UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
BÁRBARA VANESSA DE BRITO MONTEIRO
ANÁLISE DA RESPOSTA Th17 EM LÍQUEN PLANO ORAL
BÁRBARA VANESSA DE BRITO MONTEIRO
ANÁLISE DA RESPOSTA Th17 EM LÍQUEN PLANO ORAL
Orientadora: Profa. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel
Natal / RN 2012
Monteiro, Bárbara Vanessa de Brito.
Análise da resposta th17 em líquen plano oral/ Bárbara Vanessa de Brito Monteiro. – Natal, RN, 2012.
104 f. : il.
Orientadora: Profª. Drª. Márcia Cristina da Costa Miguel.
Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral.
1. Líquen Plano Bucal – Dissertação. 2. Imunoistoquímica – Dissertação. 3. Interleucina-17 – Dissertação. 4. Interleucina-23 – Dissertação. I. Miguel, Márcia Cristina da Costa. II. Título.
RN/UF/BSO Black D65
A Deus, para quem todas as coisas são. "Minhas imperfeições e fracassos são como uma bênção de Deus, assim como meus
sucessos e meus talentos, e eu coloco ambos a Seus pés" (Mahatma Gandhi);
À minha mãe, Francisca Mirian de Brito, por todo seu amor e compreensão, por acreditar na minha capacidade, nunca medindo esforços para que eu tivesse a melhor educação,
À Professora Doutora Márcia Cristina da Costa Miguel, a minha orientadora, pela fundamental e incansável ajuda na realização desta pesquisa e por todo o conhecimento compartilhado ao longo do Mestrado. Sua conduta de extrema dedicação e competência é inspiradora. Muito obrigada por compreender as minhas limitações, por despertar em mim o interesse não só pela Patologia Oral, mas também pela Imunologia e principalmente, agradeço pelo estímulo a me esforçar sempre mais e mais.
Ao Professor Doutor Gustavo Pina Godoy, por quem sinto imensa admiração e gratidão. O seu brilhante exemplo me ajudou a escolher seguir sua área de atuação. Muito obrigada por toda a ajuda prestada em um momento decisivo da minha vida profissional, pela sua paciência, pelo constante incentivo e por ser sempre tão acessível. Tenho muito orgulho de ter sido sua aluna e de ser sua “pupila”!
Às minhas irmãs Brenda e Bruna Monteiro, pelo amor e pela torcida. Aos meus sobrinhos Heitor e Arthur Jucá e João Pedro Dourado, que iluminam a minha vida e me dão forças para seguir a diante.
A Rodrigo Alves Ribeiro, por todo carinho e cumplicidade, pelas palavras doces nos momentos difíceis e pelo seu exemplo de dedicação na pós-graduação.
À Amélia Dourado, por toda a compreensão e afeição que me dedica.
À minha tia Terezinha Brito, pelo constante incentivo.
A todos os meus queridos amigos, “a amizade é uma predisposição recíproca que torna dois seres igualmente ciosos da felicidade um do outro” (Platão).
A todos os Professores do Programa de Pós Graduação em Patologia Oral da UFRN, Professor Doutor Leão Pereira Pinto, Professora Doutora Lélia Batista de Souza, Professor Doutor Antônio de Lisboa Costa, Professora Doutora Hébel Cavalcanti Galvão, Professora Doutora Lélia Maria Guedes de Queiroz, Professor Doutor Manuel Antonio Gordón-Nuñez, Professora Doutora Ana Miryam Costa de Medeiros, por todo conhecimento compartilhado e pelo exemplo de dedicação e amor à profissão. À Professora Doutora Éricka Janine Dantas da Silveira, pelo entusiasmo notório com que leciona, pela convivência edificante na Clínica de Estomatologia e pelas correções sugeridas no Exame de Qualificação deste trabalho.
A todos os meus colegas do Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN, principalmente Stefânia Ferreira, por ser uma pessoa de enorme coração com quem tenho o privilégio de compartilhar uma casa longe de casa; e aos meus conterrâneos Keila Martha e Joabe Pereira, pela convivência sempre agradável. Agradeço em especial minha estimada turma de Mestrado: Edilmar Moura, Lucileide Castro, Dmitry Sarmento, Pedro Carlos Neto e às queridas: Ana Luiza Andrade, pelo seu bom humor permanente que contagia e por ser sempre tão doce, Denise Hélen por todo carinho, pelas conversas e pelos instantes de descontração, Clarissa Demeda, por ser tão amiga, gentil e estar sempre disposta a ajudar, Roseane Vasconcelos, que me proporciona boas risadas que ajudam a tornar essa caminhada mais leve e Natália Guimarães, com quem convivi nos últimos dois anos muito mais do que com qualquer membro da minha família. Muito obrigada pelo incentivo constante, pela força nos momentos difíceis e por todos os bons momentos compartilhados.
Ao Professor Doutor Cassiano Francisco Weege Nonaka, pela solicitude na análise estatística dos resultados deste trabalho e pelo exemplo de extrema dedicação à pesquisa científica.
Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN, Gracinha, Canindé, Idelzuite, Hévio, Sandrinha, Lourdinha, Ricardo e Patrícia da Clínica de Estomatologia, por serem sempre muito gentis e dispostos a ajudar.
RESUMO
As células Th17 têm sido fortemente associadas com a patogenia de diversas doenças autoimunes e inflamatórias. A IL-17 e a IL-23 são importantes citocinas associadas com esta linhagem. O objetivo do presente trabalho foi analisar, através de métodos imuno-histoquímicos, a imunoexpressão da IL-17 e da IL-23 no infiltrado inflamatório das lesões de líquen plano oral (LPO) comparando ao da hiperplasia fibrosa inflamatória (HFI) e entre as formas clínicas reticular e erosiva do LPO com o intuito de esclarecer se a linhagem Th17 participa da patogênese do LPO. Na amostra foram incluídos 41 casos de LPO, dos quais 23 eram reticulares e 18 erosivos, além de 10 casos de HFI. Os resultados foram submetidos a testes estatísticos não paramétricos com nível de significância de 5%. Na análise histomorfológica das lesões de LPO, observou-se predomínio de: lesões hiperparaceratinizadas, espécimes com epitélio atrófico na forma clínica erosiva (p=0,011), projeções epiteliais nas lesões do tipo reticular, além de corpos de Civatte identificados na maior parte da amostra de ambas as formas clínicas. Para o estudo imuno-histoquímico, cinco campos com forte imunorreatividade para a IL-17 e para a IL-23 foram fotomicrografados sob o aumento de 400x, as fotos foram transferidas para um computador onde com o auxílio do software ImageJ®, realizou-se a contagem dos linfócitos que exibiram imunomarcação citoplasmática para estas citocinas. Posteriormente, foi estabelecida uma média para cada caso. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na quantidade de linfócitos imunopositivos para a IL-17 e para a IL-23 entre o grupo do LPO e da HFI, no entanto uma maior quantidade desses linfócitos para a IL-17 foi encontrada no grupo do LPO (p=0,079) e uma quantidade significativamente maior de linfócitos imunopositivos para a IL-23 foi encontrada entre o grupo do LPO erosivo e da HFI (p=0,019). Além disto, foi observada uma marcante imunopositividade epitelial para a IL-17 no grupo do LPO. Ainda que os resultados do presente estudo não permitam a afirmação contundente da participação da linhagem Th17 nas lesões de LPO, os achados da contagem dos linfócitos imunopositivos para a IL-17 e para a IL-23, que são potentes citocinas pró-inflamatórias, somados à marcante imunopositividade epitelial encontrada para a IL-17 neste estudo, sugerem uma possível participação desta linhagem na patogênese desta desordem.
ABSTRACT
Th17 cells have been strongly associated with the pathogenesis of several autoimmune and inflammatory diseases. IL-17 and IL-23 are important cytokines associated with this lineage. The aim of this study was to analyze, through immunohistochemical methods, the immunoexpression of IL-17 and IL-23 in the inflammatory infiltrate of oral lichen planus (OLP) lesion compared to that of inflammatory fibrous hyperplasia (IFH) and between clinical forms reticular and erosive of OLP. The sample included 41 cases of OLP, of which 23 were reticular and 18 erosive and 10 cases of IFH. The results were subjected to nonparametric statistical tests with a 5% significance level. In OLP lesions histomorphological analysis, the most common findings were: hyperparakeratinization, specimens with atrophic epithelium in erosive clinical form (p = 0.011), epithelial projections in most of reticular type of lesions, in addition Civatte bodies were identified in most samples of both clinical forms. For immunohistochemistry analysis, five fields with strong immunoreactivity for IL-17 and IL-23 were photomicrographed at 400x magnification, images were transferred to a computer where with ImageJ software®, lymphocytes that exhibited cytoplasmic immunostaining for these cytokines were counted. A mean was established after for each case. There was no statistically significant difference in the number of imunopositive lymphocytes for IL-17 and IL-23 among the group of OLP and IFH group, however a larger amount of lymphocytes imunopositive for IL-17 was found in the LPO group (p = 0.079) and significantly higher amounts of those lymphocytes were found in the erosive OLP when compared to the group of reticular OLP and IFH (p = 0.019). Furthermore, a marker epithelial immunopositivity for IL-17 was observed in OLP group. Although the results of this study do not permit the forceful assertion about the participation of Th17 lineage in OLP lesions, the findings of immunopositive lymphocytes counting for IL-17 and IL-23, which are potent proinflammatory cytokines, together with the the marked epithelial immunopositivity found for IL-17 in this study, suggest a possible role of this lineage in the pathogenesis of this disorder.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Diferenciação das células TCD4+ em Th1, Th2, Th17 ou Treg de acordo com as citocinas presentes no meio, fatores de transcrição característicos de cada linhagem bem como as principais citocinas que são produzidas por cada subptipo de células TCD4+... 41 Quadro 1. Especificidade, no do catálogo, fabricante, diluição, recuperação
antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários utilizados no estudo... 50 Gráfico 1. Distribuição da amostra quanto ao tipo de lesão. Natal – RN,
2012... 55 Gráfico 2. Box-plot relativo ao número de linfócitos imunopositivos para a IL-
23 de acordo com o tipo de lesão. Natal – RN, 2012... 62 Figura 2. Fotomicrografias de espécimes de LPO exibindo: A)
hiperparaceratinização HE (200x); B) epitélio de revestimento atrófico HE (200x) e; C) projeções epiteliais hiperplásicas HE (100x)... 64 Figura 3. Fotomicrografia demonstrando corpos apoptóticos (corpos de
Civatte) em lesão de LPO (HE, 400x)... 65 Figura 4. Fotomicrografia exibindo formação de centros germinativos em
lesão de LPO (HE, 100x)... 65 Figura 5. Fotomicrografia exibindo a imunoexpressão da IL-17 no infiltrado
inflamatório de LPO. Linfócitos imunopositivos (setas) (LSAB, 400x)... 66 Figura 6. Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão da IL-17 em LPO,
destacando-se a imunomarcação das células epiteliais (LSAB, 400x)... 66 Figura 7. Fotomicrografia revelando células endoteliais (setas pretas) e
macrófagos (setas brancas) exibindo imunopositividade para a IL-17 (LSAB, 400x)... 67 Figura 8. Fotomicrografia exibindo imunoexpressão da IL-17 no infiltrado
Figura 9. Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão da IL-23 no infiltrado inflamatório de espécime de HFI (LSAB, 400x)... 68 Figura 10. Fotomicrografia exibindo a imunoexpressão da IL-23 no infiltrado
inflamatório e em algumas células epiteliais de espécime de LPO. Destaca-se os linfócitos imunomarcados (setas) e ainda uma marcação pericelular (LSAB, 400x)... 68 Figura 11. Fotomicrografia revelando imunoexpressão da IL-23 em infiltrado
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Distribuição absoluta e relativa e significância estatística das características de ceratinização epitelial em relação à forma clínica de LPO. Natal – RN, 2012... 56 Tabela 2. Distribuição absoluta e relativa e significância estatística da espessura
epitelial em relação à forma clínica de LPO. Natal – RN, 2012... 56 Tabela 3. Distribuição absoluta e relativa e significância estatística do tipo de
projeções epiteliais em relação à forma clínica de LPO. Natal – RN, 2012... 57 Tabela 4. Distribuição absoluta e relativa e significância estatística da presença
ou ausência de corpos de Civatte em relação à forma clínica de LPO. Natal – RN, 2012... 57 Tabela 5. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos,
soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para o número de linfócitos imunopositivos para IL-17 em relação ao tipo de lesão. Natal – RN, 2012... 59 Tabela 6. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos,
soma dos postos, estatística KW e signigicância estatística (p) para o número de linfócitos imunopositivos para IL-17 em relação às HFIs e às formas clínicas do LPO. Natal – RN, 2012... 59 Tabela 7. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos,
soma dos postos, estatística U e significância estatística (p) para o número de linfócitos imunopositivos para IL-17 em relação à espessura epitelial nas lesões de LPO. Natal – RN, 2012... 60 Tabela 8. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos,
Tabela 9. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos, estatística KW e significância estatística (p) para o número de linfócitos imunopositivos para a IL-23 em relação às HFIs e às formas clínicas de LPO. Natal – RN, 2012...
61
LISTA DE ABREVIATURAS
LP Líquen Plano LPO Líquen Plano Oral
CD Cluster of Diferentiation - Unidade de diferenciação Th T Helper - Células T auxiliares
IL Interleucina
HIV Human immunodeficiency virus - Vírus da imunodeficiência humana MHC Major Histocompatibility Complex - Complexo principal de
histocompatibilidade INF-γ Interferon gama
TNF-α Tumor Necrosis Factor alfa - Fator de necrose tumoral α APC Antigen-Presenting Cell - Célula apresentadora de antígeno CCR Receptor para quimiocinas da família CC
CC Quimiocinas da família CC
MMP Matrix Metalloproteinases - Metaloproteinases da matrix NF-κB Nuclear Fator kappa B - Fator nuclear kappa B
OMS Organização Mundial da Saúde Treg Célula T reguladora
Tγδ Linfócitos T gamma-delta
TCR T Cell Receptor - Receptor da célula T
TGF β Transforming Growth Factor beta - Fator transformador do crescimento beta.
kDa Kilodálton
IL-17R Receptor para IL-17
Act-1 Proteína ativadora do fator de transcrição NF-κB
TRAF6 TNF receptor associated factor 6 - Fator 6 associado ao receptor de TNF STAT Signal Transducers and Activators of Transcription - Transdutor de
sinal e ativador da transcrição
T-bet Membro da família de fatores de transcrição T-box GATA-3 Fator de transcrição da linhagem Th2
RORγ Factor Retinoic Acid-Related Orphan Receptor gamma - Fator de transcrição das células Th17
mRNA Mesenger Ribonucleic Acid - Ácido Ribonucléico mensageiro HFI Hiperplasia Fibrosa Inflamatória
G-CSF Granulocyte colony-stimulating factor – Fator estimulador de colônias de granulócitos
IL-23R Receptor para IL-23
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 25
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 28
2.1 LÍQUEN PLANO ORAL ... ...28 2.1 RESPOSTA Th17 ... 36 3. PROPOSIÇÃO ... 45
4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 47
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ... 47 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO ... 47 4.3 POPULAÇÃO ... 47 4.4 AMOSTRA ... 47 4.4.1 Critérios de Inclusão da Amostra ... 48
4.4.2 Critérios de Exclusão da Amostra ... 48
4.5 ESTUDO MORFOLÓGICO ... 49 4.6 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO ... 49 4.6.1 Método imuno-histoquímico ... 49
4.6.2 Análise do perfil imuno-histoquímico ... 52
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 52 5. RESULTADOS ... 55
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ... 55 5.2 RESULTADOS DA ANÁLISE HISTOMORFOLÓGICA ... 55 5.3 RESULTADOS DA ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA ... 58 5.3.1 Análise da imunoexpressão da IL-17 ... 58
5.3.2 Análise da imunoexpressão da IL-23 ... 60
5.3.2 Correlação da imunoexpressão da IL-17 com a da IL-23 ... 63
7. DISCUSSÃO ... 71
8. CONCLUSÕES ... 85
ANEXO ... 99
1 INTRODUÇÃO
O Líquen Plano (LP) é uma desordem mucocutânea inflamatória crônica, imunologicamente mediada e de etiologia não determinada que pode afetar a pele, a genitália e as membranas mucosas orais (EISEN et al., 2005; AL-HASHIMI et al., 2007; ANURADHA et al., 2008). O Líquen Plano Oral (LPO) é relativamente comum e afeta duas vezes mais mulheres do que homens (SUGERMAN et al., 2002; EISEN, 2002; XUE et al., 2005), além de exibir lesões que raramente sofrem remissão espontânea. Ao contrário das lesões cutâneas, as lesões orais são mais resistentes ao tratamento e, portanto, são mais difíceis em se obter o alívio da sintomatologia (SANTORO et al., 2004; EISEN et al., 2005).
Inúmeros estudos têm detectados níveis elevados de IL-17 e IL-23 em doenças autoimunes e inflamatórias como a artrite reumatóide (ADAMOPOULOS et al., 2011; NIU et al., 2011), psoríase (LI et al., 2008; KOGA et al., 2008; NOGRALES et al., 2008; RIZZO et al., 2011), esclerose múltipla (WANG et al., 2011; CHEN et al., 2012), síndrome de Sjögren (NGUYEN et al., 2008; MIELIAUSKAITE et al., 2012), doença celíaca (HARRIS; FASANO; MANN, 2008), colite ulcerativa (MOHAMMADI et al., 2011) e lúpus eritematoso sistêmico (OH et al., 2011; EDELBAUER et al., 2012), dentre outras. No entanto, um único estudo em LP cutâneo buscou o possível papel da resposta Th17 nesta desordem (SHAKER; SAAD, 2011).
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 LÍQUEN PLANO ORAL
O Líquen Plano Oral (LPO) é uma doença inflamatória crônica, relativamente comum e com prevalências relatadas que variam de 0,5 a 4% (SUGERMAN et al., 2002; EISEN et al., 2005; AL-HASHIMI et al., 2007). Pacientes de todas as idades podem ser afetados, porém a lesão é mais comum em pessoas de meia idade e idosos, com pico de prevalência na quinta e sexta décadas de vida (CARBONE et al., 2009; CARROZZO; THORPE, 2009; FERNÁNDEZ-GONZÁLEZ et al., 2010; EBRAHIMI; NYLANDER; VAN DER WAAL, 2011). Além disso, observa-se uma forte predileção pelo sexo feminino (GORSKY et al., 2004; FERNÁNDEZ-GONZÁLEZ et al., 2010).
O Líquen Plano (LP) pode acometer a pele, os anexos cutâneos e as membranas mucosas (SCULLY; CARROZZO, 2008). Na maioria dos casos, o LP cutâneo causa prurido, é auto-limitado e as lesões são descritas como pápulas pruriginosas, arroxeadas e poligonais que normalmente são encontradas nas superfícies flexoras das extremidades (EISEN et al., 2005; AL-HASHIMI et al., 2007; ANURADHA et al., 2008; CARBONE et al., 2009). No couro cabeludo pode causar áreas de alopecia e nas unhas podem produzir adelgaçamento e separação das mesmas (SCULLY; CAROZZO, 2008). É comum o envolvimento da mucosa oral no LP bem como em outras desordens mucocutâneas, esta área pode ser tanto a região da apresentação inicial de tais desordens bem como o único local de acometimento (JAAFARI-ASHKAVANDI et al., 2011; ANURADHA et al., 2011).
Seis formas clínicas de LPO foram descritas: reticular, em placa, papular, atrófico, erosivo e bolhoso. Enquanto a forma reticular é geralmente assintomática e os portadores podem nem perceber a presença da lesão, as lesões atrófico/erosivas podem causar profundo desconforto. O número e o grau de ulceração variam, bem como o tamanho e a localização das lesões (KARATSAIDIS et al., 2003; CARROZZO; THORPE, 2009; CARBONE et al., 2009). No entanto, não é incomum que o mesmo paciente apresente mais de uma forma do LPO (EDWARDS; KELSCH, 2002).
LPO (EISEN et al., 2005; KALMAR, 2007). Já a forma erosiva é bem menos comum e as lesões são áreas atróficas e de eritema com zonas centrais variáveis de erosão ou ulceração. De forma geral, são lesões difusas, avermelhadas e que podem exibir estrias ceratóticas esbranquiçadas circundando a lesão. Essas estrias irradiam perifericamente e são usualmente evidentes nas margens das zonas atróficas da lesão. A gengiva inserida é comumente envolvida e, nestes casos, é referida como “gengivite crônica descamativa” (KALMAR, 2007; ANURADHA et al., 2008).
O LPO também pode ocorrer sob a forma de placas esbranquiçadas que se assemelham a leucoplasia oral, cujo aspecto pode variar de ligeiramente elevadas e suaves a levemente irregulares e multifocais. O LPO sob a forma de placas abrange apenas 7% dos casos e é mais comum em fumantes. Além disso, semelhante à forma reticular, geralmente é assintomática. Já a forma bolhosa surge como bolhas e vesículas pequenas que se rompem facilmente, e quando há a ruptura, a superfície torna-se ulcerada e dolorosa. É a forma mais rara do LPO (ANURADHA et al., 2008).
De forma geral, as lesões de LPO podem surgir em qualquer local da cavidade oral, mas a mucosa jugal posterior é o local mais comum de envolvimento, seguido pelas bordas laterais da língua, gengiva, mucosa labial e vermelhão do lábio inferior. Lesões no palato, assoalho bucal e lábio superior são incomuns (CARROZZO; THORPE, 2009; EBRAHIMI; NYLANDER; VAN DER WAAL, 2011).
Os critérios para o diagnóstico clínico do LPO incluem a presença de lesões brancas reticulares bilaterais e simétricas, enquanto as demais lesões podem ser atróficas, erosivas, bolhosas ou se manifestar sob a forma de placas, e normalmente, aparecer junto às lesões reticulares em determinadas áreas de cavidade oral. Se ambos os critérios forem encontrados, pode-se considerar um LPO típico (FERNÁNDEZ-GONZÁLEZ et al., 2010). Para Scully e Carozzo (2008), o LPO que se apresentar como lesões brancas clássicas pode ser diagnosticado clinicamente de forma segura se existirem outras lesões clássicas na pele ou em outros sítios extraorais. No entanto, a biópsia oral com exame histopatológico é recomendada para confirmar o diagnóstico clínico e, principalmente, para excluir displasia e malignidade.
antirretrovirais utilizados na terapia do HIV. Restaurações de amálgama também podem causar estas lesões, que nestes casos, são mais comumente encontradas na região da mucosa oral que esteja em contato direto com o material. Adicionalmente, alimentos como a canela podem provocar estomatites semelhantes a reações liquenóides, porém com aspectos histopatológicos que podem ajudar a diferenciar do LPO, como a presença de um infiltrado inflamatório mais profundo e perivascular. Ao contrário do LPO, a maioria das reações liquenóides apresenta resolução após a descontinuação do agente causador (AL-HASHIMI et al., 2007; SCULLY; CAROZZO, 2008; SCHLOSSER, 2010; MÜLLER, 2011).
No que concerne à etiopatogenia do LPO, muitos aspectos ainda permanecem pouco esclarecidos. Vários fatores têm sido implicados na etiologia e várias hipóteses têm sido propostas para a patogênese da lesão. No passado, as especulações sobre a etiopatogenia envolviam uma gama de possibilidades, incluindo trauma, sífilis e outras infecções bacterianas, parasitas, vírus, alergias, toxicidade, além de distúrbios neurogênicos, psicossomáticos e hereditários (ANURADHA et al., 2008; ROOPASHREE et al., 2011). Ainda não foi determinado se as alterações psicológicas observadas nos pacientes com LPO podem constituir um fator etiológico direto ou representam apenas uma consequência do desconforto crônico que pode estar associado aos portadores de LPO. Por si só, este desconforto pode ser um fator de estresse e, parcialmente explicar essa associação (CAROZZO; THORPE, 2009).
Atualmente, sabe-se que o desencadeamento da resposta imune inflamatória nas lesões de LPO provavelmente está associado com um antígeno, ainda não identificado, que pode ser um auto-antígeno ou um antígeno exógeno (LODI et al., 2005; FARHI; DUPIN, 2010). De acordo com Lodi et al. (2005) muitas evidências sugerem a existência de uma desregulação imunológica na patogênese desta desordem, especificamente envolvendo a parte celular do sistema imune. Além disso, sabe-se que ambos os mecanismos antígeno-específicos e não específicos estão envolvidos no LPO (SUGERMAN et al., 2002). A resposta imune específica para o antígeno desconhecido que desencadeia a resposta imune do LPO envolve três passos: (1) a migração dos linfócitos citotóxicos TCD8+ para o epitélio; (2) apresentação do antígeno pelos ceratinócitos basais e ainda; (3) ativação destes linfócitos que, uma vez ativados, destróem os ceratinócitos basais (SUGERMAN et al., 2002; ROOPASHREE et al., 2011).
basais apoptóticos e um infiltrado de células TCD4+ na lâmina própria. No entanto, o fator desencadeante da apoptose e o mecanismo destas respostas imunes ainda são desconhecidos. Tem sido sugerido que, os linfócitos TCD8+ presentes nas lesões de LPO podem ser ativados por um antígeno presente nos ceratinócitos basais associados ao MHC de Classe I, consequentemente promovendo a apoptose dos ceratinócitos (FAHRI; DUPIN, 2010).
Embora as células TCD8+ citotóxicas sejam mais prevalentes e tenham um papel bem definido na patogenia do LPO, as células TCD4+ auxiliares também parecem possuir importante função na patogênese da lesão. No estudo de Khan et al. (2003), 20 a 40% das células mononucleares presentes no infiltrado inflamatório das lesões de LPO eram TCD4+. Além disso, os autores encontraram ocasionais células TCD4+ próximas aos ceratinócitos basais das lesões estudadas.
Para Lodi et al. (2005), as células de Langerhans e os ceratinócitos basais podem apresentar um antígeno associado ao MHC classe II para as células TCD4+ auxiliares, que secretam IL-2 e INF-γ e a produção local de INF-γ pode manter a expressão do MHC classe II pelos ceratinócitos, contribuindo assim para a cronicidade do LPO. Ainda, a alta expressão antigênica, a coexpressão de CD40 e CD80 e a secreção de IL-12 pelas células que apresentam o antígeno (células apresentadoras de antígeno - APCs) via MHC de Classe II aos linfócitos TCD4+, podem promover uma resposta TCD4+ do tipo Th1 com a produção de IL-2 e INF-γ.
Existem controvérsias quanto ao número de antígenos que desencadeiam a resposta imune no LPO, pois tanto as células TCD4+ auxiliares quanto as TCD8+ citotóxicas são ativadas na lesão quando antígenos são apresentados pelo MHC de classe II e MHC de classe I, respectivamente. Os antígenos apresentados pelo MHC de classe II são processados através de uma via endossomal celular. Em contraste, os antígenos apresentados pelo MHC de Classe I são processados através de uma via citosólica celular. Portanto, o suposto antígeno apresentado pelo MHC de Classe II para as células TCD4+ pode ser diferente do que é apresentado pelo MHC de Classe I para as células TCD8+ citotóxicas. Alternativamente, um antígeno único pode obter acesso tanto à via endossomal quanto citosólica celular da apresentação de antígeno (SUGERMAN et al., 2002; LODI et al., 2005).
ainda; (3) a infusão de granzima B pelas células T nos ceratinócitos através dos poros membranares induzidos pela perforina (KHAN et al., 2003; LODI et al., 2005; FAHRI; DUPIN, 2010). Todos esses mecanismos ativam a cascata da caspase e resultam na apoptose dos ceratinócitos (SUGERMAN et al, 2002).
O estudo de Santoro et al. (2004) encontrou um pronunciado recrutamento de linfócitos TCD8+ citotóxicos no LPO. O número de linfócitos que expressavam moléculas citotóxicas como a granzima-B e a perforina foi significativamente maior quando comparado com espécimes de mucosa normal, indicando que há um recrutamento ativo das células citotóxicas nessa condição. Tais células foram particularmente abundantes na interface entre o epitélio e o tecido conjuntivo e mostravam proximidade com os ceratinócitos basais, estes exibiam evidências morfológicas de dano celular sob a forma de vacuolização citoplasmática e apoptose.
A participação de mecanismos não específicos na patogenia do LPO inclui: quimiocinas, a degranulação de mastócitos, a ativação de metaloproteinases da matriz (MMPs), a perda da integridade da membrana basal epitelial (SUGERMAN et al., 2002; ROOPASHREE et al., 2010). As quimiocinas são citocinas pró-inflamatórias produzidas por várias células, incluindo linfócitos T ativados, ceratinócitos orais e mastócitos. Os receptores CCR1, CCR3, CCR4, CCR5 e CCR10, que são receptores de superfície para quimiocinas da família RANTES (CC), foram identificados em mastócitos presentes nas lesões de LP. Acredita-se que as quimiocinas secretadas pelas células epiteliais lesionais do LPO possam atrair mastócitos e, subsequentemente, estimular sua degranulação. Os mastócitos degranulados liberam TNF-α e quimase, que regulam positivamente a secreção de quimiocinas pelas células T lesionais do LPO. Esse mecanismo cíclico seria uma explicação adicional para justificar a cronicidade do LPO. Além disso, a quimase, que é uma protease dos mastócitos, é uma conhecida ativadora de MMPs (SUGERMAN et al., 2002; ZHAO et al., 2002; ROOPASHREE et al., 2010).
Assim, os ceratinócitos apoptóticos não são mais capazes de desempenhar a sua função. Portanto, a apoptose dos ceratinócitos que foi desencadeada pelos linfócitos TCD8+ citotóxicos pode resultar em rompimento da membrana basal epitelial no LPO, o que permite que os linfócitos T não específicos presentes na zona subepitelial migrem para o epitélio (ROOPASHREE et al., 2010).
Mazarella et al. (2006) encontraram altos níveis de MMPs em lesões de LPO, e os autores observaram ainda, que a expressão das MMPs -1 e -3 estava aumentada na forma erosiva do LPO quando comparada com as lesões reticulares. O estudo de Gunduz et al. (2006) também encontrou alta expressão de MMP-9 no infiltrado inflamatório de amostras de LP cutâneo.
No estudo de Santoro et al. (2003), a ativação do fator nuclear kappa B (NF-κB), um fator de transcrição envolvido na patogênese de muitas doenças inflamatórias crônicas, foi observada tanto nas células epiteliais quanto nos linfócitos do LPO, comprovando a participação de mecanismo de inflamação na patogênese da lesão.
À parte dos mecanismos antígenos-específicos e não específicos descritos na literatura, outros diversos achados apoiam a intervenção de uma resposta autoimune nas lesões de LPO: a cronicidade da doença, o início na fase adulta, maior prevalência no sexo feminino e a associação com outras doenças autoimunes (FAHRI; DUPIN, 2010; ROOPASHREE et al., 2010).
O estudo de Charazinska-Carewicz et al. (2008) corrobora o conceito da etiopatogenia autoimune do LPO. Tais autores demonstraram que a porcentagem de células imunocompetentes no sangue periférico de pessoas com LPO diferiram dos valores normais e essas diferenças também dependeram da forma clínica da lesão. Nos pacientes afetados, a principal alteração foi uma diminuição das células T auxiliares naïves (CD4+CD45RA+), acompanhado de um aumento das células T auxiliares de memória (CD4+CD45R0+). O desequilíbrio entre as subpopulações de linfócitos pode levar a um prejuízo das funções de supressão da resposta imune e tal achado pode refletir uma diferenciação das células TCD4+ auxiliares nos estágios iniciais da etiopatogenia do LPO. Nos pacientes com a forma erosiva da lesão, observou-se uma diminuição das células T citotóxicas no sangue periférico, especialmente da sua subpopulação naïve. Os achados deste estudo podem ser justificados pela excessiva estimulação antigênica, pela alteração das funções supressoras e estes achados também podem ser observados em desordens autoimunes.
receptores do TNF-α (que é uma citocina pró-inflamatória que possui importante papel no início e na progressão das lesões de LPO) e fornece sinais de coestimulação para uma resposta imune secundária. Tais linfócitos estavam localizados profundamente na lâmina própria, o que, segundo os autores, sugeriu um mecanismo semelhante ao de outras doenças autoimunes como a síndrome de Sjögren, onde o homing destes linfócitos CD27+ para os tecidos glandulares é um evento chave na patogênse da doença. Estes linfócitos migrariam da linfa para os tecidos cutâneos e provocariam alterações teciduais semelhantes às encontradas em doenças autoimunes. Este achado, para os autores, implica a participação de mecanismos autoimunes na patogenia da lesão.
Lukač et al. (2006) encontraram altas concentrações de auto-anticorpos anti-desmogleína-1 e anti-desmogleína-3 em paciente com LPO erosivo. Tal achado indicou que anticorpos circulantes anti-ceratinócitos podem, segundo os autores, estar envolvidos na patogênese dessa forma clínica do LPO. A diferença nas concentrações dos autoanticorpos pode indicar tanto uma diferença nos mecanismos imunopatogênicos envolvidos nas formas reticular e erosiva do LPO ou simplesmente refletir diferenças na patofisiologia dessas formas clínicas. Para Roopashree et al. (2010), a presença de auto-anticorpos indicam que a imunidade humoral também desempenha um papel nas lesões de LPO.
No que tange ao diagnóstico definitivo das lesões de LP, um exame clínico acurado e avaliação histopatológica são necessários. Além disso, todas as formas clínicas do LPO devem ser monitoradas em períodos regulares para a possível detecção de quaisquer alterações displásicas em estágios iniciais (JAAFARI-ASHKAVANDI et al., 2011). Os critérios histopatológicos para diagnóstico da lesão incluem: a existência de uma banda de infiltrado inflamatório linfocítico no tecido conjuntivo subepitelial, degeneração da camada basal e ausência de displasia epitelial (WAN DER MEIJ; VAN DER WAAL, 2003). As lesões que apresentarem esses três critérios são consideradas como LPO típico na perspectiva histológica. No entanto, outros achados epiteliais comuns são hiperplasia, hiperceratose, acantose e a presença de ceratinócitos apoptóticos (FERNÁNDEZ-GONZÁLEZ et al., 2010). Estes ceratinócitos são chamados de corpos de Civatte e são células epiteliais degeneradas que são observadas como corpos eosinofílicos e ovóides, com sinais de condensação nuclear e por vezes circundados com um halo claro, na interface entre o epitélio e o tecido conjuntivo, nas camadas basal e parabasal (ACAY et al., 2006; BRANT; VASCONCELOS; RODRIGUES, 2008).
2009). Além disso, fendas subepiteliais (fendas de Max-Joseph) podem ser formadas em consequência da inflamação na interface epitélio-conjuntivo (LEHMAN; TOFFELSON; GIBSON, 2009). Porém, nas biópsias de LPO erosivo muitas das características da lesão podem estar ausentes e chegar a um diagnóstico histopatológico definitivo pode ser difícil (MÜLLER, 2011). Em tal situação, Anuradha et al. (2011) defende o uso da imunofluorescência direta que, segundo os autores, pode prover importantes critérios diagnósticos adicionais para lesões orais crônicas, ulcerativas ou erosivas e podem ser utilizadas como uma ferramenta adicional para o diagnóstico do LPO, desde que a biópsia seja representativa e possua epitélio associado. O achado deste exame para o LPO é deposição linear e, ocasionalmente granular, de fibrinogênio ao longo da camada basal do epitélio. No entanto, os autores admitem que além do alto custo para a realização deste exame, a análise histopatológica permanece como o exame padrão ouro para avaliar a maioria destas doenças.
Além das evidências de autoimunidade, em 1978 a Organização Mundial da Saúde (OMS) classificou o LPO como uma desordem potencialmente maligna. Para Acay et al. (2006) lesões potencialmente malignas são aquelas que ocorrem em um tecido morfologicamente alterado. Para analisar o potencial maligno é importante considerar que a ativação de oncogenes e inativação de genes supressores de tumor ocorre precocemente na carcinogênese. Assim, mesmo que a neoplasia não possa ser detectada clínica e morfologicamente, a lesão pode já estar sofrendo a fase inicial de carcinogênese.
Para Ebrahimi, Nylander e Van Der Waal (2011), a transformação do epitélio em câncer é baseada em uma complexa série de mutações genéticas, resultando em perda dos mecanismos de controle celular como a apoptose, e consequentemente, alterações na diferenciação celular. Alterações na expressão de algumas proteínas envolvidas nesses mecanismos celulares são necessários para que haja o desenvolvimento do câncer e também, podem prover uma possível explicação para a transformação maligna que tem sido relatada no LPO.
No entanto, o mecanismo exato da transformação maligna do LPO ainda não foi esclarecido (EBRAHIMI; NYLANDER; VAN DER WAAL, 2011) e embora tenha sido reconhecido pela OMS, o potencial de pré-malignidade do LPO e as chances reais para tal transformação são questões de grande discussão. Assim, estudos têm demonstrado diferentes proporções de potencial de malignidade do LPO, em geral variando entre 0 a 5.3% (ISMAIL; KUMAR; ZAIN, 2007) e muitos autores têm aceitado o conceito que o LPO é realmente uma lesão potencialmente maligna (ACAY et al., 2006; FARHI; DUPIN, 2010).
Levando-se em conta a prevalência do LPO e o potencial desta doença crônica para causar um desconforto significativo, é importante que os profissionais fiquem atentos às apresentações clínicas e ao manejo da lesão (EDWARDS; KELSCH, 2002). O tratamento das lesões depende da sintomatologia, da extensão do envolvimento clínico extra e intraoral, além da história médica, dentre outros fatores. Pacientes com lesões reticulares ou outras formas assintomáticas, usualmente não requerem nenhum tratamento ativo, mas deve ser instituído um bom programa de higiene oral, principalmente nos pacientes com LPO gengival (SCULLY; CARROZZO, 2008; SCHLOSSER, 2010).
Embora não haja cura para o LPO, muitas opções de tratamento tópico e sistêmico têm sido utilizadas com resultados variáveis, mas faltam estudos que avaliem a eficácia de tais medicamentos (SCHLOSSER et al., 2010). Os medicamentos corticosteróides tópicos são as drogas de escolha para o tratamento de doenças orais inflamatórias e autoimunes e devem ser utilizados nos casos de lesões sintomáticas de LPO (SCATTARELLA et al., 2011). De acordo com Schlosser (2010), de forma geral, o tratamento deve ser instituído apenas para o LPO erosivo, atrófico ou sintomático. Pacientes com formas menos graves da doença podem apresentar boa resposta a corticosteróides ou outros medicamentos tópicos e uma vez que o controle da doença seja alcançado, os pacientes devem restringir a frequência do uso dos medicamentos com base nos sintomas. Já os pacientes com lesões disseminadas, gengivite descamativa ou múltiplo envolvimento mucocutâneo da doença podem exigir o uso de terapia imunomodulatória sistêmica.
2.2 RESPOSTA Th17
combatem patógenos infecciosos e em células TCD4+ regulatórias (Treg) que possuem atividade imunossupressiva e são consideradas importantes reguladoras da imunidade adaptativa, pois promovem a autotolerância (KURTS, 2008; PECK; MELLINS, 2009).
A diferenciação das células TCD4+ naïves em efetoras é iniciada pela ligação do receptor das células T (TCR) e de moléculas coestimuladoras na presença de citocinas específicas produzidas pela imunidade inata quando há presença de patógenos específicos. O INF-γ e a IL-12 iniciam a diferenciação em células Th1, que são caracterizadas pela alta produção de INF-γ, mediam a imunidade celular e são indispensáveis na eliminação de patógenos intracelulares. Em contraste, a IL-4 estimula a diferenciação em células Th2 que estão envolvidas na imunidade humoral, pois ajudam os linfócitos B a produzir anticorpos e são produtoras de IL-4, sendo responsáveis pela organização da defesa do hospedeiro contra patógenos extracelulares (HARRINGTON et al., 2005; HARRINGTON; MANGAN; WEAVER 2006; KORN et al., 2009).
A resposta imune inata contra antígenos microbianos é a fonte inicial de fatores de diferenciação para as células Th1, enquanto que para as células Th2, estas fontes seriam antígenos parasitas ou alérgenos. As citocinas que são produzidas subsequentemente pelas células Th1, como o INF-γ e pelas células Th2, como a IL-4, podem servir para amplificar o tipo celular específico e posteriormente, favorecer a diferenciação no subtipo específico de células T (KORN et al., 2009).
Após a descoberta inicial dos subtipos Th1 e Th2, grandes esforços foram feitos para identificar o subtipo de células TCD4+ que induziria a autoimunidade órgão-específica. Várias evidências geradas com modelos de autoimunidade em animais e com a observação de pacientes com desordens autoimunes suportaram a idéia do envolvimento das células Th1 e das citocinas associadas a esse subtipo celular na indução de inflamação autoimune e injúria tecidual (BETELLI; OUKKA; KUCHROO, 2007).
Recentemente, o paradigma Th1/Th2 foi expandido devido à descoberta de um terceiro subgrupo de células TCD4+ auxiliares efetoras que produzem IL-17, as células Th17, que exibem funções efetoras distintas das células Th1 e Th2. A identificação das citocinas necessárias para a diferenciação e expansão e dos fatores de transcrição envolvidos na geração desse subtipo celular, estabelecem firmemente as células Th17 como uma linhagem independente de células TCD4+ auxiliares (KORN et al., 2009).
diferenciadas não produzem IL-17 e, de fato o IFN-γ e a IL-4 inibem a diferenciação das células Th17. Assim, foi proposto que as células TCD4+ produtoras de IL-17 representam uma nova linhagem de células T CD4+ que parecem ser muito importantes na patogênese de doenças autoimunes (CHEN; LAURENCE; O’SHEA, 2007).
Desde a identificação desta nova linhagem, muitos progressos foram feitos no sentido de compreender o desenvolvimento e na definição do tipo de imunidade que é mediada por esse subtipo de células T. As diferentes subpopulações de células TCD4+ possuem funções distintas e evoluíram para combater infecções por patógenos específicos, principalmente os causadores de infecções bacterianas intestinais, onde se descobriu que respostas do tipo Th17 são suscitadas e precisam ser produtivas para que haja eliminação destes patógenos, presumivelmente porque as respostas Th1 e Th2 não são protetoras nessas condições. Os mecanismos moleculares pelos quais a resposta imune adaptativa é desviada na direção de uma resposta Th17 parecem estar, em parte, na habilidade dos padrões moleculares associados ao patógeno específico em estimular as células do sistema imune a produzir citocinas, especificamente a IL-23, que favorece o desenvolvimento das células Th17. Tal subtipo complementaria a resposta Th1 na imunidade contra patógenos intracelulares e a Th2 na resposta contra helmintos (COOKE, 2006; KORN et al., 2009). Além disto, acredita-se que a linhagem Th17 também desempenhe um papel protetor contra uma variedade de outros patógenos, além dos intestinais, que incluem antígenos bacterianos, virais e fúngicos nas diferentes superfícies mucosas (GAFFEN; HAJISHENGALLIS, 2008; CURTIS; WAY, 2009).
Para Costa, Mattana e Silva (2010), o papel protetor nas infecções bacterianas e fúngicas estaria associado à produção de citocinas pró-inflamatórias e subsequente ativação de macrófagos e neutrófilos. Adicionalmente, a IL-17 também pode ter uma função regulatória limitando o acúmulo e a atividade dos neutrófilos durante os processos inflamatórios através da atenuação do efeito anti-apoptótico de outras citocinas pró-inflamatórias.
pró-inflamatório (KOLLS; LINDEN, 2004; COOKE, 2006; WEAVER et al., 2007; KORN et al., 2009).
A IL-17 é uma citocina homodimérica de 20 a 30 kDa que age principalmente em células endoteliais e macrófagos, induzindo a produção aumentada de quimiocinas e citocinas (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2008). Nos humanos, esta citocina é produzida principalmente pelas células TCD4+, no entanto, pode ser produzida em menores quantidades por linfócitos TCD8+, monócitos, neutrófilos, basófilos, mastócitos e células Natural killers (STARNES et al., 2001; FERRETTI et al., 2003; WITOWSKI; KSIAZEK; JÖRRES, 2004; KORN et al., 2009; STRZEPA; SCCZEPQNIK, 2011). Adicionalmente, a subpopulação linfocítica T γδ também é capaz de produzir a IL-17 independentemente da exposição prévia a antígenos e tão logo haja a ligação ao TCR. No entanto, sabe-se que a maior fonte desta citocina são os linfócitos TCD4+ da linhagem Th17 (WEAVER et al., 2007; JENSEN; SU; SHIN, 2008). Os mecanismos que levam à produção da IL-17 por outros tipos celulares além dos linfócitos TCD4+ permanecem desconhecidos (PUWIPIROM et al., 2010)
A IL-17A humana é o principal membro da família das citocinas IL-17, que inclui cinco outros tipos: IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E e IL-17F. Pouco se sabe sobre IL-17B, IL-17C e IL-17D, que são produzidas por fontes não relacionadas às células T. A IL-17E foi renomeada para IL-25 e a IL-17F compartilha muitas características com a IL-17A (WEAVER et al., 2007; COSTA; MATTANA; SILVA, 2010). A IL-17A e a IL-17F atuam através do receptor IL-17R, que é uma proteína transmembrana, composta por duas subunidades (IL-17RA e IL-17RC), que atua via Act1, que é uma proteína ativadora do fator de transcrição NF-κB, e via TRAF6 (TNF receptor associated factor 6) para induzir a expressão de citocinas e quimiocinas (CHANG; DONG, 2009). A subunidade IL-17RA é amplamente expressa em células epiteliais, endoteliais, bem como em células do sistema imune (TOY et al., 2006). Sabe-se ainda, que o gene que codifica a IL-17 se localiza no cromossomo 6 e possui uma pequena sequência promotora de aproximadamente 250 pares de bases. No entanto, a sequência exata de aminoácidos que entra em contato com o seu receptor (IL-17R) ainda não foi definida (COSTA; MATTANA; SILVA, 2010).
Embora os mecanismos moleculares que regem o desenvolvimento das células Th17 ainda não estejam bem esclarecidos (WYNN, 2005), sabe-se que o primeiro passo para a ativação de qualquer subtipo de células T está relacionado aos sinais que emanam da ocupação do TCR. Tais sinais são, portanto, importantes para a diferenciação das células Th17 e de fato, a ocupação do TCR é suficiente para as células Th17 de memória produzirem grandes quantidades de IL-17 (CHEN et al., 2007). Além dos sinais TCR-dependentes, um aspecto importante da diferenciação de células TCD4+ são as citocinas presentes no meio. Atualmente, sabe-se que a presença de IL-6, IL-23 e TGF-β são fatores chave na promoção da diferenciação das células TCD4+ naïves em células Th17 (KORN et al., 2007).
Langrish et al. (2005) sugeriram que a principal fonte de células Th17 seriam as células TCD4+ estimuladas pela IL-23, que é uma citocina heterodimérica constituída por duas subunidades, uma subunidade exclusiva de 19kDa (p19) e outra de 40kDa (p40) que compartilha com outra citocina, a IL-12 (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2008). A subunidade p19 é composta por 4 éxons e 3 íntrons, cujo gene está localizado na região cromossômica 12q13.2, enquanto a subunidade p40 consiste de 8 éxons e 7 íntros, codificados por um gene presente na região 11q1.3 (COSTA; MATTANA; SILVA, 2010).
Cesare, Meglio e Nestle (2009) afirmaram que recentes estudos genéticos também têm fornecido evidências do papel da IL-23 no desenvolvimento de doenças autoimunes. O estudo de Harrington et al. (2005) avaliou se a IL-23 estimularia a produção de IL-17 em células Th1 e Th2 totalmente diferenciadas e observaram que esta citocina tem pouco efeito sob esses subtipos de células TCD4+. Assim, surgiram algumas das primeiras evidências de que o alvo da IL-23 seria as células TCD4+ naïves em um ponto anterior à diferenciação em Th1 ou Th2.
As citocinas presentes no microambiente sinalizam através do STAT (transdutor de sinal e ativador da transcrição) ou outros indutores para iniciar a diferenciação das células TCD4+. Esses fatores aumentam a expressão dos fatores de transcrição específicos das linhagens que funcionam promovendo a diferenciação do subtipo específico além de inibirem a diferenciação em linhagens alternativas. Há extensa regulação cruzada entre estes fatores de transcrição que determinam as várias linhagens (DONG, 2011) e acredita-se que o antagonismo entre as linhagens mediado pelas células TCD4+ totalmente diferenciadas sobre os precursores naïves sirva para sustentar respostas linhagem-específicas durante a defesa do hospedeiro contra diferentes classes de antígenos (PECK; MELLINS, 2009).
o FoxP3 (PECK; MELLINS, 2009).Conforme as células Th1, Th2 e Tregs, as células Th17 expressam seletivamente um fator de transcrição linhagem-específico, este fator é o RORγ (Retinoid-Acid Receptor-related Orphan Receptor gamma), o qual se acredita que também seja necessário para a produção de IL-17 (IVANOV et al., 2006). Este fator de transcrição pertence à superfamília de receptores nucleares de esteróides e está mais estreitamente relacionado a um receptor de ácido retinóico (RAR) (EBERL; LITTMAN, 2003).
O RORγt (Retinoid-Acid Receptor-related Orphan Receptor gamma t) e RORγ são produzidos no locus Rorc, diferem em suas sequências terminais (através do uso de diferentes promotores) e pelo seu padrão de expressão. Embora o RORγ seja amplamente expresso, o RORγt só é expresso nas células hematopoiéticas (DZHAGALOV; ZHANG; HE, 2004) e no estado fisiológico, é expresso predominantemente nas células T da lâmina própria (CHEN et al., 2007) (FIGURA 1).
Figura 1: Diferenciação das células TCD4+ em Th1, Th2, Th17 ou Treg de acordo com as
citocinas presentes no meio, fatores de transcrição característicos de cada linhagem bem como as principais citocinas que são produzidas por cada subtipo de células TCD4+. Fonte: Adaptado de Iwakura e Ishigame (2006).
discrepantes ao tentar identificar os fatores críticos para a diferenciação desta linhagem em humanos. Portanto, em seu trabalho, os autores buscaram identificar a melhor condição para a diferenciação das células Th17 humanas e esclarecer o possível papel do TGF-β na diferenciação desta linhagem. Para tanto, isolaram células TCD4+ naïves de amostras de cordão umbilical e as mantiveram em cultura. Estas células foram então tratadas com diferentes concentrações de citocinas (TGF-β, IL-1, IL-6, IL-23 e IL-21) e posteriormente, foram analisadas as expressões dos genes característicos e das citocinas pela reação em cadeira polimerase em tempo real (RT-PCR) quantitativa e pelo método ELISA, respectivamente. Os autores encontraram que a combinação de TGF-β, IL-23 e IL-6, nas células em cultura, pode ser considerada como a melhor condição para o desenvolvimento das células Th17 humanas quando comparado com o tratamento com as outras citocinas estudadas. Os autores sugerem ainda, que seus achados evidenciam que o TGF-β pode ser considerado um regulador positivo da diferenciação das células Th17 humanas somente se aplicado em concentrações proporcionais.
Já Fujisawa et al. (2011), buscaram investigar o papel do RORγt nos estágios iniciais da diferenciação celular das células T, para tanto, utilizaram linfócitos derivados de células-tronco hematopoiéticas que foram transplantados em camudongos para posterior análise. Os autores encontraram que um experimento forçando a expressão do RORγt induzia o aumento da expressão de células TCD4+ FoxP3+. No entanto, as células T FoxP3+ eram RORγt-. Logo, o aumento das células T Foxp3+ e a supressão imune observada nos camudongos não foi um efeito direto do RORγt, e sim uma reação contra as células Th17 que haviam proliferado em decorrência da expressão aumentada deste fator de transcrição. Tal reação, segundo os autores, visou manter a homeostase imune e como o RORγt não mostrou habilidade em promover a diferenciação das células TCD4+ naïves em Tregs, o número aumentado das células Tregs encontrado nos camundongos foi associado a causas como, por exemplo, uma compensação ao aumento das células Th17. Os autores também sugeriram que há uma grande interação entre as células Th17 e Tregs e que, nesta interação, há implicações para a supressão das funções das células Th17 e ainda, que os resultados encontrados podem facilitar o desenvolvimento de novas abordagens para as desordens autoimunes causadas pela linhagem Th17.
reumatóide e observaram um desequilíbrio numérico e funcional das células Th17 e Tregs. O microambiente rico em citocinas pró-inflamatórias levou a um aumento na diferenciação das células Th17 e diminuição das Tregs, o que contribuiu para desencadear a autoimunidade e induzir a inflamação. Para os autores, tais achados sugerem um potencial papel do desequilíbrio entre as células Th17 e Tregs na patogênese e na progressão da artrite reumatóide.
Li et al. (2007) verificaram que a expressão de mRNA de IL-17 e IL-23 estava aumentada nas biópsias de lesões de pele de pacientes com psoríase quando comparada com biópsias de pele sem lesões e de pele normal de pacientes não afetados. Para os autores, a superexpressão das citocinas associadas com a resposta Th17 desempenham um importante papel na patogênese da psoríase.
No lúpus eritematoso sistêmico, acredita-se que a inflamação tecidual induzida pela IL-17 amplifique o dano tecidual e contribua para a quebra da tolerância dos pacientes afetados, uma vez que a IL-17 possui potentes propriedades pró-inflamatórias. Acredita-se que a participação desta citocina está intimamente relacionada com a patogênese da doença, pois contribui para a disfunção imune e para os eventos imunomediados que danificam os órgãos-alvo (CRISPÍN; TSOKOS, 2010).
Alta produção de IL-23 foi identificada em indíviduos afetados pela doença celíaca (HARRIS; FASANO; MANN, 2008). A doença celíaca é uma doença autoimune que afeta principalmente o intestino e na qual se acreditava que a patogênese estava associada com respostas do tipo Th1. No entanto, a descoberta da resposta Th17 levou a uma reavaliação dos mecanismos que provocavam o dano tecidual mediado por células nesta doença (COSTA; MATTANA; SILVA, 2010). Já no modelo experimental da esclerose múltipla, a encefalomielite experimental autoimune, sabe-se que as células Th17 desempenham um papel crucial no desenvolvimento da doença, onde cabe à IL-17 a função de induzir a expressão de produtos pró-inflamatórios nas células-alvo (ZEPP; WU; LI, 2011).
3 PROPOSIÇÃO
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O estudo foi submetido ao Sistema Nacional de Ética na Pesquisa (SISNEP) e ao Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP-UFRN) e foi aprovado sob o parecer no 362/2011 em reunião deste comitê em setembro de 2011. 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
O estudo caracterizou-se como uma avaliação descritiva realizada pela observação, análise e registro das características histopatológicas das lesões de LPO e da expressão imuno-histoquímica da IL-17 e da IL-23 em espécimes de LPO e de HFI.
4.3POPULAÇÃO
A população foi composta por todos os casos de LPO e de HFI diagnosticados e arquivados no Setor de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
4.4 AMOSTRA
LPO, dos quais 23 casos foram classificados como reticulares e 18 casos eram lesões erosivas, além de 10 casos de HFI. As lesões de LPO foram consideradas reticulares quando foram descritas nas fichas clínicas dos pacientes como: assintomáticas, com linhas brancas entrelaçadas ou como pápulas e as erosivas como lesões eritematosas, ulceradas e com sintomatologia associada (apresentando dor e/ou ardor), conforme Neville et al. (2009) e Carrozzo e Thorpe (2009). Todos os casos de HFI selecionados para o estudo exibiam intenso infiltrado inflamatório justaepitelial, com o intuito de se fazer uma análise comparativa das imunoexpressões das citocinas estudadas, tendo em vista que tanto a HFI quanto o LPO são lesões de mucosa oral que podem exibir intenso infiltrado inflamatório subepitelial, porém exibem distintas patogenias.
4. 4. 1 Critérios de inclusão da amostra
⇒ Foram incluídos os espécimes diagnosticados histopatologicamente como LPO que permitiam a caracterização nas formas clínicas reticular ou erosiva de acordo com as informações clínicas disponíveis e os espécimes de hiperplasia fibrosa inflamatória oral que, histopatologicamente, exibiam intenso infiltrado inflamatório disposto em região subepitelial.
⇒ Foram incluídos os espécimes que tinham material suficiente nos blocos de parafina para a realização do estudo.
4.4.2 Critérios de exclusão da amostra
4.5ESTUDO MORFOLÓGICO
Foi realizada análise histopatológica dos espécimes de LPO sob microscopia de luz, nos aumentos de 40x, 100x e 400x, em cortes de 5 µm de espessura, dispostos em lâminas de vidro e corados pela técnica da hematoxilina e eosina, onde foram analisadas características histomorfológicas como: tipo de ceratinização, espessura epitelial, presença e tipo de projeções epiteliais (hiperplásicas ou em dentes de serra), corpos de Civatte (observados como corpos eosinofílicos e ovóides, com sinais de condensação nuclear e circundados com um halo claro os quais estavam localizados principalmente na interface entre o epitélio e o tecido conjuntivo), intensidade e distribuição do infiltrado inflamatório e presença de centros germinativos. A avaliação foi realizada por um único observador e para isto foram utilizados os critérios de diagnóstico histopatológicos definidos pela Organização Mundial de Saúde (OMS) em 1978 e modificados por van der Meij e van der Waal (2003). Tais critérios são:
⇒ Presença de infiltrado inflamatório bem-definido, disposto em faixa, confinado à parte superficial do tecido conjuntivo e constituído em sua maior parte por linfócitos;
⇒ Sinais de degeneração liquefativa da camada basal do epitélio; ⇒ Ausência de displasia epitelial.
4.6 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
4.6.1 Método imuno-histoquímico
estreptoavidina-biotina (LSAB+ System HRP, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), utilizando os anticorpos primários anti-IL-17 e anti-IL-23 (QUADRO 1).
Como controle positivo para os anticorpos anti-IL-17 e anti-IL-23 foram utilizados cortes de tecido tonsilar. O controle negativo consistiu na substituição dos anticorpos primários por albumina de soro bovino (BSA) a 1% em solução tampão.
Quadro 1. Especificidade, nº catálogo, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários utilizados no estudo.
A técnica utilizada seguiu o protocolo descrito abaixo:
⇒ Desparafinização: 2 banhos em xilol, à temperatura ambiente (10 minutos cada); ⇒ Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis:
• Álcool etílico absoluto I (5 minutos); • Álcool etílico absoluto II (5 minutos); • Álcool etílico absoluto III (5 minutos); • Álcool etílico 95°GL (5 minutos); • Álcool etílico 80°GL (5 minutos);
⇒ Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95°, à temperatura ambiente (10 minutos);
⇒ Lavagem em água corrente (10 minutos) Especificidade
e Clone
No do Cátologo Fabricante Diluição Recuperação Antigênica
Incubação
IL-17(H-132) sc-7927 Santa Cruz Biotechnology
1:75
Citrato pH 6,0, Pascal 121 oC, 3 minutos
60’
IL-23(P-19) NPBI-01958 Novus
Biologicals 1:400
Citrato pH 6,0, Pascal 121 oC, 3 minutos
⇒ Duas passagens em água destilada (5 minutos cada); ⇒ Recuperação antigênica (Quadro 1);
⇒ Lavagem em água corrente (10 minutos);
⇒ Duas passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
⇒ Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada); ⇒ Incubação dos cortes com os anticorpos primários anti IL-17 e anti-IL-23 em solução diluente (Antibody diluent with background reducing components, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA);
⇒ Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada); ⇒ Incubação com anticorpo secundário (Biotinylated link universal, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos);
⇒ Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada); ⇒ Incubação com complexo estreptoavidina-HRP (Streptavidin-HRP, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos);
⇒ Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada); ⇒ Revelação da reação com solução cromógena de 3,3-diaminobenzidina (Liquid DAB+ Substrate, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA) (7 minutos);
⇒ Lavagem em água corrente (10 minutos); ⇒ Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
⇒ Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente (5 minutos); ⇒ Lavagem em água corrente (10 minutos);
• Desidratação em cadeia ascendente de etanóis: • Álcool etílico 80°GL (2 minutos);
• Álcool etílico 95°GL (2 minutos); • Álcool etílico absoluto I (5 minutos); • Álcool etílico absoluto II (5 minutos); ⇒ Álcool etílico absoluto III (5 minutos);
⇒ Três passagens em xilol (2 minutos cada);
4.6.2 Análise do perfil imuno-histoquímico
Os espécimes foram analisados sob microscopia de luz (Olympus CX41, Olympus Japan Co., Tokyo, JPN) por um examinador previamente treinado, o qual durante a avaliação não teve acesso sobre qual o tipo de lesão que estava sendo analisada, conforme adaptado do estudo de Oh et al. (2011). Sob o aumento de 100x, foram selecionados cinco campos de maior imunorreatividade aos anticorpos anti-IL-17 e anti-IL-23, de acordo com a metodologia adaptada de Peixoto et al. (2012). Sob o aumento de 400x, cada um destes campos foi fotomicrografado com auxílio de uma câmera acoplada a um microscópio (Olympus EVOLT E-330, Olympus Japan Co., Tokyo, JPN), as imagens obtidas foram transferidas para um computador através do sistema Olympus MasterTM 2. Com auxílio do programa Imaging Processing and Analysis in Java (ImageJ®, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA), em cada um destes 5 campos, foi realizada a contagem dos linfócitos imunopositivos presentes no infiltrado inflamatório subepitelial das lesões de LPO e HFI, sendo considerados como imunomarcados os linfócitos que exibiam coloração marrom, independente da intensidade, em região citoplasmática conforme metodologia adaptada de Zhang et al. (2010). Para cada caso, foi estabelecida uma média de linfócitos imunopositivos para posterior comparação.
4.7ANÁLISE ESTATÍSTICA
imunopositivos para IL-17 e IL-23 entre as lesões de LPO e as HFIs foram realizadas por meio do teste não paramétrico de Mann-Whitney. Por sua vez, as análises das medianas dos linfócitos imunopositivos para IL-17 e IL-23 em relação às características histomorfológicas das lesões de LPO (tipo de ceratinização, espessura epitelial, presença e tipo de projeções epiteliais, presença de corpos de Civatte e presença de centros germinativos) também foram realizadas por meio do teste não paramétrico de Mann-Whitney. As comparações das medianas dos linfócitos imunopositivos para IL-17 e IL-23 entre lesões de LPO reticular, LPO erosivo e HFI foram realizadas por meio do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis.
Para todos os testes estatísticos empregados no presente estudo, o nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05).
5 RESULTADOS
5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
No presente estudo, foram incluídos 41 casos de LPO, dos quais 23 estavam descritos nas fichas clínicas dos pacientes como lesões assintomáticas, com linhas brancas entrelaçadas ou como pápulas e, portanto, foram classificados como a forma clínica reticular. Em 18 casos, as lesões estavam descritas como eritematosas, ulceradas e com sintomatologia associada, se encaixando nos critérios clínicos para lesões erosivas. Adicionalmente, compuseram a amostra 10 casos de HFI que, histologicamente, exibiam intenso infiltrado inflamatório justaepitelial (GRÁFICO 1).
18 35%
10 20%
23 45%
LPO reticular LPO erosivo HFI
Gráfico 1. Distribuição da amostra quanto ao tipo de lesão. Natal - RN, 2012.
5.2 RESULTADOS DA ANÁLISE HISTOMORFOLÓGICA
