Contribuição ao estudo dos processos descontínuo e descontínuo alimentado de fermentação...

FACULDADE DE CIENCIAS FARMACtUTICAS

Cuno de Pós-Graduação em TecDologia Bioquimico-Farmacêutica Área de TecDologia de Fermeotaçõel

CONTRIBUIÇAO

AO ESTUDODOS PROCESSOS

DESCONT(NUO

E DESCONT(NUO

ALIMENTADO

DE FERMENT

AÇAOALCOOLlCA

JOÃO CARLOS MOY\TEIRO DE CARVALHO

Tese para obtenção do grau de

DOUTOR Orientador:

Prol. Titular EUGENIO AQUARONE

II

Contribuição

ao estudodos

processos

descontínuo e descontínuo alimentado

de

fermentaçãoalcoólica--Tesepara a obtençãodograude Doutor

ComissãoJulgadora

Prot. Tit. Eugênio Aquarone

Presidentee Orientador

Prot. Dr. José Glauco Grandi

,

o E:-:aminador

20 E:-:aminador

Prot. Dr. Reynaldo Naeeo

30 Examinador

Prot. Assoe. Sunao Sato

40 Examinador

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RESlJMO i

ABS'fR.ACT ü

NO~NCLA 11JRA iü

1. IN1RODUÇÃO 1

2. OBJETIVOS 5

3. REVISÃO BffiUOORÁFICA 6

4. MA1'ERIAIS E ~TODOS " .18

4.1 - MA'fÉRIA PRillA '"'''''' , 18

4.1.1- Mosto .. ... ... ... .... .. ..."...18

4.2- mÓCULO... " .18

4.3 - EQUIP~NTO 19

4.4- DESCRIÇÃODEUMEXPE~NTO TÍPICO 19

4.4.1- Análisedasamostras 21

4.4.1.1 - Técnicas analíticas ...,"'" ..21

4.4.1.1.1 - Medida do valor do pH 21

4.4.1.1.2 - Medida de acidez total " " 22

4.4.1.1.3 - Detenninação da concentração celular 22

4.4.1.1.4 - DetemUnaçãoda concentraçãode ART " ..22

4.4.1.1. 5 - Detenninação da concentração de etanol 24

4.4.1.2 - Métodos de cálculo '"'''''''''' ...25

4.4.1.2.1 - Cálculo do volwne presente na doma (VD) 25

4.4.1.2.1.1 - Cálculo do volwne presente na doma para o processo descon1Ínuo

clássico 25

4.4.1.2.1.2 - Cálculo do volwne presente na doma para o processo descon1Ínuo

alimentado .25

4.4.1.2.2 - Cálculo do volwne celular na doma (VX) 26

4.4.1.2.3- Cálculodo volwnede Hquidona doma (VL) 26 4.4.1.2.4 - Cálculoda massacelularsecana doma ~ 26

4.4.1.2.5 - Cálculodas massasde ART 26

4.4.1.2.5.1 - Cálculo da massa de ART adicionada à doma (MSA) 26 4.4.1.2.5.1.1 - Cálculo da MSA para o processo descon1Ínuoclássico 26 4.4.1.2.5.1.2 - Cálculo da massa de ART adicionada à doma para o processo

descontínuo alimentado 27

fer-(MSC) ... ... ,... .27 4.4.1.2.6- Cálculoda massade etanolna faseliquidado meiode fennentação

~) ... ... ... ... ,...27

4.4.1.2.7- Cálculodo rendimentoem etanol " ..28 4.4.1.2.8 - Cálculoda produtividadeem etanol 28 4.4.1.2.9 - Cálculodo parâme1rorelacionadocomproduçãode células 28 4.4.1.2.10- Cálculoda produtividadeem células 28

4.5 - ANÁliSE ooS RESlILTADOS .29

5. RESlILTADOS... ... .30

5.1- RESlIL TAOOS 00 GRUPO I

PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENTADO

1'E=5h; K=O,6h-l ;~O'=l 000g ".. ." 33

5.1.1 - Experimento nútnero 1 " ...34

5.1.2- Experimentonútnero2. ... ... ... ... .36

5.1.3- Experimentonútnero3 .38

5.1.1- Apresentaçãodosresultadosobtidosno grupoI deexperimentos 40

5.1.2- Comentáriospreliminaressobreo grupoI ..40

5.11- RESlILTADOS DO GRUPO 11

PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENTADO

1'E=5h ;K=0,6h-1 ;~O'=1300g""'''''''''''' '"'''''''''''''''''''''' .41

5.2.4 - Experimento nútnero 4 ..42

5.2.5 - Experimento nÚInero5 ..44

5.2.6 - Experimento nútnero 6 ... ... .46

5.11.1- Apresentação dos resultados obtidos no grupo 11de experimentos 48 5.11.2 - Comentários prefuninares sobre o grupo 11 48 5.m - RESlILT ADOS DO GRUPO m

PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENTADO

1'E=5h ;K=O,8h-l ;~O'=1 000g 49

5.3.7 - Experimento nÚInero7 50

5.3.8 - Experimento nútnero 8 ~2

5.IV

-

PROCESSODESCONTÍNUOALIMENfADO

1'E=5h;K=O,8h-l;l\.1XO'=1300g ... ... ..57

5.4.10- Experimentonúmero 10.. 58

5.4.11- Experimentonúmero 11 60

5.4.12- Experimentonúmero12... 62

5.IV .1 - Apresentaçãodosresultadosobtidosno grupoIV de experimentos 64 5.IV.2- Comentáriospreliminaressobreo grupoIV ..64

5.V - RESULTADOS DO GRUPO V

PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENf ADO

1'E=4h ;K=O,6h-l ;l\.1XO'=I000g "'"'''''''''''''''''' ,.. ...65

5.5.13 - Experimento número 13 , 66

5.5.14 - Experimento nútnero 14 .68

5.5.15- Experimentonúmero 15 "... 70

5.V.l - Apresentaçãodos resultadosobtidosno grupoV de experimentos 72 5.V.2 - Comentáriospreliminaressobreo grupoV 72

5.VI - RESULTADOS DO GRUPO VI

PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENf ADO

1'E=4h ;K=O,6h-l ;l\.1XO'=1300g 73

5.6.16 - Experitnento nútnero 16 74

5.6.17- Experimentonúmero17 76

5.6.18- Experimentonútnero18 78

5.VI.1 - Apresentaçãodosresultadosobtidosno grupoVI de experimentos 80 5.VI.2 - Comentáriospreliminaressobreo grupoVI 80

5.vn - RESULTADOS DO GRUPO vn

PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENf ADO

1'E=3h ;K=O,6h-l ;l\.1XO'=I000g ,...""""" '''''''''''''''''' , 81

5.7.19 - Experimento número 19 " '''''' " 82

5.7.20 - Experitnento nútnero 20 ." 84

5.VIII - RESULTADOS DO GRUPO VIII PROCESSO DESCONTíNuo ALIMENTADO

TE=3h ;K=0,611-1;1vfXO'=1300g 89

5.8.22- ExperhnentonÚIllero22 " 90

5.8.23- ExperimentonÚIllero23 92

5.8.24 - Experhnento nÚIllero24. 94

5.VIII .1 - Apresentação dos resultados obtidos no grupo VIII de experimentos 96

5.VIII.2 - Comentáriospreliminaressobreo grupoVIII 96

5.IX - RESULTADOS DO GRUPO IX

PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENTADO

TE=3h ;K=0,611-1;1\1XO'=1600g ..".. ..,... """"""'"'''''''''''' ..97

5.9.25- ExperimentonÚIllero25 "'"'''''''''''''' 98

5.9.26- ExperimentonÚIllero26"'''''''''''''''' 100

5.9.27 - Experimento nÚIllero27 102

5.IX .1 - Apresentação dos resultados obtidos no grupo IX de experimentos l 04 5.IX.2- Comentáriospreliminaressobreo grupoIX"'''''''''''''''''''''''''''''''''''''' 104

5.X - RESULTADOS DO GRUPO X

PROCESSO DESCONTíNuo ALIMENTADO

TE=3h ;K=0,611-1;1\1XO'=2100g .., 105

5.10.28 - Experhnento nÚIllero28 ... ".. "'"'''''''' 106

5.10.29- ExperimentonÚJnero29 ""'"'''''''''''''' 108

5.10.30- Experimentonúmero30 11O

5.X..l - Apresentaçãodos resultadosobtidosno grupoX de experimentos 112 5.X.. 2 - Comentáriospreliminaressobreo grupoX ..112

5.XI - RESULTADOS DO GRUPO XI

PROCESSO DESCONTíNuo ALIME~" ADO

TE=3h ;K=0,Sh-l ;1vfXO'=I000g '''''''''''''' .." ..113 5.11.31 - Experimento nÚIllero 31 '"'' '"'' """""" 114

5.11.32 - Experimento número 32 ,"""'''''''''''''' ..116

5.xn - RESULTAOOS00 GRUPOxn

PROCESSODESCONTÍNUOALIMENTAOO

TE=3h ;K=0,8h-l ;f\.fXO'=1300g .121

5.12.34- ExperimentonÚlnero34 ..122

5.12.35- ExperiInentonÚlnero35 ..124

5.12.36- ExperimentonÚlnero36. .126

5.xn.l - Apresentaçãodosresultadosobtidosno grupoxn deexperimentos 128

5.xn.2 - Comentáriospreliminaressobreo grupoxn .128

5.xm - RESULTAOOSDO GRUPOxm PROCESSODESCONfÍNUO ALIMENTAOO

TE=3h ;K=0,8h-l ;1\.1XO'=I600g , ...129

5.13.37- ExperiInentonÚlnero37 .130

5.13.38- ExperimentonÚlnero38 132

5.13.39- ExperimentonÚlnero39 134

5.xm .1 - Apresentaçãodosresultadosobtidosno grupoxm deexperimentos 136

5.xm.2 - Comentáriospre1iIninaressobreo grupoxm ..136

5.XIV- RESULTAOOS00 GRUPOXIV PROCESSODESCONfÍNUO ALIMENTADO

TE=3h ;K=0,8h-l ;f\.fXO'=2100g .137

5.14.40- ExperimentonÚlnero40 .138

5.14.41- Experimentoniunero41 ... .140

5.14.42- ExperimentonÚlnero42 142

5.XIV .1 - Apresentaçãodosresultadosobtidosno grupoXIV de experimentos .144 5.XIV.2- Comentáriosprelinrinaressobreo grupoXIV .144

5.XV - RESULTAOOS 00 GRUPO XV PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENTADO

TE=3h ; K=1,2h-l ;f\.fXO'=I000g .145

5.15.43- Experimentoniunero43 .146

5.15.44- ExperimentonÚlnero44 .148

5.XVI - RESULTADOS DO GRUPO XVI

PROCESSODESCONTíNuo ALIMENTADO

TE=3h ;K=1,2h-l ;?\.1XO'=1300g ..153

5.16.46- Experimentoniunero46 ,.. 154

5.16.47- ExperjInentoniunero47 156

5.16.48- Experimentoniunero48 ..".. ""'"'''''''' " ...158 5.XVI.l - Apresentaçãodosresu1w1osobtidosno grupoXVI de experimentos 160 5.XVI.2 - Comentáriospre1inúnaressobreo grupoXVI .160

5.XVII - RESULTADOS DO GRUPO XVII

PROCESSODESCONTíNuo ALIMENTADO

TE=3h ;K =1,2h-l ;?\.1XO'=I600g """""'''''' '''''''''' ""'"'' '"'''' ..161

5.17.49- ExperjInentoniunero49 162

5.17.50- ExperimentonÚInero50 .. .., '''''''''''''''''''''''''' ..164

5.17.51- Experimentoniunero51 ..166

5.XVII.1 - Apresentaçãodosresultadosobtidosno grupoXVII de experimentos ..168 5.XVII.2- Comentáriospreliminaressobreo grupoXVII 168

5.XVIII - RESULTADOS DO GRUPO XVIII PROCESSO DESCONTíNuo ALIMENTADO

TE=3h ;K=1,2h-l ;?\.1XO'=2100g '"'''''''''' .."... .169

5.18.52 -Experimento nÚInero52 ". " " .170

5.18.53 - Experimento niunero 53. .172

5.18.54- Experimentoniunero54 174

5XVIII.l - Apresentaçãodos resultadosobtidosno grupoXVIIIde experimentos 176 5.XVIII.2 - Comentáriospreliminaressobreo grupoXVIII ..176

5.XIX - RESULTADOS DO GRUPO XIX PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENTADO

TE=3h ;K=1,6h-l ;?\.1XO'=I000g"'''''''''''''' ..177

5.19.55- ExperimentonÚIneroS5 """ """""" ". ...178

5.19.56 - Experimento nÚInero 56 ... ... .180

5.XX - RESULTADOS 00 GRUPO XX PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENTADO

TE=3h ; K=1,6h-l ;~O'=1300g .185

5.20.58- ExperimentonÚInero58 ..186

5.20.59- ExperiInentonÚInero59 .. 188

5.20.60- ExperimentonÚInero60 " , 190

5.XX .1 - Apresentaçãodos resultadosobtidosno grupoXX de experimentos ..192

5.XX.2- Comentáriospreliminaressobreo grupoXX... ..192

5.XXI- RESULTADOS00 GRUPOXXI PROCESSODESCONTÍNUOALIMENTADO

TE=3h ;K=1,6h-l ;~O'=I600g ..193

5.21.61- ExperimentonÚInero61 .194

5.21.62- ExperimentonÚInero62 , .1%

5.21.63- ExperimentonÚInero63 198

5.XXI.l - Apresentaçãodos resultadosobtidosno grupoXXI de experimentos 200 5.XXI.2- Comentáriospreliminaressobreo grupoXXI 200

5.XXII - RESULTADOS 00 GRUPO XXII PROCESSO DESCONTÍNUO ALIMENTADO

TE=3h ;K=1,6h-l ;~O'=21 OOg ..201

5.22.64 - Experimento nÚInero64 ., ..202

5.22.65 - Experimento nÚInero65.. ..204

5.22.66 - Experimento nÚInero66 ..206

5.XXII .1 - Apresentação dos resultados obtidos no gI11pOXXII de experiInentos 208 5.XXII. 2 - Comentários preliminares sobre o grupo XXII 208 5.xxm - RESULTADOS 00 GRUPO xxm

PROCESSO DESCONTÍNUO CLÁSSICO

~O'=I000g 209

5.23.67 - ExperiInento nÚInero67. ...210

5.23.68 - Experimento nÚInero68 .212

5.XXIV - RESULTADOS DO GRUPO XXIV PROCESSO DESCONTÍNUO CLÁSSICO

1\{X0'=1300g "0 ... ... .217

5.24.70- ExperimentonÚInero70 , ..218

5.24.71- ExperimentonÚInero71 .." .220

5.24.72- ExperimentonÚInero72 ..222

5XXIV.1 - Apresentaçãodosresultadosobtidosno grupoXXIVde experimentos 224 5.XXIV.2 - Comentáriospreliminaressobreo grupoXXIV 224

5.XXV - RESULTADOS DO GRUPO XXV PROCESSO DESCONTÍNUO CLÁSSICO

1\{X0'= 1600g o o"""""""""" o. o """""""""""""""""""" .225

5.25.73- ExperimentonÚInero73 ." ..226

5.25.74 - Experimento número 74 .228

5.25.75 - Experimento número 75 .230

5.XXV.l - Apresentação dos resultados obtidos no grupo XXV de experimentos 232 5.XXV.2 - Comentários preliminares sobre o grupo XXV 232 5.XXVI - RESULTADOS DO GRUPO XXVI

PROCESSO DESCONTÍNUO CLÁSSICO

1\{X0'=21 00g .233

5.26.76- Experimentonúmero76 ..234

5.26.77 - Experimento nÚInero77 " 236

5.26.78- ExperimentonÚInero78 .238

5.XXVI.1 - Apresentaçãodos resultadosobtidosno grupoXXVIde experimentos 240 5.XXVI.2 - Comentáriospreliminaressobreo grupoXXVI 240

6 - DISCUSSÃO DOS RESULTADOS 241

6.1- INTRODUÇÃO... ,.. ..241

6.2- PRODUÇÃODEETANOL 247

6.2.1 - Produção de etanol pelo processo descontínuo alimentado 247 6.2.1.1. - Produção de etanol pelo processo descontínuo alimentado, para cada

6.2.1.1.2 - Produtividade e rendimento em etanol em função da massa de inóculo,

para TE = 4 horas. .251

6.2.1.1.3 - Produtividade e rendimento em etanol em fimção da constante de

tem-po e da massa de inóculo, para TE = 3 horas. 255

6.2.1.2 - Produção de etanol pelo processo descontínuo alimentado: Análise con-joota das três variáveis estudadas: tempo de enchimento, constante de tempo e

massa de inóculo. ...262

6.2.2 - Produção de etanol pelo processo descontínuo clássico. 272 6.2.3 - Verificação de relação entre produtividade em etanol e rendimento em etanol. 281

6.3 - PRODUÇÃO DE CÉLlJl.AS 284

6.3.1 - Produção de células pelo processo descontínuo alimentado 284 6.3.1.1 - Produção de células pelo processo descontínuo aJimentado,para cada

tem-po de enchimento ('TE) .285

6.3.1.1.1 - Produtividade em células e fator de conversão de substrato em células

(Yxls) em fimção da constante de tempo e da massa de inóculo, para TE =5 horas 285 6.3.1.1.2 - Produtividade em células e fator de conversão de substrato em células

(Yxls) em fimção da massa de inóculo, para TE= 4 horas. 288 6.3.1.1.3 - Produtividade em células e fator de conversão de substrato em células

(Yxls) em fimção da constante de tempo e da massa de móculo, para TE = 3 horas 291 6.3.1.2 - Produção de células pelo processo descontínuo alimentado: Análise

conjoo-ta das três variáveis estudadas: tempo de enchimento, consconjoo-tante de tempo e massa

de móculo .297

6.3.2 - Produção celular pelo processo descontínuo clássico. 310 6.4 - VERIFICAÇÃO DE RELAÇÃO ENlRE PRODUTIVIDADES EM CÉLlJl.AS E EM

ETANOL. .315

7. CONCLUSÕES ... ...317

8. REFERtNCIASBffiUOORÁFICAS... ... .319

Foram estudados os processos descontínuo e descontínuo alimentado de

fermentação alcoólica, utilizando-se mosto de melaço de cana de açúcar e

Saccharomyces cerevisiae na forma de fermento prensado.

Foram analisados a influência da vazão de alimentação exponencialmente decrescente, do tempo de enchimento e do nível de inóculo no comportamento do sistema, considerando os seguintes parâmetros:

-

- rendimento em etanol

- fator de conversão de substrato em células.

Para o processo descontínuo alimentado, o valor máximo atingido para a produtividade em etanol foi de 16,9 g/L.h.

ABSTRACT

The batch and fed-batch fermentations of sugar -cane blackstrap molasses by the action of Saccharomyces rerel4siae(pressed yeast) were studied.

The influence of exponentiallydecreasing feeding rates, fermentar filling-up time and levei of inocullum on the behavior was analysed considering the followingparameters:

- ethanol and cell productivities

- ethanol yield

- yield yeast.

At fed-batch fermentation, the maximum ethanol productivity obtained was 16.9 g/L.h.

NOMENCLATURA

ART: Açúcares redutores totais, calculados como glicose;

c: Constante de integração;

-DIF.: Diferença entre valor estimado e experimental (%); e: base do logaritmo neperiano

E: Concentração de etanol no meio isento de leveduras (g/L): F: vazão no instante T (Uh):

FO: vazão inicial (Uh):

K: Constante de tempo (h-1);

ME: Massa de etanol produzido até instante T, presente na fase líquida (g);

MEf:Massa de etanol presente na fase líquidano finalda fermentação(g); M5Af: Total de massa de ART adicionada na fermentação (g);

MSA: Massa de ART adicionado até instante T (g);

M5R: Massa de ART residual no instante T, presente na fase líquida(g);

M5C: Massa de ART consumido até instanteT(g);

MX: Massatotal de células secas no instante T(g);

MXf: Massa total de células secas no final da fermentação (g):

MXO: Massa total de células secas no inícioda fermentação (g):

MXOm: Massa seca médiade levedura no inóculo (g);

MXO':Massa úmidade fermento prensado utilizada o inóculo(g);

Nd: Normalidade do dicromato utilizado para receber o etanol destilado; Pe: Produtividade em etanol (g/L.h);

Pem: Produtividadeemetanol média (g/L.h);

Pe"":Produtividadeemetanol estimada (g/L.h);

Px: Produtividade em células (g/L.h);

Pxm: Produtividade em células média (g/L.h); Px"": Produtividade em células estimada (g/L.h); q.s.p.:quantidade suficiente para;

r: Coeficiente de correlação linear: r2: Coeficiente de determinação: Re: Rendimento em etanol (%):

Rem: Rendimento médio em etanol (%); Re"": Rendimento em etanol estimado (%);

s: Desviopadrão:

5: Concentração de ART na doma no instante T (g/L);

50: Concentração de ART no mosto de alimentação (g/L); T: Tempo (h);

TE: Tempode enchimento (h);

TF: Tempo de acompanhamento da fermentação (h);

VAD: Volume de mosto adicionado até instante T (L);

Vb: Volume de sulfato ferroso amoniacal gasto para titular (reduzir) o dicromato de normalidade N e volume V (mL);

VD: Volume de meio na doma (L); VF: Volume final de meio na doma (L); VL: Volume de líquido na doma (L);

VM: total de volume de mosto adicionado à doma até instante T (L) VX: Fração do volume de meio ocupado pelas células (%);

VO:Volume de inóculo (3,0 L);

X: Concentração celular em base seca (g/L).

Y

=

substrato em células;

Ym: Valor médio do parâmetro Y; Y": Valor estimado do parâmetro Y;

Após o advento da aise do petróleo, no início da década de 70, a utilização do etanol como combustível carburante surgiu como alternativa para países carentes em reservas desse óleo e com grandes extensões territoriais (4). No Brasil, em 1975 foi criado o PROÁLCOOL (Programa Nacional do Àlcool) que teve como objetivo principal aumentar a produção de etanol no país, diminuindo sua dependência do petróleo.

No momento, quando a obtenção de etanol por via fermentativa não é muito atrativa, devemos ter uma preocupação ainda maior com a otimização deste processo. visto que no Brasil há ainda grande produção de etanol, sendo, na região centro-sul. autorizada para a safra de 1994/1995 uma produção de aproximadamente 8 bilhões de litros (12).

Por outro lado devemos considerar que a produção de etanol no Brasil tem benefícios que são de difícilmensuração econômica, dentre os quais: custo

social de substituição de importações elou inaemento de exportações,

regulação do mercado internacional do açúcar (90), contribuição com a atual matriz energética nacional (109), além de ser proveniente de matéria- prima renovável. BORZANI(17) mostra que o PROALCOOLaumentou a produção de

alimentos nas áreas onde ocorreu plantação de cana-de-açúcar e criou

empregos diretos e indiretos. Adicionalmente,do ponto de vista ambienta!, o etanol, na forma anidra, substitui com vantagens os aditivos do tipo "chumbo tetraetila" no tocante ao rendimento, sem os inconvenientes da poluição ambiental (7, 34, 90), e na forma hidratada é comprovadamente menos tóxico que a gasolina (1, 9). Sob este último aspecto já se iniciou recentemente a exportação do álcool etílico para paises que, embora sejam grandes produtores de petróleo, resolveram utilizá-Ioem lugar de aditivos poluentes.

Com todos os investimentos feitos na área de fermentação alcoólica, conseguiu-se um decréscimo no custo da produção de etanol, seja pelo aumento do rendimento e produtividade da fermentação, seja pelo melhor

aproveitamento da matéria-prima e separação do etanol. Atualmente, já é

cana e se estuda a obtenção de invertase a partir da levedura proveniente da

fermentação alcoólica (26. 124). Esses dados n06 dão uma boa idéia do

desenvolvimento atingido no setor.

No Brasil. as matérias-primas mais utilizadas para a produção de etanol são as açucaradas. como o melaço e a cana-de-açúcar (107). SERRA (108), porém. diz que há a possibilidade de utilização de matérias-primas comumente não utilizadas para a produção de etanol. como aJlturas complementares à cana-de-aç(jcar ou sua substituição em determinadas regiões. Neste sentido, foram feitos trabalhos com a intenção de estudar a utilização de matérias-primas alternativas tais como mandioca (13, 96, 98, 107. 118). batata doce (96). sorgo sacarino (11, 76. 96) e milho (81).

SERRA (108) apresenta uma tabela com as matérias-primas cana-de-aÇÚCBr,sorgosacarino,batata doce,mandioca e milho,mostrando a composição, produtividade e rendimento(de fermentação) em etanol de cada uma delas e conclui que, quando se observa o rendimento em etanol por hectare por mês. verifica-se que o sorgo sacarino apresenta um elevado índice e que a batata doce e a cana-de-açúcar se sobressaem. A mandioca apresenta um índice mais baixo em relação às outras culturas. Por outro lado.embora a mandioca não

apresente índices de rendimento tão elevados. deve-se lembrar que sua

potencialidade quanto à produtividade (toneladaslhectare) e utilização integral da planta são problemas ainda pouco estudados e difundidos no Brasil. Acrescenta que a utilização da mandioca se justifica pelo fato de ser uma cultura que poderá atuar no sentido de melhorar a alimentação e facilitar a fixação do homem em determinadas áreas do território nacional.

ARAÚJO et alii (11) comentam que o trabalho com sorgo apresenta como vantagem ponderável o aproveitamento do equipamento das usinas de açúcar e etanol no período de entre-safra de cana-de-açúcar, estendendo-se a produção de álcool aos doze meses do ano, com manutenção da equipe de operação.

O presente trabalho foi realizado com melaço de cana-de-açúcar.

Nos processos fermentativos de produção de etanol utiliza-se

principalmente o Saccharomyces cerevisiae (119). embora haja estudos

procurando utilizar fungos e bactérias. Tem eles a intenção de utilizar tanto

Zymomonas moblus(31, 65. 67.72,73.75.93, 103.). A leitura de alguns desses trabalhos nos permitem concluir que certos problemas poderiam aparecer com

a utilização de Zymomonas mobi/is para a produção de etanol a partir de cana-de-açúcar elou melaço de cana-de-aç(acar tais como a formação de levano (67) e baixa velocidade de consumo da frutose (12).

Quanto às leveduras. ainda hoje há pesquisas com a finalidade de selecionar elou testar suas atividades fermentativas com respeito à produção de

etanol(15. 101).

No presente trabalho. utilizamos levedura proveniente de fermento

prensado.por ter aplicação bastante difundida em usinas de álcool. devido

possuir boa atividade fermentativa. facilidade de separação e possibilitar

tratamento ácido para diminuiro número de contaminantes.

No Brasil. há algumas décadas o processo utilizado era o descontínuo clássico, mas. atualmente. grande parte do etanol é produzido pelo processo descontínuo alimentado de fermentação.

A partir do final da década de 60 .começou-se a utilizar mais

intensamente o processo de fermentação pelo método de "MELLE-BOINOT'que desde então passou a ser a principal técnica difundida e adotada em escala

industrial. Neste processo, uma vez terminada a fermentação do conteúdo do

tanque de fermentação. o vinho resultante é centrifugado ,obtendo-se uma

suspensão de células altamente concentrada (leite de lêvedo ). A suspensão é então enviada para tanques de tratamento onde é diluída com água e tratada com ácido sulfúrico até valor de pH próximo de 2.5 e após (2-3) horas sob agitação é utilizada como inóculo (5. 99. 119).

Numa análise da bibliografia em fermentação alcoólica, verificamos que muitos processos foram estudados. principalmente em escala laboratorial elou piloto: processo contínuo com células livres (6. 28. 59. 94. 105, 130). processo continuo com células imobilizadas (35. 116). processo utilizando leveduras floculantes (56, 70, 89. 101), processo sob pressão reduzida (32, 102), processo

Atualmente, há instalações industriais produzindo etanol por processo contínuo, entretanto o processo de batelada alimentada com recielo de células ainda é utilizado por grande parte das usinas nacionais. ZARPELON &. ANDRIETTA(130) comentam que dentre os processos contínuos desenvolvidos. os processos de fermentação em cascata são os mais satisfatórios e que no Brasil há pelo menos quatro desses processos operando com sucesso em escala industrial, alcançando produtividades em etanol da ordem de 9,4 glL.h.

As usinas que trabalham com o processo descontínuo alimentado

completam as domas sob condições controladas até o completo enchimento destas. Algumas das técnicas empregadas para o enchimento são:a) regular a vazão de alimentação de forma a manter, na doma,a concentração de açúcares

redutores totais próxima à metade da concentração do mosto de

alimentação(40) ou b) regular as vazões de "leite de lêvedo" e de mosto para manter uma concentração de açúcares da ordem de (5-6)OBrixno mosto de fermentação (52).

Vários trabalhos têm contribuído para o conhedmento do processo

descontínuo alimentado de produção de etanol . Pela análise destes

Este trabalho tem por objetivos contribuir para o estudo do

processo fermentativo descontinuo aUmentadode produção de etanol, utilizando

vazões exponencialmente decrescentes no enchimento de domas, bem como

executar eXPerimentos que permitam a "transição" da batelada alimentada para

batelada dássica. Ainda visa obter um conjunto de dados que, posteriormente,

possibilitem estudo cinético desse processo. Para tanto, trabalhou-se com as

seguintes variáveis: tempo de enchimento das domas, vazão de alimentação

Processo descontinuo dássico. ou simplesmente processo descontinuo. é

um processo fermentativo utilizado desde a antigüidade. Cada fermentador

recebe um inóculo e em seguida adiciona-se todo o mosto num intervalo de

tempo que pode ser considerado desprezível em relação ao tempo de

fermentação. Terminada a fermentação. a doma é descarregada. o material

fermentado pode ou não ser separado da fração celular, dependendo do produto fermentado e se for separado da fração celular. esta pode ou não ser reutilizada para inocular a doma para fermentação subseqüente. É um processo que pode levar a baixos rendimentos e/ou produtividades quando o substrato adicionado de uma vez só no início da fermentação exerce efeitos inibitórios ou desvia o

metabolismo celular a produtos que não interessam. Mas é um processo

bastante útil. principalmente quando se deseja rigor em esterilidade. Por outro

lado. é o processo mais utilizado na indústria de alimentos. Alguns dos

alimentos e bebidas produzidos por este processo fermentativo são iogurte.

chucrute. picles. cerveja, vinho, entre outros.

Já o processo descontínuo alimentado é definido como sendo aquele em que o fermentador é continuamente alimentado com substrato sem que haja saída de meio em fermentação, a não ser no final desta (39, 97, 126). Como conseqüência. este tipo de operação leva ao aumento contínuo do volume de meio em fermentação na doma. Terminada a fermentação. a descarga pode ser efetuada total ou parcialmente. sendo neste último caso denominado processo descontinuo alimentado cídico (97).

YOSHIDA et alii (126) analisaram o processo descontínuo alimentado

para o caso em que a velocidade de alimentação de substrato é constante. Por balanço material. chegaram a uma equação o"de mostram que a variação de massa de substrato no sistema é dada por uma parcela de suprimento e outra de demanda. representadas pela adição de substrato e consumo deste para o crescimento celular. respectivamente.

DUNN &. MOR (39) citam que os processos continuo e descontínuo

alimentado têm aplicações equivalentes em pesquisa na área de bioengenharia.

domas com o processo descontínuo alimentado tornam-no um processo de grande utilidade em escala industrial (53), pois o controle da velocidade de adição de substrato ao fermentador é meio de se evitar os mecanismos de

repressão por substrato ou produto excretado levando a importantes

aaéscimos em produtividades eJou rendimentos.

Há trabalhos na literatura visando a utilização do processo descontínuo alimentado, principaJmente para produção de miaorganismos (3, 33, 53. 95), aminoácidos (57, 92) e antibióticos(110, 115), mas já se tem a tentativa de produção de outros produtos tais como enzimas (117) e até mesmo células animais (125).

AIBA et alii (3) citam que no cultivo de Saa:::haromyces cereVls/ae

crescendo em aerobiose com glicose como substrato. quando a concentração desta atinge 70 mg/L, a glicose tende a ser parcialmente desviada para a produção de etanol e C02 . Isto diminuiriao fator de conversão de substrato em células. Por outro lado. com concentrações de substrato muito baixas. tem-se que a velocidade de crescimento do microorganismo diminui sensivelmente. Daí a importância da vazão de alimentação de substrato na produção de levedura de panificação.

KISHIMOTOet alii (57) estudando a produção de ácido glutâmico por processo descontínuo alimentado, com Brevibacterium divaricatum e etanol como substrato. trabalharam com vazão de alimentação de forma a manter a concentração de etanol constante na doma. Verificaram que a ação inibitóriado etanol era crescente com o aumento de sua concentração, mas que era em

concentrações mais elevadas que se conseguia maiores velocidades na

produção de áCido glutâmico. Sugeriram, então. que a produção de ácido glutâmico fosse realizada em dois passos: inicialmente (até aproximadamente 20 horas de cultivo) mantendo concentrações mais baixas de etanol (por volta de 5%) para rápida produção de células, e num segundo passo elevando a concentração de etanol (aproximadamente 35%) para aumentar a produção de ácido glutâmico.

SOLTERO et alii (110) , trabalhando com produção de penicilina por

Penici//ium chtySogenum Q-176 em meio sintético, verificaram que poder-se-ia

substituir a lactose por glicose ou sacarose continuamente adicionados ao meio

condições empregadas por eles, as velocidades ótimas de adição de glicose e sacarose para produção de penicilina foram 0,30 glL.h e 0,36 g/L.h. respectivamente.

UDOMVARAPHUNT &.YOSHIDA (111), em estudo visando a produção de penicilinacilase, verificaram que ocorreu uma diminuição do fempo para a produção máxima da referida enzima de 70 para 50 horas quando se utilizou o processo descontínuo alimentado ao invés de descontinuo.

XIE &. WANG (125), investigando a influência de diferentes meios de

cultivo e estratégias de alimentação, verificaram que a utilização do processo

descontinuo alimentado no cultivo de células de hibridoma levou a menores

velocidades específicas de formação de ladato e de amônia (diminuiram 26

vezes e 50 vezes, respectivamente), se comparadas com as obtidas com

processo descontinuo clássico. Mais importante que isso, o total de células

produzidas pelo processo desenvolvido por eles foi 5 vezes maior que a

quantidade obtida pelo processo descontínuo clássico.

Antes do advento do PROÁLCOOL, quando as usinas tinham domas

pequenas de trabalho, o processo descontinuo era o mais utilizado para

produção de etanol. Depois, com o aumento do volume das domas de

fermentação, esse processo passou a ser substituído pelo descontínuo

alimentado, por limitação de bombeamento de mosto e/ou formação de espuma.

Há muitos trabalhos na literatura que deram atenção a fenômenos de

inibição em fermentação alcoólica (principalmente efeito do etanol, do substrato

e das células), destacando-se estudos com processo descontínuo. Esses

trabalhos serão discutidos a seguir.

a) Efeito do etanol

Um dos fatores principais que causam baixa velocidade de produção de etanol por leveduras parece ser o efeito inibitório do etanol. Este tem sido examinado por diversos trabalhos de pesquisa. Nestes, incluem-se estudos a respeito do efeito do etanol no crescimento celular(2, 44, 91), no consumo de açúcares (30, 44, 47) e na viabilidade celular (83, 84).

decresceu de 0,156 g célulalg glicose a 0,026 g célulalg glicose com o aumento da concentração de etanol de Oa 107 glL. indicando uma definitivarelação entre rendimento em biomassa e inibição por etanol. Por outro lado. o etanol não teve efeito sobre o rendimento em etanol.

NAGODAWITHANA&. 5TEINKRAU5 (84) acompanharam o efeito

inibidor do etanol pela perda de atividade de álcooldesidrogenase. sugerindo que a inibição se situaria a nível dessa enzima. enquanto que NAVARRO (86) concluiu que a enzima mais significativamente inibida é a hexoquinase.

LUONG (71) conclui. com base em dados da literatura. que "como as relações dos inversos das velocidades específicas de crescimento (1/u) e dos

inversos das concentrações de substrato (115). na presença de diferentes

concentrações de etanol. são lineares com diferentes indinaçães. mas

convergindo sempre a um mesmo ponto de intersecção com o eixo da abscissa ( dados de 1/5 ) tem-se que a velocidade específica de crescimento do microrganismo parece ser inibida pelo etanol de maneira não competitiva (similar a uma reação enzimática)."

Há divergências a respeito da inibição pelo etanol depender ou não de sua origem. Alguns autores (84. 91) observaram que o etanol adicionado é menos inibidor que o etanol produzido. Esta observação era apoiada pelo fato da

concentração intracelular de etanol ser maior que a extracelular, devido à

resistência de difusão (85).Por outro lado. GUIJARRO &. LAGUNAS (48). na

tentativa de elucidar o mecanismo de transporte do etanol através da

membrana, realizaram um experimento para medir quantitativamente o acúmulo intracelular de etanol. Chegaram à conclusão que não ocorre acúmulo de etanol e que este permeia a membrana celular por simples difusão.

DOMBEK&.INGRAM(38) relatam que" tanto o etanol adicionado como o

acumulado no caldo de fermentação causam mudanças fisiológicas no

Saccharomyces cerevisíaeKD2 tais como danos pelo etanol. que levam a uma

diminuição em sua habilidade de produção desse álcool. Mesmo lavando as células. essas não recuperam sua atividade de produção de etanol. A extensão

dos danos causados pelo etanol parece estar relacionado com sua

Estudos cinéticos que abordaram o efeito inibitório do etanol no crescimento celular chegaram a diferentes condusães. Alguns relataram que a capacidade de inibição era uma função hiperbólica da concentração de etanol (1, 44). Outros conduíram que era linear (51, 66), exponencial (80, 82) ou funções mais complexas (14).

Esta heterogeneidade nas condu5Õe5 pode estar ligada a vários fatores: grau de inibição dos álcoois (68, 69), efeito da temperatura na velocidade de produção de etanol (84), composição lipídica da membrana dtoplasmática

(49,77)presença de oxigênio molecular (50, 63, 64, 83), espécies de

microorganismos (54), concentração inicial de células com que se trabalha (123), entre outros.

b) Efeito do Substrato

As vantagens de se trabalhar com concentrações elevadas de açúcares fermentesaveis no mosto de alimentação induem redução de água de diluição,

supressão de contaminantes osmossensíveis e redução dos custos de

destilação, enquanto a concentração de etanol não se tornar inibitória. Altas concentrações de substrato são, no entanto, inibitóriasà fermentação (54).

CIFTICI et alii (29) comentam que quando a concentração de glicose

decresce à exaustão , ocorrem a respiração e a produção de etanol. Por outro

lado, níveis de glicose maiores ou iguais a 5% causam um desvio para

fermentação somente, mesmo em presença de ar. Dizem ainda que, uma vez que a concentração de glicose dentro da célula é muito pequena, a inibição pela mesma deve ser exercida por um intermediário, ou ser efeito da inibição por produto. ou ser resultado de um efeito osmótico.

NAGODAWITHANAet alii (83) relatam que" mesmo em meio aerado ,a

300C, em meio com altas concentrações de açúcares, não ocorre síntese rápida

de enzimas respiratórias devido a repressão catabólica e então a célula

dependeria da via glicolítica com produção de etanol para seu requerimento

energético. Com células com alta velocidade de fermentação, um posterior controle por feed-back sobre a via glicolíticapode ser esperado devido a inibição por produto. Isto pode causar uma depleção no nível energético da célula,

podendo levar a um rompimento da atividade metabólica levando à morte

Muitos pesquisadores concordam. de um modo geral. que a inibição pelo substrato começa a ser significativa para valores superiores a 100 g/L em fermentações com Saccharomyces cerevisiaee glicose como substrato (29. 30.

47,78,79, 114).

CONVERTI et alii (30) trabalharam com Saccharomyces cemvisiae e sacarose como fonte de carbono. Medindo as velocidades iniciais de consumo

de substrato. verificaram que se obtinha um aumento dos valores das

velocidades máximas quando a concentração inicial de substrato se situava entre 50 a 100 glL. Também verificaram que quando a concentração inicial de substrato era superior a 100 glL, ocorria uma mistura de inibição competitiva e não competitiva, evidenciada pelo aumento da constante de Michaelis-Mentene decréscimo da velocidade máxima, respectivamente.

THATIPAMALAet alii (114). trabalhando com processo descontínuo. constataram que o fator de conversão de substrato em produto ( Ypls ) caiu de 0,45 9 etanollg glicose a 0,30 9 etanoll 9 glicose quando mudou a concentração inicialdo meio de fermentação de 150 g/L para 280 gIL. Disseram que os dados experimentais indicam que a inibição por substrato é mais tóxica do que inibição por produto e desativa algumas importantes enzimas que são vitais para a sobrevivência da levedura, resultando num decréscimo de viabilidade celular.

c) Efeito das Células

A vantagem de se trabalhar com concentrações celulares mais elevadas está na redução do tempo de fermentação. No entanto, há alguns trabalhos evidenciando que concentração celular elevada no inóculo inibe seu próprio crescimento.

GHOSE &. TYAGI (43), estudando o crescimento de SaccIJaromyces

cerevisiae NRRL-Y 132 em fermentação alcoólica de bagaço de cana hidrolisado, em processo descontinuo, verificaram que o crescimento celular diminui com o aumento da concentração inicial de células, sendo que para concentrações celulares iniciais iguais ou superiores a 21,0 glL (massa seca) não havia crescimento celular. Estes autores explicaram tal comportamento através do conceito de energia de manutenção (91), pois com o aumento da

massa celular inicial no fermentador crescem as necessidades relativas à

manutenção e os nutrientes disponíveis são consumidos para atender esta finalidade.

STREHAIANOet alii (113), trabalhando com fermentação alcoólica por processo descontínuo e com diferentes níveis de inóculo, encontraram que as velocidades máximas específicas de crescimento decresceram hiperbolicamente com o aumento da concentração do inóculo, enquanto que o rendimento em etanol não mudou para diferentes concentrações de inóculo. Sugerem que o álcool não é o único inibidor do crescimento microbiano, pois conduem que há inibidores presentes no inóculo.

DEL ROSARIO (37), estudando a cinética da fermentação alcoólica com altas concentrações de levedura floculante (inóculos de 58 g/L e de 83 glL em massa seca) em processo descontínuo alimentado, verificou que, após 5 horas de fermentação, para o menor inóculo houve uma perda de viabilidade de 16%, enquanto que para o inóculo de 83 glL a perda foi de 35%.

Por outro lado, há trabalhos com processo descontínuo que visaram o estudo do efeito de condições experimentais apenas em resultados globais finais tais como rendimentos e produtividades do processo.

MAGALHÃESet alii (74), checando a influência da adição de fonte de

nitrogênio ao mosto de melaço de cana-de-açúcar no teor de proteína de

levedura residual, no processo de batelada, verificaram que não há vantagem em suplementar o mosto com nitrogênio (na forma de sulfato de amônio ou de uréia) com concentrações superiores a 0,6 glL, levando-se em conta apenas a concentração final de proteína celular. Por outro lado, observando o perfil do gráfico que representou tempo de fermentação em função de uréia no mosto,

aUEIROZ et alii (100) estudaram influência do inóculo (Xi) e da

concentração inicial do mosto (Si) em processo descontínuo de fermentação

alcoólica, com condições experimentais onde as concentrações iniciais de

mosto (em ART) e de inóculo (em massa seca) variaram de 90,9 a 226,2g1L e

de 1,1 a 57,1 glL, respectivamente. Verificaram que para somente 3

experimentos não houve crescimento celular (Si = 216,7 glL, Xi = 25,0 g/L;

Si = 209,1 glL, Xi = 30,6 glL; Si = 206,9 glL, Xi = 55,1 glL)

.

conduíram que o fator de conversão de substrato em células bem como a

quantidade de substrato utilizado para manutenção não são constantes.

BORZANI et alii (21) chegaram a uma equação empírica para relacionar a produtividade em etanol (P) com concentração inicial de açúcar (Si) e

concentração inicial de células em massa seca (Xi) para o processo de batelada dássica. Os valores de Si variaram de 90 a 260 g/L e os de Xi de 14 a 31 glL. A equação por eles obtida pode ser escrita assim:

P = b . Si . Xi / ( a . Si +tm . Xi )

Onde: a = constante de proporcional idade entre o tempo de fermentação e a razão Si/Xi;

b = constante de proporcionalidade entre a concentração de etanol no vinho fermentado e Si ;

tm = "tempo morto" em um cido de funcionamento de uma doma.

ENDO et alii (41), trabalhando com processo descontínuo, verificaram que o rendimento em etanol tem valores mais elevados para concentrações iniciais de substrato entre 130 e 200 glL e concentração de células no inóculo

( Xi - em massa seca) da ordem de 2 glL. Com o aumento de Xi de 2 glL para

6 g/L, nota-se, graficamente, que houve diminuição do rendimento em etanol

que, devido à apresentação gráfica, não pode ser quantificada. Mesmo com Xi de 6,Og/L, trabalharam em condições distantes das utilizadas industrialmente.

CHEN (27) estudou o processo descontínuo. Trabalhou com meio

sintético com glicose como fonte de carbono ( concentrações que variaram de 120 a 300 Brix ) , -suplementado com extrato de levedura, e com uma levedura

termos de massa seca)

.

21g/L.h, com concentrações iniciais de 44 g/L (base seca) , 120 Brix e 2.8 % para células, substrato e extrato de levedura, respectivamente.

VAZ et alii (122) estudaram o efeito da temperatura e da suplementação do mosto em fermentação alcoólica pelo processo de batelada. Nos

experimentos, conduzidos com Saccharomyr::es uvarume com Saccharomyces

cerevisiae como inóculo, verificaram uma queda bastante acentuada na

produtividade em etanol ( da ordem de 60% ) quando trabalharam com temperatura de 380C ao invés de 300C. Para os rendimentos alcançados. constataram que foram pouco alterados em função da suplementação do meio. Nesta suplementação, foram utilizados, isoladamente ou em grupos, as seguintes substâncias: ácido linoleico. ergosterol, tween 80, albumina bovina, lecitina de soja, farinha de soja e óleo de soja comercial.

o primeiro trabalho realizado. tendo como objetivo estudar o processo descontínuo alimentado para produção de etanol, foi publicado por ENDO &

INOUE (40). Trabalharam com meio sintético e com glicose como substrato na

concentração de 10 g/L. condições essas bastante diferentes das adotadas

industrialmente. Posteriormente foram realizados trabalhos onde se procurou

essa aproximação.

Alguns trabalhos (45, 58. 60. 88) procuraram verificar a influência dos fatores: concentração celular no inóculo (9,5 glL

-

produtividade em etanol mais baixas. O rendimento em etanol praticamente não foi afetado pelas condições experimentais.

Em trabalho posterior, BORZANI (16), relacionando velocidade de

produção de etanol em processo descontinuo alimentado para produção de

etanol com vazão constante, mostra que é possível avaliar o máximo valor de vazão de alimentação que deve ser usado de forma a obter um meio completamente fermentado no fim da fase de enchimento.

AQUARONE et alii (10) realizaram estudos do processo descontínuo alimentado para produção de etanol, utilizando diversos tipos de alimentação: vazão constante e vazão variável (linear decrescente e exponencial crescente). Observaram um aumento da produtividade em etanol quando utilizaram vazão de alimentação linearmente decrescente com o tempo. Esses resultados foram confirmados mais tarde (61).

De fato, KRAUTER et alii (62) concluíram que aumentou-se a

produtividade em etanol aproximadamente em 10% quando se utilizaram vazões de alimentação linearmente decrescentes ao invés de vazões de alimentação constantes em processo descontínuo alimentado para produção de etanol. Verificaram ainda uma correlação linear entre massa de etanol e tempo na fase de enchimento da doma.

VASCONCELOS&.VALDMAN(120). trabalhando com mosto de caldo de

cana-de-açúcar em escala piloto e utilizando vários perfis de vazão de

alimentação do mosto à doma, verificaram que nos perfis decrescentes obtinham-se maiores produtividades em etanol, tanto no final da fase de enchimento como nas produtividades finais do processo.

Trabalhando em escala industrial, VASCONCELOS &. VILELA FILHO

(121) ressaltaram a importância do perfil da vazão de alimentação na

produtividade e na eficiência do processo fermentativo.

CARVALHOet alii (23) estudaram o efeito de vazões exponencialmente

decrescentes (F=FO.e-K.T), onde K representa a constante de tempo, no

enchimento de domas- com tempos de enchimento de 5 e 7 horas - utilizando

o processo fosse batelada dássica) e mosto de 220 g/L em ART. Conseguiram um aumento da produtividade em etanol de 14% e 13% quando passaram de K=O (vazão constante de alimentação) a K=0,6 h-1 para tempos de enchimento de 5 e 7 horas, respectivamente, sem que houvesse queda no rendimento em etanol. Ajustaram uma equação do tipo Monod para relacionar vazão mássica

inicial ( FO

.

estudadas, chegaram a:

Pe = 9,6 . ( FO . 50 ) I ( 54 +FO.50 )

onde: FO= vazão de enchimento inicial (Uh)

50 = concentração do mosto em ART (g/L)

A equação anterior estima que a produtividade máxima possível de ser alcançada nas condições estudadas é 9,6 glL.h .

Em trabalho posterior. CARVALHO et alii (25), analisando os resultados

referentes a células. nas condições de fermentação acima descritas. chegaram a

equações do tipo hiperbólica para correlacionar tanto Px ( produtividade em

células) como Yxls (fator de conversão de substrato em células) com a vazão

mássica inicial (FO .50). Essas equações foram, respectivamente:

Px = 1,84 .( FO.50 ) I (156,1 +FO.50 )

103. Yxls = 73,0 . ( FO. 50) I (80,3

+

.

onde: FO= vazão de enchimento inicial (Uh)

50 = concentração do mosto de alimentação, em ART (g/L)

5eus resultados permitem, ainda, conduir que a utilização de vazões

exponencialmente decrescentes com constante de adição ( K ) igual a 0,6 h-1

em vez de K=O (vazão constante de alimentação) levou a um aumento das

médias dos fatores de conversão de substrato em células e das produtividades

em células da ordem de 24% e 42%, respectivamente, para tempo de

valor zero para o valor 0,6 h-1. Esse incremento da produção de células não afetou os valores de rendimento em etanol.

VITOLO et alii (124), trabalhando com o mesmo processo descontínuo alimentado, com vazão exponencialmente deaescente de mosto. para produção de etanol, acompanharam a atividade invertásica das células. Constataram um aumento de 16% e 17% na velocidade específica de crescimento celular e na atividade invertásica específica em células na fase de enchimento da doma, respectivamente, quando se trabalhou com constante de tempo (K)de 0,6 h-1 ao invés de K=O.para tempo de enchimento de 7 horas.

CARVALHO & AQUARONE (24) publicaram uma nota prévia, onde

fizeram um estudo preliminar da otimização do processo descontínuo

alimentado de produção de etanol, utilizando vazões exponencialmente

decrescentes de enchimento de domas ( F=FO.e-K.T) e massas de inóculo

( fermento prensado) variáveis. Trabalharam com volume de inóculo de 3 L e adicionaram 7 L de mosto à doma .Conduíram que para tempo de enchimento de 5 horas e K=0,6 h-1 e K=0,8 h-1 , massas úmidas de inóculo da ordem de 1000 gramas já são suficientes para se conseguir o término da fermentação simultaneamente com o término do enchimento da doma, utilizando-se mosto com concentração de aproximadamente 220 g/L em ART. Esse estudo feito por eles, com alteração de massa de inóculo, foi realizado com os valores de constante de tempo (K)que levaram a melhores resultados em trabalho anterior

(23).

4.1 - MATÉRIA PRIMA

Utilizou-se melaço de cana-de-açúcar em todos os experimentos. Foi

recebido da Usina Éster (Cosmápolis) e armazenado em tambores de 200 L,

sendo o lote de melaço suficiente para a realização de todos os experimentos e tendo teor de ART em torno de 85% em massa.

4.1.1 - Mosto

A preparação do mosto consistiu em sua prévia darificação e posterior

diluição e suplementação adequadas.

A darificação foi realizada com diluição do melaço pela adição de água

destilada, em partes iguais, adição de 1,5 g de fosfato de sódio monobásico ,

como agente floculante, em cada litro da solução de melaço diluído e posterior

aquecimento a 1210e por 10 minutos. Após o aquecimento, foi mantido em

repouso. no mínimo por 48 horas, para sedimentação do material em

suspensão. O melaço darificado foi. então. sifonado e diluído com água

destilada de forma a se obter mosto com concentração de aproximadamente

220 glL em ART (23). Acertou-se o pH do mosto na faixa de 4,5

-

normal. Suplementou-se com uréia a 0,5 glL (14) e adicionou-se penicilina V

ácida ao mosto na concentração de 500 U/L (8).

4.2 - INÓeULO

Os experimentos foram realizados utilizanda-se como inóculo fermento

prensado comercial ,suspenso em água destilada. GOMEZ & BORZANI (46)

verificaram que a utilização de fermento prensado em fermentações alcoólicas

leva a variabilidades nos resultados da ordem de 5% e de 10% quando se

trabalha com meio sintético e com meio de melaço de cana-de-açúcar,

respectivamente. Por motivos operacionais , o volume de inóculo foi fixado em

impossibilidade de se obter informações a respeito da data de fabricação do fermento. nível de contaminantes e das condições de armazenamento, verificou-se apenas sua aparência (textura e cor) e odor.

4.3 - EQUIPAMENTO

Foi utilizado. em todos os experimentos. fermentador fabricado pela New Brunswick Scientific ec. Inc.. com domas de vidro de 14 L de capacidade nominal. com controles de temperatura e de freqüência do agitador. A figura 4.1 mostra, esquematicamente, o equipamento utilizado nos experimentos

4.4 - DESCRiÇÃO DE UM EXPERIMENTO TíPICO

Em todos os experimentos, foram fixados os seguintes parâmetros: a) temperatura de fermentação: (32 +/- 1)OC (129);

b) freqüência do agitador: 200 rpm (200 mino-1); a finalidade foi promover uma melhor homogeneização na doma;

c) concentração de ART no mosto de alimentação: aproximadamente

220g/L (23);

d) pH do mosto de alimentação: 4,5 a 5,0 (54);

e) concentração de uréia no mosto de alimentação: 0,5 g/L (74);

1)concentração de penicilina V ácida no mosto de alimentação:

500UIIL(8);

g) volume de inóculo adicionado: 3.0 L;

A

~

8

I

b

I

Legenda

A- Saída de amostra

8- Entrada de ar comprimido C- Chicana

D- Chicana

E- Turbina superior de 6 pás F- Turbina inferior de 6 pás G- Dispersar de ar

D

:yI

c d e

Cotas: a - 200 mm b - 75 mm c - 80 mm d - 230 mm e - 440 mm

Figura 4.1 - Esquema da doma de fermentação utilizada.

21

No dia anterior ao experimento ligou-se o equipamento para que logo no iníciodaquele, o banho já apresentasse a temperatura desejada.

No dia do experimento, preparou-se a suspensão de levedura e adicionou-se à doma. Acionou-adicionou-se a agitação para homogeneização e retirou-adicionou-se uma amostra de 10mL para determinação da concentração celular. Em seguida, iniciou-se a adição de mosto à doma, sendo 7,0 L o volume total de mosto adicionado, cuja vazão de alimentação foi previamente escolhida. Pelo fato de não dispormos de bomba de alimentação, esta foi feita periodicamente (22).

A fermentação foi acompanhada por amostragens de 30 em 30 minutos. Após o término do enchimento, as amostras deixaram de ser retiradas 1,5 horas após verificação de que não houve mais desprendimento de gás. O tempo de

fermentação a que correspondeu um valor mássico de etanol que não pôde

ser determinado diferente da média dos valores posteriores foi considerado

como tempo final de fermentação e foi denominado tempo de fermentação.

Considerou-se dois valores iguais quando a diferença entre a massa de etanol anterior e a média das posteriores foi menor ou igual a 2,2%. Este valor foi o

resultado da média dos coeficientes de variação de Pearson (desvio padrão

percentual), determinados experimentalmente a partir de 5 determinações de

cada uma das 3 amostras testadas (amostras com concentração de

aproximadamente 60 g IL, 70 g/L e 80 glL de etanol). Convém ressaltar aqui,

porém, que, para os experimentos realizados com processo descontínuo

alimentado, o menor tempo de fermentação possível é o equivalente ao tempo de enchimento da doma.

4.4.1 - Análise das amostras

Um volume de aproximadamente 25 mL de amostra foi retirado e usado para as técnicas analíticas desaitas a seguir.

4.4.1.1 - Técnicas analíticas

4.4.1.1.1 - Medida do valor do pH

4.4.1.1.2 - Medida de acidez total

Foi medida no mosto de alimentação e no meio final de fermentação.

Permite-nos a verificação da ocorrência de contaminação por bactérias

produtoras de ácidos. Quando se utiliza uréia como fonte de nitrogênio, o valor de acidez total final até duas vezes maior que a inicial Pode ser considerada como normal (94).

Como dispunha-se de penicilina V ácida no mosto e tratava-se de

fermentações rápidas não se determinou acidez total para todos os

experimentos

A acidez foi expressa em acidez sulfúrica total.

4.4.1.1.3 - Determinação da concentração celular

Uma amostra de 5,0 mL foi filtrada em membrana MilliporeR(diâmetro médio dos poros= 1,2 mícra) previamente pesada e depois foi lavada com 100 mL de água destilada. Após lavagem, foi submetida à secagem em estufa a (105 a 110)OCaté peso constante, o que era conseguido aproximadamente após 3 horas.

O resultado foi expresso em gramas de matéria seca por litrode amostra.

4.4.1.1.4 - Determinação da concentração de ART

A determinação da concentração de ART foi realizada pelo método de SOMOGYI (111), precedido da hidrólise da sacarose contida na fase líquida do meio de fermentação (amostra).

a)soluçães reagentes(preparados com reagentes p.a.)

SOLUÇÃO I:

NaHC03 1S,Og

NaKC4H40S 12,Og

Na2C03 .24,Og

Na2S04 144, Og

Água destilada q.s.p. " ..800,OmL

SOLUÇÃO 11:

Na2S04 .36,Og

CuS04.5H20 ..4,Og

Água destilada q.S.p. .200,OmL

SOLUÇÃO 111:

(NH4)6M07024.4. H20 ...25.0g

H2S04 (d=1.84 g/mL) 21,OmL

Na2HAs°4.7H20 ,.. .3,Og

Água destilada q.S.p. 500,OmL

As soluções devem ser guardadas em frascos escuros, à temperatura de 300C, por um período mínimo de 30 horas para então, serem calibradas a partir de soluções de glicose de concentrações conhecidas (20 a 200mg/L).

b) Doseamento

Em tubo de Follin-Wucontendo 1mL das soluções I e 11na proporção 4: 1, preparada no momento do uso, coloca-se 1.0mL de amostra convenientemente diluída. Leva-se ao banho em água fervente por 10 minutos e retira-se colocando em banho de água e gelo. Após o resfriamento, adidona-se 2,OmLda solução 111 e agita-se para a expulsão dos gases formados. Completa-se o volume de 25mL

com água destilada. Uma prova em branco é preparada simultaneamente

utilizando-se água destilada.

As leituras foram feitas em comprimento de onda igual a 540nm. em

espectofotômetro marca Prodon sc 90

4.4.1.1.5 - Determinação da concentração de etanol

A concentração de etanol foi determinada por uma adaptação do método do microdicromato (55).

Destilou-se em um microdestilador. com arraste a vapor. 1.0 mL de fase líquida do meio de fermentação (amostra). recolhendo aproximadamente 30mL de destilado em 15 mL de solução de dicromato de concentração rigorosamente conhecida e em excesso. A seguir tampou-se o Erlenmeyer e levou-se a banho de água a aproximadamente 650C por 15 minutos para que se completasse a oxidação do etanol. Decorridos os 20 minutos, retirou-se o Erlenmeyer do banho e deixou-se esfriar até temperatura ambiente, para ,então. ser titulado com solução de sulfato ferroso amoniacal. utilizando ortofenantrolina como indicador. Fez-se uma prova em branco, titulando o dicromato de potássio com o sulfato ferroso amoniacal.

A concentração de etanol na amostra é obtida pela expressão:

E(gll)

=

Seguem-se a composição das

utilizados(preparados com reagentes p.a.)

soluções e indicadores

SOLUÇÃO I : Solução de sulfato ferroso amoniacal

Fe(NH4)2(S04)2' 6H20 135,19

H2S04 (d= 1,84 glL) 30.0 mL

Água destilada q.s.p. 1000,OmL

SOLUÇÃO 11: Solução de dicromato de potássio

K2Cr207... ...33.7 g

H2S04(d= 1,84 glL) ..325,0 mL

Água destilada q.s.p. 1000,OmL

SOLUÇÃO 111: Solução de ortofenantrolina

C12H8N2' H20 1.485 9

FeS04.7H20 0,695 9

4.4.1.2 - Métodos de cálculo

Por trabalhar-se com um sistema onde a variação de concentração é

dada por duas variáveis( volume e massa - produzidaou consumida

).

se trabalhar com volumes celulares significativos. calculou-se os valores de massas totais para um melhor entendimento do processo fermentativo . Estes valores foram calculados de acordo com a técnica proposta por BORZANI &

BARALLE(19)

.

sugerida por eles. por concentração celular em massa seca (18) . Cabe

ressaltar aqui que essa metodologia é de grande valia para estudos onde se

quer diminuir erros na determinação de volumes ocupados pela células.

especialmente quando se quer determinar o volume celular em fermentações

onde há desprendimento de gás.

Utilizamos em nossos cálculos a densidade de 1120 g/L para levedura

(20) e teor de massa seca de levedura igual a 0.292. determinado

experimentalmente (média de 5 determinações. onde se pesou 10 g de fermento

prensado previamente fragmentado e colocou-se para secar até massa

constante. A massa final de células. após secagem. dividida por 10 dá o valor

do teor de massa seca do fermento).

4.4.1.2.1 - Cálculo do volume presente na doma (VD)

4.4.1.2.1.1 - Cálculo do volume presente na doma para o processo

descontínuo clássico

Para este processo. VD foi constante e igual a 10.0 L, considerando o

volume retirado de amostras desprezível.

4.4.1.2.1.2 - Cálculo do volume presente na doma para o processo descontinuo alimentado

Num determinadoinstante T ,o VD foidado por :

VD

=

Onde "e" é a base do logaritmo Neperiano, e considerando desprezível o

4.4.1.2.2 - Cálculodo volume celular na doma (VX)

Num determinado instante T , o VX , para ambos os processos fermentativos estudados,é dado por:

VX = (X /327,04) .100 (%)

Onde 327,04 é o produto da densidade da levedura pelo seu teor de

massa seca e o valor de X é correspondente ao instante T.

4.4.1.2.3-

Num determinado instante T , o VL , para ambos os processos fermentativos estudados, é dado por :

VL = VD. ( 1 - X / 327,04 ) (L)

Onde 327,04 é o produto da densidade da levedura pelo seu teor de massa seca e os valores de VD e X são correspondentes ao instante T.

4.4.1.2.4 - Cálculo da massa celular seca na doma (MX)

Num determinado instante T , a MX , para ambos os processos fermentativos estudados.é dada por:

MX= X

.

Onde os valores de X e VD são correspondentes ao instanteT.

4.4.1.2.5-Cálculo das massas de ART

4.4.1.2.5.1 - Cálculo da massa de ART adicionada à doma (MSA)

4.4.1.2.5.1.1 - Cálculo da MSA para o processo descontínuo dássico

Para qualquer instante, a MSA é :

4.4.1.2.5.1.2 - Cálculo da massa de ART adicionada à doma para o processo descontínuo alimentado

Num determinado instante T. o valor de M5Aé dado por:

M5A

=

Onde !te"é a base do logaritmo Neperiano.

4.4.1.2.5.2 - Cálculo da massa de ART residual na fase líquida do meio de fermentação (MSR)

Num determinado instante T

.

M5R

=

Onde os valores de 5 e VLsão correspondentes ao instante T.

4.4.1.2.5.3 - Cálculo da massa de ART consumida pelo microrganismo (M5C)

Num determinado instante T

.

.

fermentativos estudados, é dada por:

M5C

=

-

Onde os valores de M5Ae M5R são correspondentes ao instante T.

4.4.1.2.6 - Cálculo da massa fermentação (ME)

Num determinado instante T fermentativos estudados, é dada por :

de etanol na fase líquida do meio de

, a ME , para ambos os processos

ME

=

4.4.1.2.7 - Cálculo do rendimento em etanol

Ao término da fermentação, para ambos os processos fermentativos estudados, o rendimento em etanol (Re) foi expresso por:

Re

=

Onde M5Af

=

4.4.1.2.8 - Cálculo da produtividade em etanol

Ao término da fermentação. para ambos os processos fermentativos estudados, a produtividade em etanol (Pe) foi expressa por:

Pe

=

4.4.1.2.9 - Cálculo do parâmetro relacionado com produção de células Ao término da fermentação, para ambos os processos fermentativos estudados, o valor do parâmetro relacionado com a produção de células (Y) foi expresso por:

Y

=

Considerou-se "[( MXf- MXO) I M5Af ]" como sendo fator de conversão de substrato em células (Yxls).

4.4.1.2.10 - Cálculo da produtividade em células

Ao término da fermentação. para ambos os processos fermentativos estudados. a produtividade em células (Px) foi expressa por :

4.5 - ANÁLISEDOSRESULTADOS

Com a finalidade de auxiliar na verificação da influência dos fatores

estudados (tempo de enchimento, constante de tempo e massa de inóculo) nos

resultados obtidos nos grupos de experimentos, foram feitas análises de

variânda para um únicofator ou multivariada(87).

Emalguns casos, também se fez análise de regressão linear multivariada

(87), cujo modelo estatístico é dado pela seguinte equação geral:

Yi

=

com z-1 variáveis independentes, onde:

Yi

=

b, bo, . . ., bz-1

=

Xi1, Xi2, . . ., Xi,z-1

=

=

Ei

=

Observação: as variáveis independentes podem ser compostas somente

dos fatores em casos de não interação entre estes na resposta da variável

dependente; podem também ser compostos de adições de outras variáveis

independentes, representadas pelo produto de fatores, no caso de interação

destes na resposta da variável dependente.

Em todas as análises apresentaram-se as tabelas correspondentes,

sempre indicando os erros, chamados níveis descritivos (p).

Na análise de variânda, os valores de p indicam o menor erro em que se incorre ao afirmar que existe pelo menos uma média diferente entre as

comparadas, sendo essas médias resultados obtidos em função de diferentes

níveis dos parâmetros estudados, uma diferença entre as médias indica a influência destes parâmetros nos resultados obtidos.

Na análise de regressão, os valores de p indicam o menor erro em que se

incorre ao afirmar que um determinado coeficiente tem influência na

determinação do parâmetro estimado. Em outras palavras, testando o

coeficiente angular correspondente a uma variável independente é possível verificar se esta tem importância na determinação do parâmetro estimado.

Todas as análises estatísticas foram conduzidas utilizando o programa

estatístico Statgraphics (112), emprestado pelo Centro de Computação