OS EXERCÍCIOS FÍSICOS AERÓBIO E RESISTIDO
MELHORAM A MEMÓRIA ESPACIAL DE RATOS POR
MECANISMOS CELULARES DIFERENTES
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para a obtenção do Título de Doutor em Ciências.
OS EXERCÍCIOS FÍSICOS AERÓBIO E RESISTIDO
MELHORAM A MEMÓRIA ESPACIAL DE RATOS POR
MECANISMOS DIFERENTES
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para a obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Marco Túlio de Mello. Co-orientadora: Profa. Dra. Kil Sun Lee.
Co-orientadora: Profa. Dra. Maria Gabriela Menezes de Oliveira.
Cassilhas, Ricardo Cardoso
Os exercícios aeróbio e resistido melhoram a memória espacial de ratos por mecanismos diferentes / Ricardo Cardoso Cassilhas. -- São Paulo, 2011.
128p.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia.
Título em inglês: Spatial memory is improved by aerobic and resistance exercise through different mechanisms.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
Chefe do Departamento de Psicobiologia
Profa. Dra. Maria Lucia Oliveira de Souza Formigoni
Coordenador de Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Carlos Ugrinowitsch Profa. Dr. José Rodrigo Pauli Profa. Dra. Vânia D’Almeida
Prof. Dr. Sérgio Eduardo de Andrade Perez Prof. Dr. Ricardo Mário Arida (Primeiro Suplente) Prof. Dr. Daniel Alves Rosa (Segundo Suplente)
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a todos os profissionais que acreditam no exercício físico como uma ferramenta terapêutica.
AGRADECIMENTOS
Agradeço o apoio financeiro da FAPESP e do CNPq que acreditaram no potencial científico deste trabalho.
À AFIP e ao Prof. Dr. Sérgio Tufik, não só pelo apoio financeiro, mas também por prover uma excelente estrutura de trabalho.
À UNIFESP e ao Departamento de Psicobiologia por toda a sua ajuda institucional.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Marco Túlio de Mello, por todo este tempo juntos e por todo o conhecimento transmitido, desde o Mestrado. Fez-me acreditar que este trabalho realmente valia a pena.
À minha co-orientadora, Prof. Dra. Maria Gabriela Menezes de Oliviera (Gabi), que me forneceu subsídios para responder à minha pergunta, que questionou e, no momento necessário, me ajudou a solucionar os problemas.
À minha co-orientadora, Profa. Dra. Kil Sun Lee, que apesar de tê-la conhecido só após ter começado o meu Doutorado, mostrou-se dedicada e empenhada a me ajudar e ensinar, dedicação, preocupação e comprometimento que eu jamais vira antes em uma pessoa.
Ao CEPE, pela excelente estrutura de trabalho, a todos os amigos e colegas de trabalho que lá estão ou por lá passaram em particular,
Guarita, o Helton de Sá, a Iona Zalcman, o Ivan Trombino, a Juliana Prado, a June Carnier, a Leana Araújo, a Luciana Santo, o Marcos Monico, a Maria Altamira (Dona Maria), a Maria da Gloria (querida Glorinha), o Murilo Dattilo, o Noler Heyden, a Patricia Leão, a Patrícia Rzezak, a Priscila Sanches, a Raquel Munhoz, a Renata Koyama, o Ronaldo Vagner Thomatieli, a Sandra Queiroz, a Tia Candinha, o Valdir Lemos, o Valter Viana, a Viviane Grassmann, e ao Vladimir Modolo.
Ao Prof. Dr. Ricardo Mário Arida e aos seus alunos Fabiano, Lívia e Michele, pela sua ajuda e pelo fornecimento de estrutura para a realização de parte dos experimentos.
À Profa. Dra. Rita Sinigaglia Coimbra, pela gentileza de disponibilizar o labirinto aquático.
À Márcia Feres pelo suporte nos Ensaios imunorradiométricos. Aos meus amigos Hanna Karen, Jansen Fernandes, Marcio Rossi e Sérgio Gomes, pela sua amizade e pelo seu suporte acadêmico. Em especial ao Daniel Venâncio Cabeça que, além da amizade, me ensinou diversas técnicas e procedimentos que foram fundamentais para esta pesquisa.
Aos colegas com quem estabeleci parcerias, as quais me ajudaram para o êxito deste trabalho.
Ao Prof. Paulo Zilhão, pela revisão gramatical deste estudo com o intuito de o tornar o mais claro e correto possível.
À minha amada família, ao meu pai Roberto, à minha mãe Cleury e aos meus irmãos Rogério e Patrícia.
“It’s not about how hard you can hit, it’s
about how hard you can get hit and keep
moving forward. That's how winning is
done!”
(Rocky Balboa, 2007)
“A ignorância gera confiança com mais
frequência do que o conhecimento: são
aqueles que sabem pouco, e não
aqueles que sabem muito, que tão
positivamente afirmam que este ou
aquele problema jamais será resolvido
pela ciência”.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Esquema representativo da formação hipocampal e da via trisináptica.30
FIGURA 2: Sinalizações intracelulares a partir da ativação do TrKB. ... 33
FIGURA 3: Imagem pseudo colorida de uma autorradiografia de uma hibridização in situ para o RNAm do BDNF em cérebros de ratos (corte em plano sagital) ... 35
FIGURA 4: Sinalizações intracelulares a partir da ativação do IGF-1R. ... 38
FIGURA 5: Foto do aparato da escalada na escada vertical. ... 47
FIGURA 6: Secção transversal das fibras do FDL ... 54
FIGURA 7: Teste da esquiva inibitória ... 55
FIGURA 8: Efeito dos exercícios físicos sobre a aprendizagem e sobre a memória espacial. ... 66
FIGURA 9: Concentração periférica do IGF-1 medida no soro. ... 67
FIGURA 10: Concentração hipocampal do IGF-1 ... 67
FIGURA 11: BDNF cerebral medido no hipocampo. ... 68
FIGURA 12: Expressão hipocampal do IGF-1R ... 68
FIGURA 13: Expressão hipocampal do TrKB ... 69
FIGURA 14: Expressão hipocampal da p-AKT ... 70
FIGURA 15: Expressão hipocampal da CaMKII ... 70
FIGURA 16: Expressão hipocampal da sinapsina 1 ... 71
LISTA DE TABELAS
TABELA 1: Familiarização (up ladder performance) dos grupos ao longo dos três dias... 48
LISTA DE ABREVIATURAS
AKT: Serina-treonina kinase (serine-threonine kinase)
BDNF: Fator de crescimento derivado do cérebro (brain-derived neurotrophic factor);
CA: Corno de Amon;
CaMK: Proteínas quinases dependente do Ca2+/calmodulina (Ca2+
CE: Córtex entorrinal;
/calmodulin-dependent protein kinase);
CEDEME: Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para a Medicina e Biologia;
CONEP: Comissão Nacional de Ética em Pesquisa
CREB: Proteína ligadora ao elemento de resposta ao AMP cíclico (cyclic AMP response element-binding protein);
CSF: Fator estimulante de cartilagem (cartilage-stimulating factor);
DAG: Diacilglicerol (diacylglycerol);
DPM: Desvio padrão da média; EI: Esquiva inibitória;
ELISA: Ensaio
FDL: Flexor digitorum longus;
imunoabsorvente de ligação de enzimas (enzyme linked immunosorbent assay);
FGF-2: Fator de crescimento fibroblástico 2 (fibroblast growth factor 2);
GD: Giro denteado;
Grupo CTRL: Grupo controle;
Grupo RES: Grupo resistido;
GSK3: Sintase quinase 3 (glycogen synthase kinase 3);
H&E: Hematoxilina e eosina de Meyer’s;
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística;
IGF-1: Fator de crescimento símile à insulina 1 (insulin-like growth factor 1);
IGF-1R: Receptor para o IGF-1 (insulin-like growth factor 1 receptor);
IGFBP: Proteínas transportadoras do IGF (insulin-like growth factor binding proteins);
Ins(1,4,5)P3
IRS: Substratos do receptor de insulina (insulin receptor substrates);
: Trifosfato inositol-1,4,5 (inositol-1,4,5-trisphosphate);
LTD: Depressão de longa duração (long-term depression);
LTP: Potenciação de longa duração (long-term potentiation);
mTOR: Proteína alvo da rapamicina nos mamíferos (mammalian target of rapamycin);
MyoD: Fator de regulação miogênica (master regulator of muscle differentiation);
NGF: Fator de crescimento neural (nerve growth factor);
P75ntr
PI3K: Fosfatidilinositol 3-quinase (phosphoinositide 3-kinase);
: Receptor neurotrofina pan 75 (pan neurotrophin receptor);
PKC: Proteína quinase C (protein kinase C);
PLC: Fosfolipase Cγ (phospholipase Cγ);
Ras-MAPK: Ras-proteína quinase ativada pelo mitógeno (Ras-mitogen-activated protein kinase);
RNAm: Ácido ribonucléico mensageiro (ribonucleic acid);
SNC: Sistema nervoso central;
tPA: Ativador tecidual do plasminogênio/ plasmina (tissue plasminogen activator/ plasmin);
TrKB: Receptor tropomiosina quinase B (tropomyosin-related kinase B);
RESUMO
resistido por oito semanas aumentou, de maneira similar, a aprendizagem e a memória espacial dos ratos. Embora os mecanismos moleculares pelo qual isso ocorreu, até certo ponto tenham sido divergentes. Isso porque, o exercício físico aeróbio ativou a via BDNF/TrKB/CaMKII e, o resistido a via IGF-1/IGF-1R/AKT, embora ambos, de maneira similar, tenham aumentado, no hipocampo, a expressão da sinapsina e da sinaptofisina.
ABSTRACT
A growing body of scientific evidence indicates that exercise has a positive impact on human health and on neurological health in particular. Effects such as increased BDNF and IGF-1 neurotrophic activity are induced by aerobic exercise and appear to influence hippocampal neurons, leading to improved spatial learning and memory. However, nothing is known about the effect of resistance exercise on hippocampus-dependent memory or whether the cellular pathways associated with aerobic exercise are also activated by resistance training. Objective:
CaMKII and stimulating the synthesis of synapsin and synaptophysin. In contrast, resistance training appears to increase synapsin and synaptophysin expression via the IGF-1/IGF-1R pathway.
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA ... 6
AGRADECIMENTOS ... 7
LISTA DE FIGURAS ... 11
LISTA DE TABELAS ... 12
LISTA DE ABREVIATURAS ... 13
RESUMO ... 16
ABSTRACT ... 18
1. INTRODUÇÃO ... 23
1.1 ATIVIDADE FÍSICA E SAÚDE ... 23
1.2 EFEITO DO EXERCÍCIO FÍSICO NA COGNIÇÃO ... 25
1.3 EFEITO DO EXERCÍCIO FÍSICO NA PLASTICIDADE CEREBRAL ... 28
1.4 EFEITO DO EXERCÍCIO FÍSICO NOS FATORES NEUROTRÓFICOS ... 31
1.4.1 Ação Neurotrófica do BDNF ...31
1.4.2 Ação Neurotrófica do IGF-1 ...35
1.4.3 BDNF, IGF-1, Memória e Exercício Físico ...39
2. OBJETIVOS ... 43
3. PARTE 1 ... 45
3.1 MATERIAL E MÉTODOS ... 45
3.1.1 Animais ...45
3.1.2 Procedimentos Experimentais ...46
3.1.2.1 Grupo Controle ... 46
3.1.2.2 Grupo Sham ... 46
3.1.2.3 Grupo Resistido ... 47
3.1.2.4 Familiarização – up ladder performance ... 48
3.1.2.5 Protocolo do Treinamento Resistido ... 48
3.1.2.6 Tarefa da Esquiva Inibitória ... 50
3.1.2.7 Coleta, Processamento e Armazenamento dos Materiais ... 50
3.1.2.8 Medição da Área da Secção Transversal do FDL ... 51
3.1.3 Análise dos Dados ...51
4. PARTE 2 ... 57
4.1 MATERIAL E MÉTODOS ... 57
4.1.1 Animais ...57
4.1.2 Procedimentos Experimentais ...57
4.1.2.1 Grupo Controle ... 58
4.1.2.2 Grupo Sham ... 58
4.1.2.3 Grupo Aeróbio ... 59
4.1.2.4 Grupo Resistido ... 59
4.1.2.5 Labirinto Aquático de Morris ... 60
4.1.2.6 Coleta, Processamento e Armazenamento dos Materiais ... 61
4.1.2.7 Ensaio Imunorradiométrico ... 61
4.1.2.8 Ensaio de ELISA ... 62
4.1.2.9 Western Blot ... 62
4.1.3 Análise dos Dados ...63
4.2 RESULTADOS ... 65
5. DISCUSSÃO ... 73
6. CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 80
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 83
8. ANEXOS ... 112
8.1 PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA INSTITUCIONAL ... 112
8.2 AUTORIZAÇÃO PARA USO DAS FIGURAS ... 114
8.2.1 Figura 1: Lent. Cem Bilhões de Neurônios, 2004. ...114
8.2.2 Figura 2: Minichiello. Nature Review Neuroscience, 2009. ...115
8.2.3 Figura 3: Neeper e col. Nature, 1995....117
8.2.4 Figura 4: Annenkov, Molecular Neurobiology, 2009. ...119
8.2.5 Figuras Suplementares ...121
8.3 ARTIGOS PUBLICADOS ... 122
8.4 COMUNICAÇÕES APRESENTADAS EM EVENTOS CIENTÍFICOS ... 126
8.5.1 The Impact of 8 wks of Aerobic or Resistance Exercise on Spatial Memory
Hippocampal BDNF of Rodents. ...126
8.5.2 Animal Model for Resistance Exercise and Memory. ...126
8.5.3 Animal Model for Resistance Exercise and Memory: Implications for the Study of the
Mechanisms Involved in Improving Memory by Exercising....126
8.5.4 Equilíbrio, Coordenação e Agilidade de Idosos após Participarem de um Programa de
Atividade Física. ...126
8.5.5 Treinamento Resistido Moderado e Intenso e o Índice de Massa Corporal de Idosos.
127
8.5.6 Correlação do IMC e da RCQ com o Percentual de Gordura de Idosos Sedentários. 127
8.5.7 Avaliação dos Efeitos do Treinamento de Força no Equilíbrio, Marcha e Agilidade em
Idosos. 127
8.5.8 Associação VNTR do Gene Per3 com Preferência Diurna em Jovens, mas não em
1
1. INTRODUÇÃO
1.1
Atividade Física e Saúde
O conceito de atividade física compreende todos os movimentos realizados ao longo dos dias de vida, incluindo o trabalho, a recreação e as atividades esportivas, independentemente da sua periodicidade(127). Já o conceito de exercício físico é diferente. A execução deste tem que levar em consideração alguns princípios que regem o treinamento, como a duração de cada sessão, (de treinamento), a sua relação com a intensidade, a frequência semanal, o nível e o tipo do treinamento, a idade e, especialmente, os objetivos a serem alcançados (aprimoramento da função de tecidos e órgãos, coração, músculos, cérebro, etc.)(127). Isto pode ser interpretado como melhora das capacidades físicas: da resistência, da força, da velocidade, da agilidade, do equilíbrio, da flexibilidade e da coordenação motora(127). Recomenda-se a prática diária mínima de exercício físico
aeróbio e / ou resistido, entre os 20 e os 30min (duas a cinco vezes por semana), com intensidades de moderada a alta(72)
O que se observa na sociedade moderna é a prevalência cada vez maior, de um estilo de vida com baixos níveis de atividade física
, para benefícios gerais à saúde.
(51). Para a
Organização Mundial da Saúde(177), o sedentarismo é o quarto maior fator de risco
mortes em todo o mundo(178). Esse comportamento sedentário pode contribuir para a desarmonização do organismo, predispondo-o a diferentes quadros patológicos (5;119-122) como as doenças cardiovasculares(70), a hipertensão arterial(71), o diabetes(73) e o
declínio da função cognitiva(5;32;33;80)
De fato, o sedentarismo no Brasil é significativo, segundo o relatório sobre os padrões de vida dos brasileiros, elaborado pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE)
.
(82) em 2006, apenas 26% dos homens e 12,7% das
mulheres foram considerados fisicamente ativos. Na população da cidade de São Paulo, em um levantamento realizado por de Mello e col.(109) sobre a prática da
atividade física, registrou-se aproximadamente 30% de indivíduos fisicamente ativos, embora somente pouco mais de um terço recebessem a supervisão de um profissional de educação física. Em outro estudo com a população do Estado de São Paulo, Matsudo e col.(105)
A prática de atividade física é considerada um comportamento saudável, relacionada à redução do risco de se desenvolverem doenças cardiovasculares, obesidade, diabetes tipo 2, declínio cognitivo, além de outras doenças e condições crônicas
verificaram que 45,5% dos homens e 47,3% das mulheres eram sedentárias.
(5;45;126). Junto com a prática de exercício físico
1.2
Efeito do Exercício Físico na Cognição
A palavra cognição é derivada do latim cognitione, que significa a aquisição de um conhecimento(173). Em sentido mais amplo, a função cognitiva compõe as diferentes fases do processo de informação (percepção, aprendizagem, memória, atenção, vigilância, tempo de reação, raciocínio e solução de problemas)(9)
Muito tem se discutido a respeito dos benefícios do exercício físico aeróbio e resistido para o cérebro e para a função cognitiva, quer em condições normais ou de doenças. A maior parte das evidências indicam que o exercício físico pode ser considerado uma maneira eficiente de preservar saudável o cérebro, até mesmo protegendo-o do declínio cognitivo inerente do envelhecimento
.
(40;107)
Willians e Lord
. No entanto, quando se analisam as evidências acerca da influência do exercício físico no cérebro, percebe-se que os estudos realizados, na sua maioria, utilizaram protocolos com o exercício físico aeróbio na sua metodologia.
(176) observaram que, em idosas, havia uma melhora
investigou-se a relação entre o exercício físico aeróbio e a alteração na função cognitiva, no perfil de humor e na qualidade de vida. Para a sua realização, recrutaram-se 46 idosos, entre os 60 e os 75 anos, que foram distribuídos em dois grupos (controle e experimental). O grupo experimental foi submetido, três vezes por semana, durante 24 semanas, ao exercício físico aeróbio com uma intensidade no limiar ventilatório 1 (LV1) (intensidade moderada). Constatou-se que, após esse período, o grupo melhorou a sua função cognitiva, a sua capacidade aeróbia, o seu perfil de humor e a sua qualidade de vida, tendo a sua viscosidade sanguínea diminuída em relação ao grupo controle, o qual permaneceu sedentário ao longo da intervenção(11). Em uma meta-análise, Heyn e col.(75) também observaram uma significativa melhora da cognição e do condicionamento físico de idosos demenciados, confirmando que a prática de exercício físico, com intensidade moderada, pode ser um importante protetor contra o declínio cognitivo e a demência nos indivíduos idosos(95)
Além dos estudos que, por intermédio de testes neuropsicológicos, analisam a influência do exercício físico aeróbio nas funções cognitvas, testes de neuroimagem apontam que há alterações no volume hipocampal após a realização de exercício físico. O volume hipocampal e do lobo temporal medial são maiores nos idosos treinados do que nos sedentários, sendo isto um fator protetor para o declínio cognitivo
.
(55;77). Existe uma perda anual de aproximadamente 1% do volume
hipocampal que é inerente ao processo de envelhecimento, mas ela pode ser revertida com a prática do exercício físico aeróbio moderado(55). Tendo em vista que
em idosos, que houve um acréscimo de 2% no volume hipocampal em relação ao grupo controle, o que pode ser equivalente a uma recuperação de dois anos de envelhecimento cerebral(56)
Somente poucos estudos mostraram o efeito positivo do treinamento resistido na cognição
.
(43;101;125;132), embora este tipo de exercício físico seja altamente
recomendado para a população adulta e idosa(59;72), indicado para o gerenciamento e a prevenção de várias doenças crônico-degenerativas(72) e para os transtornos
mentais(27;148-150). No entanto, apesar de poucos, os resultados obtidos são promissores. Em estudo conduzido por Perrig-Chiello e col.(132), 46 voluntários
idosos foram submetidos a oito semanas de exercício físico resistido progressivo, tendo-se constatado que houve uma melhora no seu bem-estar psicológico e no seu funcionamento cognitivo. Em outro estudo, realizado posteriormente, Ozkaya e col.(125) submeteram 36 voluntários, entre os 60 e os 85 anos, a nove semanas de exercício físico progressivo aeróbio ou resistido. Os dois grupos de exercícios físicos melhoraram a sua função cognitiva em relação ao grupo controle, não se tendo observado que houve uma diferença significativa entre os grupos aeróbio e resistido. Mais recentemente, verificou-se que o treinamento resistido, realizado por idosas durante 12 meses, uma ou duas vezes por semana, melhorou o desempenho destas nos testes que avaliaram a sua função executiva(101)
Cassilhas e col.
.
(28) submeteram 62 homens, entre os 65 e os 75
relação ao grupo controle. Além disto, constatou-se que, em ambos os grupos experimentais, houve um aumento na concentração sérica do fator de crescimento símile a insulina 1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1), porém não houve alteração da viscosidade sanguínea ao final da intervenção. Estas observações permitiram inferir que a melhora cognitiva ocorrem em função do IGF-1 e não por alterações por melhora do fluxo sanguíneo cerebral.
1.3
Efeito do Exercício Físico na Plasticidade Cerebral
Ao longo dos anos, a comunidade científica considerou que o sistema nervoso central (SNC) dos mamíferos se tornava estruturalmente estável logo após o nascimento, pouco mudando ao longo dos anos de vida. Com o avanço das técnicas ao longo das décadas, este paradigma foi alterado e hoje considera-se que o cérebro demonstra persistente plasticidade durante todas as fases da vida(99). A plasticidade neuronal permite ao SNC aprender novas habilidades, reter e evocar memórias, reorganizar as redes neurais em resposta ao estímulo ambiental e se recuperar de lesões(88). Algumas das formas pelos quais essa neuroplasticidade
pode ocorrer são a neurogênese, a apoptose celular, a atividade sináptica-dependente e a reorganização dos circuitos neuronais (83;84))
A mudança na frequência da ativação sináptica pode resultar, no longo prazo, no aumento ou na diminuição da eficiência destas sinapses, fenômenos que são conhecidos como potenciação de longa duração (long-term potentiation, LTP) e depressão de longa duração (long-term depression, LTD)
.
atividade-dependente ocorrem em todas as sinapses excitatórias que usam o glutamato como neurotransmissor e, também, em algumas sinapses inibitórias gabaérgicas(83)
Uma região do SNC altamente plástica, mesmo na vida adulta, é a formação hipocampal, localizada no lobo temporal medial
.
(99). É uma das mais
estudadas estruturas neurológicas associadas com memória, importante para a consolidação das memórias declarativas(96). Ela é essencialmente uma faixa curva
de córtex filogeneticamente primitivo (arquicórtex), localizada na porção medial do lobo temporal(103). A Figura 1 mostra as principais regiões da formação hipocampal e
FIGURA 1: Esquema representativo da formação hipocampal e da via trisináptica. CE (córtex entorrinal), CA1 e CA3 (células piramidais do Corno de Amon); GD (células granulares do giro denteado). Figura modificada do livro, Cem Bilhões de Neurônios, autor Lent(98).
Diversos eventos como, por exemplo, o exercício físico podem desencadear plasticidade hipocampal(88). Os estudos mostram que os animais submetidos ao exercício físico forçado (esteira) ou não (roda de corrida) aumentam, no hipocampo, a neurogênese, a proliferação celular(151;160;161) e também a arborização
dendrítica(53;152). Outros mecanismos que podem estar relacionados com a neuroplasticidade induzida pelo exercício físico passam pela modulação da liberação e pela utilização de neurotransmissores, tal como as monoaminas(107;108), assim como a ação neurotrófica do fator de crescimento derivado do cérebro (brain-derived neurotrophic factor, BDNF)(117;161;162;164;170) e de fatores de crescimento com ação no
1.4
Efeito do Exercício Físico nos Fatores Neurotróficos
1.4.1 Ação Neurotrófica do BDNF
As neurotrofinas têm a capacidade de responder ao aumento da atividade elétrica neuronal e parecem suportar o fortalecimento entre as sinapses em virtude dessa elevação, podendo ativar sinais intracelulares envolvidos com a sobrevivência, à diferenciação e ao crescimento neuronal(74;117;118). Entre as
neurotrofinas, o BDNF é um dos maiores influenciadores da plasticidade cerebral(143;144). Ele é formado por 252 aminoácidos, codificados pelo gene BDNF
que se localiza na banda p13 do cromossomo 11 e que contém 11 exons e nove regiões promotoras funcionais(18). O BDNF foi descoberto e purificado por Barde e col.(16), em 1982, a partir do cérebro de porcos, e ele é produzido inicialmente como
pró-BDNF (forma imatura, 30kDa) que, posteriormente, sofre uma clivagem para a forma madura de 14kDa. Esta pode ocorrer tanto na fenda sináptica, pelo sistema ativador tecidual do plasminogênio/ plasmina (tissue plasminogen activator/ plasmin, tPA/ plasmin system)(128), quanto no reticulo endoplasmático, pela furina(17). No entanto, quando a expressão do BDNF é aumentada, a maior parte desta é secretado na forma de pró-BDNF e clivado em BDNF pelo sistema tPA/ plasmina, em virtude de ele não ser um bom substrato para a furina(115). Além da ação no SNC, o BDNF pode influenciar os sistemas periféricos, como, por exemplo, na redução da ingestão alimentar, no aumento da oxidação da glicose, na diminuição do nível sanguíneo da glicose e no aumento da sensibilidade à insulina(116;157;158). O que se
também interliga os processos centrais e os periféricos, relacionados ao controle do metabolismo e à homeostase(88). Com isto, tenta-se associar os níveis periféricos
desta neurotrofina à cognição, às doenças metabólicas e aos transtornos mentais(20;29;41;79)
A sinalização celular do BDNF é desencadeada pela ativação do receptor tropomiosina quinase B (tropomyosin-related kinase B, TrKB), membro dos receptores tirosina quinase
.
(110) (Figura 2). A interação com o receptor causa a
fosforilação dos resíduos da tirosina no domínio tirosina quinase, favorecendo, a ligação das proteínas adaptadoras. Por exemplo, a fosforilação do domínio da tirosina na posição 515 ativa as moléculas adaptadoras Shc ou FRS2 que podem competir entre si pela ligação neste sítio(110). Estas adaptadoras, posteriormente, ativam a via Ras-proteína quinase ativada pelo mitógeno (Ras-mitogen-activated protein kinase, Ras-MAPK), o qual promove a diferenciação e a proliferação neuronal(110)
A fosforilação do TrKB também pode ativar a via fosfatidilinositol 3-quinase (phosphoinositide 3-kinase, PI3K) e estimular a sobrevivência e a proliferação neuronal
.
(110). A fosforilação na posição 816 da porção C-terminal causa
a ativação da fosfolipase Cγ (phospholipase Cγ, PLCγ), o que resulta na produção do trifosfato inositol-1,4,5 (inositol-1,4,5-trisphosphate (Ins(1,4,5)P3) e do
diacilglicerol (diacylglycerol, DAG)(110). A DAG estimula as isoformas da proteína
quinase C (protein kinase C, PKC), e a Ins(1,4,5P3) a liberação do Ca2+ e a
subsequente ativação das proteínas quinases dependente do Ca2+/calmodulina
cíclico (cyclic AMP response element-binding protein, CREB), o que pode promover a LTP e /ou outro tipo de plasticidade sináptica(110). A PI3K pode ativar também a via
serina-treonina kinase (serine-threonine kinase, AKT), promovendo a sobrevivência celular(110)
Além do TrKB, a forma imatura do BDNF, o pro-BDNF, pode se ligar a outro tipo de receptor, o receptor neurotrofina pan 75 (pan neurotrophin receptor, P75
(Figura 2).
ntr), gerando uma cascata de sinalizações que induzem à apoptose pela ativação
da caspase 3(128). A morte celular induzida pela sinalização pro-BDNF/p75ntr ocorre somente quando a sinalização BDNF/TrkB está ausente ou diminuída(62).
FIGURA 2: Sinalizações intracelulares a partir da ativação do TrKB. As três principais vias de
FIGURA 3: Imagem pseudo colorida de uma autorradiografia de uma hibridização in situ para o RNAm do BDNF em cérebros de ratos (corte em plano sagital). A hibridização aumentada é representada por verde, amarelo e vermelho. Figura (a) (imagem a esquerda superior) animal controle; Figura (b) (imagem a esquerda inferior) animal após sete dias de atividade física. Camadas do neocortex II e V; áreas hipocampais CA1 – CA4 e giro denteado (DG) podem ser identificados na figura a. Gráficos de correlação estatística entre distância percorrida a noite e RNAm do BDNF (Figura a direita). Gráfico (a), duas noites (r=0,97, P<0,05); gráfico (b), quatro noites (r=0,95, P<0,05); gráfico (c), sete noites (r=0,89, P<0,05). Figura utilizada e traduzida com a autorização de Macmillan Publishers Ltd: Nature (autorização na seção Anexos, 8.2.2), autores Neeper e col.(117).
1.4.2 Ação Neurotrófica do IGF-1
de cartilagem (cartilage-stimulating factor, CSF) no soro(141). Baseado nestas evidências aceitou-se que, a ação do GH sobre a cartilagem era feita por intermédio de um fator chamado fator de sulfação sérica (serum sulfation factor), o qual foi redesignado de somatomedina, que hoje é conhecido como IGF-1. Este tem um baixo peso molecular, cerca de 7KDa, e contém 70 aminoácidos na sua cadeia peptídica(42)
Os níveis do IGF-1 nos tecidos e no sangue podem variar de acordo com a etapa de desenvolvimento do organismo, sendo o GH o principal estimulador da produção do IGF-1
.
(37). O qual está, principalmente, expresso no fígado(37). No
período fetal, o nível do IGF-1 sérico é relativamente baixo e é GH-independente, mas, ao longo do desenvolvimento pós-natal, os níveis séricos do IGF-1 aumentam lentamente até à adolescência(37). Durante a puberdade, a concentração do IGF-1
pode aumentar até duas a três vezes acima dos valores de referência para os adultos(37) e, ao longo do processo de envelhecimento, a concentração do IGF-1
sofre um declínio idade-dependente(130)
Nos cérebros adultos, a expressão do ácido ribonucléico mensageiro (ribonucleic acid, RNAm) do IGF-1 ocorre em regiões específicas, por exemplo no hipocampo
.
(174), no entanto o receptor do IGF-1 (insulin-like growth factor
podendo atuar como transportadoras para os tecidos alvos, além de também aumentarem a afinidade do IGF-1 com o seu receptor(36;85)
O IGF-1 exerce o seu efeito biológico pela interação com o IGF-1R. Este faz parte da família dos receptores transmembrânicos do tipo tirosina quinase, tem um arranjo heterotetrâmico, com duas subunidades alfa (130KDa) e duas beta (95KDa), sendo que o IGF-1 se liga nas subunidades alfa
.
(1;37). A via IGF-1/ IGF-1R é
fundamental para os diversos processos biológicos, visto que a ativação desta via é conhecida como a principal via antiapoptótica, que inibe a morte dos neurônios, dos fibroblastos e das outras células(123;140). O IGF-1R é altamente expresso em muitos
tecidos periféricos e também no SNC do adulto, especialmente no bulbo olfatório, no cerebelo e no hipocampo(174)
Quando fosforilados, os domínios intracelulares beta do IGF-1R interagem com as proteínas adaptadoras, os substratos do receptor de insulina (insulin receptor substrates, IRS), ativando a via Ras-MAPK
.
(8). Existem três
isoformas de IRS (ISR1, ISR2 e ISR4) e todas estão presentes no SNC, podendo ter diferentes papéis na função neural e no desenvolvimento(180). A ligação do IRS induz a ativação da via PI3K/ AKT(8); a AKT, por sua vez, medeia a sobrevivência celular
por inibir a enzima glicogênio sintase quinase 3 (glycogen synthase kinase 3, GSK3) e a consequente inibição das sinalizações apoptóticas. Além disto, a AKT pode estimular o fator de regulação miogênica (master regulator of muscle differentiation, MyoD) que controla a diferenciação celular, especialmente na musculatura estriada esquelética(133), a proteína alvo da rapamicina nos mamíferos (mammalian target of
FIGURA 4: Sinalizações intracelulares a partir da ativação do IGF-1R. A principal via de sinalização intracelular acontece pela ativação da PI3K. Esta ativa a via AKT que sinaliza para várias moléculas intracelulares, a ativação da MyoD, mTOR e P70 S6K levam, respectivamente, à diferenciação celular, à hipertrofia e à prolifereção celular. A inibição da GSK3 induz uma ação antiapopitótica, levando ao aumento da sobrevivência celular. Figura utilizada e traduzida com a autorização de Springer: Molecular Neurobiology (autorização na seção Anexos, 8.2.3), autor Annenkov(8).
O IGF-1 pode ser considerado uma molécula que atua no SNC como um fator neurotrófico responsável pela manutenção das células cerebrais, bem como está envolvido na diferenciação, na proliferação, na plasticidade sináptica e na neurogênese(8;94;180). Em virtude deste envolvimento do IGF-1 com os processos neurogênicos, foram realizados, com seres humanos, estudos com o propósito de correlacionar as suas concentrações periféricas com a função cognitiva, tendo sido observadas correlações positivas entre o aumento da concentração sanguínea do IGF-1 e a melhora da função cognitiva(4;14;47;86;113;129;138).
GSK3 MyoD
mTOR P70 S6K
Inibição da apoptose celular
(Sobrevivência) Diferenciação
celular
Síntese de proteína (Hipertrofia) (Proliferação)
GSK3 MyoD
mTOR P70 S6K
Inibição da apoptose celular
(Sobrevivência) Diferenciação
celular
1.4.3 BDNF, IGF-1, Memória e Exercício Físico
Nos diferentes estudos realizados com seres humanos ou com a utilização de modelos animais, tem-se observado que há uma relação entre a memória, o exercício físico e as vias do IGF-1 e do BDNF(23;26). Os estudos constataram que, roedores submetidos ao exercício físico na esteira ou na roda de corrida, tiveram melhor desempenho na tarefa do labirinto aquático de Morris (tarefa que avalia a memória espacial hipocampo-dependente), assim como uma maior concentração do BNDF no hipocampo, no córtex, no cerebelo e na medula espinhal(67;117;118)
Ang e col. .
(7)
Ding e col.
submeteram, durante 12 semanas, roedores a uma intervenção com exercício físico aeróbio em esteira e ao labirinto aquático de Morris após o treinamento. Os resultados indicaram que o grupo de ratos corredores teve um melhor desempenho no labirinto aquático de Morris do que o grupo dos sedentários, indicando que houve uma melhora do aprendizado da e memória espacial nos ratos submetidos ao treinamento aeróbio forçado na esteira.
(48) submeteram ratos a cinco dias de atividade física
receptor bloqueado. Neste mesmo estudo, não foi constatado nos animais com o receptor bloqueado qualquer alteração na expressão da sinapsina 1 ou do seu gene.
A sinapsina 1 é a fosfoproteína mais abundante observada nos terminais pré-sinápticos do CNS(58), está localizada na superfície citoplasmática da
vesícula sináptica fixando esta no citoesqueleto do neurônio(44;81), sendo fundamental para a transmissão sináptica e para a liberação do neurotransmissor(58). Observou-se que nos camundongos com baixa expressão da sinapsina 1 houve diminuição da atividade pós-sináptica(147), e que aqueles com sinapsina (-/-) tinham menos vesículas e uma menor atividade sináptica(38)
Uma outra molécula igualmente importante e associada à função sináptica é a sinaptofisina, uma proteína fixada na membrana da vesícula sináptica, também abundante, mas cujas funções ainda não são totalmente conhecidas. Ela parece ser um dos componentes que formam o poro de fusão da vesícula com a membrana pré-sináptica
.
(63), também participa da endocitose e da reciclagem das
vesículas(57). Pode ser utilizada como um marcador da sinaptogênese, tendo em vista que em doenças neurodegenerativas a sua densidade diminui juntamente com a diminuição do número de sinapses(35)
Existem indicativos de que o exercício físico aeróbio pode aumentar a expressão cerebral da sinapsina
.
(48;163;164;168) e da sinaptofisina(60)
seres humanos). Em estudos recentes, Correia e col.(39) e Goekint e col.(64) não constataram a existência de alterações no BDNF periférico em indivíduos submetidos a uma sessão ou treinamento com exercício físico resistido. Além disto, os estudos apontam que o treinamento resistido aumenta os níveis sanguíneos do IGF-1(22;27;28;159), embora o exercício físico aeróbio pareça ter pouca ou nenhuma influência sobre esse fator de crescimento nos níveis sanguíneos(12;13;106;159)
O IGF-1 periférico, está envolvido com os fenômenos que ocorrem no SNC
.
(156). Isto porque o IGF-1 periférico é transportado através da barreira
hemato-encefálica, ativando a cascata de sinalização, via receptor IGF-1R, no hipocampo(23;24;48), o que pode ser abolido, perifericamente, quando se bloqueia o IGF-1(23;48;156)
Tendo em vista todas estas informações, surge a dúvida se o treinamento resistido, em relação ao exercício físico aeróbio, desencadearia as mesmas sinalizações celulares associadas à neuroplasticidade. Considerando que o exercício físico resistido é altamente recomendado para a população adulta e idosa para melhorar a sua massa mineral óssea, a sua força e a sua massa muscular, diminuindo os riscos de quedas e a limitação funcional é importante que o seu efeito na função cerebral seja melhor elucidado, para assim se poder recomendá-lo também como ferramenta terapêutica para os processos neurodegenerativos e os transtornos mentais.
2
2. OBJETIVOS
1 Testar e validar um modelo animal (em ratos) de treinamento resistido, que seja
capaz de melhorar o desempenho em uma tarefa que avalia a memória hipocampo-dependente (Parte 1).
2 Verificar os efeitos dos exercícios físicos aeróbio e resistido na aprendizagem, na
3
PARTE 1
3. PARTE 1
3.1
Material e Métodos
Todos os procedimentos deste estudo seguiram as normas estabelecidas pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP), assim como os procedimentos éticos estabelecidos previamente(6) os quais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de São Paulo (número da licença 0778/07, seção Anexos, 8.1).
3.1.1 Animais
3.1.2 Procedimentos Experimentais
Os animais foram distribuídos em três grupos, controle (CTRL,
n=10), sham (SHAM, n=10) e resistido (RES, n=10), de acordo com o pareamento do desempenho da subida na escada (up ladder performance) descrito no item (3.1.2.4).
3.1.2.1 Grupo Controle
Os animais deste grupo permaneceram nas suas gaiolas por todo o período, com uma manipulação diária, com o objetivo de diminuir o estresse do animal perante os testes experimentais e o pesquisador.
3.1.2.2 Grupo Sham
3.1.2.3 Grupo Resistido
Os animais deste grupo foram submetidos a um protocolo de exercício físico resistido progressivo, cinco vezes por semana (segunda a sexta-feira) por oito semanas. O aparato da escalada na escada vertical, em que foi realizado o treinamento, foi adaptado do estudo de Pereira e col.(131) e usado em outros estudos anteriores(52;78;134;145;179). Este consiste em uma escada com dimensões de 110cm de altura por 18cm de largura, inclinada a 80º, com espaçamento de 2cm entre os degraus, em cujo topo da escada existem um abrigo de (20 X 20 X 20cm) que serve de abrigo aos animais durante o descanso entre as séries de escalada (Figura 5).
FIGURA 5: Foto do aparato da escalada na escada vertical.
80º 18cm
110cm 20cm
3.1.2.4 Familiarização – up ladder performance
O critério utilizado para a distribuição dos animais em cada grupo foi o pareamento pela “up ladder performance”, que serviu também para a sua familiarização ao aparato. Esta, realizada por três dias, consistiu de três tentativas diárias de escalada na escada. Antes da primeira tentativa, o animal foi colocado no abrigo durante 60s. Na primeira tentativa, o animal foi colocado na parte proximal da escada, a 35cm de distância da porta do abrigo. Na segunda tentativa, o animal foi posicionado a 55cm de distância da porta do abrigo. Na terceira tentativa, o animal foi colocado a 110cm de distância da porta do abrigo. O tempo de subida foi medido na terceira tentativa de cada dia, tendo os animais sido distribuídos em três grupos, de acordo com o seu tempo de subida. O teste de ANOVA de 1 via mostrou que a distribuição dos animais foi homogênea baseada nos tempos de subida na escada ao longo dos três dias (Tabela 1).
TABELA 1: Familiarização (up ladder performance) dos grupos ao longo dos três dias.
Grupos Dia 1 Dias de familiarização (3ª tentativa de cada dia) Dia 2 Dia 3 Controle 36,40 ± 19,75 F
(6,50)=0,94621 24,00 ± 18,48
(p=0,47) F(6,50)(p=0,47) =0,94621
19.93 ± 10.21 F
(6,50)
(p=0,47) =0,94621
Sham 29,56 ± 14,15 21,15 ± 11,32 18,79 ± 7,13
Resistido 38,81 ± 20,20 15,79 ± 5,08 15.36 ± 7.25
Dados estão expressos como média ± DPM. Dia 1, dia 2, dia 3: tempo (segundos) na terceira tentativa de cada dia, ANOVA de 1 via.
3.1.2.5 Protocolo do Treinamento Resistido
sobrecarga progressiva. A cada tentativa de escalada o animal fazia, em média, de 8 a 12 movimentos de escalada, consideradas como repetições. A sobrecarga variou de acordo com as sessões e as semanas de treinamento (Tabela 2). Para o ajuste da sobrecarga, os animais foram pesados semanalmente. Para a fixação da sobrecarga, foram utilizados 13,5cm de cabo de aço plastificado e unidos entre si para formar um círculo, 1 peça conectora de aço inoxidável para fixar cada um dos cilindros utilizados nas séries do exercício físico ao cabo de aço. O cabo de aço foi fixado na cauda do animal (porção proximal) por meio de uma fita emborrachada sem cola (Scotch 23 Rubber Tape, Scotch 3M), e no cabo foram fixados os tubos (tipo Falcon com peso de chumbo) com sobrecarga relativa à série da sessão de treinamento.
TABELA 2: Protocolo do treinamento resistido durante oito semanas de intervenção.
Semanas escada ao longo da Escaladas na
sessão
Sobrecarga (% da massa corporal total)
Intervalo (segundos) (no abrigo)
1
1ª 50 60
2ª 50 60
3ª 50 60
4ª 75 60
5ª 75 60
6ª 75 -
2-3
1ª 50 60
2ª 50 60
3ª 75 60
4ª 75 60
5ª 75 60
6ª 75 60
7ª 90 -
4-8
1ª 50 60
2ª 50 60
3ª 75 60
4ª 75 60
5ª 90 60
6ª 90 60
7ª 100 60
3.1.2.6 Tarefa da Esquiva Inibitória
Vinte e quatro horas após a última sessão de treinamento, os animais foram submetidos à tarefa da memória esquiva inibitória (EI). O aparato consiste em duas caixas de acrílico (uma branca e uma preta), cada uma medindo (21 X 26 X 27.5cm), interligadas por uma porta deslizante. O compartimento branco é considerado seguro e o compartimento preto aversivo. O piso do aparato é gradeado com barras metálicas (0.4cm de diâmetro), separadas entre si por 1,2cm e interligadas a um gerador de choque elétrico.
No dia do treino, cada animal foi colocado no compartimento branco (seguro) com a porta fechada. Após 10s, a porta foi aberta e, logo que o animal passou para o outro compartimento (aversivo), a porta foi fechada e o animal recebeu um choque elétrico nos pés (0.6mA/1s). A latência para passar para o compartimento preto foi mensurada. No dia do teste, 24h após o treino, cada animal foi recolocado no compartimento seguro e, a latência para passar para o lado aversivo foi novamente mensurado. A latência máxima foi estabelecida em 540s(111;139).
3.1.2.7 Coleta, Processamento e Armazenamento dos Materiais
movimento associado com a escalada) foi retirado, coberto com amido de milho e crioprotetor (Tissue-Tek OCT, Miles, Naperville, IL, EUA), depois congelado em isopentano / nitrogênio líquido. Os tecidos e o soro foram armazenados a -80ºC até ao seu uso.
3.1.2.8 Medição da Área da Secção Transversal do FDL
Os cortes transversos (8µm) foram feitos na porção média do FDL, usou-se um criostato a -20ºC e colocados em lâminas para a microscopia (Superfrost, Fisher Scientific, EUA). Estas foram coradas pelo ensaio histológico da hematoxilina e da eosina de Meyer’s (H&E), e fotografadas por um uma câmera digital DP71 (Melville, NY, EUA) acoplada a um microscópio de luz (Olympus BX50) com lente objetiva de 40X. A análise da área transversal de 100 fibras de cada músculo foi feita de forma “cega”, com a utilização do programa Axio Vision 4.6 (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, DE).
3.1.3 Análise dos Dados
3.2
PARTE 1
3.2
Resultados
Todos os animais submetidos ao treinamento resistido concluíram com sucesso, sem a presença de qualquer lesão, desistência ou morte. Não houve a necessidade, em nenhum momento do experimento, de se usar choque elétrico ou qualquer outro estímulo para motivar a execução da tarefa da escalada em escada. A massa corporal total dos animais aumentaram ao longo de toda a intervenção e não houve variação entre os grupos e nenhum período (Anexo 8.2.5 – Figura Suplementar 1).
A medição do tamanho das fibras musculares mostrou que o treinamento por oito semanas causou hipertrofia no FDL (Figura 6; F(2,27) = 42,56,
P<0,001). Esta diferença no tamanho transversal do músculo mostra que uma importante resposta adaptativa ao treinamento resistido (hipertrofia) ocorreu, indicando a vantagem da utilização deste modelo animal.
FIGURA 6: Secção transversal das fibras do FDL. Grupo controle (CTRL, n=10), grupo sham (SHAM,
n=10) e grupo resistido (RES, n=10). Os valores estão expressos como média ± DPM. **P<0,001 comparado aos grupos CTRL e SHAM, ANOVA de 1 via, teste post hoc de Tukey.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 S ecção tr an sver sal d o F D L (µ m 2)
CTRL SHAM RES
Os resultados de medida pela latência para entrar no compartimento aversivo no dia do teste, indicaram que houve uma melhora da memória hipocampo-dependente nos animais do grupo RES em relação aos demais, em razão de uma maior latência (Figura 7; F(2, 27)
Este experimento permitiu testar um modelo animal em ratos de treinamento resistido progressivo, capaz de melhorar o desempenho em uma tarefa hipocampo-dependente e causar hipertrofia no músculo FDL.
= 4,64, P<0,05).
0 100 200 300 400 500 600 1 Lat ên ci a ( s) p ar a e nt rar n o co m par tim en to aver si vo
CTRL SHAM RES
Dia do Teste Dia do Treino
*
FIGURA 7: Teste da esquiva inibitória. Latência para entrar no compartimento aversivo nos dias do
treino e do teste. Grupo controle (CTRL, n=10), grupo sham (SHAM, n=10) e grupo resistido (RES,
4
PARTE 2
4. PARTE 2
4.1
Material e Métodos
4.1.1 Animais
Os 50 ratos adultos (90 dias de idade no inicio da intervenção) da linhagem Wistar foram fornecidos pelo Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia (CEDEME) – Universidade Federal de São Paulo. Os animais foram mantidos nas condições descritas no item (3.1.1 – parte 1)
4.1.2 Procedimentos Experimentais
tempo e ocasionalmente corre na metade da esteira); 5= corrida excelente (corre sempre na parte da frente da esteira). Somente foram selecionados os animais que obtiveram classificação igual ou maior a 3. Seis animais não atingiram a escala 3 e foram excluídos.
Após a seleção dos animais por meio da corrida na esteira, os 44 animais foram submetidos à familiarização ao aparato da escada vertical (descrito no item 3.1.2.4 – parte 1). Após este protocolo, notou-se que todos os animais aprenderam a escalar a escada vertical, tendo a sua distribuição sido feita de forma homogênea em quatro grupos: controle (CTRL), sham (SHAM), aeróbio (AERO) e resistido (RES).
4.1.2.1 Grupo Controle
Os animais deste grupo permaneceram nas suas gaiolas por todo o período, com uma manipulação diária, com o objetivo de diminuir o estresse do animal perante os testes experimentais e o pesquisador.
4.1.2.2 Grupo Sham
(abrigo) escada de treinamento. Esse procedimento foi feito ao longo de oito semanas cinco vezes por semana.
4.1.2.3 Grupo Aeróbio
Os animais deste grupo foram submetidos a um protocolo de treinamento aeróbio com intensidade moderada em esteira (Columbus, Ohio, EUA), com o choque elétrico desligado, com a frequência semanal de cinco vezes durante oito semanas. A cada sessão foi permitido que, como a forma de aquecimento, os animais corressem a 10m/min durante 5min. A velocidade da esteira foi estabelecida em 15m/min durante 25min na primeira semana, tendo sido incrementada até 20m/min com a duração de 30min na última semana. Este protocolo foi escolhido pelo fato de desencadear neuroplasticidade e não ser considerado exaustivo, tendo sido utilizado no estudo anterior(155).
4.1.2.4 Grupo Resistido
4.1.2.5 Labirinto Aquático de Morris
Neste estudo foi utilizado o labirinto aquático de Morris(114),
adaptado do protocolo descrito no estudo de Ang e col.(7)
O teste de labirinto aquático de Morris foi dividido nas fases treino e teste. Na fase do treino, que aconteceu durante dois dias, cada animal foi submetido a quatro tentativas por dia para achar a plataforma. Cada tentativa teve duração de 60s e sempre foi iniciada de um lugar diferente da piscina, escolhido de forma aleatória. No caso de falha em encontrar a plataforma dentro do tempo, o animal era conduzido gentilmente até à plataforma e permanecia ali por 10s. Após 24h da fase do treino, foi iniciada a fase do teste, a qual consistiu de três blocos de quatro tentativas para encontrar a plataforma, tendo um intervalo de 30min entre os blocos. Ao final de cada bloco os animais retornavam para as suas caixas-moradia. Foi mensurada a latência para achar plataforma, bem como a distância e a velocidade do nado. Trinta minutos após o terceiro bloco, os animais foram submetidos ao teste
da memória espacial (probe). Neste teste, a plataforma foi retirada e, a cada animal, foi permitido explorar o labirinto por 60s em uma única tentativa. Foi mensurada a porcentagem do tempo de permanência na zona da plataforma.
4.1.2.6 Coleta, Processamento e Armazenamento dos Materiais
No dia posterior ao labirinto aquático de Morris, os ratos foram eutanasiados por decapitação em guilhotina. O sangue do tronco foi coletado em tubos sem anti-coagulante, e centrifugados (3500xg, 10min) para a coleta do soro. Os hipocampos foram dissecados e imediatamente congelados em nitrogênio líquido. Os hipocampos e o soro foram armazenados a -80ºC até o seu uso.
4.1.2.7 Ensaio Imunorradiométrico
4.1.2.8 Ensaio de ELISA
A concentração do BDNF hipocampal (amostras em duplicata) foi medida usando o kit comercial para o ensaio imunoabsorvente da ligação das enzimas (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) (ChemiKine BDNF kit, Millipore, Billerica, EUA), de acordo com as orientações do fabricante. Os níveis do BDNF para os grupos SHAM, AERO e RES foram expressos em porcentagem relativa ao grupo CTRL.
4.1.2.9 Western Blot
Previamente ao ensaio de Western Blot, foram preparados extratos dos hipocampos, isto é, homogeneizados em tampão de lise (1% Triton X-100; 0.5% deoxicolato de sódio; 100mM Tris-HCl, pH 8.3; 150mM NaCl; 10mM EDTA; 0.1%
SDS; 10% glicerol; e inibidores de proteases). A concentração de proteína foi mensurada seguindo o método de Lowry’s(102)
A imunodetecção foi conduzida à temperatura ambiente. A membrana foi bloqueada em uma solução de bloqueio (2% leite desnatado em TBS + 0,1% Tween 20) por 1h, seguido da incubação com um anticorpo primário durante
. As amostras foram separadas em gel
1h (anti-IGF-1R phospho Y1161 (1:100), TrkB (1:100), CaMKII (1:100), synapsin 1 (1:500), synaptophysin (1:50000), Abcam, Cambridge, EUA; phospho-AKT (1:100), Cell Signaling, Danvers, EUA; anti-actin (1:10000), Sigma, St. Louis, EUA). Após três lavagens de 5min, a membrana foi incubada durante 45min com anticorpo secundário (Alexa 680 conjugated secondary antibody anti-rabbit IgG, 1:5000, Invitrogen, Carlsbad, EUA). Após cinco lavagens de 5min, as imagens digitais foram adquiridas e quantificadas usando um escaner e programa (Odyssey infrared image system, Li-cor, Baltimore, EUA). A intensidade das bandas foram normalizadas pela intensidade da banda de actina. A expressão das proteínas para os grupos SHAM, AERO e RES, foram expressas em porcentagem relativa ao grupo CTRL.
4.1.3 Análise dos Dados
4.2
PARTE 2
4.2
Resultados
Após o período de intervenção, todos os grupos diminuíram a latência (Figura 8A; efeito bloco, F(4, 160)=145,62; P<0,001) e a distância (Figura 8B;
efeito bloco, F(4, 160)=104,44; P<0,001) para encontrar a plataforma ao longo dos
blocos de tentativas, indicando aprendizagem espacial. Os animais dos grupos AERO e RES alcançaram a plataforma em menor tempo (Figura 8A; efeito grupo,
F(3, 40)=48,57; P<0,001) e percorreram menor distância (Figura 8B; efeito grupo, F(3,
40)=37,31; P<0,001) do que os grupos CTRL e SHAM. A ANOVA para medidas
repetidas mostrou interação significativa na latência (Figura 8A; efeito intervenção
F(12, 160)=4,72; P<0,001) e na distância (Figura 8B; efeito intervenção F(12, 160)=5,05;
P<0,001). O teste post hoc de Tukey revelou que esta interação foi em razão de, os grupos AERO e RES, terem diminuído a latência e a distância para achar a plataforma ao longo dos três blocos (fase do teste) em comparação aos grupos CTRL e SHAM (Figuras 8A, 8B), apesar de não ter sido observada diferença, entre os grupos, nos dias 1 e 2 (fase do treino). No probe, a ANOVA de 1 via, seguida do teste post hoc de Tukey para cada zona, mostrou que não houve diferença entre os grupos nas zonas 1 e 3, embora os animais dos grupos AERO e RES tenham explorado a zona 4 (zona da plataforma) por mais tempo do que os grupos CTRL e SHAM (Figura 8D; F(3,40)=20,01; P<0,001). No entanto, na zona 2, foi observado que
os grupos CTRL e SHAM despenderam mais tempo do que os grupos AERO e RES (Figura 8D; F(3,40)=22,57; P<0,001). Não se observou diferença entre os grupos
físicos têm os mesmos efeitos sobre a aprendizagem sobre a memória espacial. A massa corporal dos animais ao longo das 8 semanas de intervenção podem ser visualizadas na Figura Suplementar 2 (Anexo 8.2.5 – Figura Suplementar 2).
FIGURA 8: Efeito dos exercícios físicos sobre a aprendizagem e sobre a memória espacial. O teste
labirinto aquático de Morris foi realizado. (A) latência para encontrar a plataforma, (B) distância percorrida, (C) velocidade de nado, (D) porcentagem do tempo em cada zona, (P) significa a zona da plataforma. Grupo controle (CTRL, n=11), grupo sham (SHAM, n=11), grupo aeróbio (AERO, n=11) e grupo resistido (RES, n=11). Os valores estão expressos como média ± DPM. Figuras A, B, e C
**P≤0,001 comparado aos grupos CTRL e SHAM em cada bloco, ***P<0,001 dia 1 (fase do treino) comparado ao bloco 3 (fase do teste) para todos os grupos, ANOVA para medidas repetidas, teste post hoc de Tukey. Figura D **P<0,05 comparado aos grupos CTRL e SHAM, ANOVA de uma via, post hoc de Tukey.
Como mostrado na Figura 9, a concentração sérica do IGF-1 nos animais do grupo RES aumentou em relação aos outros grupos (Figura 9; H=22,14;
P<0,001). No entanto, a concentração hipocampal do IGF-1 aumentou, de maneira
similar, para os dois grupos experimentais (AERO e RES) em relação aos grupos CTRL e SHAM (Figura 10; H=33,16; P<0,001).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 V el oc ida de do na do ( cm /s ) C
Bloco 1 Bloco 2 Bloco 3 Dia 2
Dia 1
Fase do Treino Fase do Teste
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 D ist ân ci a p er co rr id a ( cm ) ** ** ** B ***
Bloco 1 Bloco 2 Bloco 3 Dia 2
Dia 1
Fase do Treino Fase do Teste
0 10 20 30 40 50
Zona 1 Zona 2 Zona 3 Zona 4
% tem p o em cad a zo n a CTRL SHAM AERO RES ZONA 1 ZONA 2 ZONA 3 ZONA 4 P
D
** **
CTRL SHAM AERO RES
CTRL SHAM AERO RES
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 L at ên ci a ( s) p ar a a ch ar a p lat af o rm a
Bloco 1 Bloco 2 Bloco 3
** A *** Dia 2 Dia 1 ** **
Fase do Treino Fase do Teste
CTRL SHAM AERO RES
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 V el oc ida de do na do ( cm /s ) C
Bloco 1 Bloco 2 Bloco 3 Dia 2
Dia 1
Fase do Treino Fase do Teste
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 D ist ân ci a p er co rr id a ( cm ) ** ** ** B ***
Bloco 1 Bloco 2 Bloco 3 Dia 2
Dia 1
Fase do Treino Fase do Teste
0 10 20 30 40 50
Zona 1 Zona 2 Zona 3 Zona 4
% tem p o em cad a zo n a CTRL SHAM AERO RES ZONA 1 ZONA 2 ZONA 3 ZONA 4 P
D
** **
CTRL SHAM AERO RES
CTRL SHAM AERO RES
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 L at ên ci a ( s) p ar a a ch ar a p lat af o rm a
Bloco 1 Bloco 2 Bloco 3
** A *** Dia 2 Dia 1 ** **
Fase do Treino Fase do Teste
FIGURA 9: Concentração periférica do IGF-1 medida no soro. Ensaio imunorradiométrico foi realizado. Grupo controle (CTRL, n=11), grupo sham (SHAM, n=11), grupo aeróbio (AERO, n=11) e grupo resistido (RES, n=11). Os valores estão expressos como média ± DPM relativos ao grupo CTRL. *P<0,05 comparado aos grupos AERO e SHAM, **P<0,001 comparado ao grupo CTRL, teste de Kruskal-Wallis.
FIGURA 10: Concentração hipocampal do IGF-1. Ensaio imunorradiométrico foi realizado. Grupo
controle (CTRL, n=11), grupo sham (SHAM, n=11), grupo aeróbio (AERO, n=11) e grupo resistido (RES, n=11). Os valores estão expressos como média ± DPM relativos ao grupo CTRL. *P<0,05 comparado ao grupo CTRL. **P<0,001 comparado ao grupo SHAM, teste de Kruskal-Wallis.
A concentração hipocampal do BDNF foi mensurada e pode ser vista na Figura 11. O grupo AERO mostrou maior concentração desta molécula do que os outros grupos (CTRL, SHAM e RES) (Figura 11; H=29,41; P<0,001).
0% 50% 100% 150% 200% 250% 300% 350% 1 C o n cen tr ação p er ifér ic a d e I G F -1 (% d o gr up o c o nt rol e)
CTRL SHAM AERO RES
**
*
0% 50% 100% 150% 200% 250% 300% 350% 1 C onc ent ra çã o hipoc am pa l de IG F-1 (% d o gr up o c ont role )CTRL SHAM AERO RES
**
*
**
FIGURA 11: BDNF cerebral medido no hipocampo. Método de ELISA foi realizado. Grupo controle (CTRL, n=11), grupo sham (SHAM, n=11), grupo aeróbio (AERO, n=11) e grupo resistido (RES,
n=11). Os valores estão expressos como média ± DPM relativos ao grupo CTRL. *P<0.05 comparado ao grupo RES. **P<0.001 comparado aos grupos CTRL e SHAM, teste de Kruskal-Wallis.
A Figura 12 mostra a expressão do IGF-1R no hipocampo. Somente o grupo RES aumentou significativamente a expressão deste receptor em relação aos grupos CTRL e SHAM (Figura 12; H=13,54; P<0,001).
FIGURA 12: Expressão hipocampal do IGF-1R. Western blot foi realizado. Grupo controle (CTRL,
n=6), grupo sham (SHAM, n=6), grupo aeróbio (AERO, n=6) e grupo resistido (RES, n=6). Os valores estão expressos como média ± DPM relativos ao grupo CTRL. *P<0,05 comparado aos grupos CTRL e SHAM, teste de Kruskal-Wallis.
0% 50% 100% 150% 200% 250% 300% 350% 1 C o n cen tr ação h ip o cam p al d e B D N F (% d o g ru po c o nt rol e)
CTRL SHAM AERO RES
A Figura 13 mostra a expressão do receptor TrKB no hipocampo após oito semanas de intervenção. Foi observado nos animais do grupo AERO uma maior expressão do receptor do que nos outros grupos (Figura 13; H=13,56;
P<0,001).
FIGURA 13: Expressão hipocampal do TrKB. Western Blot foi realizado. Grupo controle (CTRL, n=6),
grupo sham (SHAM, n=6), grupo aeróbio (AERO, n=6) e grupo resistido (RES, n=6). Os valores estão expressos como média ± DPM relativos ao grupo CTRL. *P<0,05 comparado ao grupo CTRL, SHAM, e RES, teste de Kruskal-Wallis.
FIGURA 14: Expressão hipocampal da p-AKT. Western Blot foi realizado. Grupo controle (CTRL,
n=6), grupo sham (SHAM, n=6), grupo aeróbio (AERO, n=6) e grupo resistido (RES, n=6). Os valores estão expressos como média ± DPM relativos ao grupo CTRL. *P<0,05 comparado aos grupos CTRL e SHAM, teste de Kruskal-Wallis.
FIGURA 15: Expressão hipocampal da CaMKII. Western Blot foi realizado. Grupo controle (CTRL,
n=6), grupo sham (SHAM, n=6), grupo aeróbio (AERO, n=6) e grupo resistido (RES, n=6). Os valores estão expressos como média ± DPM relativos ao grupo CTRL. *P<0,05 comparado aos grupos CTRL e SHAM, ANOVA de uma via, post hoc de Tukey.
As expressões da sinapsina 1 e da sinaptofisina estão mostradas, respectivamente, nas Figuras 16 e 17. Os dois grupos submetidos ao exercício físico (AERO e RES) mostraram maiores expressões da sinapsina 1 (Figura 16; F(3,
20)=12,12; P<0,001) e da sinaptofisina (Figura 17; H=15,92; P<0,001) do que os
FIGURA 16: Expressão hipocampal da sinapsina 1. Western Blot foi realizado. Grupo controle (CTRL,
n=6), grupo sham (SHAM, n=6), grupo aeróbio (AERO, n=6) e grupo resistido (RES, n=6). Os valores estão expressos como média ± DPM relativos ao grupo CTRL. *P<0,05 comparado aos grupos CTRL e SHAM. **P<0,001 comparado aos grupos CTRL e SHAM, ANOVA de uma via, post hoc de Tukey.
FIGURA 17: Expressão hipocampal da sinaptofisina. Western Blot foi realizado. Grupo controle
