Avaliação da prliferação e apoptose com a utilização de arranjos em matriz de amostra tecidual (Tissue Microarray - TMA) em mastocitomas cutâneos caninos

(1)

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(3)

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Vidale, Mariana Marras.

Avaliação da proliferação e apoptose com a utilização de Arranjo em Matriz de Amostra Tecidual (Tissue Microarray – TMA) em mastocitomas cutâneos caninos / Mariana Marras Vidale. - Botucatu, 2011

Dissertação (mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2011

Orientador: Renée Laufer Amorim Capes: 50503006

1. Cão - Doenças - Diagnóstico. 2. Animais domésticos. 3. Mastócitos. 4. Patologia veterinária.

(4)

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(8)

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(9)

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(15)

Mariana Marras Vidale – Dissertação de Mestrado Resumo

VIDALE, M. M. Avaliação da proliferação e apoptose com a utilização do Arranjo de Matriz de Amostra Tecidual (Tissue Microarray – TMA) em

mastocitomas cutâneos caninos. Botucatu, 2010. 46p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.

RESUMO

Os mastócitos são células provenientes do precursor CD34 da medula óssea, o mastocitoma (MCT) pertence ao grupo das neoplasias de células redondas e possui etiologia desconhecida, é a neoplasia cutânea mais comum em cães, sem predileção por raça, sexo ou idade. Seu comportamento biológico é bastante agressivo e de alta frequência. A graduação histopatológia proposta Patnaik et al., (1984), é o critério mais utilizado para a graduação

histopatológica da neoplasia sendo o grau 1 uma neoplasia bem diferenciada, o grau 2 moderadamente diferenciada e o grau 3 pouco diferenciada ou anaplásica. O presente trabalho teve como objetivos a avaliação do ínidice proliferativo e apoptotico dos MCT em lâmina de Microarranjo de tecido (TMA) utilizando a técnica de imunoistoquiímica e TUNEL. Para tal utilizou-se 166 casos de MCT compondo um arranjo em matriz de amostra tecidual, ou tissue microarray (TMA) com 190 amostras, sendo avaliado o padrão de marcação da proteína Kit, a proliferação celular com o anticorpo primário Ki67 e apoptose com o anticorpo primário caspase-3 clivada e pela técnica da Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Mediated dUTP Nick end Labeling Assey

(TUNEL). Quando os casos foram avaliados quanto à imunoexpressão de c-KIT, os tumores (únicos e múltiplos) com expressão citoplasmática da proteína

KIT tiveram uma taxa proliferativa maior e uma menor taxa apoptótica quando

comparados aos com expressão membranosa. Os MCTs grau 3 tiveram um maior índice proliferativo (imunoexpressão de Ki67) quando comparados aos tumores de graus 1 e 2. Não foi observada correlação entre a imunomarcação do anticorpo primário caspase-3 clivada e a técnica de TUNEL, sendo que a técnica de TUNEL se mostrou mais eficaz na avaliação da apoptose que a imunomarcação para caspase-3 clivada.

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Mariana Marras Vidale – Dissertação de Mestrado Abstract

VIDALE, M. M. Evaluation of proliferation and apoptosis using Tissue Microarray (TMA) in cutaneous mast cell tumors. Botucatu, 2010. 46p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.

ABSTRACT

Mast cells are from precursor CD34 cells bone marrow, the mast cell tumor (MCT) belongs to the group of round cell malignancies and has unknown etiology, is the most common skin cancer in dogs without distinction of race, sex or age. Its biological behavior is very aggressive and high frequency. The histopathological grading proposal from Patnaik et al., (1984), is the most

commonly used criterion for the histopathological grade of the tumor is a tumor grade 1 are well-differentiated, grade 2 are moderately differentiatedand grade 3 are poorly differentiated or anaplastic. This study aimed to evaluate the proliferative and apoptotic index of MCT in blade tissue microarray (TMA) using the TUNEL technique and immunohistochemistry. To this end we used 166 cases of MCT composing an tissue microarray (TMA) with 190 samples, and evaluated the pattern of protein labeling kit, cell proliferation, with the primary antibody Ki67 and apoptosis with primary antibody and cleaved caspase-3 by the technique of terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling Mediated Assey (TUNEL). When the cases were evaluated for immunoexpression of c-KIT, tumors (single and multiple) with cytoplasmic KIT protein expression had a higher proliferative rate and a lower apoptotic rate when compared to those with membranous expression. Grade 3 MCTs had a greater proliferative index (Ki67 immunostaining) when compared with tumor grades 1 and 2. No correlation was observed between the immunostaining of primary antibody caspase-3 cleavage and TUNEL technique, and TUNEL technique was more effective in assessing apoptosis that immunostaining for cleaved caspase-3.

(17)

Mariana Marras Vidale – Dissertação de Mestrado Introdução

1. INTRODUÇÃO

O mastocitoma cutâneo (MCT) é uma neoplasia de mastócitos que pertencente ao grupo das neoplasias de células redondas e possui etiologia desconhecida, porém como a maioria dos tumores é provavelmente multifatorial (WELLE et al., 2008). Os mastócitos

neoplásicos podem variar de células bem diferenciadas até anaplásicas (THAMM & VAIL, 2007). O mastocitoma é a neoplasia maligna cutânea mais comum em cães, respondendo por 7 – 21% dos casos de neoplasias malignas da pele destes animais, sem predileção por sexo ou idade (STREFEZZI et al., 2003; PREZIOSI et al., 2004; THAMM & VAIL, 2007;

NEWMAN et al., 2007; DALECK et al., 2009).

Os mastócitos são células efetuadoras da imunidade inata e adiquirida que podem ser encontradas na maioria dos órgãos, como pele, pulmões, e trato gastrointestinal (TIZARD, 2002; HARIR, 2008; WELLE et

al, 2008). Elas são derivadas do precursor celular CD34 da medula óssea,

como efetuadores do sistema imune, deixam a medula ainda indiferenciados e assumem a sua estrutura e função no momento que atingem os tecidos alvo. (SEARCY, 1998; TIZARD, 2002; HARIR, 2008; WELLE et al., 2008).

De todos os métodos que podem fornecer auxílio no prognóstico do paciente com mastocitoma cutâneo, a graduação histopatológica proposta por Patnaik et al., (1984), que utiliza informações derivadas da

análise de diferentes atributos histomorfológicos (tamanho do tumor, celularidade, morfologia celular, índice mitótico e reação estromal) a de maior consistência preditiva (GROSS et al., 2005). Este é o sistema de

graduação mais amplamente utilizado e está bem estabelecido quanto ao tempo de sobrevida nos mastocitomas bem diferenciados e nos pouco diferenciados, porém os de grau intermediário trazem dificuldades de avaliação (SCASE et al., 2006).

A proteína KIT, codificada pelo protooncogene c-KIT estimula a

(18)

Mariana Marras Vidale – Dissertação de Mestrado Introdução

tirosina quinase dos mastócitos que estimulam a proliferação celular (LONGLEY & METCALFE, 2000).

Apoptose é um processo ativo de morte celular que difere morfologicamente da morte por necrose e ocorre durante várias situações fisiológicas e patológicas, constituindo um mecanismo de remoção de células lesadas e, de renovação celular e tecidual (ANAZETTI & MELO, 2007).

A demonstração de que a apoptose é um mecanismo inato de defesa antineoplásica levou a uma intensa investigação dos mecanismos moleculares e sua aplicação no tratamento do câncer (GRIVICICH et al.,

2007).

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Mariana Marras Vidale – Dissertação de Mestrado Revisão de Literatura

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Mastocitoma

O mastocitoma cutâneo (MCT) é um tumor pertencente ao grupo dos tumores de células redondas, sua etiologia é desconhecida, mas como a maioria dos tumores é provavelmente multifatorial (WELLE et al., 2008). Os

mastócitos tumorais podem variar de células bem diferenciadas até anaplásicas (THAMM & VAIL, 2007). Segundo Daleck et al. (2009), este é o

segundo tumor mais comum no cão. Considerando-se apenas os tumores cutâneos, o MCT é o de maior freqüência em diagnósticos de biopsias de pele de cães, correspondendo de 7-21% das neoplasias dermatológicas que afetam estes animais, sem pré-disposição por sexo ou idade (STREFEZZI et

al., 2003; THAMM & VAIL, 2007; NEWMAN et al., 2007; DALECK et al.,

2009).

O MCT ocorre mais freqüentemente em animais idosos, com média de idade de oito a nove anos, mas também pode ser observados em cães jovens (DALECK et al., 2009). Não há predileção sexual, porém, há

forte evidência de predisposição racial, sugerindo uma contribuição genética para o desenvolvimento do MCT (THAMM & VAIL, 2007). Raças como o Boxer, Boston Terrier, Bullmastiff e Labrador são freqüentemente acometidas. Apesar da ocorrência maior na raça Boxer, estes cães apresentam tumores bem diferenciados, o que indica um prognóstico favorável (BOSTOCK et al., 1986). No entanto, até o presente momento não

há trabalhos que comprovem que os mastocitomas nos Boxers são menos agressivos em relação às outras raças.

O comportamento dos MCTs e seu prognóstico dependem do seu grau histológico (PATNAIK et al., 1984) e localização anatômica (POLTON,

(20)

Segundo Patnaik et al., (1984), os tumores de grau 1 são

circunscritos, localizam-se principalmente na derme, e são compostos de células bem diferenciados com grânulos metacromáticos bem diferenciados no citoplasma. Os tumores de grau 3 apresentam uma pobre diferenciação celular, padrão de crescimento agressivo, moderada a elevada atividade mitótica e quantidade discreta ou ausência de grânulos citoplasmáticos. Os tumores de grau 2 constituem uma forma intermediária, mas eles tendem a infiltrar-se mais profundamente do que as neoplasias de grau 1.

A graduação histopatológica proposta por Patnaik et al., (1984) é

o método mais utilizado para prever o comportamento biológico e prognóstico de um cão com MCT. Esta classificação é útil para predizer a progressão geralmente benigna (grau 1) e das formas malignas (grau 3) da doença. No entanto, este método de classificação não prediz o comportamento do MCT de grau intermediário (grau 2) devido à ampla gama de características exibida por esses tumores (SCASE et al., 2006). A

sobrevivência dos animais com tumores bem diferenciados (grau 1) é duas vezes maior que a de animais portadores de tumores de diferenciação intermediária (grau 2) e seis vezes maior que os animais portadores de tumores de baixo grau de diferenciação (grau 3) (JAFFE et al., 2000).

Macroscopicamente o MCT é caracterizado por: lesões firmes, elevadas, circunscritas, freqüentemente edemaciadas ou ulceradas, com variações de 1-10 cm de diâmetro. A área pode estar alopécica e/ou eritematosa em alguns casos (RIVA et al., 2005; THAMM & VAIL, 2007,

DALECK et al., 2009). O MCT pode se desenvolver de forma rápida, com

metástases e pode recidivar depois da remoção cirúrgica, principalmente quando ocorre o comprometimento das margens cirúrgicas (ZEMKE et al.,

2002). As metástases ocorrem por disseminação hematógena ou linfática, atingindo linfonodos regionais, baço, fígado e medula óssea, sendo rara a metástase pulmonar (GIEGER et al., 2003; MURPHY et al., 2004; MULLINS

(21)

Devido a quantidade variável de tecido colágeno no MCT, alguns podem ter consistência firmes e outros macia, semelhante ao lipoma (DOBSON & SCASE, 2007). MCTs mais agressivos podem ser grandes massas mal definidas de tecido mole, e alguns podem estar cercados por nódulos satélites (DOBSON & SCASE, 2007).

Os sinais clínicos refletem a extensão do envolvimento sistêmico e a presença ou ausência de síndrome paraneoplásica atribuída a degranulação dos mastócitos e a liberação de histamina e heparina. O animal pode apresentar sinais clínicos sistêmicos como anorexia, êmese ou hematêmese, diarréia, melena, anemia, peritonite e dor abdominal (THAMM & VAIL, 2007, DALECK et al. 2009).

Podem ser também observados gastrite, ulcerações gastroduodenais, vasculite, distúrbios de coagulação sanguínea e na resposta imunológica, glomerulonefrite focal e degeneração do colágeno, devido à liberação de produtos vasoativos pelos mastócitos neoplásicos (PULLEY & STANNARD, 1990; AIELLO et al., 2001; THAMM & VAIL, 2007).

Úlceras gastrointestinais são muito comuns, ocorrendo com maior freqüência no estômago e em menor no duodeno (DALECK et al., 2009). Em estudo

post-mortem, 83% dos cães com MCT apresentavam ulcerações

gastroduodenais (DALECK et al., 2009).

As associações dos estágios clínicos do paciente com a graduação histológica são bons fatores preditivos para o prognóstico, sendo o tumor que teve sua retirada cirúrgica incompleta o de estágio 0, o tumor com ou sem o envolvimento do linfonodo regional designados estágios 2 e 1 respectivamente e múltiplos tumores são estágio 3 e tumores recorrentes e/ou metastáticos estágio 4 na classificação quanto ao estágio clínico (ZEMKE et al., 2002).

O tratamento mais utilizado para o MCT é a excisão cirúrgica associada ou não a quimioterapia e/ou radioterapia e criocirurgia, dependendo do grau do tumor e evidência de metástase (NAKAICHI et al.,

2007; DALECK et al., 2009). A excisão cirúrgica do tumor acompanhada de

(22)

maior facilidade de realização quando comparada a radioterapia, além de possibilitar o tratamento de possíveis focos metastáticos em órgãos distantes do foco primário do tumor (NAKAICHI et al., 2007; DALECK et al.,

2009).

Segundo Kiupel et al., (2004), Northrup et al., (2005) e Pinczowski

et al.,(2008), há uma variação interobservador significativa entre os

patologistas veterinários na graduação histopatológica do MCT utilizando o sistema proposto por Patnaik et al., (1984). Algumas hipóteses foram

geradas para justificar essa discrepância na graduação dos mastocitomas, como a subjetividade dos critérios avaliados, dificuldade em determinar ou distinguir entre as características da classificação ou até mesmo a heterogenicidade na população celular em diferentes campos do mesmo mastocitoma (PINCZOWSKI et al., 2008).

A graduação dos mastocitomas cutâneos caninos tendo como base critérios morfológicos, não é a mais adequada quando se procura o estabelecimento de ferramentas prognósticas, devendo-se levar em consideração a correlação de aspectos morfológicos, moleculares, imunológicos e clínicos (PINCZOWSKI et al., 2008).

2.2 Proto-oncogene c-KIT e sua proteína

O proto-oncogene c-KIT, foi primeiramente identificado como o

homólogo celular do oncogene viral v-KIT derivado do retrovírus felino

HZ4FeSV do sarcoma felino (MORINI et al., 2004). A proteína transcrita pelo

gene c-KIT é um receptor transmembrana tipo três do fator de crescimento

dos mastócitos (Mast cell growth factor – MGF), também conhecido como

fator de células tronco (stem cell factor – SCF), esta é expressa em muitos

tecidos como glioblastoma, placenta, cérebro, precursores eritrocitários, melanócitos, basófilos e mastócitos (KIUPEL, et al., 2004; EDLING &

HALLBERG, 2007).

(23)

está associada com carcinogênese, como ocorre nas neoplasias gastrointestinais estromais, mastocitoma e leucemia mielóide crônica (NCBI, 2010).

Foi descrita a ocorrência de mutações no domínio justamembrana do protooncogene c-KIT em mastócitos neoplásicos que culmina na

autofosforilação deste receptor (LONDON et al., 1999; REGUERA et al.,

2000). A principal mutação encontrada é a duplicação em tandem, que causa fosforilação constitutiva do receptor, sem que ocorra a necessidade da ligação com o SCF. Isso explicaria o crescimento descontrolado dos tumores e a associação das duplicações em tandem com a malignidade desta neoplasia (LONDON et al., 1999; REGUERA et al., 2000; ZEMKE et

al., 2002; DOWNING et al., 2002; WEBSTER et al., 2007).

Reguera et al., (2000), demonstraram uma correlação direta entre

a expressão da proteína KIT (que se dá pela tradução do DNA correspondente ao gene c-KIT) com os graus histológicos mais agressivos

dos mastocitomas, principalmente nos menos diferenciados em respeito à determinação do prognóstico do paciente.

Kiupel, et al., (2004) e Webster et al., (2007), citam três padrões

de marcação imunoistoquímica para a localização da proteína KIT nos mastócitos neoplásicos de cães, sendo eles membranoso, citoplasmático focal e citoplasmático difuso. Esses padrões foram correlacionados com o prognóstico, sendo que animais que apresentavam os padrões citoplasmáticos possuíam um prognóstico pior que do que os que apresentavam o padrão membranoso.

2.3 Índice Proliferativo

(24)

A proliferação celular descontrolada é uma marca registrada das neoplasias e, como tal, a mensuração da proliferação celular têm sido amplamente utilizada na tentativa de prever o comportamento das neoplasias (MAGLENNON et al., 2008; WELLE et al., 2008). O

desenvolvimento neoplásico depende, em diversas instâncias, das taxas de proliferação e morte celular (MARTIN DE LAS MULAS et al., 1999).

Biomarcadores de proliferação celular foram amplamente investigados na medicina humana como ferramentas potenciais determinação do prognóstico, comportamento biológico das neoplasias e resposta à terapia (DOBSON & SCASE, 2007). Os biomarcadores de proliferação, como o AgNOR e os anticorpos anti Ki-67 e PCNA podem ser utilizados para estimar o número de células que estão em processo de divisão celular (SCASE et al., 2006; WEBSTER 2007).

2.3.1 Ki-67 (clone MIB-1)

O Ki-67 é uma proteína nuclear que é expressa em todas as fases ativas do ciclo de proliferação celular, mas não está presente em células fora deste ciclo ou que estão quiescentes, a meia vida da proteína Ki-67 é curta, sendo esta degradada em aproximadamente 1 hora após o final da mitose (ABADIE et al., 1999; STREFEZZI et al., 2003; SCASE et al., 2006; OZAKI

et al., 2007; DOBSON & SCASE, 2007; WEBSTER et. al., 2007; WELLE et

al., 2008;).

O número de células positivamente imunorreativas para Ki-67 é utilizado para determinar o índice de proliferação ou o número relativo de células ativamente envolvidas na fração de crescimento do ciclo de proliferação celular (WEBSTER et al., 2007). A imunoexpressão elevada de

Ki-67, clone MIB1, está associada ao aumento da mortalidade, taxa de recidiva local e metástase nos mastocitomas cutâneos caninos (ABADIE et

al., 1999; SCASE et al., 2006; WEBSTER et al., 2007).

(25)

primeiro identifica as células que estão nas fases S e M do ciclo celular, possuindo valor prognóstico em diferentes estudos realizados em seres humanos e outros animais (SCASE et al., 2006).

2.4 Morte Celular

Morte celular é a perda irreversível das atividades integradas da célula com consequente incapacidade de manutenção dos seus mecanismos de homeostasia. Os processos de morte celular podem ser classificados de acordo com suas características morfológicas e bioquímicas em necrose, apoptose, autofagia e senescência. Alterações na coordenação desses tipos de morte celular estão implicadas na carcinogênese (GRIVICICH et al., 2007).

As células morrem em resposta a uma variedade de estímulos e durante apoptose isso ocorre de forma controlada. Assim sendo, a apoptose se distingue da necrose, que é uma morte celular descontrolada, levando à lise das células, resposta inflamatória e, potencialmente, a problemas graves de saúde. Apoptose, ao contrário, é um processo no qual as células desempenham um papel ativo na sua própria morte (muitas vezes referida como o suicídio celular) (DASH, 2010).

Embora os processos de proliferação e morte celular pareçam ser opostos e contraditórios, evidências indicam que os dois estão ligados (EVAN & LITTLEWOOD, 1998; LOS, et al., 2001). Uma explicação para isso

é que a tendência à ocorrência de apoptose é uma conseqüência normal da célula em proliferação, sendo que a proliferação celular e apoptose podem compartilhar as mesmas vias (EVAN & LITTLEWOOD, 1998).

Uma neoplasia com baixo índice de proloferação e baixo índice de morte celular pode ser tão agressiva quanto uma que prolifera rápido mas possui um uma alta taxa de morte celular (SCASE et al., 2006). Embora seja

(26)

2.4.1 Apoptose

Apoptose ocorre devido ativação de mecanismos bioquímicos intrínsecos (MARTIN DE LAS MULAS, 1999), que desempenha papéis fundamentais durante o desenvolvimento embrionário e na manutenção dos tecidos (MARTIN DE LAS MULAS, 1999; ANAZETTI & MELO, 2007; GRIVICICH et al., 2007).

É um processo pelo qual células indesejadas são eliminadas nos organismos multicelulares de maneira não-prejudicial (ALLAN & CLARKE, 2009; PENNARUN et al., 2010), sendo de especial importância nos

processos de desenvolvimento das células animais, regeneração dos tecidos, funcionamento e controle do sistema imune e nas doenças (SALGADO, 2002; ANAZETTI & MELO, 2007; GRIVICICH et al., 2007).

A característica morfológica da apoptose é a retração celular, causando perda da aderência com a matriz extracelular e células vizinhas. Ocorre ruptura da membrana das mitocôndrias, posteriormente a formação de prolongamentos (blebbings) na membrana, condensação da cromatina e

degradação do DNA em fragmentos oligonucleossomais. Os prolongamentos celulares aumentam de tamanho e número, se desprendendo e formando corpos apoptóticos que são fagocitados por macrófagos sem incitar processo inflamatório (IEMURA, 1994; COHEN, 1997; LOWE & LIN, 2000; GRIVICICH et al., 2007). As alterações nucleares

pré-eminentes da apoptose são associadas à clivagem internucleossômica do DNA (COHEN, 1997).

(27)

A apoptose pode ser iniciar por meio de duas vias, que são a intrínseca e extrínseca, e resulta numa última via comum que é ativada pelas mesmas moléculas e substâncias efetoras da apoptose (PENNARUN et al.,

2010; BREGANO et al., 2010). O processo completo de apoptose envolve um grande número de proteínas diferentes localizadas principalmente na membrana celular, citoplasma, mitocôndria e núcleo (SALGADO, 2002 PENNARUN et al., 2010).

2.4.2 Caspases

As caspases (enzimas que estão relacionadas diretamente com a apoptose) estão presentes no citoplasma da maioria das células nas suas formas inativas como uma cadeia única de polipeptídeos. Elas atuam como transdutoras de sinal e efetoras da morte celular (GUO & HAY, 1999), sendo ativadas e levando a apoptose quando a cadeia polipeptídica é quebrada (WEIL et al., 1999; ALLAN & CLARKE, 2009). As caspases são enzimas da

família das cisteinoproteases e podem ser agrupadas em duas (2) subfamílias: a subfamília ICE (enzima de conversão da interleucina-β dos

mamíferos – mammalian interleukin-β converting enzime), que

predominantemente atua nos processos inflamatórios; e a subfamília CED (relacionada à proteína derivada do gene CED-3 do nematódeo C. elegans),

que possuem entre seus membros a caspases-3, uma proteína diretamente envolvida na apoptose (NICHOLSON & THORNBERRY, 1997; NICHOLSON, 1999; DUAN et al., 2003; BRÖKER et al., 2005). Essas

proteínas são caracterizadas pela sua especificidade, quase que absoluta, pelo ácido aspártico em sua posição ”P” (COHEN, 1997; ALLAN & CLARKE, 2009).

Já foram identificadas 14 tipos de caspases, que são envolvidas em diferentes aspectos da morte celular (LOS, 2001). O papel das caspases é crucial para interferir na homeostase, no processo de reparação celular e na clivagem de componentes essenciais, resultando na apoptose (NICHOLSON & THORNBERRY, 1997).

(28)

duas vias bem descritas onde as caspases funcionam como transdutoras para a ativação da apoptose. Em uma via, que se inicia na membrana plasmática, a caspase se liga no receptor de morte celular, resultando no recrutamento da pró-caspase-8 e um complexo de multiproteínas que se autoativam e também umas as outras. Na outra via, o estresse celular de vários tipos causa a liberação da proteína citocromo c,a partir da

mitocôndria, em associação com uma proteína citoplasmática conhecida como Apaf-1, que recruta e ativa a caspase-9 (ALLAN & CLARKE, 2009). As duas vias levam a clivagem de substratos celulares ocorrendo a apoptose (GUO & HAY, 1999).

A caspase-3 é uma das principais proteínas executoras do processo de apoptose, sendo responsável, total ou parcialmente, pela clivagem proteolítica de enzimas importantes em diferentes sistemas durante apoptose (COHEN, 1997; DUAN et al., 2003). É a caspase mais estudada e

relaciona-se com apoptose em diversos distúrbios de origem hematopoiética no ser humano. Neoplasias altamente agressivas possuem uma concentração citoplasmática menor de caspase-3 que as neoplasias menos agressivas. A inibição da atividade das caspases, por mutação ou mesmo por ação terapêutica, pode retardar ou até impedir a morte celular por apoptose (NICHOLSON, 1999), tornando-a uma importante molécula alvo no tratamento dos cânceres.

2.4.3 Índice Apoptótico

O crescimento tumoral depende da proliferação e morte das células neoplásicas, incluindo a apoptose (MARTIN DE LAS MULAS, 1999; SCASE, 2006; GRIVICICH et al., 2007). A sobrevivência celular é

determinada pela estabilidade cromossômica durante a mitose, podendo ser seu principal efeito burlar a morte celular (SCASE et al., 2006).

(29)

2.5 Arranjo em matriz de amostra tecidual, ou tissue microarray (TMA)

Um dos principais problemas enfrentados é a falta crônica de tecidos para a realização das análises. Quando uma amostra de tecido é obtida, ela precisa ser gerenciada de modo a maximizar seu valor de pesquisa. O arranjo em matriz de amostra tecidual, ou tissue microarray

(TMA), utiliza esse recurso escasso de forma eficiente por meio do corte das amostras de tecido ao realizar uma biópsia única em blocos doadores, que pode ser posteriormente utilizada em múltiplos ensaios. Um bloco de parafina contendo amostra de centenas de tumores de modo ordenado é uma poderosa ferramenta para a patologia investigativa aplicada (ANDRADE, et al., 2007).

Outra vantagem significativa inerente à técnica é de que cada amostra de tecido é tratada em condições idênticas, mantendo a uniformidade experimental. Além disso, apenas uma pequena quantidade de reagentes é necessária para analisar toda uma coorte de cada lâmina, assim reduzindo significativamente o custo dos estudos (ANDRADE, et al.,

2007).

2.6 Técnica da Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Mediated dUTP Nick end Labeling Assey (TUNEL)

Na ausência de uma molécula específica para detectar a apoptose, alterações estruturais do DNA fornecem a base para o sistema de marcação pela fragmentação da cadeia dupla de TUNEL (terminal

deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling assey)

(manual In situ Cell Death detection Kit, POD. ROCHE, cat. nº

11684871910), (MARTIN DE LAS MULAS, 1999; BRYNE et al., 1999;

DUAN et al, 2003).

A avaliação de TUNEL (In situ Cell Death Detection Kit, ROCHE)

(30)

terminal deoxynucleotidyl transferase que polimeriza os nucleotídeos

modificados nas regiões de fragmentação do DNA, possibilitando assim sua observação por meio de fluorescência a qual pode ser avaliada por meio de microscopia fluorescente. Para a visualização em microscopia de luz utiliza-se o anticorpo anti-POD (anticorpo anti-fluoresceína conjugada com

horse-radish peroxidase) que se liga a fluoresceína e, após a revelação utilizando

DAB, culmina na marcação do tecido de maneira semelhante ao que ocorre na imunoistoquímica (manual In situCell Death detection Kit, POD. ROCHE,

(31)

Mariana Marras Vidale – Dissertação de Mestrado Objetivos

3. OBJETIVOS

3.1 Correlacionar os índices de proliferação celular e apoptose com a graduação histopatológica, de acordo com Patnaik et al., (1984), nos

mastocitomas cutâneos caninos.

3.2 Correlacionar os índices de proliferação celular e apoptose com o padrão de marcação de c-KIT (KIUPEL et al., 2004 e WEBSTER et al.,

(32)

Mariana Marras Vidale – Dissertação de Mestrado Material e Métodos

4. MATERIAL E MÉTODOS

Este trabalho está de acordo com o termo de “Princípios Éticos na Experimentação Animal” e foi aprovado pela Comissão de Ética e Experimentação Animal (CEUA) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) – Unesp - Botucatu (Protocolo: 102/2010-CEUA).

4.1 Seleção das Amostras

Foram selecionadas 98 amostras de MCT cutâneo canino do arquivo do Serviço de Patologia Veterinária – FMVZ – Unesp, Botucatu e 68 amostras do Laboratório Veterinário Werner e Werner (Curitiba/PR), totalizando 161 casos, os casos enviados pelo Laboratório Veterinário Werner e Werner correspondiam somente a cães da raça Boxer com MCT, sem dados sobre idade, sexo, local da lesão.

Foram coletados dados como raça, sexo, idade dos animais, e estadiamento clínico, da maioria dos animais (n=51/98) da FMVZ, Unesp, Botucatu, por meio de entrevista com os proprietários, veterinário e/ou análise de prontuários. Do material proveniente do Laboratório Veterinário Werner e Werner (Curitiba/PR), se obteve apenas a idade dos animais, raça e sexo.

(33)

As lâminas histológicas coradas por HE, correspondentes a cada uma dessas amostras, foram reavaliadas e reclassificadas histologicamente de maneira simultanea por três pesquisadores (MMV, RTN, RLA) utilizando microscópio de múltipla observação (modelo: DM2500, Leica, Inglaterra), obedecendo a graduação histológica e os critérios morfológicos determinados por Patnaik et al. (1984). Os pesquisadores não estavam

cientes, ao momento da reavaliação dos casos, dos dados referentes à localização e grau histológico da neoplasia (previamente atribuído) no momento das avaliações das lâminas. Quando havia discordância na graduação, estabeleceu-se um consenso de pelo menos dois observadores.

4.2 Confecção das lâminas de arranjo em matriz de amostra tecidual, ou tissue microarray (TMA)

De cada lâmina de HE selecionou-se uma área representativa do tumor, que foi marcada com caneta permanente, para ser o local da “biopsia” (spot) para a confecção do TMA. A lâmina de TMA foi constituída dos 161

casos, somando-se 5 casos em triplicata e 7 casos em duplicata (161 + 5 triplicatas + 7 duplicatas), totalizando 190 amostras para avaliação.

O TMA foi construído no Departamento de Anatomia Patológica do Hospital A. C. Camargo, São Paulo/SP, com o uso do equipamento específico Tissue Microarrayer (Beecher Instruments, Silver Spring, EUA)

para este procedimento. Para tal construção, agulhas com diâmetro de 1,0 mm2 foram introduzidas em um bloco de parafina virgem (receptor), com a distância de 0,2mm entre eles. Para a posterior leitura do TMA, foi construído um mapa com a identificação de cada amostra, sendo o spot do

tecido diferente do tumor (placenta) para orientação da seqüência de leitura.

Cortes seriais de 4µm foram obtidos a partir do bloco receptor com auxílio de micrótomo, sendo estes transferidos para lâminas adesivas carregadas positivamente (Positive Charged Adhesion Slides, Amitel, Brasil)

utilizando selos de transferência de material parafinado (Paraffin tape

transfer, Instrumedics, EUA). A primeira delas foi corada por HE, para

(34)

permaneceram em freezer a –200C para posterior realização das técnicas de

imunoistoquímica e de TUNEL.

4.3 Técnica de imunoistoquímica para detecção de c-KIT (CD117), Ki67 (clone MIB1) e caspase-3 clivada(clone Asp 175)

Seguiu-se protocolo do Laboratório de Imunoistoquímica do Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ – Unesp – Botucatu para a realização das reações. As lâminas de TMA foram inicialmente mantidas em estufa a 56ºC por 24 horas, para a retirada da parafina protetora que recobria as lâminas. Posteriormente, as lâminas foram desparafinizadas utilizando xilol - 2 banhos, sendo o primeiro de 30 minutos, o segundo de 20 minutos, hidratação em álcool – álcool absoluto 1 (3 minutos), álcool absoluto 2 (3 minutos), álcool absoluto 3 (3 minutos), álcool 95º (3 minutos), álcool 85% (3 minutos), após a desparafinização foi feita 10 lavagens em águas deionizada para retirar o excesso de álcool.

A recuperação antigênica foi realizada utilizando solução de citrato 10mM, pH 6,0 em câmara microprocessada de pressão (Pascal

Pressure Chamber, Dako, EUA), de acordo com o programa indicado pelo

fabricante. Após a recuperação antigênica as lâminas foram resfriadas em temperatura ambiente por 20 minutos e lavadas com água deionizada (10 lavagens) e mantidas em solução de tampão TRIS.

Foi realizado bloqueio da peroxidase endógena incubando as lâminas com peróxido de hidrogênio 3% diluído em metanol durante 20 minutos. Na seqüência, as lâminas foram lavadas em água destilada (10 vezes) e realizou-se o bloqueio das proteínas inespecíficas com solução de leite MOLICO (Nestlé, Brasil) a 3%, durante 1 hora. Posteriormente, as lâminas foram lavadas em águas destilada (10 vezes) e subseqüentemente mantidas em solução de TRIS.

Após, as lâminas foram incubadas com anticorpos primários diluídos em solução própria para realização de imunoistoquímica – Dako

Antibody Diluent, Co. S3022 (Dako, EUA). Os anticorpos primários, clones,

(35)

finalidade podem ser observados na tabela 1. As lâminas foram posteriormente depositadas em câmara úmida e incubadas com os anticorpos primários por 18 horas (“overnight”) a temperatura de 4ºC.

Tabela 1. Anticorpos primários, tipos de marcação, clones, fabricantes, diluições e

finalidades

Anticorpo

primário marcação Tipo de Clone Fabricante Diluição Finalidade

Anti-CD117 humano

(c-KIT)

Co. A4502

Citoplasmática ______ Dako, EUA 1:400 Marcação da _{proteína kit}

Anti-Ki67 humano

Co. M7240

Nuclear MIB-1 Dako , EUA 1:50 Marcação de células em proliferação

Anti-caspase-3

clivada

Co. 9661

Nuclear Asp 175 Cell Signaling, _EUA 1:50

Marcação de células em

apoptose

Após a incubação dos anticorpos primários as lâminas foram lavadas com solução de TRIS. Na seqüência, a reação antígeno-anticorpo foi detectada utilizando sistema de detecção Envision Dual Link – Co. K4065

(Dako, EUA). Seguindo as recomendações do fabricante, incubou-se as lâminas em câmara úmida por 1 hora em estufa a 27ºC, com posterior lavagem utilizando tampão TRIS.

(36)

absoluto (3 minutos), xilol (6 minutos) e montadas utilizando meio de montagem Permount– Co. SP 15-500 (Fisher Scientific, EUA) e lamínulas.

4.4 Reação da Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Mediated dUTP Nick end Labeling Assey (TUNEL)

Para realização da reação, uma lâmina de TMA foi mantida em estufa 56ºC por 24 horas, para a retirada da parafina protetora que recobria as lâminas e posterior desparafinização, assim como seus controles positivo e negativo (ambos linfonodos caninos). Posteriormente, a desparafinização das lâminas foi realizada com xilol – 2 banhos, sendo o primeiro de 30 minutos, o segundo de 20 minutos, hidratação em álcool – álcool absoluto 1 (3 minutos), álcool absoluto 2 (3 minutos), álcool absoluto 3 (3 minutos), álcool 95º (3 minutos), álcool 85% (3 minutos), após a desparafinização foi feita 10 lavagens em águas deionizada para retirar o excesso de álcool.

Na seqüência, a lâmina foi submetida à recuperação antigênica utilizando solução de citrato 10mM, pH 6,0 em câmara microprocessada de pressão, de maneira semelhante ao realizado nas reações de imunoistoquímica. Subseqüentemente foi realizado bloqueio da peroxidase endógena utilizando peróxido de hidrogênio 3% diluído em metanol durante 20 minutos. Após este bloqueio a lâmina foi lavada com solução de tampão salina fosfato (phosphate buffer-saline– PBS).

A lâmina foi depositada em câmara úmida, removeu-se 100µl de

LABEL SOLUTION - fornecido pelo kit - para o controle negativo,

adicionou-se o volume total (50µl) da ENZIMA aos 450µl restantes do LABEL

SOLUTION - obtendo 500µl de solução TUNEL, aplicou-se 50µl por lâmina,

que foram cobertas com parafilme e incubadas em câmara úmida por 1hora em estufa a 37ºC. Após esse período as lâminas foram lavadas com PBS, secas e aplicou-se 50µl do conversor POD, cobrindo-se as amostras com parafilme. As lâminas foram subseqüentemente incubadas em câmara úmida por 30 minutos em estufa a 37ºC.

(37)

um período de 5 minutos em temperatura ambiente, efetuou-se mais uma lavagem com PBS e contra coloração com hematoxilina de Harris (3 minutos). Posteriormente, foi realizada lavagem em água corrente (10 minutos) e montagem em meio aquoso (Aqueous mounting medium, Dako,

EUA).

4.5 Forma de análise dos resultados

Os casos foram subdivididos em dois grupos, o de animais com tumores únicos (animais que apresentavam apenas um nódulo em seu corpo, n=33) e múltiplos (animais que apresentavam mais de um nódulo, n=18). As amostras foram agrupadas de acordo com o grau histológico (grau 1, grau 2 e grau 3) e com padrão de marcação para c-KIT (membranoso e citoplasmático – difuso e focal, segundo Kiupel et al., 2004 e Webster et al.,

2007).

Nas reações de TUNEL e imunoistoquímicas para os anticorpos caspase-3 clivada, Ki-67, avaliou-se o percentual de células positivas em cada core do TMA, de forma semi-quantitativa, atribuindo-se escores (0 -

sem marcação celular, 1 - até 10% de marcação celular, 2 - de 10 a 30% de marcação celular, 3 - de 30 a 60% de marcação celular e 4 – maior que 60% de marcação celular), de acordo com o descrito por Russell, et al., 2010. Os

cores que não apresentaram nenhuma marcação para o anticorpo primário

Ki-67, mesmo que em regiões distintas do tumor (considerada como controle positivo interno) foram descartados da avaliação. Para a imunomarcação de da proteína Kit, avaliou-se o padrão de marcação, de acordo com Kiupel et

al., (2004) e Webster et al., (2007).

Os escores atribuídos a cada um dos marcadores foram reagrupados em 0 (negativo), 1 e 2 (até 30% das células com marcação positiva), 3 e 4 (mais de 30% das células com marcação positiva). Estes resultados foram avaliados de acordo com o grau histológico e padrão de marcação do anticorpo c-KIT, com o auxílio do teste Exato de Fisher (grau de liberdade 1 e nível de significância de 95%) utilizando software

(38)

associação entre o grau histológico e os escores de imunomarcação foi realizada.

Para avaliar estatisticamente a concordância entre os resultados obtidos pelos métodos de análise de apoptose – TUNEL e imunoistoquímica pela caspase-3 clivada – foi utilizado o coeficiente Kappa, onde resultados menores do que 0,20 foram considerados como de concordância pobre; os resultados compreendidos entre o intervalo de 0,21 a 0,40 foram considerados como de concordância regular; resultados alocados entre o intervalo de 0,41 a 0,60 foram considerados como de concordância moderada; entre 0,61 a 0,80, os resultados foram considerados como de concordância boa; e resultados alocados no intervalo compreendido entre 0,81 a 1,00 foram considerados como de concordância muito boa.

Fotomicrografias foram obtidas das lâminas de imunoistoquímica e de TUNEL foram digitalizadas utilizando microscópio óptico de campo claro Leica DMR (Leica, Inglaterra) acoplado a um sistema de analise de imagens constituído por uma câmera digital DFC 500 de 1360x1024 pixels e 96 DPIs (Leica, Inglaterra) e software de análise de imagens QWin versão

(39)

Mariana Marras Vidale – Dissertação de Mestrado Resultados

5. RESULTADOS

Do total de casos avaliados como tumores únicos (n=141), 13 (9%) foram diagnosticados como MCT de grau 1, 82 (58%) como MCT de grau 2 e 46 (33%) como MCT de grau 3, os casos em que os spots

desgrudaram das lâminas ou foram prejudicados de forma que não era possível a sua avaliação não foram contados. Para os MCT únicos de grau 1, 11 (11/11 - 100%) tiveram imunomarcação para o anticorpo Ki-67 com <30% das células positivas (escores de 1 e 2) e/ou negativas (escor 0); para os MCT de grau 2, 75 (75/75 - 100%) tiveram imunomarcação para Ki-67com <30% das células positivas (escores de 1 e 2) e/ou negativas (escore 0); e para os MCT únicos de grau 3, 28 (28/33 - 85%) tiveram imunomarcação para Ki-67 com <30% das células positivas (escores de 1 e 2) e/ou negativas (escore 0), e 5 (5/33 - 15%) com mais de 30% das células positivas (escores 3 e 4) (tabela 2). Observou-se diferença estatística pelo Teste Exato de Fisher, entre o índice proliferativo dos graus 2 e 3 (p=0,0021), sendo que os MCT grau 3, tiveram o maior número de amostras >30% das células positivas (escores 3 e 4) quando comparado aos MCTs de grau 2 (tabela 2).

Para os MCT de graus 1, 2 e 3 100% das amostras tiveram a imunomarcação para o anticorpo caspase-3 clivada com <30% das células positivas (escores de 1 e 2) e/ou negativas (escore 0). Não houve diferença estatística pelo Teste Exato de Fisher (tabela 2).

(40)

Teste Exato de Fisher, entre o índice apoptótico avaliado pelo método de TUNEL e os graus histológicos dos MCTs (tabela 2).

Tabela 2. Índice proliferativo (Ki-67) e apoptótico (TUNEL e Caspase-3 clivada) dos MCT

únicos, de acordo com o grau histológico

Grau 1 Grau 2 Grau 3

Escores 0, 1 e 2 Escores 3 e 4 Escores 0, 1 e 2 Escores 3 e 4 Escores 0, 1 e 2 Escores 3 e 4

Ki-67 11 (100%) 0 75 (100%) 0 28 (85%) 5 (15%)

TUNEL 9 (90%) 1 (10%) 56 (74%) 20 (26%) 33 (75%) 11 (25%)

Caspase-3 12 (100%) 0 95 (100%) 0 51 (100%) 0

(41)

tiveram mais amostras <30% das células positivas (escores 1 e 2) e/ou negativas (escore 0) quando comparado aos MCTs de grau 3 (tabela 3).

Tabela 3. Índice proliferativo (Ki-67) e apoptótico (TUNEL e Caspase-3 clivada) dos MCT

múltiplos, de acordo com o grau histológico (n=25)

Grau 1 Grau 2 Grau 3

Escores 0, 1 e 2 Escores 3 e 4 Escores 0, 1 e 2 Escores 3 e 4 Escores 0, 1 e 2 Escores 3 e 4

Ki-67 1 (100%) 0 19 (100%) 0 4 (100%) 0

TUNEL 1 (100%) 0 18 (95%) 1 (5%) 2 (50%) 2 (50%)

Caspase-3 1 (100%) 0 19 (100%) 0 4 (100%) 0

Quando reagrupamos os MCTs de acordo com a localização anatômica, não observamos diferenças estatística em relação aos índices proliferativo (Ki67) e apoptótico (caspase-3 e TUNEL) (dados não apresentados).

Quando os MCTs únicos foram agrupados quanto ao padrão de imunomarcação da proteína KIT em membranoso (n=39) e citoplasmático

(difuso e focal – n=97), os valores do anticorpo Ki-67(também utilizando

cut-off de 30% de células marcadas) foram 37 (37/37 - 100%) das amostras com

<30% de marcação positiva das células (escores de 1 e 2) e/ou negativas (escore 0); para os tumores com marcação membranosa para proteína KIT;

76 (76/81 - 64%) das amostras com <30% de marcação positiva das células (escores de 1 e 2) e/ou negativas (escore 0) e 5 (5/81 - 6%) das amostras obtiveram >30% de células marcadas (escores 3 e 4) dos tumores com marcação citoplasmática (difusa e focal) para proteína KIT (tabela 4). O

resultado obtido pelo Teste Exato de Fisher não foi significativo para a avaliação da imunoexpressão do Ki-67 nos tumores agrupados quanto à imunoexpressão da proteína KIT em membranosa e citoplasmática (difusa e

focal).

(42)

para os tumores únicos, não foram observados resultados significativos pelo Teste Exato de Fisher, quando os mesmos foram agrupados quanto à imunoexpressão de c-KIT (CD117) em membranoso e citoplasmático (difuso e focal).

Tabela 4. Índice proliferativo (Ki-67), apoptótico (TUNEL e Caspase-3) dos MCT únicos, de

acordo com as imunomarcações para c-KIT membranoso e c-KIT citoplasmáticos

c-KIT (MARCAÇÃO

MEMBRANOSA) CITOPLASMÁTICA) c-KIT (MARCAÇÃO

Escore 0, 1 e 2 Escore 3 e 4 Escore 0, 1 e 2 Escore 3 e 4

Ki-67 37 (100%) 0 76 (64%) 5 (6%)

TUNEL 31 (86%) 5 (14%) 66 (71%) 27 (29%)

Caspase-3 39 (100%) 0 97 (100%) 0

Quando os MCTs múltiplos foram agrupados quanto ao padrão de imunomarcação da proteína KIT em membranoso (n=9) e citoplasmático

(difuso e focal – n=16), os valores do anticorpo Ki-67, caspase-3 clivada e reação de TUNEL (também utilizando cut-off de 30% de células marcadas)

(43)

Tabela 5. Índice proliferativo (Ki-67), apoptótico (TUNEL e Caspase-3) dos MCT múltiplos,

de acordo com as imunomarcações para c-KIT membranoso e c-KIT citoplasmáticos

c-KIT (MARCAÇÃO

MEMBRANOSA) CITOPLASMÁTICA) c-KIT (MARCAÇÃO

Escore 0, 1 e 2 Escore 3 e 4 Escore 0, 1 e 2 Escore 3 e 4

Ki-67 8 (100%) 0 16 (100%) 0

TUNEL 8 (89%) 1 (11%) 13 (87%) 2 (13%)

Caspase-3 9 (100%) 0 15 (100%) 0

(44)

Figura 1. Gráfico demonstrando o índice de apoptose (TUNEL) de acordo com a

imunomarcação para o anticorpo c-KIT (CD117) independente do nº de nódulos dos animais acometidos pelo MCT

(45)

Tabela 6. Comparação entre o número de casos de mastocitoma cutâneo canino de grau 1,

2 e 3 com marcação celular <30% para TUNEL e <30% de células marcadas para caspase-3 clivada pela imunoistoquímica

O mesmo ocorre quando comparados os mastocitomas de grau 1, 2 e 3, as células marcadas para TUNEL >30% com as células marcadas para caspase-3 clivada >30% o coeficiente Kappa foi de 0,07 (IC [-0,14;0,14]), indicando que não houve concordância (tabela 7).

Tabela 7. Comparação entre o número de casos de mastocitoma cutâneo canino de graus

1, 2 e 3 com marcação celular >30% pelo TUNEL e >30% de células marcadas para caspase-3 clivada pela imunoistoquímica

TUNEL <30% Caspase <30%

Grau 1 Grau 2 Grau 3

Grau 1 21 68 45

Grau 2 87 134 111

Grau 3 54 101 78

TUNEL >30% Caspase >30%

Grau 1 Grau 2 Grau 3

Grau 1 1 19 11

Grau 2 1 19 11

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Figura 2. Fotomicrografias demonstrando coloração de hematoxilina e eosina, padrão de

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(48)

Mariana Marras Vidale – Dissertação de Mestrado Discussão

6. DISCUSSÃO

O percentual de cães SRD foi de 15%. Dos cães com raça definida, os Boxers foram os mais acometidos (54% do total), assim como demonstra a literatura DALECK, (2009); entretanto, no presente estudo o resultado tende a estar direcionado, uma vez que uma parte das amostras utilizadas consistia exclusivamente de animais da raça supracitada. As fêmeas foram mais acometidas (47%) pelo mastocitoma cutâneo que os machos (39%), sendo que 14% dos animais não possuíam informações relativas ao sexo. Esses dados estão de acordo com Simões et al., (1994);

Maglennon, et al., (2008) e Webster, et al., (2007). A maioria dos cães com

mastocitoma cutâneo incluídos neste estudo possuía a idade de sete (7) anos, o que corrobora com os dados encontrados por Webster, et al., (2007),

e Maglennon, et al., (2008), mas no estudo citado anteriormente, todos os

animais possuíam mastocitomas cutâneos de grau 2.

As lesões em tórax (50%) foram as mais freqüentes, seguidas pelas lesões em membros (29%), as lesões menos freqüentes foram nas regiões perineal/genital (18%) e de cabeça (3%), que corroboram com a literatura de NEWMAN, et al., (2007); THAMM & VAIL (2007); FURLANI, et

al., (2008); WELLE, et al,. (2008); DALECK, (2009). Segundo THAMM &

VAIL (2007); FURLANI, et al., (2008) e DALECK, (2009). As regiões de

ocorrência do MCT com pior prognóstico são a cavidade oral, inguinal, perineal, genital e leito ungueal (Daleck et al., 2009) no presente estudo a de

maior ocorrência foi a região torácica, sendo que os índices proliferativo (imunoexpressão de Ki67) e apoptóticos (imunoexpressão de caspase e reação de TUNEL) não apresentaram diferença estatística em relação a outros sítios, porém tiveram baixos escores de proliferação e maiores escores de apoptose, o que corrobora com a literatura de BOSTOCK, (1973) e LONDON & SEGUIN (2003), que reportam a ausência de evidências na literatura de que a ocorrência de MCT em certas regiões corporais estaria associado com o comportamento mais agressivo do MCT.

(49)

proteína KIT tiveram uma taxa proliferativa maior, que corroboram com os

achados de Webster et al., (2004), que citam a maior agressividade tumoral

vinculada a expressão citoplasmática desta proteína, podendo estar ligado a ativação das isoformas da proteína pelo SCF ou por estas formas conterem maior número de mutações, levando a inibição de apoptose e maior proliferação celular. Foi observada uma maior taxa apoptótica dos tumores (únicos e múltiplos) com expressão citoplasmática da proteína KIT quando

comparados com os tumores (únicos e múltiplos) com expressão membranosa da proteína, Martin de Las Mulas et al., (1999) observaram que

alguns carcinomas de células escamosas apresentavam uma taxa apoptótica maior, tal qual os tumores benignos em seu estudo.

Na análise de imunoexpressão de Ki-67, os mastocitomas cutâneos caninos de grau 3 tiveram mais células com marcação positiva >30% (escores 3 e 4) quando comparados com os tumores de grau 1 e 2, que corrobora com o descrito por Scase, et al., (2006) e Webster, et al.,

(2007). Os resultados não foram estatisticamente significativo quando comparados os tumores de grau 1 e 2, e grau 1 e 3, isso pode ser explicado pelo pequeno número de casos de tumores de grau 1. Já quando comparamos os tumores de grau 2 e 3 foi observada a significância estatística. Isso demonstra que o índice proliferativo dos tumores de grau 3 é relativamente maior que os de grau 1 e 2 quando determinado por este método nos MCTs, sendo útil na classificação e na avaliação da proliferação celular, como descrito por Abadie et al., (1999).

Quanto a comparação da técnica de TUNEL e a imunoistoquímica para caspase-3 clivada no intuito de avaliar a concordância entre os resultados obtidos na avaliação da apoptose, no que diz respeito às variações entre neoplasias de grau 1, 2 e 3, segundo Duan et al., (2003)

(que utilizaram um modelo xenográfico baseado na linhagem celular PC-3 de carcinoma prostático, que possui altas taxas apoptóticas) uma boa correlação é observada. No presente estudo, a técnica de TUNEL mostrou-se mais adequada, pois mostrou-se obmostrou-servou maior quantidade de células marcadas, assim como no estudo de Bregano et al., (2010), onde grande quantidade de

(50)

Duan et al., (2003), uma vez que não foi observada concordância estatística

entre os resultados obtidos pela técnica de TUNEL e a imunoistoquímica para caspase-3 clivada (realizada utilizando o coeficiente estatístico Kappa). Isso provavelmente se deve ao fato da técnica de TUNEL detectar a fragmentação do DNA, sendo, conseqüentemente, melhor na avaliação da apoptose do que a imunoistoquímica que se baseou na avaliação de uma das proteína componente da cascata de reação da apoptose intrínseca. Com isso, a cascata de reação da apoptose extrínseca não é detectada pela última, fazendo com que células em apoptose por tal via não sejam marcadas (o que não acontece quando é utilizada a técnica de TUNEL).

Segundo Duan., et al (2003) a maioria das células com marcação

positivas para TUNEL foram encontradas em áreas de necrose tumoral, o que discorda dos achados deste estudo, onde as células marcadas eram nas áreas dos MCT devido ao TMA, que se retira a parte mais representativa do tumor.

Quando comparados os padrões de imunomarcação de c-KIT (CD117) e apoptose avaliada pelas técnicas de TUNEL e imunoistoquímica para caspase-3 clivada, o resultado não foi estatisticamente significativo. Observou-se que a maioria dos casos com marcação membranar ou citoplasmática (difuso e focal) apresentou menor taxa apoptótica. Isso se deve provavelmente ao fato de que uma vez ativado, c-KIT interfere em diversas respostas intracelulares por meio da sinalização de cascatas como a das vias celulares fosfatidilinositol-3 quinase (phosphatydilinositol-3 kinase

- PI3K/Akt) e proteína quinase ativada por mitose (mitogen-activated protein

kinase – MAPK). Esta deflagração culmina na regulação do crescimento e

da sobrevivência celular ao atuarem, dentre outros pontos, nos fatores pró e antiapoptóticos (SATTLER et al., 1997; LENARTSSON et al., 1999;

BLUME-JENSEN et al., 2000), resultando no desbalanço entre os sinais de

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Mariana Marras Vidale – Dissertação de Mestrado Conclusões

7. CONCLUSÕES

Os tumores grau 3 apresentaram maior índice proliferativo e menor índice apoptótico que os de grau 1 e 2, sendo estes importantes fatores para confirmação da sua malignidade.

Quanto à imunoexpressão de c-KIT, é possível concluir que os casos onde o padrão de marcação deste receptor tirosina quinase está alterado (citoplasmático) apresentaram maior taxa de proliferação celular e maior taxa apoptótica.

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Mariana Marras Vidale – Dissertação de Mestrado Referências

8. REFERÊNCIAS*:

ABADIE, J.J.; AMARDEILH, M.A.; DELVERDIER, M.E.: Immunohistochemical detection of proliferating cell nuclear antigen and Ki-67 in mast cell tumors from dogs. Journal of the American Veterinary Medical Association, v.215, n.9, p.1629 – 1633, 1999.

AIELLO, S.E. et al.: Sistema Tegumentar. In: Manual Merck de Veterinária. 8ª ed. Roca. São Paulo, 2001. p.579 – 581.

ALLAN, L.A.; CLARKE, P.R.: Apoptosis and autophagy: Regulation of caspase-9 by phosphorylation. Federation of European Biochemical Societies Journal, v.276, n.21, p.6063 – 6073, 2009.

ANAZETTI, M.C.; MELO, P.S.: Morte Celular por Apoptose: uma visão bioquímica e molecular. Metrocamp Pesquisa, Jan/Jun; v.1, n.1, p.37 – 58, 2007.

ANDRADE, V.P.; CUNHA, I.W.; SILVA, E.M.; AYALA, F.; SATO, Y.; FERREIRA, S.S.; NASCIMENTO, C.F.; SOARES, F.A.: O arranjo em matriz da amostras teciduais (tissue microarray): larga escala e baixo custo ao alcance do patologista. Jornal Brasileiro de patologia e Medicina Laboratorial, v.43, n.1, p.55 – 60, Review, 2007.

BOSTOCK, D.E. The prognosis following surgical removal of mastocytomas in dogs. Journal of Small Animal Practice, v.14, n.1, p.27 – 40, 1973.

BOSTOCK, D.E.: Neoplasms of the skin and subcutaneous tissues in dogs and cats. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v.142, n.3, p.1 – 19, 1986.

BLUME-JENSEN, P.; JIANG, G.; HYMAN, R.; LEE, K.F.; O’GORMAN, S.; HUNTER, T.: Kit/stem cell factor receptor–induced activation of phosphatidylinositol 3′-kinase is essential for male fertility. Nature Genetics, v.24, p.157 – 162, 2000.

*ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 6023: informação e documentação – Referências – Elaboração. Rio de Janeiro, 2002. 22p.

(53)

BREGANO, L.C.; AGOSTINHO, S.D.; RONCATTI, F.T.L.B.; PIRES, M.C.; GARCIA, A.F.; GAMEIRO, R.; LUVIZOTTO, M.C.R.; CARDOSO, T.C.: Expression of pro-and-anti-apoptotic antigens in the cerebellum of dogs naturally infected with canine distemper virus. Brazilian Journal of Veterinary Pathology, v.3, n.2, p.80 – 85, 2010.

BRÖKER, L.E.; KRUYT, F.A.E.; GIACCONE, G. Cell death independent of caspases: a Review. Clinical Cancer Research, May; v.11, n.9, p. 3155 – 3162, 2005.

BRYNE, A.T.; SOUTHGATE, J.; BRISON, D.R.; LEESE, H.J.: Analysis of apoptosis in the preimplantation bovine embryo using TUNEL. Journal of Reproduction and Fertility, v.117, p. 97 – 105, 1999.

CURRY, A.; JEZIORSKA, M.; WOOLLEY, D.E.: Evidence for in vivo mitosis by granule-containing mast cells from canine mastocytomas. Virchow Archive, v.433, n.5, p.465 – 470, 1998.

DALECK, C.R.; ROCHA, N.S.; FURLANI, J.M.; CESAR, J.R.F.: Mastocitoma. In: DALECK, C.R.; DE NARDI, A.B.; RODASKI, S. (Eds.). Oncologia em cães e gatos. São Paulo: Roca, 2009. p.281 – 292.

DASH, P.: Reproductive and cardiovascular disease research group. Disponível em: http://www.sgul.ac.uk/depts/immunology/~dash/ Acesso em: 25 de junho de 2010

DOBSON, J.M.; SCASE, T.J.: Advances in the diagnosis and management of cutaneous mast cell tumours in dogs. Journal of Small Animal Practice, v.48, n.8, p.424 – 431, 2007.

DOWNING, S.; CHIEN, M.B.; KAAS, P.H.; MOORE, P.E.; LONDON, C.A.: Prevalence and importance of internal tandem duplications in exons 11 and 12 of c-KIT in mast cell tumors of dogs. American Journal of Veterinary Research, v.63, n.12, p.1718 – 1723, 2002.

DUAN, R.W.; GARNER, D.S.; WILLIAMS, S.D.; FUNCKES-SHIPPY, C.L.; SPATH, I.S.; BLOMMER, E.A.G.: Comparison of immunohistochemistry for activated caspase-3 and cleaved cytokeratin 18 with the TUNEL method for quantification of apoptosis in histological sections of PC-3 subcutaneous xenografts. The Journal of Pathology, Feb; v.199, n.2, p.221 – 228, 2003.

(54)

ENDICOTT, M.M.; CHARNEY, S.C.; MCKNIGHT, J.A.; LOAR, A.S.; BARGER,A.M.; BERGMAN, P.J.: Clinicopathological findings and results of bone marrow aspiration in dogs with cutaneous mast cell tumours: 157 cases (1999 – 2002). Veterinary and Comparative Oncology, v.5, n.1, p.31 – 37, 2007.

EVAN, G.; LITTLEWOOD, T.: A matter of life and death. Science, v.281, n.28, p.1317 – 1322, Review, 1998.

FURLANI, J.M.; DALECK, C.R.; VICENTI, F.A.M.; DE NARDI, A.B.; PEREIRA, G.T.; SANTANA, A.E.; EURIDES, D.; SILVA, L.A.F.: Mastocitoma canino: Estudo retrospectivo. Ciência Animal Brasileira, Jan/Mar; v.9, n.1, p.242 – 250, 2008.

GALINSKY, D.S.T.; NECHUSHTAN, H.: Mast cells and cancer – No longer just basic science. Critical Reviews in Oncology/Hematology, v.68, n.2, p.115 – 30 Review, 2008.

GIEGER, T.L.; THÉON, A.P.; WERNER, J.A.; MCENTEE, M.C.; RASSNICK, K.M.; DECOCK, H.E.V.: Biologic behavior and prognostic factors for mast cell tumors of the canine muzzle: 24 cases (1990-2001). Journal of Veterinary Internal Medicine, v.17, n.5, p.687 – 92, 2003.

GRIVICICH, I.; REGNER, A.; ROCHA, A.B.: Morte celular por Apoptose. Revista Brasileira de Cancerologia, v.53, n.3, p.335 – 343, 2007.

GROSS, T.L.; IHRKE, P.J.; WALDER, E.J.: Mast cell tumors. In: GROSS, T.L.; IHRKE, P.J.; WALDER, E.J. (Ed). Skin diseases of the dog and cat: clinical and histopathologic diagnosis. 2ed. Oxford. Blackwell. 2005. p.853 – 858.

GUO, M.; HAY, B.A.: Cell proliferation and apoptosis. Current Opinion in Cell Biology, Dec; v.11, n.6, p.745 – 752, 1999.

HARIR, N.; BOUDOT, C.; FRIEDBICHLER, K. et al.: Oncogenic kit

controls neoplastic mast cell growth through a Stat5/PI3-kinase signaling cascade. Blood, Sep 15; v.112, n.6, p.2463 – 2473, 2008.

HILL, P.B.: Mast cells: a review of their biology and role in cutaneous inflammation. Advances in Veterinary Dermatology. 4ed. Oxford: Blackwell Publishing, 2002. P.161 – 177.