enzima, 4% de água e 6 h de reação. ... 40
Figura 3.14. Influência do solvente orgânico na conversão do óleo de girassol por transesterificação via rota metílica usando lipases imobilizadas (RM -
Rhizomucor miehei; TL - Thermomyces lanuginosa; AK - Pseudomonas fluorescens). ... 42
Figura 3.15. Comparação do percentual de conversão para as diferentes matérias-primas através do uso de solvente orgânico puro e co-solvente. ... 44
Figura 3.16. Reação de transesterificação mostrando os resuntados dos sistemas: isento de solvente e com o solvente t-butanol. ... 45
Figura 3.17. Representação esquemática: (a) sistena isento de solvente e (b) com solvente orgânico. ... 46
Figura 3.18. Influência da temperatura na metanólise do óleo de colza. ... 47
Figura 3.19. Influência do percentual de água na metanólise do óleo de farelo de arroz. ... 48
Figura 3.20. Efeito do pH na atividade enzimática da lipase do farelo de arroz. ... 49
Figura 3.21. Influência da velocidade de agitação do sistema reacional na conversão dos ésteres metílicos. Condições de reação: razão molar de 4:1 de metanol para o óleo, 4% de Novozyme 435, 40°C, 12 h de reação. .... 50
Figura 3.22. Visualização do glicerol na etanólise de óleo de colza, catalisada por diferentes lipases imobilizadas: (a) Lipozyme TL-IM, (b) Novozyme 435 e (c) Lipozyme TL-HC. ... 51
Figura 5.1. Resultado das imagens do grão de arroz (Oryza sativa) mostrando suas principais constituições: (a) fotografia do grão de arroz com casca e sem casca em escala de 0,5 mm e (b) micrografia da secção longitudinal do grão de arroz com casca. ... 64
Figura 5.2. Curvas TG das faixas granulométricas 20-32, 32-35, 35-60, 60-100 mesh e do farelo de arroz bruto. ... 67
Figura 5.3. Resultados da extração do óleo em base seca para as granulometrias de 20-32, 32-35, 35-60 e 60-100 mesh. ... 68
Figura 5.4. Resultados da extração do óleo do farelo bruto e para as granulometrias de 20-100, 32-100, 20-32, 32-35, 35-60 e 60-100 mesh em base úmida (10,5%). ... 69
Figura 5.6. Espectros de FTIR sobrepostos do (a) óleo do farelo de arroz refinado e (b) do óleo extraído do farelo de arroz bruto na região de número de onda de 1816-1658 cm-1. ... 73
Figura 5.7. Espectros de FTIR sobrepostos do óleo extraído das faixas granulométricas e farelo de arroz bruto obtidos após o polimento do grão de arroz na região de número de onda de 1823-1622 cm-1. ... 73
Figura 5.8. Espectros de FTIR sobrepostos do óleo extraído das faixas granulométricas e farelo de arroz bruto obtidos após dez semanas de estocagem na região de número de onda de 1812-1611 cm-1. ... 74
Figura 5.9. Percentual de AGL nas diversas granulometrais e farelo de arroz bruto em função do tempo de armazenamento na temperatura de 35ºC. ... 76
Figura 5.10. Curva ln[AGL]/[AGL]0 versus tempo (dia) da hidrólise dos triglicerídeos
do óleo extraído do farelo de arroz através da atividade enzimática nas diversas granulometrias e farelo de arroz bruto de 35ºC. ... 77
Figura 5.11. Perfil cromatográfico da mistura dos substratos (C16:0, C18:1 e C18:2) e do PI utilizados na obtenção do FRR, na faixa de (tr) de 6 a 15 min, do
total de 22,75 min de análise. ... 79
Figura 5.12. Determinação experimental do FRR de cada um dos substratos (C16:0, C18:1 e C18:2) em comparação com do PI. ... 79
Figura 5.14. Influência do MeOK: (a) pH do meio reacional medido antes e 0, 12 e 24 h e (b) conversão do substrato (óleo) presente no farelo de arroz em biodiesel. Razão molar 8:1 metanol:óleo, 12:1 hexano:metanol, KOH (1, 1,5 e 2% m/m). Temperatura de 35ºC, tempo de reação de 24 h, agitação mecânica de 180 rpm e as respectivas soluções de MeOK foram adicionadas em duas etapas (0 e 12 h) conforme o iten 4.3.2. ... 83
Tabela 3.1. Composição de aminoácidos e massa molecular da lipase do farelo de arroz. ... 26
Tabela 3.2. Valores médios dos percentuais e produtividade de óleo de oleaginosas. ... 38
Tabela 4.1. Parâmetros de operação para as análises por ICP-OES. ... 56
Tabela 5.1. Constituição do grão de arroz (Oryza sativa) obtido experimentalmente (base seca). ... 65
Tabela 5.2. Resultados das análises granulométrica, gravimétrica e termogravimétrica na caracterização do farelo de arroz. ... 66
Tabela 5.3. Resultados da quantificação dos elementos metálicos presentes no farelo de arroz. ... 70
Abreviações
AGL Ácido graxo livre
[AGL] Concentração de ácido graxo livre ANOVA Análise de Variância
ATR Refletância total atenuada, do inglês - Attenuated Total Reflectance
B5 % de Biodiesel misturado ao diesel de petróleo CONAB Companhia Nacional de Abastecimento
DTG Térmogravimétrica Derivada, do inglês –Differential Thermogravimetric
EDS Espectroscopia de Energia Dispersiva por Raios-X, do inglês - Energy Dispersive X-Ray Spectrometer
FID Detector por Ionização de Chama, do inglês –Flame Ionization Detector
FRR Fator de resposta relativo
FTIR Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier, do inglês – Fourier Transform Infrared Spectroscopy
GC Cromatografia em fase gasosa, do inglês –Gas Chromatography
IA Índice de acidez IC Intervalo de confiança
ICP-OES Espectrometria de emissão ótica com plasma indutivamente acoplado, do inglês –Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectrometry
k Constante cinética KOH Hidróxido de potássio MeOK Metóxido de potássio
Mesh Tamanho; mesh (número de abertura por polegada linear em uma tela)
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura, do inglês - Scanning Electron Microscopy
MO Microscopia Ótica
PPL Lipase, Porcine pancreas
Si Substratos
sn Número específico, do inglês– specific number
TGA Análise Termogravimétrica, do inglês –Thermogravimetric Analysis
Unidades
ºC Graus Celsius
g Grama
h Hora
kg Quilograma
L Litro
m/m Razão massa/massa
mg Miligrama
mL Mililitro
mm Milimetro
mol Quantidade de matéria ppm Partes por milhão rpm Rotações por minuto tr Tempo de retenção
µm Micrometro
PEREIRA, José Evandro Saraiva. Síntese de biodiesel a partir do farelo de arroz via catálise enzimática. Porto Alegre. 2013. Dissertação. Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Tecnologia de Materiais, PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL.
Avanços tecnológicos que possibilitem reduzir os custos do processo de produção de biodiesel praticados hoje em dia são necessários, para torná-lo mais competitivo frente aos combustíveis fósseis. Neste contexto, o presente trabalho estudou a síntese de biodiesel via catálise enzimática utilizando o farelo de arroz e o óleo bruto extraído deste através da biotransformação do óleo no farelo de arroz e utilizando a lipase presente nesta matéria-prima como biocatalisador. Ao se usar as razões molares de 8:1 de metanol:óleo e 12:1 de hexano:metanol, 35ºC, 180 rpm, 10,5% de umidade, 25 g de farelo de arroz, durante 24 h de reação com adição de metanol em duas etapas foi alcançado 5,7% de conversão em ésteres metílicos. Este resultado demonstrou que o solvente orgânico hidrofóbico com log P > 3 auxiliou a catálise enzimática quando comparado com um solvente polar (acetronitrila/t-butanol/metanol). O ajuste de pH do meio com a adição de metóxido de potássio (1% m/m KOH/óleo), nas mesmas condições reacionais, aumentou em 2,2 vezes a conversão em ésteres metílicos (12,9%). A adição de maiores concentrações de metóxido de potássio (1,5 e 2% m/m) manteve o pH ≈ 7, mas não teve efeito na conversão em ésteres metílicos, ao contrário promoveu uma redução para 10,7% e 7,1%, respectivamente. A catálise enzimática realizada sobre o óleo bruto extraído do farelo de arroz nas razões molares de 3:1 de metanol:óleo e 3:1 de hexano:metanol utilizando a lipase Porcine pancreas, mantendo-se constante os outros parâmetros reacionais, levou a uma conversão de 72,1% em ésteres metílicos. Este trabalho mostrou que, em condições adequadas, a enzima lipase
está mais protegida da toxidade do metanol, ao mesmo tempo em que melhora a solubilidade deste álcool no óleo promovendo assim a síntese de biodiesel a partir do farelo de arroz.
ABSTRACT
PEREIRA, José Evandro Saraiva. Synthesis of biodiesel from rice bran via enzymatic catalysis. Porto Alegre. 2013. Master. Graduation Program in Materials Engineering and Technology, PONTIFICAL CATHOLIC UNIVERSITY OF RIO GRANDE DO SUL.
Technological advances that allow reducing the biodiesel production process costs practiced today, are needed to make it more competitive against fossil fuels costs. In this context, the present work studied two methods for the synthesis of biodiesel via enzymatic catalysis using rice bran and the crude oil extracted from it, through the biotransformation of oil in the rice bran and using the lipase found in raw material as biocatalyst. When it was used the molar ratios of methanol:oil 8:1 and hexane:methanol 12:1, 35°C, 180 rpm, 10.5% moisture, 25 g of rice bran for 24 h the reaction with the addition of methanol in two steps has been reached 5.7% conversion to methyl esters. This result demonstrated that the hydrophobic organic solvent with log P > 3 assisted enzymatic catalysis when compared polar solvent (acetronitrile/t-butanol/methanol). The pH adjustment of the medium with the addition of potassium methoxide (1% w/w KOH/oil) under the same reaction conditions increased in 2.2 times conversion to methyl esters (12.9%). The addition of higher
concentrations of potassium methoxide (1.5 and 2% w/w) kept the pH ≈ 7, but had
no effect on the conversion to methyl esters, unlike promoted a decrease to 10.7% and 7.1%, respectively. The enzymatic catalysis performed on the crude oil extracted from rice bran with molar ratios of methanol:oil 3:1 and hexane:methanol 3:1 using
Porcine pancreatic lipase keeping constant the other reaction parameters, led to a 72.1% of conversion to methyl esters. This work showed that, under suitable conditions, the enzyme lipase is more protected from methanol toxicity, while it improves the solubility of the alcohol in the oil thereby promoting the synthesis of biodiesel from rice bran.
1. INTRODUÇÃO
Quatro décadas atrás uma frase bastante irônica, mas muito intrigante e de certo modo utópica, foi proferida pelo Sheikh Zaki Yamani, na época ministro do petróleo da Arábia Saldita durante o primeiro (1973) e o segundo (1979) choques do petróleo de que “a idade da pedra não acabou por falta de pedra, assim como a era do petróleo não irá acabar por falta de petróleo” (TFE, 2012). Fazendo alusão da necessidade de obter novas fontes de energia renováveis (mais eficiente, segura e menos prejudicial ao meio ambiente) incorporando-as à matriz energética, e assim, tornando-nos menos dependentes dos combustíveis fósseis (Pires, 2012).
Assim, o interesse por novas fontes de energia, em especial a produção de biocombustíveis líquidos, tem aumentado em todo o mundo como parte de políticas governamentais para enfrentar a crescente escassez de petróleo, assim como, desenvolver novas tecnologias para a obtenção de energia de fontes renováveis para suprir a demanda e auxiliar na mitigação das mudanças climáticas (Solomon, 2010). Segundo consta no boletim mensal dos combustíveis renováveis do Ministério de Minas e Energia, o Brasil encerrou o ano de 2012 com produção de 2,7 bilhões de litros de biodiesel (MME, 2013). Devido à crescente demanda do mercado interno de combustíveis, a previsão é de 2,8 bilhões de litros até 2013, garantindo assim, a mistura de 5% (B5) ao diesel de petróleo (Goes et al., 2013).
modificações nas estruturas químicas destes por intermédio de biocatalisadores (enzimas) (Castro et al., 2004).
Uma fonte de óleo (triglicerídeos) de baixo custo é o farelo de arroz, subproduto do beneficiamento do arroz. No farelo de arroz também, encontra-se a enzima lípase, um biocatalisador capaz de transformar o óleo, com a adição de álcool de cadeia curta (metanol ou etanol), favorecendo a catálise enzimática, obtendo assim biodiesel (Paucar-Menacho et al., 2007; Lai et al., 2005; Ju e Vali, 2005; Lin et al., 2008).
A Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB) informou em seu oitavo levantamento-maio/2013, que a produção de arroz da safra 2011/12 foi de 11,6 milhões de toneladas. A região Sul do país produziu 8,9 milhões de toneladas, representando 77,5% da produção nacional de arroz. Somente o Rio Grande do Sul (RS) contribuiu com 86,1% (7,7 milhões de toneladas) (CONAB, 2013). Nesse ano o RS obteve 650,1 mil toneladas de farelo de arroz, com a capacidade de fornecer 160,5 mil toneladas de óleo. Se, este óleo fosse transformado em biodiesel, equivaleria aproximadamente a 6,4% da demanda de biodiesel de 2012.
As vantagens da catálise enzimática sobre os catalisadores tradicionais é que as enzimas são reutilizáveis e potencialmente mais compatíveis com as variações na qualidade da matéria-prima. São capazes de produzir biodiesel em menos etapas de processo usando menos energia e com uma drástica redução na quantidade de águas residuais para o processo de purificação. Também, é capaz de melhorar a separação do produto (biodiesel) para se obter uma melhor qualidade de glicerol. E, a principal vantagem é que a lipase esta disponível nesta matéria-prima (farelo de arroz) com custo praticamente zero, o que se torna atrativo para a atividade industrial (Fjerbaek et al., 2009; Paucar-Menacho et al., 2007).
2. OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho foi à síntese de biodiesel via catálise enzimática a partir do farelo de arroz oriundo dos engenhos de beneficiamento do arroz.
2.1. Objetivos Específicos
● Caracterizar a matéria-prima (farelo de arroz) segundo o seu percentual na constituição do grão de arroz, sua distribuição granulométrica, o teor óleo e umidade e concentração de metais;
● Avaliar a atividade enzimática da lipase em função da hidrólise dos triglicerídeos através da quantificação dos ácidos graxos livres no óleo presente no farelo de arroz em função do tempo;
● Avaliar os parâmetros: razões molares óleo:álcool e solvente:álcool e pH nas sínteses de biodiesel a partir de farelo de arroz e do óleo bruto extraído do farelo de arroz;
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Aminoácidos
As proteínas são polímeros ou macromoléculas de aminoácidos contendo de centenas a vários milhares de aminoácidos em sequência. Isto ocorre devido à reação de condensação, resultando em ligações covalentes simples que são formadas entre dois aminoácidos através das extremidades do grupo amino (grupo
N-terminal) e do grupo carboxílico (grupo C-terminal) de cada aminoácido, tendo como subproduto a formação de água. Esta ligação covalente simples recebe o nome de ligação peptídica (Manahan, 2012). E a cadeia formada por várias ligações peptídicas é denominada de cadeia polipeptídica ou esqueleto polipeptídico. A Figura 3.1 apresenta uma pequena sequência de uma proteína estabelecida por quatro resíduos de aminoácidos como a metionina (Met), ácido aspártico (Asp), leucina (Leu) e tirosina (Tyr), formando uma cadeia polipeptídica.
Figura 3.1. Sequência de quatro resíduos de aminoácidos Met, Asp, Leu e Tyr formando uma cadeia polipeptídica.
Fonte: Adaptação de Alberts et al., 1999.
3.2. Enzimas
Quase todas as enzimas são proteínas globulares que variam em tamanho, forma e complexidade. Proteínas globulares são relativamente esféricas, como o nome implica (Matthews, 2001; Manahan, 2012; Karshikoff, 2012).
Figura 3.2. Estrutura cristalográfica da enzima lipase Candida antarctica B.
Fonte: Adaptação de Monhemi et al., 2012.
A catálise de uma reação enzimática não ocorre em um local aleatório qualquer sobre a superfície da enzima, mas sim em uma região muito específica (fenda ou cavidade) denominada de sítio ativo. Todos os sítios ativos apresentam propriedades em comum. Por exemplo, aminoácidos com cadeias laterais importantes que formam interações não covalentes específicas com o substrato e serve como pontos de ancoragem para manter o substrato ligado ao sítio ativo, o que possibilita novas reações químicas (novas ligações covalentes). As interações não covalentes como ligações iônicas e de hidrogênio são estabelecidas no momento que o substrato é ancorado ao sítio ativo da enzima. Entretanto, estas interações apresentam elevada especificidade, consequentemente apenas uma ou um conjunto de moléculas específicas podem ser considerados substratos (Alberts
et al., 1999; Aehle et al., 2008).
estabelece ligações de hidrogênio e iônicas com a molécula de monofosfato cíclico de adenosina (Alberts et al., 1999; Aehle et al., 2008).
Figura 3.3. Representação esquemática de uma sequência de aminoácidos (Ser, Arg, Gly, Glu, Thr e Ser) formando o sítio ativo de uma enzima, que estabelece ligações de hidrogênio e iônicas com a
molécula de monofosfato cíclico de adenosina.
Fonte: Adaptação de Alberts et al., 1999.
3.2.1. Sítio ativo das lipases
As lipases são enzimas que têm a capacidade de realizar o rompimento (hidrólise) das ligações éster, tais como os triglicerídeos e ésteres de ácidos graxos. Todos os membros da família das lipases conservam o resíduo de aminoácido (Ser) no sítio ativo, que é nucleófilo essencial para a catálise. Estas enzimas são denominadas proteases serina (Al-Zuhair et al. 2007; Schmid e Verger, 1998). A tríade do sítio ativo das lipases consiste dos resíduos de aminoácido serina (Ser), histidina (His) e ácido aspártico (Asp) ou ácido glutâmico (Glu). O arranjo espacial da citada tríade é muito semelhante à tríade clássica da lipase esterase (Raghavendra et al., 2008; Bhardwaj et al., 2001).
quais os resíduos de aminoácidos fazem parte da estrutura tridimensional, quantidade de aminoácidos e peso molecular da lipase. Este estudo possibilitou confirmar a presença da tríade de aminoácidos (Serina, Histidina e os Ácidos aspártico ou glutâmico) que fazem parte do sítio ativo desta lipase.
Tabela 3.1. Composição de aminoácidos e massa molecular da lipase do farelo de arroz.
Aminoácidos Aminoácidos (µg/1,362mg de proteína) Massa molecular mínimo
Número de resíduos Massa molecular calculado Calculado Integral
Lisina (Lys) 39,735 4393,6 8,8 9 39541
Histidina (His)* 19,325 9665,9 4,0 4 38664
Arginina (Arg) 59,614 3568,6 10,8 11 39255
Ácido aspártico (Asp)* 135,925 1153,2 33,5 34 39209
Ácido glutâmico (Glu)* 102,607 1714,0 22,6 23 39422
Glicina (Gly) 87,635 886,7 43,6 44 39015
Alanina (Ala) 86,482 1119,5 34,5 35 39118
Valina (Val) 54,425 2415,2 16,0 16 38643
Leucina (Leu) 47,377 3253,2 11,8 12 39038
Isoleucina (Ile) 28,064 5492,0 7,0 7 38444
Prolina (Pro) 61,962 2134,8 18,1 18 38426
Serina (Ser)* 89,693 1322,3 29,3 29 38347
Treonina (Thr) 60,867 2262,7 17,1 17 38466
Cistina (-S-S-)(a) 55,648 5440,7 7,1 7 38085
Metionina (Met) 19,155 9328,9 4,1 4 37316
Tirosina (Tyr) 95,786 2320,3 16,7 17 39445
Fenilalanina (Phe) 82,432 2431,8 15,9 16 38909
Triptofano (Trp) 61,079 4152,5 9,3 9 37370
Total: 312 Média: 38706
(a) Molécula resultante das ligações de dissulfeto entre os resíduos de cisteína; (*) Tríade do sítio ativo da lipase.
Fonte: Adaptação de Aizono et al., 1971.
3.2.2. Especificidade das lipases ao substrato
Lipases de diferentes origens apresentam diferentes especificidades quanto aos substratos, pois tem a capacidade de distinguir características estruturais do grupo acil, tais como o número de carbonos da cadeia, posição ou configuração das ligações, presença de ramificações, bem como, a fonte do carbono da carbonila (ácidos graxos livres, ésteres graxos e acilgliceróis) (Antczak et al., 2009).
Estas enzimas podem diferir consideravelmente quanto ao número específico (do inglês, specific number - sn) da posição do grupo acil no acilglicerol. E em termos de substrato-enzima, a atividade das lipases pode ser caracterizada em: tiposeletividade (capacidade de hidrolisar um tipo particular de éster de ácidos graxos); regioseletividade (capacidade para hidrolisar os grupos de éster sn-1 e sn-3 posições em relação a posição sn-2 do triglicerídeo) e estereosseletividade (capacidade para diferenciar entre dois enantiômeros em um substrato racêmico) (Muralidhar et al., 2002; Zarevucka et al., 2005; Pilarek e Szewczyk, 2007).
Lipases são classificadas em três grupos, pois tem a capacidade de realizar a reação de hidrolise nas ligações éster dos triglicerídeos nas posições: sn -1,3-específicos (posições R1 ou R3), sn-2-específico (posição R2) e aleatória, que atuam em todas as três posições (Tongboriboon et al., 2010; Stransky et al., 2007; Schmid e Verger, 1998).
3.3. Biotransformação
3.3.1. Biorefinaria
A biotransformação de óleos e gorduras é um exemplo de biorefinaria que
tem como definição: “Biorefinaria é o processamento sustentável de biomassa em um espectro de produtos comercializáveis (alimentos, materiais e produtos químicos) e de energia (combustíveis, energia e calor)". A biorrefinaria pode consistir em uma única unidade ou ser formada por um conjunto de instalações simples que processam os subprodutos ou resíduos de instalações vizinhas (Jong e Ree, 2012; IEA, 2012).
Potencialmente, as biorrefinarias podem fazer uso de uma ampla variedade de fontes de biomassa. As biorrefinarias contribuem para o uso sustentável e eficiente dos recursos da biomassa, fornecendo uma variedade de produtos para diferentes mercados e setores. Elas também têm o potencial de reduzir os conflitos de terra e competição pela matéria-prima (IEA, 2012).
Neste contexto, em particular a cultura do arroz propicia que além da obtenção do produto principal (arroz integral, branco e/ou parabolizado) possa também, obter através de processos biotecnológicos outros produtos comercializáveis, tendo como matéria-prima os subprodutos do beneficiamento do arroz, como a casca e o farelo de arroz.
3.3.2. Produção de arroz
Em 2012, a área do planeta ocupada para o seu cultivo foi de aproximadamente de 162,5 milhões de hectares tendo uma produtividade mundial de 724,5 milhões de toneladas de arroz com casca. As perspectivas para a safra de 2013 são de 746,7 milhões de toneladas, o que representa 2,9 por cento acima da produção de 2012 (Figura 3.4) (FAO, 2013).
Figura 3.4. Produção global de arroz com casca (colunas verdes) e área ocupada (linha vermelha).
Fonte: Adaptação de FAO, 2013.
No Brasil, a CONAB, ao realizar o oitavo levantamento de grãos em maio de 2013, estimou que a safra de arroz deverá ser de 11,9 milhões toneladas, 3% maior que a safra 2011/12 (11,6 milhões de toneladas). A região Sul foi responsável por 77,5% (8,9 milhões de toneladas) da produção nacional de arroz, e o RS representou 86,1% (7,7 milhões de toneladas), seguido de Santa Catarina com aproximadamente 12% e Paraná com 1,8% (SOSBAI, 2010; CONAB, 2013).
3.3.3. Farelo de Arroz
O farelo de arroz é um dos subprodutos obtido do beneficiamento do arroz, resultado das etapas de descasque e polimento do grão (Sawant et al., 1999; Amissah et al., 2003), durante este processo, varias partes do grão são removidas. A Figura 3.5 mostra uma representação esquemática da constituição do grão de arroz, o qual é constituido (base seca) de aproximadamente 20% de casca, 7 a 8,5% de farelo, 70 a 72% de endosperma e 2 a 3% de embrião ou germe (Ju e Vali, 2005; Zhou et al., 2002).
Figura 3.5. Representação esquemática da constituição do grão de arroz.
Fonte: Adaptação de Ju e Vali, 2005; Zhou et al., 2002.
O farelo contém de 15 a 23% de óleo e é direcionado para a indústria de ração animal. Devido a sistemas enzimáticos presentes no farelo que rapidamente hidrolisa os triglicerídeos em ácidos graxos livres (AGL), aumentando o teor de acidez (Paucar-Menacho et al., 2007; Ju e Vali, 2005). Segundo a ANVISA (2012) determina que o percentual de AGL nos diversos óleos vegetais utilizados na alimentação humana é de no máximo 0,3g/100g.
através do óleo dessa matéria-prima. Para isto, investigaram o efeito da umidade, temperatura e tempo de armazenamento do farelo de arroz em função do teor de AGL.
Na Figura 3.6, observa-se que no tempo zero de armazenamento o percentual de AGL encontra-se acima do pré-estabelecido pela ANVISA (2012). Também, duas informações importantes podem ser obtidas no que se refere ao percentual de umidade (10,3%) e temperatura na faixa de 30 a 50°C, propiciando um ambiente adequado para que a lipase alcance sua máxima atividade enzimática de hidrólise, produzindo o máximo de 76% e 82% de AGL em respectivamente 24 semanas. A definição de atividade enzimática que envolve a velocidade de reação é: “uma unidade (U) de atividade é a quantidade de enzima que transforma um µmol de substrato ou a formação de um µmol do produto por minuto”, sob condições de teste, como temperetura, pH e concentração de substrato (Uttatre et al., 2010).
Figura 3.6. Percentual de AGL versus tempo de armazenamento do farelo de arroz nas temperaturas de 5, 30, 50 e 70ºC. Percentual de AGL inicial 6,6% e teor de umidade de 10,3% em peso.
Fonte: adaptação de Zullaikah et al., 2005.
Verde (Química Sustentável) com importância fundamental na transição para uma matriz energética renovável e de baixo impacto ambiental (Vichi e Mansor, 2009).
3.4. Reações catalisadas por lipases
As enzimas não só apenas têm a capacidade de realizar a reação de hidrólise, mas também, podem catalisar as reações “reversas” através das reações
de transesterificação e esterificação com elevada seletividade, proporcionando um processo eficiente e limpo (Schuchardt et al., 1998; Li et al., 2012; Reis et al., 2009).
3.4.1. Reação de hidrólise
A hidrólise (Figura 3.7) ocorre nos grupos acil dos triglicerídeos e ésteres através do consumo de água, produzindo AGL, acilgliceróis parciais e 1,2,3-propanotriol (glicerol). As lipases têm a capacidade de realizar esta mudança da estrututa dos triglicerídeos e ésteres, na interface óleo/água, tendo como substratos óleos e gorduras (Schuchardt et al., 1998; Liu et al., 2008; Wu e Tsai, 2004).
H2C
HC O
O
H2C O C C C O O O CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 CH3
CH2 CH2 CH3 + 3H2O Lipase
H2C
HC
H2C OH
OH
OH
+ 3 HO C O
CH2 CH2 CH3
Triglicerídeo Água Glicerol Ácido carboxílico
Figura 3.7. Representação esquemática da reação de hidrólise catalisada através da lipase.
Fonte: Adaptação de Wu e Tsai, 2004.
3.4.2. Reação de transesterificação
Os produtos formandos são três mols de ésteres de ácidos graxos (biodiesel) e um mol do subproduto glicerol. Esta reação é reversível e ocorre em três etapas diferentes, obtendo o diglicerídeo e o monoglicerídeo, como intermediários (Schuchardt et al., 1998; Suarez et al., 2007; Reis et al., 2009).
3.4.3. Reação de esterificação
Nesta reação, ocorre a condensação do ácido carboxílico com um álcool formando éster. Também de forma esquemática, a Figura 3.8 (b) mostra a reação de esterificação catalisada pela lipase, em que a estequiometria entre os reagentes é na razão molar de 1:1. Esta reação é reversível e ocorre em apenas uma etapa, onde um mol do ácido carboxílico irá reagir com um álcool formando um mol de biodiesel e um mol do subproduto água (Schuchardt et al., 1998 Oliveira, 2006; Jaeger e Reetz, 1998).
H2C
HC O
O
H2C O
C C C O O O R1 R2 R3 + Lipase
H2C
HC
H2C
OH
OH
OH
R C OH
O
Triglicerídeo Álcool Glicerol Biodiesel
3R OH +
O C O R1 R O C O R2 R O C O R3 R (a) (b)
+ 'R OH Lipase H2O + O C
O
R 'R
Ácido carboxílico Álcool Água Biodiesel Figura 3.8. Representação esquemática de duas das reações catalisadas pelas lipases: (a)
transesterificação e (b) esterificação.
3.4.4. Mecanismo da reação de transesterificação na produção de biodiesel
Estudos propostos por Raghavendra et al. (2008), Bhardwaj et al. (2001) e Aizono et al. (1971), confirmaram a presença de grupos funcionais ácidos ou básicos, localizados nos sítios ativos das enzimas lipases, possibilitando catalisarem as reações através da doação ou recepção de prótons durante o transcorrer da reação, devido aos ácidos conjugados das aminas que são doadores de prótons, ao passo que as próprias aminas e íons carboxilatos são receptores de prótons (Schuchardt et al., 1998; Mendes et al., 2012; Ribeiro et al., 2011).
O mecanismo proposto para a transesterificação de triglicerídeos com mono-álcoois consiste na sequência dos seguintes passos, como monstrado na Figura 3.9: (a) a amina presente no resíduo de aminoácido histidina do sítio ativo da enzima, desprotona a hidroxila do resíduo de aminoácido serina possibilitando o ataque nucleofílico do íon hidroxila ao carbono carbonílico de um dos grupos acila do triglicerídeo formando um intermediário tetraédrico, o complexo enzima-substrato (E-S); (b) ocorre o rearranjo de elétrons do intermediário tetraédrico do complexo E-S, seguido da desprotonação do ácido conjugado da amina, formando o diglicerídeo e o complexo enzima-acilada (E-Ac); (c) a amina desprotona a hidroxila do álcool (HO-R1) o que possibilitado por parte deste um ataque nucleofílico ao carbono carbonila
do complexo E-Ac, formando um intermediário tetraédrico denominado de complexo enzima-acilada-álcool (E-Ac-A). Finalmente a última etapa (d), onde através do rearranjo de elétrons do intermediário tetraédrico E-Ac-A e da desprotonação do ácido conjugado da amina, ocorre à regeneração do sítio ativo da enzima e a formação do éster de ácidos graxo, isto é, o biodiesel. Em processos similares, reações semelhantes ocorrerão com os diglicerídeos, produzindo monoglicerídeos, os quais formarão, finalmente, a glicerina (Al-Zuhair et al., 2007; Marques et al.,
2013; Suarez et al., 2007; Jaeger e Reetz, 1998; Reis et al., 2009; Mendes et al.,
Figura 3.9. Mecanismo da reação de transesterificação de triglicerídeos via catálise enzimática.
Fonte: Adaptação de Al-Zuhair et al., 2007.
3.4. Fatores que influenciam a atividade enzimática
de extrema relevância, determinando, principalmente a estabilidade da enzima. Além disso, enzimas estáveis durante o processo catalítico permitem obter elevadas taxas de reação (Eijsink et al., 2004).
A estabilidade da enzima está relacionada a fatores que influenciam na conversão do substrato em biodiesel. Para alcançar a viabilidade econômica, é imprescindível que o meio reacional possibilite um ambiente favorável ao desempenho da enzima como biocatalisador. Para isso, é necessário ter com clareza dois aspectos fundamentais: os parâmetros básicos, como escolha da lípase, substratos (reagentes), sistemas de solvente, razão molar óleo:ácool e temperatura, este último influencia diretamente os subparâmetros (quantidade de água, pH do meio, transferência de massa, aditivos e concentração do glicerol) (Figura 3.10). Não ocasionando assim, a desnaturação da enzima o que possibilitará que a mesma possa alcançar sua máxima atividade enzimática, que em última análise se reflete nas taxas de reação (Antczak et al., 2009).
Figura 3.10. Fluxograma dos parâmetros reacionais que influenciam a atividade enzimática na síntese do biodiesel.
3.5. Escolha da lipase
As lipases são classificadas como hidrolases e atuam sobre as ligações éster presentes em acilgliceróis, liberando ácidos graxos e glicerol. Estas podem ser divididas em dois grupos principais: (i) carboxilesterases (EC 3.1.1.1) e (ii) as lipases
(EC 3.1.1.3), que diferem em várias características bioquímicas. As lipases podem atuar na hidrólise de triglicerídeos e na síntese de ésteres (Messaoudi et al., 2010; Arpigny e Jaeger, 1999; Sivaramakrishnan e Muthukumar, 2012). As lipases catalisam reações de substratos insolúveis em água, enquanto que as esterases em substratos solúveis em água (Alvarez-Macarie et al., 1999).
3.6. Substratos
3.6.1. Lipídios
Óleos e gorduras, substâncias hidrofóbicas do reino vegetal e animal que são formados por um mol de glicerol e três mols de ácidos graxos, sendo geralmente referidos como triglicerídeos e ácidos graxos livres (Alberts et al., 1999; Yang, 2007). Estes são à base da matéria-prima para a produção de biodiesel.
A produção mundial de biodiesel tem se concentrado em combustível derivado de oleaginosas que fornecem o óleo, onde se encontram os lipídios. A Tabela 3.2 apresenta as principais fontes de oleaginosas que fornecem as matérias-primas fáceis de processar e de alta qualidade para produção de biodiesel.
O biodiesel produzido no Brasil está baseado em óleo de soja, o que corresponde a 81% da produção total de biodiesel no país (ANP, 2013). Entretanto, alguns aspectos relacionados à viabilidade da matéria-prima devem ser observados, no intuito do processo ser viável economicamente como o percentual de óleo por grão, balanço energético (produção do óleo versus biodiesel produzido), vocação da região para a produção da matéria-prima e variações sazonais (Quintella et al.,
Tabela 3.2. Valores médios dos percentuais e produtividade de óleo de oleaginosas.
Fonte: Adaptação de Quintella et al., 2009.
3.6.2. Álcool
Na produção tradicional de biodiesel, o excesso de álcool sobre os triglicerídeos é necessário para aumentar a taxa de conversão da reação na obtenção do produto. No processo enzimático, o excesso de álcool pode ocacionar a inibição das enzimas, reduzindo sua atividade enzimática, tornando o processo ineficiente. Este cuidado não é exagerado, pois, a otimização deste parâmetro de reação irá assegurar uma boa difusão do álcool no substrato, evitando a elevação da polaridade do meio reacional, além de manter o glicerol que é extremamente hidrofílico em solução, impossibilitando a desativação da lipase (Noureddini et al.,
2005; Hernandez-Martin e Otero, 2008). Sendo assim, alguns aspectos quanto ao tipo de ácool, comprimento da cadeia, razão molar, polaridade e solubilidade deste frente ao substrato terão que ser observados para que não ocorra inibição da enzima.
molar metanol/óleo foi superior a 1,5:1 ocorreu inativação da lipase, conforme Figura 3.11. Neste exemplo, verifica-se que esta lipase é suscetível a um álcool primário, polar e de apenas um carbono.
Outro aspecto que pode ser constatado (Figura 3.12) é a resposta de cada enzima, frente ao tipo, comprimento da cadeia do álcoo e razão molar álcool:substrato na catálise enzimática. Constata-se que para o metanol (Novozym 435), etanol (Lipozyme TL-IM) e butanol (Lipozyme RM-IM) as razões molares ótimas foram 5:1; 7:1 e 9:1, respectivamente. Acima destes valores, a atividade enzimática foi prejudicada como constatado (Rodrigues et al., 2008).
O comprimento da cadeia alifática do álcool também influência nas taxas de conversão na esterificação. Ghamgui et al. (2004) realizaram a esterificação do ácido oléico (C18:1) na presença da lipase Rhizopus oryzae imobilizada utilizando álcoois primários de diferentes comprimento de cadeia como etanol (C2), propanol (C3), butanol (C4), pentanol (C5) e hexanol (C6). Estas reações foram em sistema isento de solvente e em sistema com solvente orgânico, o hexano. A razão molar de ácido oléico:álcool foi de 1:1, a 37°C e agitação (200 rpm).
Figura 3.11. Influência da razão molar (metanol:óleo) na conversão dos triglicerídeos em biodiesel.
Fonte: Adaptação de Shimada et al., 1999.
Figura 3.12. Influência da razão molar álcool:óleo na transesterificação do óleo de soja. Novozym 435
(-■- metanol), Lipozyme TL-IM (-o- etanol) e Lipozyme RM-IM (-▲- butanol), 30°C, 15% de enzima, 4% de água e 6 h de reação.
Fonte: Adaptação de Rodrigues et al., 2008.
Figura 3.13. Influência do comprimento da cadeia dos álcoois na esterificação em sistemas de solvente hexano (branco) e isento de solvente (preto).
Fonte: Adaptação de Ghamgui et al., 2004.
3.7. Sistemas de solvente
3.7.1. Solvente orgânico
A escolha adequada do solvente em síntese enzimática é um dos parâmetros mais importantes em biocatálise. De modo geral, as características do solvente orgânico influenciam, não somente, na transferência de massa (solubilidade) no sistema de reação, mas também têm grande efeito sobre a estrutura da enzima, influenciando na quantidade de água ideal para que a enzima possa manter sua máxima atividade (Zheng et al., 2010).
associada a enzima para log P > 3, mantendo a hidratação necessária para a máxima atividade enzimática. O mesmo não acontece quando a biocatálise é realizada com solventes hidrofílicos, cujo log P < 2. Estes têm a capacidade de retirar água associada à enzima, influenciando na sua estrutura e flexibilidade frente ao substrato, ocasionando perda de atividade enzimática (Villeneuve, 2007; Li et al.,
2006).
Recentes trabalhos em síntese de biodiesel foram realizados utilizando diferentes solventes orgânicos, demonstrando que a conversão do biodiesel, também é influenciado pelo tipo de lipase utilizada (Antczak et al., 2009). Soumanou e Bornscheuer (2003) constataram que utilizando diferentes solventes orgânicos como hexano (log P = 3,5), ciclohexano (log P = 3,1), heptano (log P = 4,0), iso -octano (log P = 4,7), acetona (log P = -0,24) e o éter de petróleo (log P = 3,2), na produção de biodiesel de óleo de girassol por transesterificação via rota metílica com lipases (RM - Rhizomucor miehei; TL - Thermomyces lanuginosa; AK -
Pseudomonas fluorescens) imobilizadas, houve uma menor diferença entre as máximas conversões quando o solvente era apolar. Também, foi possível constatar que, quando o solvente é polar, a conversão é extremamente prejudicada como mostrado na Figura 3.14.
Figura 3.14. Influência do solvente orgânico na conversão do óleo de girassol por transesterificação via rota metílica usando lipases imobilizadas (RM - Rhizomucor miehei; TL - Thermomyces
lanuginosa; AK - Pseudomonas fluorescens).
3.7.2. Co-solvente
Teoricamente, o solvente orgânico polar poderia extrair a água de hidratação da lipase desativando o biocatalisador, impossibilitando de realizar seu papel. Uma alternativa é fazer uso de um co-solvente, que neste estudo foi a mistura de um solvente orgânico hidrofóbico forte e um solvente orgânico hidrofóbico fraco. Li et al.
(2010) ao realizar a síntese enzimática para a produção de biodiesel, determinou o co-solvente adequado para misturas de dois solventes orgânicos para a máxima atividade enzimática, baseando-se nos trabalhos de Hilhorst et al. (1984) e de Laane
et al. (1987), que estabeleceram a Equação 3.1.
2 2
1 1
c x .log P x .log P
P
log (3.1)
onde,
c
P
log o log P do co-solvente;
x e
x1 2 frações molares dos solventes misturados;
P log e P
log 1 2 valores dos solventes puro.
A Figura 3.15 apresenta os percentuais de conversão em biodiesel para diferentes tipos de matérias-primas, quando estas foram transesterificadas com metanol utilizando as lipases Novozym 435 e Lipozyme TL IM imobilizadas, tendo o co-solvente (40% acetronitrila + 60% t-butanol) no meio reacional. As conversões superaram 90% quando comparadas com o solvente puro, exceto para os óleos de semente de chá, resíduo de fritura e salada. Com o uso somente de álcool t-butanol, as conversões foram inferiores ao do co-solvente (Li et al., 2010; Li et al., 2006 ).
Figura 3.15. Comparação do percentual de conversão para as diferentes matérias-primas através do uso de solvente orgânico puro e co-solvente.
Fonte: Adaptação de Li et al., 2010.
3.7.3. Sistema isento de solvente
Outra maneira de realizar a catálise enzimática é não utilizar solvente no meio reacional. Entretanto, um estudo detalhado dos parâmetros reacionais como quantidade de lipase, tempo de reação, temperatura, agitação e razão molar álcool:óleo deverão ser realizados, possibilitando assim, que a lipase obtenha sua máxima ativida enzimática.
Figura 3.16. Reação de transesterificação mostrando os resuntados dos sistemas: isento de solvente e com o solvente t-butanol.
Fonte: Adaptação de Liu et al., 2009.
Os resultados mostram que o t-butanol eliminou os efeitos negativos causados pelo metanol e o glicerol nas lipases, mantendo estes solubilizados no substrato, possibilitando que as lipases alcançacem suas máximas atividades enzimáticas (Liu et al., 2009).
3.8. Relação entre solvente e álcool
A necessidade do adequado balanço da relação solvente versus álcool fica evidenciando quando a lipase é suscetível à toxidade do álcool empregado como agente transesterificador e/ou esterificador, na catálise enzimática (Nelson et al.,
Entretanto, as enzimas requerem muito menos álcool para realizar a reação como demonstrado no iten 3.6.2, Figura 3.11 (Shimada et al., 1999). A adição de um solvente orgânico com adequado coeficiente de partição (log P), influencia no meio reacional, pois possibilita o aumento da solubilidade do metanol em triglicerídeos, ao mesmo tempo que reduz a concentração de metanol em torno da enzima, evitando a retirada de água de solvatação e hitratação, como demonstrado na representação esquemática da Figura 3.17 (b) (Fu e Vasudevan 2009; Gagnon e Vasudevan, 2011; Villeneuve, 2007).
Figura 3.17. Representação esquemática: (a) sistena isento de solvente e (b) com solvente orgânico. Fonte: Adaptação de Fu e Vasudevan, 2009.
3.9. Temperatura
que na faixa de 25 a 55°C, a conversão em ésteres metílicos diminui após a temperatura ultrapassar 40°C, devido à perda de atividade enzimática da lipase.
Figura 3.18. Influência da temperatura na metanólise do óleo de colza.
Fonte: Adaptação de Jeong e Park, 2008.
3.10. Influência da água
Outro parâmetro de reação importante em biocatálise é a presença de água no meio reacional, principalmente em meio orgânico, pois é essencial para a atividade enzimática. A característica de sua ação é justamente na interface (óleo/água) gerada entre a fase orgânica e inorgânica do meio reacional (Zheng et al., 2010). A água deve estar dissolvida no solvente e também ligada à enzima, o que não significa ser somente de hidratação da enzima, mas sim, reflete na quantidade de água de solvatação que circula a enzima contribuindo para a sua estabilização (geometria espacial) através das forças de interações do tipo: ligações de hidrogênio, van der Waals e pontes salinas. Esta estabilização da enzima reflete na sua menor ou maior flexibilidade frente às interações do complexo enzima-substrato (Villeneuve, 2007; Fu et al., 2009).
quantidade de água em relação ao óleo, pois a água é adicionada ao sistema reacional para aumentar a eficiência catalítica (Antczak et al., 2009; Zheng et al.,
2010). O trabalho de Zheng et al. (2010) ao realizar a síntese de biodiesel por transesterificação através da metanólise do óleo do farelo de arroz e utilizando a
lipase Candida sp. 99-125 imobilizada indicou que de 20% até 40% de água foram as quantidades ideais para obter os melhores resultados de conversão. Entretanto, acima de 40% de água, os resultados em conversão reduziram conforme os resultados apresentados na Figura 3.19.
Figura 3.19. Influência do percentual de água na metanólise do óleo de farelo de arroz.
Fonte: Adaptação de Zheng et al., 2010.
3.11. pH
O pH tem uma forte influência sobre a estabilidade da enzima e deve ser ajustado a um intervalo adequado para enzima (Kirk et al., 2012). O pH é determinante para a estrutura tridimensional da enzima em função da camada de água circundante na enzima, pois influencia na sua atividade enzimática. As cargas eletrostáticas dos grupos polares contidos nas moléculas da enzima dependem do pH do seu microambiente em meios não aquosos.
reacional com 0,5N NaOH ou 0,5N HCl, constataram que a máxima atividade relativa percentual da lipase foi quando o pH permaneceu entre 7,5 e 8 (Figura 3.20).
Figura 3.20. Efeito do pH na atividade enzimática da lipase do farelo de arroz.
Fonte: Adaptação de Aizono et al., 1973.
3.12. Transferência de massa
Figura 3.21. Influência da velocidade de agitação do sistema reacional na conversão dos ésteres metílicos. Condições de reação: razão molar de 4:1 de metanol para o óleo, 4% de
Novozyme 435, 40°C, 12 h de reação.
Fonte: Adaptação de Halim e Kamaruddin, 2008.
3.13. Concentração do glicerol
O glicerol é o subproduto obtido da transesterificação do triglicerídeo em biodiesel e possui elevada densidade e polaridade. Estudos sobre o efeito do glicerol na catálise enzimática indicam que o glicerol reduz a eficiência da enzima, devido à inativação da lipase quando imobilizada, pois o glicerol é adsorvido na superfície do suporte, formando um revestimento hidrofílico, bloqueando o sítio ativo da enzima e impossibilitando assim, o acesso ao substrato hidrofóbico (Dossat et al., 1999; Lai et al., 2005). Também, por ser uma molécula altamente hidrofílica, quando não atua diretamente na superfície da enzima, impede que o álcool se solubilize no substrato reduzindo a atividade enzimática (Xu et al., 2011).
Xu et al. (2011) através de um método de tingimento in situ do glicerol utilizando um corante vermelho, demonstraram o efeito negativo do glicerol na etanólise por transesterificação do óleo de colza utilizando três tipos de lipases
enzima. Observa-se também, uma fase líquida límpida sem glicerol livre, sugerindo que o glicerol formado foi completamente adsorvido sobre o suporte.
Figura 3.22. Visualização do glicerol na etanólise de óleo de colza, catalisada por diferentes lipases
imobilizadas: (a) Lipozyme TL-IM, (b) Novozyme 435 e (c) Lipozyme TL-HC. Fonte: Adaptação de Xu et al., 2011.
Na tentativa de neutralizar a influência negativa do glicerol no meio reacional, Li et al. (2006) realizaram a síntese de biodiesel do óleo de colza com metanol em solvente orgânico hidrofílico (t-butanol) utilizando lipases imobilizadas (Lipozyme TL-IM e Novozyme 435). Neste estudo foi possível verificar que o glicerol permaneceu solúvel no meio reacional, sem formar filme sobre a lipase suportada. Constataram que o solvente não só impossibilitou a deposição do glicerol sobre a lipase como também, manteve o metanol solúvel no substrato (Watanabe et al., 2000; Li et al.,
2010).
3.14. Cinética enzimática
A lei cinética para uma reação de primeira ordem em função do consumo de um reagente limitante (triglicerídeos) WBC (2013) é dada pela Equação (3.1), onde a [AGL] é em função da concentração do reagente limitante e k é a constante cinética da reação (Ouachab e Tsoutsos, 2012). A Equação (3.1) pode ser reescrita como na Equação (3.2), esta por sua vez ao ser integrada (Equação (3.3)), resulta na Equação (3.4 ou 3.5), onde k é independente do tempo, sendo em t = 0, a [AGL]
é [AGL]0, e em um instante de tempo qualquer é [AGL].
k AGLdt AGL
AGL
kdtAGL
d (3.2)
AGL
AGL t 0 o dt k AGL AGL d (3.3)
AGL
ktAGL ln o
(3.4)
ou
kt0.e
AGL
AGL (3.5)
3.15. Aditivos
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Amostra
O farelo de arroz utilizado neste estudo, assim como o arroz (Oryza sativa) com casca foram doados pelo engenho de beneficiamento de arroz Dom Carlito, localizado na cidade de Viamão-RS. O farelo de arroz foi imediatamente coletado após o processo de descasque e polimento do grão de arroz e foi armazenado em embalagem plástica e a baixa temperatura (-10ºC), para posteriores análises de caracterização física, microestrutural e química.
4.1.1. Análise da constituição do grão de arroz
A determinação da constituição do grão de arroz foi dada em percentuais a partir da pesagem (base seca) em balança analítica (Gibertini E154) da casca, endosperma mais o farelo e, por último o germe ou embrião, estes em relação ao grão inteiro. Para este experimento foram realizadas replicatas (n=6) no Laboratório de Organometálicos e Resinas na Faculdade de Química da PUCRS.
4.1.2. Análise granulométrica
Armazenamento de Carbono (CEPAC) na Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande de Sul (PUCRS).
4.1.3. Teor de umidade
O teor de umidade do farelo de arroz foi obtido através das análises gravimétrica e termogravimétrica, do inglês – Thermogravimetric Analysis (TGA), para o farelo de arroz bruto e demais granulometrias estudadas (Zullaikah et al.,
2005; Zheng et al., 2010; Al-Zuhair et al., 2007; Reis et al., 2009).
4.1.3.1. Análise gravimétrica
O percentual de umidade determinado pela análise gravimétrica, baseou-se nas normas Bc 2-49 da AOCS (1997) e IAL (2008). A massa de amostra de farelo de arroz foi de aproximadamente 2 g. Esta permaneceu na estufa em cadinho de porcelana por 1 h na temperatura de 130 ± 2ºC até peso constante. Sendo que, passado o tempo de permanência na estufa a amostra permaneceu por 45 min em dessecador de sílicagel e, posteriormente, foi feito a pesagem em balança analítica. O teor de umidade (w) foi determinado segundo a Equação (4.1). Para este experimento foram realizadas replicatas (n=15) na FAQUI.
100 . M M M M w c cs cs cws
(4.1)
onde,
w
teor de água, %;
cws
M
massa do cadinho e amostra úmida, g;
cs
M
massa do cadinho e amostra seca, g;
c
4.1.3.2. Análise termogravimétrica
Análise termogravimétrica foi realizada em um equipamento SDT, modelo Q600 da TA Instruments, em atmosfera de nitrogênio a uma taxa de aquecimento de 5ºC/min, na faixa de 25ºC a 600ºC, utilizando-se porta-amostra de alumina (Oliveira, 2002). Estas análises foram realizadas no Laboratório de Caracterização de Materiais da Faculdade de Química da PUCRS.
4.1.4. Teor de óleo no farelo de arroz
O teor de óleo do farelo de arroz foi expresso em percentual em relação à massa do farelo. Cada extração foi realizada com aproximadamente 12 g de farelo utilizando-se um sistema com extrator Soxhlet e balão de fundo redondo de 250 mL em temperatura de refluxo do hexano (Neon, 95%). O tempo ideal de extração foi determinado através de estudo prévio e com base na literatura (Amarasinghe e Gangodavilage, 2004; Pourali et al., 2009). Após o término de cada extração, o solvente foi recuperado em rota evaporador e, em seguida o óleo foi seco em estufa a 90ºC por 30 min. Após foi realizada a pesagem (diferença de massa) do balão com o óleo extraído em balança analítica Gehaka AG 200. Estas análises foram realizadas no Laboratório de Organometálicos e Resinas na Faculdade de Química da PUCRS.
4.2. Caracterização microestrutural e química
4.2.1. Microscopia eletrônica de varredura e ótica
Para a realização da caracterização microestrutural do grão de arroz através da técnica de microscopia eletrônica de varredura, do inglês – Scanning Electron Microscopy (MEV) foi necessário o preparo da amostra através do procedimento de preparação de superfícies polidas em dispositivos adequados (embutimento) seguido de lixamento e polimento conforme descrito na literatura (Dedavid et al.,
