Natal / RN 2010
JOABE DOS SANTOS PEREIRA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
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Natal / RN 2010
Pereira, Joabe dos Santos.
Análise de células T regulatórias FoxP3+no líquen plano oral / Joabe dos Santos Pereira. – Natal, RN, 2010.
107 f. : il.
Orientador: Profa. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel.
Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Gran de do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós Graduação em Patolo gia Oral.
1. Líquen Plano Oral – Dissertação. 2. Imunoistoquímica – Dissertação. 3. Ce lulas T Regulatórias – Dissertação. 4. FoxP3 – Dissertação. I. Miguel, Márcia Cristi na da Costa. II. Título.
RN/UF/BSO Black D66
Aos meus pais, por terem acreditado e investido em mim;
Às minhas irmãs por sempre me trazerem alegria;
A todos aqueles que me incentivaram mesmo sem saber, com suas palavras ou ações, e até mesmo pela simples lembrança presente em minha memória...
...dedico.
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da minha vida e me fazer chegar até aqui. Por me tornar tudo aquilo que sou hoje. Pelos momentos difíceis que me fizeram crescer, amadurecer e ser mais forte. Por renovar meus sonhos e me dar novos propósitos nos momentos de maior dificuldade, nunca me deixando só. Por tudo enfim, obrigado Senhor!
À meus pais+ ( , * + ' ' , por terem acreditado e investido em mim durante toda a minha vida. Por serem exemplos de honestidade, humildade, integridade, perseverança e tantas outras qualidades que nem as maiores intempéries da vida podem apagar do meu coração nem do meu caráter. Com eles aprendi não somente a ser alguém melhor, mas a ter um sentido para ser melhor. Obrigado pela fé que me ensinaram.
Às minhas irmãs+ -& + .' , por toda felicidade que me trazem. Por estarem sempre presentes nos momentos mais importantes da minha vida. À minha tia$ ' 'por todo o carinho dispensado, pelo cuidado, pelo interesse, pela saudade e por todas as alegrias. Ao meu sobrinho /) por me dar mais um motivo pra ser feliz. À minha avó ) & , exemplo de fé, de coragem, de amor a Deus e ao próximo. Obrigado por tudo que me ensinou.
À todos os meus 0 ( ', pessoas sem as quais seria muito difícil chegar até aqui.
Ao ". # 1 , exemplo de dedicação e amor pelo que faz. Sua experiência e seus conhecimentos contribuem de forma singular com nosso aprendizado científico.
À " # # 2* 3 ' )4 , por todos os seus valiosos conhecimentos compartilhados, por toda colaboração para a melhoria deste Programa de Pós graduação. Pelo interesse em tornar seus alunos profissionais melhores. Pelos momentos de seriedade e probidade com os quais conduz suas atividades, e pela simpatia nos momentos de descontração.
À " # # 2* $ ) ' ) 45por toda a competência com que conduz suas atividade neste programa.
À "# # 627 * , *& *,1 , pela confiança em nós depositada durante a realização das nossas atividades, por ser sempre incentivadora e pelos estímulos cedidos.
Ao "# # 8 '7 9 ' ' 5por ser para seus alunos um exemplo de integridade e seriedade naquilo que faz, além de proporcionar valiosos momentos de descontração.
À " # # &: + ' *, 5por ser para nós um exemplo de dedicação e perseverança. Pelo seu amor à profissão demonstrado em todas as suas atitudes. Pelo entusiasmo contagiante sempre presente no nosso cotidiano.
Ao "# # $ ) * ; )< 45pelo seu exemplo de dedicação e humildade.
À " # # $ - 0 ' $ '5por toda a competência demonstrada na condução da clínica da estomatologia. Por ser uma pessoa atenciosa, calma e paciente para ensinar.
Ao "# # => ' 0 5pela contribuição na realização da análise estatística deste trabalho.
Ao "# # )' , -por ser um grande exemplo de professor e pesquisador, pela participação importante nas etapas da minha vida acadêmica desde a graduação, pelo encaminhamento a este Programa de Pós Graduação.
Aos meus amigos da turma de Mestrado, por todos os momentos compartilhados. Pela força durante as dificuldades, e pelas dificuldades compartilhadas também. Pelo companheirismo presente no nosso dia a dia. Pelo otimismo, pela ajuda mútua, pelo cuidado e preocupação. Por todos os nossos momentos de alegria... ... como teria sido difícil esta caminhada sem todos vocês! Vocês estarão sempre presentes na minha memória. Obrigado - , */ 5 0 *
como uma conversa agradável durante o almoço, () 5 )* 5 * '' 5 ? *2 5 " * 5sem vocês meu dia a dia não seria o mesmo.
Aos colegas do doutorado '' 5 ( 5 27 /5 3 ) " * 5 3 ) 0 *5 = )4 5 * @ 5 ** 5 ' 5 5 $ & * ) /por toda a ajuda dispensada no início e no decorrer do curso. Pelas experiências compartilhadas, pelos ensinamentos, por toda atenção e pelo convívio sempre agradável.
Aos funcionários: & / 5 / 5 ) / 5 25 2 5 *4) 62, , por toda a ajuda prestada.
À , pelo incentivo financeiro que me permitiu cursar este Mestrado.
As células T regulatórias (Treg) possuem a função de controlar respostas imunes e manter a autotolerância. O FoxP3 tem sido considerado o marcador mais específico para células Treg. O objetivo deste estudo foi avaliar a imunoexpressão do FoxP3 no infiltrado inflamatório do líquen plano oral (LPO) comparado ao da hiperplasia fibrosa inflamatória (HFI) e posteriormente entre as formas reticular e erosiva do LPO. A amostra foi composta por 32 casos de LPO (17 reticulares e 15 erosivos) além de 10 casos de HFI que foram submetidos à marcação imunoistoquímica para o FoxP3. A localização da marcação foi classificada em justaepitelial ou intraepitelial e a quantidade das células FoxP3+ foi avaliada através da contagem destas em 10 campos consecutivos, com aumento de 400x. Os valores foram expressos em média ± desvio padrão, e submetidos aos testes estatísticos com nível de significância de 5%. Observou se uma diferença estatisticamente significativa na quantidade de células Treg FoxP3+ entre os dois tipos de LPO reunidos (1,6 ± 2,2) e a HFI (0,5 ± 0,4) ( <0,05). Isto talvez possa ser explicado pelo mecanismo imunológico do LPO, que envolve uma provável indução antigênica permanente com conseqüente perpetuação da lesão, suscitando a proliferação e recrutamento constante das células Treg. Em contrapartida, a HFI apresenta uma etiopatogenia diferente, na qual também há geração de um infiltrado inflamatório variável, porém qualitativamente distinto do verificado no LPO. A forma erosiva do LPO exibiu um maior número (1,7 ± 2,4) de células Treg FoxP3+que a forma reticular (1,5 ± 2,1). Estas alterações podem ter relação com a maior atividade da doença verificada no LPO erosivo, ou ainda, com anormalidades na função reguladora das células Treg que ocasionariam o aumento observado. Considerando se a capacidade já bem estabelecida na literatura, tanto das células Treg modularem as respostas imunológicas, quanto da mucosa oral em exibir um grande potencial de regeneração, sugere se que a possibilidade de desenvolvimento e implantação de estratégias imunoterapêuticas que regulem a freqüência e a função destas células, possa futuramente auxiliar no tratamento de doenças inflamatórias mediadas imunologicamente, como o LPO.
T regulatory cells have the function of controlling immune responses and maintaining self tolerance. The FoxP3 has been considered the most specific marker for Treg cells. The aiming of this paper was to evaluate the immunoexpression of FoxP3 in the inflammatory infiltrate from oral lichen planus (OLP) and to compare it with the infiltrate in fibrous inflammatory hyperplasia (FIH) and then, between reticular and erosive forms of OLP. The samples were composed by 32 cases of OLP (17 reticular and 15 erosive) beyond 10 cases of FIH that were submitted to immunohistochemistry staining for FoxP3. Localization of the staining was classified in underepithelial and intraepithelial and the amount of FoxP3+ cells was evaluated through cells counting in 10 consecutive fields, at 400x power magnification. The values were expressed in mean ± standart deviation, and submitted to statistical tests with 5% of significance level. It was observed a statistical significant difference in the amount of FoxP3+ Treg cells between the two combined forms of OLP (1,6 ± 2,2) and the FIH (0,5 ±0,4) ( <0,05). This maybe could be explained by immunological mechanism of OLP, which involves a permanent antigenic induction likely with consequent perpetuation of lesion, eliciting the proliferation and constant recruitment of Treg cells. Otherwise, FIH presents a different etiopathogenesis, in which there is also generation of a variable inflammatory infiltrate, however qualitatively distinct from that seen in OLP. The erosive form of OLP exhibited a greater number (1,7 ± 2,4) of FoxP3+ Treg cells than reticular form (1,5 ± 2,1). These alterations could have relation with the great disease activity verified in erosive OLP, or also, with abnormalities in the regulatory function of Treg cells that could cause the increase observed. Considering the capacity already well established in the literature, both about Treg cells in modulating immune responses, as in the oral mucosa in showing great potential for regeneration, it is suggested that the possibility of development and implantation of immunotherapeutic strategies that regulate the frequency and function of these cells, may help in future treatment of immune mediated inflammatory diseases such as OLP.
Quadro 01 Critérios diagnósticos propostos pela OMS para LPO, modificados por van der Meij e van der Waal (2003)... 52 Quadro 02 Especificidade, clone, recuperação antigênica, diluição e tempo de
incubação dos anticorpos utilizados... 53 Gráfico 01 Distribuição da amostra quanto ao tipo de lesão. Natal/RN – 2010... 58
Gráfico 02 Barra de Erros da média ± desvio padrão em relação ao tipo de lesão.
Natal/RN 2010... 62 Gráfico 03 Barra de Erros da média ± desvio padrão em relação ao tipo de lesão.
Natal/RN 2010... 64 Figura 01 Corte histológico de líquen plano oral corado em HE, exibindo atrofia
epitelial ... 66 Figura 02 Corte histológico de líquen plano oral corado em HE, exibindo os Corpos
de Civatte ... ... 66 Figura 03 Imunoexpressão do FoxP3 em líquen plano oral, exibindo a formação de
centro germinativo no infiltrado inflamatório justaepitelial ... ... 67 Figura 04 Imunoexpressão do FoxP3 nas células Treg intraepiteliais (setas) em líquen
plano oral reticular ... ... 68 Figura 05 Imunoexpressão do FoxP3 nas células Treg intraepiteliais e justaepiteliais
(setas) em líquen plano oral erosivo ... 68 Figura 06 Imunoexpressão do FoxP3 nas células Treg justaepiteliais (setas) em líquen
plano oral reticular ... ... 69 Figura 07 Imunoexpressão do FoxP3 nas células Treg justaepiteliais (setas) em líquen
plano oral erosivo ... ... 69 Figura 08 Imunoexpressão do FoxP3 nas células Treg intraepiteliais e justaepiteliais
Tabela 01 Distribuição dos casos quanto ao tipo de lesão em relação ao tipo de
ceratinização. Natal/RN – 2010... 59
Tabela 02 Distribuição dos casos quanto ao tipo de lesão em relação ao tipo de
hiperceratinização. Natal/RN – 2010... 59
Tabela 03 Distribuição dos casos quanto ao tipo de lesão em relação às características epiteliais. Natal/RN – 2010... 60
Tabela 04 Quantidade, média ± desvio padrão e intervalo de confiança (95%) relativos à contagem de células justaepiteliais imunomarcadas para o
FoxP3. Natal/RN – 2010. ... 62 Tabela 05 Valor de e Intervalo de Confiança (95%) obtidos através do teste t de
Student para a quantidade de células justaepiteliais imunomarcadas para o FoxP3. Natal/RN – 2010. ... 63 Tabela 06 Quantidade, média ± desvio padrão e intervalo de confiança (95%)
relativos à contagem de células intraepiteliais imunomarcadas para o
FoxP3. Natal/RN – 2010. ... 64 Tabela 07 Valor de e Intervalo de Confiança (95%) obtidos através do teste t de
Treg Célula T regulatória LPO Líquen plano oral
HFI Hiperplasia fibrosa inflamatória
LP Líquen plano
MMP Matrix metalloproteinase – metaloproteinase da matriz CD Cluster of differentiation unidade de diferenciação
MHC Major histocompatibility complex complexo principal de histocompatibilidade IL Interleukin interleucina
APC Antigen presenting cell célula apresentadora de antígeno Th T helper cells células t auxiliares
INF Interferon
NF κB Nuclear factor kappa b – fator nuclear kappa b
TGFβ Transforming growth factor β fator transformador de crescimento β ICAM Intercellular adhesion molecule molécula de adesão intercelular VCAM Vascular cell adhesion molecule – molécula de adesão celular vascular MEC Matriz extracelular
CXCR Chemokine receptor cxc – receptor à quimiocina cxc
CCR Chemokine (c c motif) receptor – receptor (c c motif) à quimiocina TNFα Tumor necrosis factor alpha – fator de necrose tumoral alfa
TNF R Tumor necrosis factor Receptor – receptor ao fator de necrose tumoral VEGF Vascular endothelial growth factor – fator de crescimento endotelial vascular nTreg Célula T regulatória natural
iTreg Célula T regulatória induzida Ts Célula T supressora
TCR T cell receptor receptor de célula T
IPEX Immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy X linked syndrome – síndrome da desregulação imune, poliendocrinopatia, enteropatia, ligada ao X NK Natural killer cells – células eliminadoras naturais
GITR Glucocorticoid induced TNF receptor – receptor TNF induzido por glicocorticóide
HE Hematoxilina e eosina Tr Células T reguladoras
AMP Adenosine monophosphate – monofosfato de adenosina DC Dendritic cell – células dendríticas
$
1 AC ... 25 2 ? C ... 28 2.1 Líquen plano oral... 28 2.2 Células T regulatórias... 36 3 AC ... 48 4$ $ ... 50 4.1 Considerações Éticas ... 50 4.2 Caracterização do estudo ... 50 4.3 População ... 50 4.4 Amostra ... 50 4.5 Critérios de seleção da amostra ... 51 4.5.1 Critérios de inclusão ... 51 4.5.2 Critérios de exclusão ... 51 4.6 Estudo morfológico ... 51 4.7 Estudo imunoistoquímico ... 52 4.7.1 Método imunoistoquímico... 52 4.7.2 Análise do perfil imunoistoquímico ... 55 4.8 Análise Estatística ... 56 5 ... 58 5.1 Caracterização da amostra ... 58 5.2 Análise morfológica ... 58 5.3 Análise do perfil imunoistoquímico ... 61 6 C ... 72 7 B ... 87
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E AC
O líquen plano (LP) é uma doença inflamatória crônica imunologicamente mediada que pode afetar a pele e a mucosa. É uma das condições dermatológicas que mais freqüentemente envolvem a cavidade oral. Sua prevalência na população é estimada entre 1 a 2%, existindo um grande número de casos relatados em mulheres (BORNSTEIN, HAKIMI e PERSSON, 2008; MCCARTAN e HEALY, 2008; SOUSA e ROSA, 2008).
De acordo com Sousa e Rosa (2008), o líquen plano oral (LPO) possui características clínicas específicas, se apresentando mais comumente em duas formas principais: a reticular e a erosiva. A forma reticular geralmente é assintomática, sendo descoberta na maioria das vezes durante exame clínico intra oral de rotina. Diferentemente, as lesões erosivas são dolorosas, causando incômodo no paciente (BORNSTEIN, HAKIMI e PERSSON, 2008; MCCARTAN e HEALY, 2008).
Não existem tratamentos específicos para o LPO, todavia o paciente deve ser orientado para diminuir possíveis traumas mecânicos ou químicos, o que pode levar à remissão dos sintomas (EISEN et al, 2005). As medicações para estas lesões são utilizadas de forma paliativa e agem apenas temporariamente na resolução das lesões. As drogas usadas podem ser de ação local ou sistêmica e possuem como principais componentes ativos os corticosteróides (AGHA HOSSEINI et al, 2009).
O LPO apresenta etiologia desconhecida, todavia, Sugerman et al (2002) afirmaram que mecanismos imunológicos específicos e não específicos podem estar envolvidos na sua patogênese. Bornstein, Hakimi e Persson (2008) citam como mecanismos específicos a apresentação de antígenos pelos ceratinócitos e a morte celular causada pelos linfócitos T citotóxicos, enquanto que os não específicos incluem a degranulação dos mastócitos e ativação das MMPs (metaloproteinases da matriz).
desconhecidos, são ativadas de forma descontrolada, como reposta a um antígeno de natureza incerta associado ao MHC de classe I nos ceratinócitos da camada basal do epitélio, conduzindo estes ceratinócitos à apoptose.
Um subconjunto de células T, conhecidas como células T regulatórias (Treg), possui a função de controlar respostas imunes e manter a autotolerância (YAN e LIU, 2009; FEUERER et al, 2009). Estas células são geradas principalmente no timo, mas também podem se desenvolver nos tecidos periféricos (ABBAS, LICHTMAN e PILLAI, 2008). Possuem ainda a função de prevenir respostas imunes descontroladas contra patógenos ou alérgenos, ajudar a manter o equilíbrio da microflora normal e prevenir que tumores escapem da vigilância imunológica (FEUERER et al, 2009). Boros e Bromberg (2009) afirmam que as células Treg demonstram ser importantes no desenvolvimento do câncer, na autoimunidade, alergia e asma.
Existem vários estudos sobre o papel das Treg em diferentes doenças, como: dermatite atópica (ITO et al, 2009); doença do enxerto versus hospedeiro (WANG et al, 2009; RAO et al, 2009; XIE et al, 2009); linfoma de células T (KARUBE et al, 2004; MARZANO et al, 2009; RAO et al, 2009; WADA et al, 2009); miastenia grave (MU et al, 2009); linfoma de células B (GRILLE et al, 2009); aterosclerose (VAN ES et al, 2009); esclerose múltipla (VANDENBARK et al, 2009); lúpus eritematoso sistêmico (FERREIRA et al, 2009; YANG et al, 2009); artrite reumatóide (RAGHAVAN et al, 2008; CHEN et al, 2008), líquen plano cutâneo (DE BOER et al, 2007a); líquen plano oral (TAO et al, 2009).
F ? C
2.1 Líquen Plano Oral
O Líquen Plano (LP) é uma doença mucocutânea crônica, relativamente comum e que pode envolver a mucosa oral, pele, mucosa genital, couro cabeludo e unhas. Embora sua etiologia permaneça desconhecida, uma patogênese mediada imunologicamente tem sido reconhecida nessa entidade. O LP tem sido relatado com maior freqüência em pacientes de meia idade e do sexo feminino, sendo raros os casos encontrados em crianças (ISMAIL, KUMAR e ZAIN, 2007). Balasubramaniam, Ogboli e Moss (2008) relatam que a maioria dos casos de LP em crianças ocorre na Índia, com média de idade de 10 anos e em indivíduos do gênero masculino.
Estudo recente relatou a prevalência do líquen plano oral (LPO) em uma população indiana, o qual revelou 1,26% da população estudada acometida, principalmente na faixa etária entre 41 e 60 anos (MATHEW et al, 2008). Pentenero et al. (2008), encontraram em seu estudo uma freqüência de 1,46% de ocorrência do LPO entre as lesões orais, sem diferença entre gênero. Todavia, vários estudos relatam uma predominância desta condição em mulheres (LOZADA NUR e MIRANDA, 1997; KOVAC KOVACIC e SKALERIC, 2000; EISEN, 2002). A prevalência do LPO relatada na literatura varia de 0,5 a 2,2% da população, com idade entre 30 e 60 anos (VAN DER WALL, 2009).
De acordo com Bidarra et al (2008), o LP confinado em mucosa oral com mínimo envolvimento em pele, é encontrado em aproximadamente 15% dos casos relatados. Outros sítios de acometimento citados na literatura são o esôfago, a mucosa gástrica, a conjuntiva, a bexiga e a mucosa vulvolvaginal, muito embora casos nessas regiões sejam incomuns.
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envolvimento do couro cabeludo resulta em alopécia por cicatriz (SUGERMAN et al., 2002).
As lesões de LPO surgem como lesões esbranquiçadas, de forma reticulada ou estriada (estrias de Wickham), pápulas ou placas, eritemas, erosões ou bolhas. Essas lesões são geralmente bilaterais e as de forma atrófica, erosiva ou bolhosa usualmente ocorrem com sensação de queimação ou dor (ISMAIL, KUMAR e ZAIN, 2007; RAD et al, 2009). O sítio mais comum de envolvimento é a mucosa jugal, seguida pela língua, gengiva, mucosa labial, e vermelhão do lábio. As lesões no palato, assoalho da boca e no lábio superior são incomuns. (EISEN, 2002). De acordo com Kovac Kovacic e Skaleric (2000) o tipo reticular é a forma de apresentação mais comum, que em seu estudo teve 92,3% de prevalência entre os diversos tipos de LPO.
De modo geral, o LPO pode se apresentar clinicamente de duas formas distintas: a reticular e a erosiva. A forma reticular ocorre com maior freqüência, sendo caracterizada por estriações brancas conhecidas como estrias de Wickham, geralmente cercadas por bordas discretamente eritematosas. Essa forma usualmente é assintomática. A forma erosiva tem por característica ser sintomática (dor e/ou ardor), se apresentando como áreas eritematosas frequentemente rodeadas por finas estrias (SOUSA e ROSA, 2008).
Em algumas lesões, as características clínicas por si só podem ser suficientes para o diagnóstico do LPO, particularmente quando o padrão reticular está presente. A evidência relativa à necessidade da biópsia para confirmação histológica do diagnóstico já foi bastante questionada (VAN DER MEIJ e VAN DER WAAL, 2003). Todavia, por ser uma condição crônica, essa patologia exige tratamento e monitoramento por tempo prolongado, o que torna a biópsia uma prática clínica prudente, particularmente quando a doença não mostra suas características clínicas típicas, ou quando há dúvida com relação à existência de displasia ou malignidade (EISENBERG, 2000).
De acordo com Epstein et al (2007) as lesões de LPO que apresentam endurecimento, componente vermelho, superfície não homogênea e ulceração são as mais indicadas para a realização de biópsia. Os pacientes com lesões vermelhas precisam ser examinados preferencialmente duas vezes por ano.
inicial no LPO possa variar de paciente para paciente, através de mecanismos específicos e não específicos. Todavia, após o evento inicial da lesão, tanto os mecanismos específicos quanto os não específicos permanecem induzindo a formação e conseqüente expansão da lesão. A susceptibilidade de um paciente em desenvolver LPO pode resultar de uma combinação de fatores, incluindo a expressão desregulada de antígeno pelos ceratinócitos do epitélio de mucosa oral, persistência das células de Langerhans orais maduras, circulação de células T auto reativas e atividade imunossupressora defeituosa combinada com o reconhecimento de algum antígeno próprio (SUGERMAN et al., 2002).
Lodi et al (2005) afirmam que no LP, as células T CD8+ lesionais podem ser ativadas por um antígeno associado ao MHC de classe I nos ceratinócitos basais. Estes então são levados à apoptose, sendo a natureza deste antígeno ainda desconhecida. As células de Langerhans, ou ainda os ceratinócitos também apresentam um antígeno associado ao MHC de classe II para as células T CD4 auxiliares, que secretam IL 2 e INF γ. A combinação destes dois mecanismos pode ser responsável pela ativação dos linfócitos T CD8+ citotóxicos. A produção local de INF γ pode manter a expressão do MHC classe II pelos ceratinócitos, contribuindo assim para o cronicidade do LPO. Além disto, o rompimento da membrana basal pode ainda ser mediado pelas proteases dos mastócitos diretamente ou indiretamente através da ativação da MMP 9, secretada pelas células T.
De acordo com Scully e Carrozzo (2008) a forma crônica do LPO pode resultar da ativação do NF κB e a inibição da via do TGF beta/smad pode causar a hiperproliferação dos ceratinócitos, levado às lesões brancas. Os autores relatam que as células T são recrutadas e migram através do epitélio oral, também atraídas por moléculas de adesão celular (ICAM 1 e VICAM), pelo aumento na regulação das proteínas da MEC (matriz extracelular) da membrana basal do epitélio, incluindo colágeno IV e VII, laminina e integrinas e possivelmente pelas vias de sinalização CXCR3 e CCR5.
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Muitos estudos têm sugerido um papel central do INF γ e TNF α na patogênese do LPO. Um estudo sugeriu que a produção aumentada de INF γ relacionada a polimorfismo genético pode ser um fator importante para o desenvolvimento de LPO. Constatou se nesta pesquisa que a alta produção do INF γ determinada geneticamente pode ser responsável pelas lesões orais crônicas, enquanto que a presença de alta produção de TNF α, determinada da mesma forma, pode estar envolvida no início das lesões cutâneas (CARROZZO et al, 2004).
Kalogerakou et al (2008) citam que as citocinas representam um foco no estudo da patogênese da autoimunidade. Em geral, as citocinas são classificadas em dois grupos: as do tipo 1 (IL 2, IL 12, INF γ, TNF α) que se encontram relacionadas com a imunidade mediada por células, e as do tipo 2 (IL 4, 5, 6, 10, 13) que promovem a imunidade humoral. Estes autores observaram uma redução no número de células produtoras de IL 12 e INF γ no sangue periférico de pacientes com LPO, indicando uma falha na resposta imune mediada por células nesses pacientes.
O INF γ é encontrado em altas concentrações nas células mononucleares do infiltrado inflamatório em lesões de LPO. Essas células secretam INF γ, induzindo a expressão do MHC de classes I e II nos ceratinócitos e consequentemente viabilizando a interação direta entre as células T citotóxicas e as T auxiliares com os ceratinócitos (YOUNGNAK PIBOONRATANAKIT et al, 2009).
As moléculas CD40/CD40L são proteínas transmembrana, expressas por células com alto potencial de proliferação, incluído os ceratinócitos. Estas proteínas estão relacionadas com a indução ou inibição da apoptose em diferentes cânceres. Um estudo observou a perda de expressão de CD40/CD40L na região basal de áreas de LPO, sugerindo que os ceratinócitos basais podem escapar da indução de apoptose através desta via no LPO, comprovando que outros mecanismos de apoptose encontram se mais envolvidos nessa patologia (NEPPELBERG et al, 2007).
redução da integridade estrutural da camada basal, permitindo o aumento da migração de células T para o epitélio no LPO.
Mazzarella et al (2006) citam que as MMPs estão envolvidas no processo de degradação da membrana basal do epitélio no LPO que permite a migração dos linfócitos para dentro do epitélio. Foi então realizado um estudo para avaliar a expressão das MMPs em lesões de LPO. Constatou se que os níveis da expressão dessas proteínas se encontram aumentados nas lesões erosivas quando relacionadas com as reticulares, podendo as MMP 1 e MMP 3 estarem associadas com o desenvolvimento da forma erosiva. Dessa forma, as diferentes formas clínicas do LPO estão associadas com diferenças entre os níveis das MMPs.
Um estudo recente identificou a presença de angiogênese significativa nos pacientes com LPO através da expressão de VEGF, CD34, CD106 e CD54. Esses dados indicam que a angiogênese no líquen além de restabelecer a oxigenação tecidual, possui uma função importante na modificação dos elementos inflamatórios da área afetada, bem como na perpetuação da doença através da liberação de proteases que influenciam a infiltração celular e remodelação dos tecidos (SCARDINA et al, 2009).
De acordo com Lehman et al (2009), o padrão histopatológico do LP nas superficies mucocutâneas é constituído pela presença de um infiltrado linfo histiocítico em forma de banda na junção derme epiderme, associado à degeneração hidrópica na camada basal. Pode se observar disceratose representada pela presença de ceratinócitos necrosados (corpos de Civatte ou corpos citóides) os quais são expulsos para a derme papilar. Fendas subepiteliais (fendas de Max Joseph) podem ser formadas como conseqüência da inflamação na interface epitélio conjuntivo. Além da acantose irregular e hiperortoceratose, quando encontram se áreas de hiperparaceratose pode se suspeitar de erupção liquenóide por drogas. De acordo com estes autores acredita se que as estrias de Wickham originam se como resultado da hipergranulose.
Beachkofsky et al (2009) descrevem os achados histopatológicos do LP hipertrófico com hiperortoceratose focal, projeções epiteliais em forma de dente de serra, alterações vacuolares na camada basal do epitélio e um infiltrado linfocítico em faixa.
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Civatte), projeções epiteliais ausentes, hiperplásicas ou em forma de dente de serra; espessura variável da camada espinhosa e variáveis graus de orto ou paraceratose (SOUSA e ROSA, 2008).
Várias lesões que acometem a mucosa oral podem apresentar um infiltrado inflamatório em posição justaepitelial semelhante ao que acontece no LPO, como por exemplo, as hiperplasias fibrosas inflamatórias (HFIs), com a diferença de que no LPO o infiltrado é predominantemente linfocítico. As hiperplasias fibrosas inflamatórias, por sua vez são caracterizadas por uma hiperplasia do tecido conjuntivo fibroso, que geralmente encontram se associadas ao uso de próteses mal adaptadas, observando se graus variáveis de infiltrado inflamatório mononuclear, entretanto mais variável e que muitas vezes também pode se encontrar disposto em faixa subepitelial (NEVILLE et al, 2009).
Zarei, Chamania e Amanpoorb (2007) afirmam que as HFIs são lesões semelhantes a tumor, porém não neoplásicas. Estas são originadas após a ocorrência de injúrias, que desencadeiam um processo crônico caracterizado pela formação de tecido de reparo em excesso no local afetado. As HFIs podem se apresentar na forma séssil ou pediculada, com superfície íntegra ou ulcerada. Sua cor varia entre rosa pálido, vermelho ou púrpura e sua consistência pode ser amolecida, flexível ou firme, dependendo da quantidade de fibras colágenas no local. Algumas lesões com maior vascularização podem apresentar sangramento. Estes autores realizaram um estudo para verificar as características clínicas de hiperplasias reacionais orais em um grupo de iranianos, no qual observaram a ocorrência de HFIs em indivíduos de 33 até 79 anos de idade, com média de 52 anos, relação homem mulher igual a 1:1,37 e uma maior freqüência destas lesões na região anterior da mandíbula.
Além da HFI, várias outras lesões também podem ser similares ao LPO tanto clinicamente quanto histopatologicamente, sendo conhecidas como reações liquenóides. Essas reações abrangem várias condições: reações liquenóides por contato (que ocorrem por contato da mucosa com materiais restauradores); aquelas que ocorrem por influência de fármacos, como agentes hipoglicêmicos orais, inibidores da enzima angiotensina convertase e antiinflamatórios não esteróides; reações liquenóides da doença do enxerto versus hospedeiro (AL HASHIMI et al, 2007). Além disto, no diagnóstico diferencial do LPO, Ismail, Kumar e Zain (2007) ainda citam as leucoplasias, o lúpus eritematoso e a doença do enxerto versus hospedeiro.
A eliminação de fatores que exacerbam o LPO sintomático é um passo inicial no seu tratamento. Em sua grande maioria, os fatores consistem em restaurações ásperas, próteses mal adaptadas, comidas ácidas, picantes ou muito temperadas e bebidas alcoólicas. O esclarecimento do paciente e as ações no sentido de diminuir estes possíveis traumas mecânicos ou químicos podem levar à melhora no quadro sintomatológico (EISEN et al, 2005). Intervenções psico sociais também são importantes, mormente o estresse emocional agudo e/ou ansiedade que têm sido relacionados com a patogênese do LPO (CHAUDHARY, 2004).
Como ainda não existe tratamento definitivo para as lesões de LPO, as medicações
têm sido usadas de forma paliativa, com a finalidade de aliviar os sintomas dolorosos e o
tamanho das lesões, promovendo assim a saúde bucal do paciente. As drogas usadas
podem ser de ação local ou sistêmica, e possuem como principais componentes ativos os
corticosteróides como a Triancinolona, acetonida de fluocinolona e fluocinonida. Elixir de
dexametasona e clobetasol são frequentemente utilizados em pacientes com envolvimento
oral (ISMAIL,KUMAR e ZAIN,2007).
As lesões de LPO são tratadas de acordo com as suas características clínicas, recomendando se um acompanhamento rigoroso do paciente, que pode necessitar de várias visitas ao profissional. Novas biópsias podem ser requeridas para o diagnóstico da lesão, tratamento ou controle dos sinais e sintomas. (EPSTEIN et al, 2007).
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que não respondem ao tratamento com medicações de uso tópico (THONGPRASOM e DHANUTHAI, 2008).
Um estudo verificou o efeito da acetonida de fluocinolona de uso tópico em pacientes, por dois anos de tratamento, encontrando uma total remissão das lesões em 77,3% dos casos estudados, enquanto que aqueles que utilizaram a acetonida de fluocinolona a 0,1% em solução, mostraram 21,4% de remissão das lesões (THONGPRASOM et al, 2003).
Youngnak Piboonratanakit et al (2009) avaliaram a eficácia da acetonida de fluocinolona em orabase a 0,1% para o tratamento das lesões de LPO. Esses autores encontraram que após um mês de tratamento, as células inflamatórias mononucleares, incluindo as INF γ positivas, sofreram uma diminuição em número nas lesões, mostrando que o INF γ pode estar associado com a imunopatogênese do LPO.
A discussão relativa ao potencial de transformação maligna de um LPO tem crescido desde o primeiro relato de caso de um carcinoma de células escamosas desenvolvido a partir desta lesão. Estudos recentes têm mostrado diferentes proporções de possibilidade de potencial maligno do LPO, em geral variando entre 0,04 e 1,74%. Considerando estes dados, muitos autores têm aceitado a idéia de que esta lesão possui potencial para transformação maligna. Todavia, outros propuseram o uso do termo “lesão liquenóide oral”, para lesões com características histopatológicas de líquen plano que exibem também displasia epitelial, diferenciando as do LPO verdadeiro. Provavelmente, estas lesões possuem um considerável potencial de transformação maligna, o que as difere dos reais casos de LPO (ACAY et al, 2006).
Ainda não existem evidências que apontem a quimio prevenção ou a remoção cirúrgica das lesões displásicas como medidas preventivas contra a transformação maligna da lesão no decorrer do tempo (EPSTEIN et al, 2007).
Tizeira, Agua e Sano (2003) observaram em sua pesquisa que as formas clínicas de LPO que sofrem transformação maligna com mais freqüência são as formas de placa e erosiva. Estes autores acompanharam durante sete anos 719 pacientes com líquen plano oral e encontraram uma freqüência de transformação maligna correspondente a 6,51%. Bermejo Fenoll et al (2009), em estudo com uma população de 550 pacientes diagnosticados com LPO, encontrou uma ocorrência de carcinoma epidermóide em 0,9% dos pacientes, em um período de acompanhamento de 24 ± 20,83 meses, sendo a língua o local de acometimento mais comum.
2.2 Células T regulatórias
As células T regulatórias (Treg) são um subconjunto de células T que possuem a função de suprimir respostas imunes e, consequentemente, manter a autotolerância (YAN e LIU, 2009; FEUERER et al, 2009).
Independente da linhagem, todos os linfócitos regulatórios identificados até o momento inibem a autoimunidade e induzem a autotolerância por dois mecanismos gerais. As células regulatórias podem exercer sua função supressiva em células T, B e dendríticas através de contato direto ou por secreção de citocinas, geralmente referida como inibição extrínseca à célula. A tolerância é também induzida por mecanismos intrínsecos à célula como deleção clonal de células auto reativas, edição de receptores de células B ou T que reconhecem o “próprio”, e a iniciação de sinais de anergia ou apoptose na periferia após contato com antígenos próprios. Apesar das células Treg serem consideradas como os agentes supressores de maior importância, outros tipos celulares também exercem papéis cruciais na manutenção da homeostase imunológica, incluindo células CD8+, B e CD4+ (SKAGGS et al, 2008).
37
Pesquisas recentes têm estabelecido que a família de linfócitos T regulatórios/supressores consiste não apenas na população de células T CD4+, mas também inclui populações de células CD8+. Vários tipos de células Ts (T supressoras) CD8+ com fenótipos diversos parecem existir em seres humanos e em animais. Os modelos de supressão, podem incluir citotoxicidade à células marcadas, supressão mediada por contato célula célula e secreção de citocinas antiinflamatótias (SUZUKI et al, 2008).
As células Treg são geradas principalmente através do reconhecimento de antígenos próprios no timo, mas também podem se desenvolver nos órgãos linfóides periféricos. Sua produção e sobrevida dependem de citocinas como o fator de crescimento transformador β (TGF β) e IL 2, além da co estimulação pela via B7 CD28, muito embora não esteja claro o que estes sinais fazem no desenvolvimento das células Treg. Da mesma forma, se desconhecem os fatores que determinam se a célula será efetora, de memória, ou ainda, regulatória (ABBAS, LICHTMAN e PILLAI, 2008).
Ainda de acordo com Abbas, Lichtman e Pillai (2008) apesar de estas células reconhecerem antígenos próprios e serem geradas pelo reconhecimento destes, sua especificidade e diversidade de receptores em indivíduos normais ainda não está definida. Uma das formas das células Treg controlarem respostas imunes é pela secreção de citocinas imunossupressoras. Muitos estudos mostram que a função das células Treg depende do TGF β, que por sua vez tem a função de inibir as respostas imunes de linfócitos e macrófagos. Desse modo, as células T que produzem essas citocinas, podem bloquear a ativação e as funções efetoras de outras células T.
As células Treg originadas no timo são conhecidas também como células Treg naturais, podendo ser reconhecidas pela expressão de CD4+CD25+FoxP3+(VILA, ISAACS e ANDERSON, 2009). Estas células executam um papel crucial na prevenção da doença autoimune e na manutenção da tolerância periférica (SAKAGUSHI et al, 2008).
células T periféricas e dos timócitos, também sendo encontradas em fagócitos mononucleares e em algumas células dendríticas. Esta molécula tem ainda quatro domínios extracelulares, uma região transmembrana hidrofóbica e uma cauda citoplasmática altamente básica. A proteína CD4 liga se ao domínio β2 da molécula de MHC classe II através de dois domínios N terminais. O maior número das células T CD4 restritas à classe II do MHC são células que produzem citocinas, atuam como auxiliares e funcionam na defesa contra os microrganismos extracelulares ingeridos pelos macrófagos ou que esperam ser reconhecidos por anticorpos para serem removidos (ABBAS, LICHTMAN e PILLAI, 2008).
Um gene regulador da autoimunidade, conhecido como , promove a expressão de antígenos próprios tecido específicos através das células epiteliais medulares do timo (ANDERSON et al, 2002). A expressão desse gene é essencial para o estabelecimento da tolerância central através de alguns peptídeos próprios, levando à deleção os timócitos que são fortemente auto reativos (KYEWSKI e KLEIN, 2006).
Os sinais que influenciam o desenvolvimento das células nTreg em humanos ainda não estão totalmente esclarecidos, muito embora se conheça a influência exercida pelas moléculas co estimuladoras e citocinas, afinidade antigênica e TCR. Em adição à força e afinidade peptídica do sinal do TCR, o contexto no interior do timo onde o antígeno é encontrado pode influenciar se o timócito vai ser selecionado, deletado ou se tranformar em células Treg (WORKMAN et al, 2009).
As células nTreg reconhecem antígenos estranhos com a mesma freqüência que as células T convencionais, o que sugere uma participação dos peptídeos do timo na sua seleção, podendo ser estes diferentes daqueles que guiam a proliferação e função das células nTreg periféricas (PACHOLCZYK et al, 2007). Um estudo mostrou que o contexto ou nicho no qual as células T entram em contato com o antígeno é mais importante na determinação da deleção ou seleção das células do que a afinidade ao antígeno próprio (VAN SANTEN, BENOIST E MATHIS, 2004).
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CD25 não é exclusivo das células Treg, as células T como um todo expressam CD25 quando ativadas pelo ligante do TCR (VIGNALI, COLLISON e WORKMAN, 2008).
O CD28 (molécula co estimuladora do linfócito T) parece suportar a sobrevivência das células nTreg promovendo a produção da IL 2 pelas células T convencionais além de manter a expressão do CD25 nas células nTreg (TANG et al, 2003; FONTENOT et al, 2005). Fontenot et al (2005) ainda relatam que a sinalização de IL 2 parece ser crítica, não somente para a sobrevivência das células nTreg, mas também para sua produção e função no timo e na periferia.
A deficiência genética do CD25 em humanos resulta em manifestações clínicas similares às da IPEX (síndrome ligada a mutações no gene do FoxP3 que exibe desregulação imune, poliendocrinopatia e enteropatia ligadas ao cromossomo X) o que enfatiza a importância da IL 2 na função e manutenção das células nTreg (VELLA et al, 2005). Estudos em humanos e em ratos mostraram que a neutralização promovida pela anti IL 2 induz à autoimunidade e reduz de forma significante o número das células nTreg no timo e na periferia (SAKAGUCHI, 2004; BAYER et al, 2005).
O FoxP3 é um fator de transcrição, pertencente à família , essencial para o desenvolvimento e função da maioria das células Treg. A ocorrência de mutações em FoxP3 em murinos e no homem resulta na ausência de linfócitos Treg CD25+ e doença autoimune em múltiplos sistemas (ABBAS, LICHTMAN e PILLAI, 2008). Banham et al (2006) afirmam que a expressão do FoxP3 é crítica para o desenvolvimento do fenótipo regulatório, o que não ocorre com o CD25. O FoxP3 tem sido considerado o marcador mais confiável para avaliação de células Treg (YAGI et al, 2004; KARUBE et al, 2004; SCHEREIBER, 2007, LIN et al, 2007; SOLOMON e MAGRO, 2008; WADA, 2009).
Hori, Nomura e Sakaguchi (2003) afirmam em seu estudo que a expressão de FoxP3 é predominantemente restrita à população de células CD25+CD4+ tanto no timo quanto nos tecidos linfóides periféricos e que essa expressão é estável nas células Treg CD25+CD4+ independente do modo ou estado de ativação destas. Esses autores ainda verificaram que a expressão ectópica do FoxP3 foi suficiente para converter células T näive não regulatórias em um fenótipo de células Treg capazes de suprimir a proliferação de outras células T, através da inibição da produção de IL 2.
deficiência desta proteína resulta na ausência destas células. Eles ainda ressaltam que o FoxP3 é suficiente para ativar um mecanismo supressor das células T CD4 não regulatórias periféricas.
O FoxP3 possui um papel crucial na regulação da resposta imune pelas células T periféricas, prevenindo a autoimunidade e possibilitando a manutenção das células Treg (KHATTRI et al, 2003). Uma mutação no gene da FoxP3 é responsável pelo desenvolvimento da síndrome IPEX. Os portadores desta condição apresentam autoimunidade e imunodeficiência variável, com conseqüências fatais tanto em ratos quanto em humanos, demonstrando assim, a importância dessa proteína em humanos (GAMBINERI, TORGERSON e OCHS, 2003, VERCOULEN et al, 2009).
Fontenot et al (2005) mostraram em seu estudo que as células FoxP3+ são encontradas somente na medula do timo, sugerindo que o desenvolvimento das células nTreg ocorre relativamente tarde no desenvolvimento deste órgão. Segundo Pacholczyk et al (2007) e Liston et al (2008) muito embora o FoxP3 não seja detectado no córtex do timo, alguns estudos sugerem que a seleção da linhagem das células nTreg pode ocorrer neste local, em um estágio inicial do desenvolvimento do órgão.
Outro estudo relatou que entre a população de células T CD4+ no timo, existem células CD25high que representam as precursoras imediatas das células nTreg, as quais encontram se prontas para expressar FoxP3 após estimulação com IL 2 ou IL 15. Este dado sugere que em adição ao TCR, estas interleucinas exibem um papel essencial no desenvolvimento das células nTreg (LIO e HSIEH, 2008).
Outra molécula que desempenha papel importante no desenvolvimento das células nTreg é o TGF β, cuja sinalização constante é necessária para manter a expressão e função supressora do FoxP3 nessas células, além de manutenção e homeostase da células nTreg periférica (MARIE et al, 2005). A sinalização de TGF β nas nTreg periféricas é essencial para a supressão de vários tipos celulares, como células Th1, células T CD8+citotóxicas e células NK (MARIE, LIGGITT e RUDENSKY, 2006).
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controverso, considerando a hipótese anteriormente existente de que o contato célula célula era requerido para mediar a supressão. Todavia, existe uma lista crescente de estudos in vivo que descrevem a importância do IL 10, TGF β e IL 35 na supressão de várias respostas imunes (WORKMAN et al, 2009).
A citólise promovida pelas células Treg é mediada pela granzima A em humanos e granzima B em ratos. Enquanto a dependência da perforina permanece em questão, modelos de células Treg parecem capazes de eliminar células marcadas através de um mecanismo granzima dependente (GONDEK et al, 2005; CAO et al, 2007).
Existem vários estudos que buscam definir os mecanismos de supressão exercidos pelas células Treg, mostrando que estas células não exercem um mecanismo simples de supressão, mas possuem um arsenal de mecanismos reguladores. Esses podem ser classificados em alguns tipos básicos: citocinas inibitórias, citólise, rompimento metabólico e modulação da função das APCs (WORKMAN et al, 2009)
Concernente às doenças autoimunes, Vila, Isaacs e Anderson (2009) afirmam que estas surgem de uma falha na tolerância imunológica periférica, levando à respostas imunes anormais contra antígenos próprios. As células Treg, incluindo as naturais que se originam no timo e as induzidas, geradas na periferia, são responsáveis pelo controle destas células auto reativas.
As células Th17 caracterizam se pela produção de IL 17, aparentemente estando associadas à patogênese da doença autoimune, regulações imunes e defesa do hospedeiro. As células Th17 foram caracterizadas como uma nova linhagem das células T CD4+, especulando se que as células Th17 e as células Treg são reguladas reciprocamente (CHEN et al, 2007).
afirmam que a falha na atividade supressora das células Treg tanto no sangue quanto nos tecidos lesionados, pode conduzir a uma hiperproliferação de células T patogênicas na psoríase.
Gao et al (2009) avaliaram em uma população chinesa a associação entre polimorfismos no gene do FoxP3 e a susceptibilidade à psoríase. Os autores encontraram relação de alguns polimorfismos com um risco aumentado de desenvolver essa doença enquanto outros foram relacionados com a sua severidade, acentuando assim a relação entre os polimorfismos no gene do FoxP3 e a psoríase.
Flores Borja et al (2008) em pesquisa avaliando a função e expressão de células Treg CTLA 4+ em pacientes com artrite reumatóide, verificaram que as células Treg isoladas destes pacientes são incapazes de suprimir a produção de citocinas pelas células T convencionais. Constataram se anormalidades na expressão e função das células Treg, ligadas ao CTLA 4, uma molécula relacionada com a sinalização das células Treg, o que pode ocasionar falhas nessas células em pacientes com artrite reumatóide.
Recente trabalho comparou a proporção de células T CD4+CD25high e as T CD4+FoxP3+ em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico ativo e inativo e comparou com um grupo controle formado por indivíduos saudáveis. Para isso, foi coletado sangue dos pacientes e a proporção foi encontrada através de citometria de fluxo. Os resultados mostraram que o aumento da atividade da doença estava associado com a diminuição nas proporções de células T CD4+CD25high e aumento das T CD4+FoxP3+, sugerindo que a expressão do FoxP3 nas células T CD4+ dos pacientes doentes estava dissociada da expressão do fenótipo CD4+CD25high. Observou se ainda uma correlação significativa entre a atividade clínica da doença e as proporções das células T CD4+FoxP3+. Desse modo, a expressão do FoxP3 nas células T CD4+ dos pacientes com lúpus eritematoso sistêmico reflete a ativação destas células frente à atividade da doença, não indicando necessariamente uma capacidade funcional das células Treg (BONELLI et al, 2008).
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linfomas de células T. A expressão do FoxP3 mostrou se reduzida quando não ausente nos casos de dermatomiosite e de lúpus eritematoso, indicando defeitos qualitativos e quantitativos na função das células T, o que contribui para o excesso e desregulação de células T e B auto reativas nestas doenças autoimunes. A baixa expressão do FoxP3 nas lesões de pele da dermatomiosite e do lúpus eritematoso, bem como da doença do enxerto versus hospedeiro poderiam facilitar a persistência e propagação das células T auto reativas.
Wang et al (2009) em seu estudo que verificou a expressão do mRNA do FoxP3 na urina de pacientes com nefrite associada ao lúpus, observaram que a quantidade do mRNA desta proteína foi maior em pacientes com lúpus ativo quando comparado àquele latente. Ainda verificou se que os pacientes com nefrite proliferativa exibiram um nível maior de expressão de mRNA do FoxP3 na urina que aqueles com nefrite não proliferativa e que o FoxP3 urinário foi relacionado de forma significativa com a atividade sistêmica e histológica da doença. Estes autores acrescentam que o mRNA do FoxP3 encontrado seria originário das células T infiltradas no rim.
Em estudo recente em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico, Yang et al (2009) avaliaram a atividade das células Treg e das Th17 nessa patologia. Os autores observaram que esta condição pode estar relacionada ao aumento na população de células Th17, que sugere um ambiente de citocinas distinto que se encontra ativo no lúpus. Estes autores encontraram ainda uma diminuição da população das células nTreg, indicando que as citocinas produzidas pelo sistema imune dos pacientes com a doença ativa suprime a geração deste subconjunto celular.
Yan e Liu (2009) citam que existe uma grande quantidade de células CD4+CD25 FoxP3+presentes no sangue periférico de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico. Eles sugerem que essa quantidade de células CD4+CD25 FoxP3+aumentada pode constituir um reservatório periférico da população de células Treg CD4+CD25+FoxP3+. Sob reativação da doença autoimune, as células CD4+CD25 FoxP3+ poderiam ser recrutadas para expandir a coleção de células Treg com o ganho de CD25, no esforço de reverter um desequilíbrio na expansão de células T e B auto reativas no lúpus.
FoxP3+ em vários órgãos e um aumento na formação da lesão aterosclerótica. Os dados exibem o importante papel destas células Treg na aterosclerose, denotando a função protetora destas células (VAN ES et al, 2009).
Ito et al (2009) avaliaram a quantidade e qualidade de células T FoxP3+ na circulação de pacientes com dermatite atópica comparando com um grupo controle através de citometria de fluxo. A freqüência de células FoxP3+CD25+entre a população de células CD4+ nos indivíduos com essa doença foi significativamente maior que aquela do grupo controle, exibindo ainda uma diminuição na quantidade conforme as lesões regrediam. Os autores sugerem que a flutuação dinâmica nos números das células Treg FoxP3+ pode contribuir com a patogênese da dermatite atópica, acrescentando que estas células podem ser expandidas em resposta à inflamação alérgica sistêmica ou local.
Radstake et al (2009) investigaram o papel das células Treg na esclerose sistêmica. Para tanto, as células CD3+ foram isoladas e subsequentemente estudadas através de citometria de fluxo para a expressão de CD4, CD8, CD25, FoxP3, CD127, CD62L, GITR e CD69. A função supressora destas foi correlacionada com a expressão do CD69 e a secreção/expressão do TGFβ. As células T CD4+CD25+ e CD25highFoxP3highCD127neg foram altamente expressas em todos os casos de esclerose sistêmica quando comparados com o grupo controle. Já a expressão do CD62L e do CD69 foi baixa nesses indivíduos, sendo relacionadas com uma função supressora diminuída. A co incubação de células Treg de indivíduos saudáveis com o plasma de pacientes com esclerose sistêmica anulou completamente qualquer atividade supressora. Os resultados indicam que fatores solúveis no plasma de pacientes com esclerose sistêmica inibem a função das células Treg, associados às alterações na expressão do CD69 e do TGFβ.
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Investigou se a expressão de FoxP3 e GITR na pele normal e em um painel de diferentes dermatoses inflamatórias: LP, psoríase, dermatite espongiótica e leishmaniose. Os resultados revelaram que o FoxP3 e o GITR estavam quase que exclusivamente presentes nas células T que expressaram tanto CD4 como CD25. Em geral, a freqüência das células FoxP3+ se mostraram similares na pele normal e no LP. Estas freqüências também não variaram entre os outros espécimes patológicos, o que pode ser resultado do processo inflamatório inerente a estas lesões, enquanto que na pele normal, uma grande variação na freqüência de células FoxP3+ foi encontrada entre os diferentes pacientes. Estes dados, no entanto, não indicam necessariamente que as células Treg não estão envolvidas na patogênese das doenças inflamatórias em pele (DE BOER et al, 2007a).
Tao et al (2009) analisaram a correlação entre o número de células FoxP3+ e a atividade das lesões de LPO. Estes observaram que o FoxP3 está presente preferencialmente nas células que apresentam o fenótipo CD4+CD25+. Constataram um aumento no número de células Treg FoxP3+ e alta transcrição do próprio FoxP3+ nas lesões de LPO, além de uma baixa quantidade do número dessas células nas lesões eritematosas/erosivas em comparação com as reticulares. Esses dados indicam que as células Treg FoxP3+estão envolvidas na patogênese do LPO e relacionadas com o subtipo clínico e com a atividade da doença.
Embora estudos prévios que buscaram relacionar a densidade/quantidade do infiltrado inflamatório no LPO com as formas clínicas (reticular e erosiva) não mostrem relação entre as duas variáveis, estes sugerem haver uma relação entre a apresentação clínica da lesão e a qualidade do infiltrado inflamatório, o que justifica o interesse em identificar tipos celulares específicos neste infiltrado para então qualificá lo (SEOANE et al, 2004; LÓPEZ JORNET, 2009).
indiretamente as células efetoras da inflamação alérgica, como os eosinófilos (TANTIBHAEDHYANGKUL, 2009).
Piccirillo et al (2008) afirmam que a identificação de marcadores de alta especificidade e fidedignidade que discriminem as células Treg das efetoras, permitirá o desenvolvimento de reagentes apropriados para facilitar o monitoramento da freqüência e função destas células nas doenças, ou ainda, a verificação clínica da eficácia de novas terapias que modulem a função das células Treg in vivo. Novos marcadores também poderão auxiliar na diminuição ou aumento da supressão mediada pelas células Treg de forma seletiva no intuito de tratar ou prevenir várias desordens inflamatórias.
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4.1 Considerações éticas
O presente estudo foi submetido à análise pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN e pelo Sistema Nacional de Ética na Pesquisa SISNEP, tendo sido aprovado sob o parecer no. 253/2009 em reunião deste comitê em setembro de 2009.
4.2 Caracterização do estudo
Este estudo foi caracterizado como uma pesquisa retrospectiva descritiva constituída pela observação, análise e registro da expressão imunoistoquímica do FoxP3 em líquen plano oral e hiperplasia fibrosa inflamatória. O objetivo consistiu em analisar comparativamente a imunoexpressão desta molécula entre o infiltrado inflamatório do LPO e da hiperplasia fibrosa inflamatória, bem como entre as duas formas clínicas de líquen plano oral (reticular e erosiva).
4.3 População
Para o desenvolvimento desta pesquisa, foram utilizados todos os casos de líquen plano oral e hiperplasia fibrosa inflamatória registrados, diagnosticados e arquivados no Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
4.4 Amostra
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pacientes como assintomáticas, com linhas brancas entrelaçadas ou como pápulas e as erosivas como lesões eritematosas, ulceradas e sintomáticas (apresentando dor e/ou ardor), conforme Neville et al (2009).
4.5 Critérios de seleção da amostra
4.5.1 Critérios de inclusão
Foram incluídos os espécimes diagnosticados histopatologicamente como líquen plano oral que continham as informações clínicas disponíveis para caracterizá los nas formas reticular ou erosiva e os espécimes de hiperplasia fibrosa inflamatória com intenso infiltrado inflamatório disposto em posição justaepitelial.
Foram incluídos os espécimes que tinham material suficiente nos blocos de parafina para o desenvolvimento da pesquisa.
4.5.2 Critérios de exclusão
Foram excluídos os espécimes que não satisfizeram os critérios de inclusão descritos anteriormente.
4.6 Estudo morfológico
modificado por van der Meij e van der Waal (2003) associado aos dados clínicos presentes nos prontuários dos pacientes (Tabela 01).
HE# 2 ' ( ;' & ' 9 9 ' ' 9 * $ 9 5 0 " & ' 9
, $ I , J * KFHH L#
2 ' 6 ' 9 *;( & '
Presença de uma zona em faixa, bem definida, de infiltração celular, confinada à porção superficial do tecido conjuntivo, consistindo principalmente de linfócitos
Sinais de liquefação degenerativa na camada basal do epitélio
Ausência de displasia epitelial
4.7 Estudo imunoistoquímico
4.7.1 Método imunoistoquímico
53
HF M '9 & " & 5 &* 5 &)9 N1 (> & 5 *) N1 09 &)7 N1 ' & 9 ' ) * 4 '#
'9 & " & * &)9 N1 (> &
*) N1 09
&)7 N1 FoxP3* FoxP3 (H190) Tris EDTA pH 9,0 1:150 Overnight
*Marca: Santa Cruz Biotechnology, Inc
Para detecção da marcação imunoistoquímica foi aplicado o sistema Envision®(Dako Co., Carpinteria, CA, USA). Foram utilizados como controle positivo para o FoxP3 cortes de tecido tonsilar. O controle negativo foi feito substituindo se o anticorpo primário por
albumina de soro bovino a 1% (BSA – ) em solução tampão. A técnica utilizada foi realizada conforme os passos que se seguem:
Desparafinização: 2 banhos em xilol, ambos por 10 minutos à temperatura ambiente (TA); Re hidratação em cadeia descendente de etanóis:
álcool etílico absoluto I (5 minutos) TA; álcool etílico absoluto II (5 minutos) TA; álcool etílico absoluto III (5 minutos) TA; álcool etílico absoluto IV (5 minutos) TA; álcool etílico 95°GL (5 minutos) TA; álcool etílico 80°GL (5 minutos) TA;
Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95° por 10 minutos, à temperatura ambiente;
2 passagens em água destilada por 5 minutos cada; Recuperação dos sítios antigênicos (Quadro 1);
Lavagem em água corrente por 10 minutos e 2 passagens em água destilada por 5 minutos cada;
Duas incubações dos cortes, pelo período de 10 minutos cada, em solução de 0,3% de peróxido de hidrogênio em metanol para bloqueio da peroxidase endógena tecidual; Lavagem em água corrente por 10 minutos e 2 passagens em água destilada por 5 minutos cada;
Duas passagens em solução tampão TRIS HCl (tris hidroximetil aminometano, Sigma Chemical, St Louis, MO, USA) pH 7,4 por 5 minutos cada;
Incubação com o anticorpo primário (Quadro 1) diluído em solução BSA (albumina sérica bovina, BIOTEST S/A, São Paulo, Brasil) a 1% conservada em azida sódica a 0,1% em TRIS HCl pH 7,4;
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS HCl pH 7,4 por 5 minutos cada; Incubação tampão TRIS HCl, pH 7,4 (2 passagens – 5 minutos cada)
Incubação do anticorpo secundário + Envision®(Dako Co., Carpinteria, CA, USA); Incubação do complexo avidina/biotina, diluído em TRIS gelado (A+B)
Lavagem em solução tampão TRIS HCl, pH 7,4;
Imersão em TRIS HCl pH 7,4, duas trocas de 5 minutos cada;
Aplicação do agente cromógeno diaminobenzidina 25 a 30 mg (3,3 diaminobenzidina, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA), diluída em 100 ml TRIS HCl pH 7,4, acrescida de 1,2 ml de peróxido de hidrogênio 10 volumes durante 3 minutos na câmara escura;
Lavagem em água corrente por 10 minutos; Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
55
Lavagem em água corrente – 10 minutos;
Duas passagens em água destilada por 5 minutos cada; Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
álcool etílico 80°GL (2 minutos) TA; álcool etílico 95°GL (2 minutos) TA; álcool etílico absoluto I (5 minutos) TA; álcool etílico absoluto II (5 minutos) TA; álcool etílico absoluto III (5 minutos) TA;
Diafanização em dois banhos de xilol: xilol 1 (2 minutos) e xilol 2 (2 minutos);
Montagem da lamínula em resina Permount ® (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ, USA).
4.7.2 Análise do perfil imunoistoquímico
A expressão imunoistoquímica do FoxP3 foi analisada em microscópio óptico Nikon® considerando se a localização da expressão imunoistoquímica em região nuclear e a quantidade de células marcadas. Tanto para o LPO quanto para a hiperplasia fibrosa inflamatória a avaliação foi realizada por um único observador, sendo os achados anotados em ficha previamente elaborada (Apêndice C) para posterior análise dos resultados obtidos.
A localização da marcação, definida como a região onde as células marcadas pelo FoxP3 se encontraram, foi classificada em: justaepitelial ou intraepitelial.
A quantidade foi avaliada contando se as células marcadas em 10 campos consecutivos (com aumento de 400x) em cada espécime, para o tecido conjuntivo subjacente e para o epitélio. Para as células justaepiteliais e para as intraepiteliais foi feita uma média representando a quantidade de células marcadas em cada caso, conforme Loddenkemper et al (2009). Os dados de ambas as somas foram expressos em médias ± desvio padrão, conforme Di Stefano et al (2009).
4.8 Análise estatística
O
5.1 Caracterização da amostra
A amostra deste estudo foi composta por 32 casos de líquen plano oral, divididos entre as formas clínicas reticular (17 casos) e erosiva (15 casos), além de 10 casos de hiperplasia fibrosa inflamatória (HFI). Todos os espécimes utilizados na amostra foram obtidos dos arquivos do Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
5.2 Análise morfológica
Foram analisadas as características histopatológicas do LPO corados com hematoxilina e eosina (HE) onde verificou se a presença de epitélio de revestimento do tipo pavimentoso estratificado. A lamina própria papilar e reticular foi composta por tecido conjuntivo fibroso de densidade variada. Em relação às características de ceratinização do epitélio, a maioria dos LPO erosivos foi paraceratinizada (n=11; 73,3%) enquanto a forma reticular se dividiu entre paraceratinizada (n=7; 41,1%) e ortoceratinizada (n=10; 58,9%). Os dados encontram se descritos na Tabela 02. Quanto à presença ou não de hiperceratinização observou se que a maioria dos LPO erosivos foi paraceratinizada/ortoceratinizada (n=11;
59
73,3%) e a grande parte dos LPO reticulares foi hiperparaceratinizada/hiperortoceratinizada (n=12; 70,6%), sendo esta relação estatisticamente significativa ( <0,05) (Tabela 03).
Com relação às características epiteliais verificou se que 20 casos (62,5%) de LPO apresentaram predominância de atrofia (Figura 01). Apesar de não ter havido resultado estatisticamente significativo ( >0,05), verificou se que a maioria dos casos de LPO erosivo (n=12; 80,0%) exibiu este padrão, por sua vez, os LPO reticulares se dividiram entre nove casos (52,9%) demonstrando hiperplasia e oito (47,1%) atrofia, conforme se observa na
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* 11 (100,0%) 7 (100,0%) 5 (100,0%) 9 (100,0%)
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' , 11 (68,8%) 4 (25,0%)
&)* 5 (31,3%) 12 (75,0%)
* 16 (100,0%) 16 (100,0%)
0,032
Tabela 04. Ainda do total, 18 casos (56,3%) exibiram projeções epiteliais em forma de “dentes de serra”, a maior parte dos LPO erosivos não mostrou as projeções (n=9; 60,0%) e a maior parte dos reticulares (n=12; 70,6%) apresentou esse padrão.
De acordo com a presença de exocitose nas lesões, a maioria dos casos de LPO (n=19; 59,4%) apresentou infiltrado inflamatório intraepitelial em quase toda a extensão do epitélio, onde sete (46,7%) foram LPO erosivos e 12 (70,6%) foram do tipo reticular. Verificou se também a presença de corpos de Civatte na região justaepitelial dos espécimes, onde se observou que em oito casos (53,3%) das lesões erosivas houve a presença desta estrutura e ausência em sete (46,7%). Nos LPO reticulares, 13 (76,5%) exibiram corpos de Civatte e quatro (23,5%) não exibiram (Figura 02).
Nos casos de LPO analisados, o tecido conjuntivo fibroso foi predominantemente frouxo, exibindo intenso infiltrado inflamatório predominantemente linfocítico, posicionado em forma de faixa contínua em região justaepitelial. Observou se que dentre os espécimes de LPO erosivos, um caso (6,7%) apresentou a formação de centros germinativos na região mais superficial do tecido conjuntivo. Na forma reticular, três (17,7%) exibiram quantidade variável destas formações.
A análise dos cortes histológicos de hiperplasia fibrosa inflamatória mostrou fragmentos de mucosa oral revestidos por epitélio pavimentoso estratificado com camada córnea de espessura variável, sendo ortoceratinizada ou paraceratinizada, com hiperplasia,
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' , 3 (25,0%) 12 (60,0%)
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* 12 (100,0%) 20 (100,0%)
0,076
61
acantose e exocitose variável. O tecido conjuntivo fibroso subjacente foi predominantemente frouxo, exibindo intenso infiltrado inflamatório, predominantemente mononuclear, situado principalmente em região justaepitelial.
5.3 Análise do perfil imunoistoquímico
A marcação imunoistoquímica para o FoxP3 em região nuclear foi analisada em microscopia de luz, a qual se revelou difusa quanto à sua distribuição, localizando se nas células presentes no infiltrado inflamatório predominantemente linfocítico situado em região justaepitelial, bem como em algumas células inflamatórias intraepiteliais. Nos centros germinativos, verificou se que poucas células imunomarcadas foram encontradas em seu interior e uma maior quantidade de marcação foi encontrada em sua periferia. Nestes casos de marcação positiva, a quantidade de células imunomarcadas ao redor das formações foi semelhante àquela encontrada nas demais áreas dos espécimes (Figura 03).
Foram contadas as células justaepiteliais e intraepiteliais do infiltrado inflamatório imunomarcadas para o FoxP3 em 10 campos consecutivos, sendo obtida uma média para cada caso. Posteriormente, foi encontrada uma média ± desvio padrão de todos os casos de LPO reticular, erosivo e de hiperplasia fibrosa inflamatória. (Figuras 04 a 08). A distribuição Normal dos dados foi constatada pelo teste de Kolmogorov Smirnov.
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9 1
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&)* 17 (40,0) 1,5 ± 2,1 0,421 2,667
' , 15 (36,0) 1,7 ± 2,4 0,304 3,182
63
Como a distribuição dos dados foi Normal em todos os casos, inicialmente aplicou se o teste t de Student para verificar a relação existente entre a imunomarcação para o FoxP3 entre os tipos do LPO e a HFI separadamente, onde não houve diferença estatisticamente significativa ( >0,05). Posteriormente, os dois tipos de LPO foram reunidos (1,6 ± 2,2) e analisados com a HFI (0,5 ± 0,4), revelando uma diferença estatística significativa ( <0,05). A mesma análise foi aplicada avaliando se a quantidade de células marcadas pelo FoxP3 entre o LPO reticular e o erosivo. Este teste revelou não haver diferença estatisticamente significativa entre as formas clínicas de LPO ( >0,05). Estes dados são demonstrados na Tabela 06.
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&)* @ ' , 0,814 1,9192 1,5209
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, * & " N KTOUL
'92& 0 KUL $2 S ',
9 1
$. 0 $%@ 0
&)* 17 (40,0) 0,9 ± 1,7 0,034 1,941
' , 15 (36,0) 0,4 ± 0,4 0,133 0,667
65
Verificou se ainda a relação existente entre a quantidade de células intraepiteliais marcadas pelo FoxP3 entre as formas clínicas de LPO e a HFI, separadamente, entre os dois tipos de LPO reunidos e analisados com a HFI e posteriormente entre o LPO reticular e o erosivo. Nenhum desses testes revelou diferença estatisticamente significativa ( >0,05). Estes dados são demonstrados na Tabela 08.
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&)* @ 6 0,576 0,8900 1,5650
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@ 6 0,889 0,8468 0,9734
