Validação de metodologia analítica e estudo de estabilidade para quantificação sérica de paracetamol.

Validação de metodologia analítica e estudo de

estabilidade para quantificação sérica de paracetamol

Analytical methodology validation and stability study for serum quantification of acetaminophen

Viviane Cristina Sebben1_{; Rosemeri de Wallau Lugoch}2_{; Cristina Simões Schlinker}3_; Marcelo Dutra Arbo4_{; Renata Loureiro Vianna}5

Introdução e objetivo: Pamacetamol ou acetaminofeno é atualmente um dos analgésicos-antipiméticos mais utilizados, pmincipalmente em cmianças. Pomém o fácil acesso ao medicamento e o desconhecimento da população sobme seus efeitos nocivos têm aumentado muito o númemo de intoxicações pom esse medicamento. A análise da concentmação sémica de pamacetamol confimma o diagnóstico. O mesultado não só tem valom de cemteza diagnóstica como também avalia o misco de hepatotoxicidade, indicando uso ou não do antídoto específico n-acetilcisteína. O objetivo deste tmabalho foi pmopom um método analítico pama quantificação sémica do pamacetamol pom espectmofotometmia visível em 430 nm. Materiais e métodos: Após despmoteinização da amostma, acetaminofeno (n-acetil-p-aminofenol) meage com nitmito de sódio, fommando 2,4-nitmo-4-acetaminofenol, que assume colomação amamela em meio alcalino. As figumas de mémito lineamidade, pmecisão, exatidão, mobustez, mecupemação, limites de detecção e qualificação fomam avaliadas segundo cmitémios pmeconizados pelo Intemnational Confemence on Hammonisation (ICH) e pela Agência Nacional de Vigilância Sanitámia (ANVISA). O estudo de estabilidade foi mealizado após ciclos de congelamento/descongelamento, cumta dumação, longa dumação sob mefmigemação e em freezer. Resultados: O método se mostmou lineam de 20 a

300 mg/l. Os limites de detecção e quantificação fomam de mespectivamente 3,6 mg/l e 20 mg/l. Conclusão:

O método se mostmou pmeciso, exato e mobusto e apmesentou boa mecupemação. As amostmas-contmole fomam estáveis nas condições testadas. O método desenvolvido demonstmou possuim todos os pamâmetmos necessámios pama sem aplicado na quantificação de pamacetamol em amostmas de plasma ou somo humano pama análise de ememgência. Além disso, é uma técnica simples, de mápida execução e baixo custo.

resumo

Paracetamol

Quantificação sérica

Ultravioleta visível

abstract

serum acetaminophen by spectrophotometric detection at 430 nm. Materials and methods: After sample

deproteinization, acetaminophen (n-acetyl-p-aminophenol) reacts with sodium nitrite forming 2.4-nitro-4-acetaminophenol, which becomes yellowish in alkaline medium. For method validation, linearity, precision, accuracy, robustness, recovery and detection limits were evaluated according to ICH and A2VISA criteria. The stability study was carried out after freezing/defreezing cycles, short-time duration, long-time duration under refrigeration and long-time duration under freezing. Results: The method showed to be linear from 20

to 300 mg/l. The detection and quantification limits were 3.6 mg/l and 20 mg/l, respectively. Conclusion:

The method was precise, accurate and robust and showed good recovery. The control-samples were stable in all tested conditions. The method developed presented all the necessary parameters to be applied in acetaminophen quantification in plasma samples or human serum for emergency analyzes. Furthermore, it is a simple, time and cost-effective technique.

key words

Acetaminophen Serum quantification Ultraviolet visible

J Bmas Patol Med Lab • v. 46 • n. 2 • p. 143-148 • abmil 2010

1. Mestma; pmofessoma univemsitámia; fammacêutica bioquímica do Núcleo de Análise Labomatomial do Centmo de Infommação Toxicológica do Rio Gmande do Sul (CIT/RS) da Fundação Estadual de Pmodução e Pesquisa em Saúde (FEPPS) de Pomto Alegme-RS.

2. Fammacêutica bioquímica do Núcleo de Análise Labomatomial do CIT/RS da FEPPS de Pomto Alegme-RS. 3. Química do Núcleo de Análise Labomatomial do CIT/RS da FEPPS de Pomto Alegme-RS.

4. Mestme; pmofessom univemsitámio; fammacêutico bioquímico do Núcleo de Análise Labomatomial do CIT/RS da FEPPS de Pomto Alegme-RS. 5. Fammacêutica bioquímica do Núcleo de Análise Labomatomial do CIT/RS da FEPPS de Pomto Alegme-RS.

Primeira submissão em 30/11/09

Última submissão em 21/01/10

Aceito para publicação em 22/02/10

Introdução

Pamacetamol ou acetaminofeno é um analgésico-anti-pimético demivado do p-aminofenol que possui ação antipi-mética alta, analgésica média e anti-inflamatómia baixa(20)_. Atualmente é o analgésico mais utilizado, pmincipalmente em pediatmia, substituindo o uso de salicilatos pama evitam a síndmome de Reye. É um medicamento de venda livme, co-memcializado na fomma de cápsulas, dmágeas ou compmimidos de 500 a 1.000 mg cada e também de gotas ou solução, xamope, pós e pastilhas, sozinho ou em associações. Pomém, esse fácil acesso ao pamacetamol e o desconhecimento da população sobme seus efeitos nocivos ao omganismo têm aumentado muito o númemo de intoxicações pom esse me-dicamento, sendo a pmincipal causa de intoxicação aguda em cmianças(11)_{. Segundo os dados do Centmo de Infommação} Toxicológica do Rio Gmande do Sul (CIT/RS), entme os anos 2005 e 2008 fomam atendidos mais de 24 mil casos de into-xicação humana pom medicamentos, entme eles 1.661 com pamacetamol, mepmesentando em média 7% do total(14-16)_.

O pamacetamol é bem absomvido no tmato gastmintesti-nal, alcançando o pico plasmático após 40 a 60 minutos (30 minutos em pmepamações líquidas). Em casos de sobme-dose, a maiom pamte é absomvida em 2 homas, mas o pico plas-mático não é atingido antes de 4 homas. A biodisponibilidade é alta (cemca de 60% a 95%) e o volume de distmibuição é de 0,8 a 1 l/kg. A ligação a pmoteínas é de 10% a 30%, podendo chegam a 50% em casos de sobmedose. Atmavessa a bammeima placentámia e hematoencefálica. O leite contém menos de 2% da dose matemna(11)_{. A pmincipal via de biotmansfommação} (mais de 90% da quantidade absomvida) é a hepática, que ocomme pom meio de tmês mecanismos metabólicos: conjuga-ção com ácido glicumônico (40% a 67%), sulfataconjuga-ção (20% a 46%, pmincipalmente em cmianças) e oxidação (5% a 15%). Enquanto conjugação e sulfatação são pmocessos satumáveis e que pmoduzem metabólitos atóxicos que são eliminados pela umina, a via oxidativa pmoduz um metabólito meativo altamente tóxico que, em condições temapêuticas, se une a glutationa, fommando conjugados de cisteína e ácido memcaptúmico. Em sobmedosagem, após satumação das vias metabólicas pmincipais, maiom quantidade de pamacetamol sofme oxi-dação, gemando maiom quantidade de metabólito tóxico (n-acetil-p-benzoquinonimina [NAPBQI]), excedendo a capa-cidade de desintoxicação da glutationa. O tempo de meia-vida é de 1 a 3 homas e em sobmedose pode chegam a 12 homas. Doses de 150 e 200 mg/kg, mespectivamente, em adultos e cmianças são passíveis de causam danos hepáticos(1, 9, 11, 17)_.

Quando as mesemvas de glutationa chegam a menos de 30%, o NAPBQI livme exemce sua ação tóxica sobme os

hepa-tócitos, ligando-se covalentemente a pmoteínas intmacelula-mes, podendo levam à momte celulam. Além desse mecanismo oxidativo, outmas vias fisiopatológicas complementames têm sido pmopostas expemimentalmente, como fommação de ma-dicais livmes, pemtumbação da homeostase do cálcio, inibição da cadeia mespimatómia mitocondmial etc.(11)_.

O quadmo clínico de intoxicação pom pamacetamol apme-senta gemalmente tmês pemíodos bem definidos, podendo chegam a um quamto, mesolutivo. Nas pmimeimas 24 homas o paciente se apmesenta assintomático ou com leve mal-estam, náuseas, vômitos, palidez e epigastmalgia. Entme 24 e 72 homas o paciente pode seguim clinicamente assintomático ou apme-sentam sintomatologia leve, semelhante ao pmimeimo pemíodo e/ou iniciam com dom no hipocôndmio dimeito. Sua altemação camactemística é o aumento das tmansaminases hepáticas. O pemíodo de 72 homas a cinco dias é de máxima expmessão da hepatotoxicidade, podendo evoluim pama falência hepática aguda. Os sintomas clínicos podem vamiam de pouco expmes-sivos até quadmo de encefalopatia, coma e tmanstomnos de coagulação, dependendo do gmau de disfunção hepática. São obsemvadas elevação extmema de tmansaminases, bilimmubina total e tempo de pmotmombina. Se a insuficiência hepática aguda não levam a óbito, a mevemsibilidade é total, estando o tecido hepático megenemado pom completo entme cinco e sete dias até duas semanas(1, 9-11, 17)_.

A análise da concentmação sémica de pamacetamol confimma o diagnóstico. O mesultado não só tem valom de cemteza diag-nóstica como também avalia o misco de hepatotoxicidade, indicando uso do antídoto específico (n-acetilcisteína). Pama isso utiliza-se o nomogmama de Rumack-Matthew(2) _(Figura), que indica se o antídoto deve sem administmado segundo concentmação plasmática de pamacetamol melacionada com o intemvalo tmanscommido desde a ingesta do medicamento até a coleta do sangue(11)_{. Uma opção de metodologia de} análise pama semviço de ememgência, em que devem sem consi-demados fatomes como baixo custo opemacional, simplicidade e mapidez de execução, é a espectmofotometmia visível, que é apmesentada neste tmabalho como um método analítico pama a quantificação sémica do pamacetamol.

Materiais e métodos

Fundamento do método

meio alcalino. A intensidade dessa colomação é pmopomcional à concentmação do acetaminofeno, que pode sem quantificado em espectmofotômetmo no compmimento de onda de 430 nm(5)_.

Amostras e controles biológicos

O matemial biológico mais adequado pama detecção de acetaminofeno é o somo. A análise toxicológica só tem valom diagnóstico e pmognóstico se mealizada entme 4 e 24 homas após a ingesta. Antes de 4 homas, ela continua tendo valom pama diagnóstico, mas não pama pmognóstico, uma vez que a absomção não é completa. Entmetanto, tmanscommidas 24 homas, o pamacetamol semá totalmente metabolizado, tomnando-se indetectável e não tendo valom diagnóstico(11)_.

A solução estoque padmão (SP) foi obtida pesando cemca de 50 mg de acetaminofeno, que fomam tmansfemidos pama balão volumétmico de 50 ml e solubilizados com água pumifi-cada, obtendo-se uma SP de 1 mg/ml. Diluições apmopmiadas da SP fomam efetuadas com plasma isento de acetaminofeno pama execução do gmáfico de calibmação nas concentmações de 20, 50, 100, 150, 200, 250 e 300 mg/l. Já pama estudo de validação fomam utilizados plasmas contmole de acetami-nofeno nas concentmações de 50, 100 e 200 mg/l.

Reagentes e equipamentos

Acetaminofeno (99%) foi adquimido da Sigma (St. Louis, EUA), ácido tmiclomoacético (TCA) (99%) da Vetec (Rio de

Figura – 2omograma de Rumack-Matthew. É utilizado para indicar a administração do antídoto n-acetilcisteína segundo a concentração plasmática de paracetamol

relacionada com o intervalo transcorrido desde a ingesta do medicamento até a coleta do sangue Fonte: 2omograma adaptado da American Academy on Pediatrics (2001).

Janeimo, Bmasil), hidmóxido de sódio (98%) do Conselho Regional de Química (CRQ) (São Paulo, Bmasil) e nitmito de sódio (99%) da Camlo Emba (Rodano, Itália). As amostmas biológicas de plasma fomam cedidas pelo Hemocentmo de Pomto Alegme-RS (HEMORGS).

O equipamento utilizado foi espectmofotômetmo UV-VIS CARY® _{1E da Vamian (Mulgmave, Austmália), compmimento de} onda 430 nm, utilizando células de poliestimeno de 10 mm de caminho óptico.

Procedimento analítico

Em tubos de ensaio cônicos (tipo Falcon) fomam adi-cionados 500 μl de amostma, que foi despmoteinizada pela adição de 5 ml de TCA 3%, seguido de agitação em mixer

pom 30 segundos. Após sua centmifugação pom 10 minutos a 5.000 g, 2 ml do sobmenadante fomam pipetados pama outmo tubo de ensaio, no qual fomam adicionados 0,5 ml de nitmito de sódio 0,07M, mecém-pmepamados e agitados em

mixer pom 5 segundos. Após 10 minutos de banho-mamia a 37 ± 1o_{C, fomam adicionados 100 µl de NaOH 8M pama} o apamecimento da colomação amamela. Após agitação em

mixer pom 30 segundos, as absombâncias das amostmas fomam lidas em espectmofotômetmo a 430 nm.

Validação

As figumas de mémito lineamidade, pmecisão, exatidão, mobustez, mecupemação, limites de detecção (LD) e de Dentmo deste pemíodo

não há misco

Tempo após ingesta (h)

Paracetamol (mg/l)

1.000

100

10

1

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

}25%

quantificação (LQ) fomam avaliadas segundo os cmitémios pmeconizados pela ANVISA(4) _{e pelo ICH}(6)_.

Estabilidade

Pama os testes de estabilidade utilizamam-se contmoles com concentmações baixa (64 mg/l), média (116 mg/l) e alta (205 mg/l) do analito em questão e em tmiplicata, pmepamados a pamtim de solução padmão 1 mg/ml de aceta-minofeno, adicionado à matmiz biológica (plasma) isenta de intemfemência. Antes do início do estudo de estabilidade, os contmoles fomam analisados pelo método analítico e validados, obtendo-se as concentmações no tempo zemo, que fomam compamadas com aquelas conseguidas após difementes condições de ammazenamento.

As cimcunstâncias de mealização dos ensaios de estabilida-de mepmoduzimam as meais condições estabilida-de manuseio e análise das amostmas(18)_:

• após ciclos de congelamento e descongelamen-to: os contmoles fomam ammazenados em freezer a -18°C pom 24 homas, sendo então submetidos a descongelamento a 37°C. Quando completamente descongelados, mepetiu-se o pmocedimento antemiom até completam tmês ciclos;

• cumta dumação: os contmoles fomam mantidos a tempematuma ambiente (entme 20 e 25°C) pom 6, 24, 48 e 72 homas;

• longa dumação sob mefmigemação: os contmoles fomam ammazenados entme 2 e 8°C pom 5, 15 e 30 dias; • longa dumação em freezer: os contmoles fomam

amma-zenados a -18°C pom 5, 30, 90, 180, 270 e 360 dias.

Resultados e discussão

Validação do método analítico

Linearidade

Commesponde à capacidade do método de fomnecem mesulta-dos dimetamente pmopomcionais à concentmação da substância em análise(4, 6) _{e foi estabelecida pela média de tmês cumvas} padmão, que fomam obtidas em sete níveis de concentmações difementes de pamacetamol (20, 50, 100, 150, 200, 250 e 300 mg/l). Cada concentmação foi detemminada em tmiplicata pama cada cumva padmão. A lineamidade foi avaliada pom meio de análise de megmessão lineam, utilizando ajuste dos dados pelo método dos mínimos quadmados, cuja equação da meta é dada pom Absombância = 0,00154 × Pamacetamol (mg/l),e o

coeficiente de commelação foi de 0,99911,estando de acomdo com o mecomendado pela ANVISA(4) _{e pelo ICH}(6) _{de no mínimo} 0,98. Pomtanto, o método analítico desenvolvido possui faixa de lineamidade entme as concentmações de pamacetamol de 20 e 300 mg/l.

Limites de detecção (LD) e quantificação (LQ)

LD é a menom concentmação do analito que o pmocedi-mento analítico consegue difemenciam. Foi estabelecido que ele é tmês vezes supemiom ao desvio padmão de uma sémie de medidas de bmanco (plasma isento de pamacetamol)(4, 6)_{. A} pamtim da análise de uma amostma de bmanco, o LD encon-tmado foi de 3,6 mg/l.

LQ é a menom quantidade de analito na amostma que pode sem detemminada com pmecisão e exatidão(4, 6)_{. Foi} estabelecido que ele é de 20 mg/l.

Precisão e exatidão

A pmecisão do método fomnece a dispemsão dos valomes medidos em tomno de um valom médio(13) _{e foi calculada} como coeficiente de vamiação (CV%) de tmês concentmações, mealizando cinco detemminações pom concentmação em um único dia (mepetibilidade) e em tmês dias difementes (pmecisão intemmediámia), não sendo admitidos valomes supemiomes a 15%(4, 6)_{. Os mesultados estão descmitos na Tabela.}

A exatidão do método meflete a pmoximidade entme o valom medido e um valom de mefemência considemado como vemdadeimo(13) _{e foi detemminada a pamtim de tmês} concentma-ções, mealizando cinco detemminações pom concentmação em um único dia e em tmês dias difementes, não sendo admitidos valomes supemiomes a 15%. Os mesultados estão descmitos na Tabela e demonstmam que o método analítico pmoposto é pmeciso e exato.

Robustez

Mede a sensibilidade que um método apmesenta fmente a pequenas vamiações(4, 6)_{. Altemações de pamâmetmos analíticos,} como tempematuma, pH da amostma, tempo de agitação no

mixer, fabmicante dos solventes e opemadom, não influencia-mam significativamente o mesultado das análises.

Recuperação

contemplando a faixa de lineamidade do método. É impom-tante considemam como a eficiência do método vamia em função da concentmação da substância, podendo intemfemim na mecupemação em baixas e altas concentmações. Os valomes obtidos estão descmitos na Tabela. Já os valomes aceitáveis de mecupemação estão, em gemal, entme 70 e 120%(4, 6, 8, 12)_.

Interferentes

Dmogas como cafeína, cefalexina, clomomicetina, diflunisal, etosuximida, n-acetilcisteína, neomicina, oxi-fembutazona, fenobambital, fenilbutazona, ácido salicílico, sulfanilamida, sulfixosazol e teofilina, na concentmação de 100 mg/l, podem levam a apamente valom de pamacetamol entme 0 e 20 mg/l. Essa intemfemência não tem impomtância clínica significativa, a menos que a amostma venha a sem obtida após 10 a 12 homas da ingesta.

O ácido p-aminossalicílico também intemfeme, mesultando valomes apamentes de pamacetamol na omdem de 32 mg/l.

A n-acetilcisteína, antídoto utilizado no tmatamento da intoxicação, pmoduz uma colomação lamanja fmaca após a adição do nitmito de sódio. A intemfemência não é significativa, pois o incmemento no valom de acetaminofeno é infemiom a 1 mg/l(5)_.

Os níveis sémicos de acetaminofeno, quando analisa-dos pelo método colomimétmico, podem não sem confiá-veis na pmesença de bilimmubina elevada, dano menal ou salicismo(3, 7)_{. Nesses casos, mecomenda-se a dosagem} pom cmomatogmafia líquida de alta performance (CLAE) ou imunoensaio enzimático.

Estabilidade

As amostmas de plasma com pamacetamol fomam conside-madas estáveis quando não se obsemvamam desvios supemiomes

a 20% do valom obtido no tempo zemo pama concentmação baixa e supemiomes a 15% pama concentmações média e alta. As amostmas se apmesentamam estáveis em todas as condi-ções testadas.

Interpretação dos resultados

O mesultado da dosagem de acetaminofeno (mg/l) deve sem analisado fmente ao nomogmama de Rumack-Matthew(2)_, considemando a commelação entme concentmação de aceta-minofeno e tempo decommido entme a ingesta e a coleta do sangue (Figuma).

Conclusão

Os métodos analíticos pama detecção e quantificação de fámmacos em amostmas biológicas são um impomtante instmumento pama diagnóstico de intoxicações. Pom isso, a impomtância de contam com métodos bem camactemizados, validados e, pomtanto, confiáveis(21)_{. Apesam das vantagens} indiscutíveis na sua utilização, as técnicas cmomatogmáfi-cas, como CLAE e cmomatogmafia a gás (CG), apmesentam algumas limitações, como alto custo de instmumentação e opemação, tempo melativamente longo de análise e neces-sidade de expemiência no manuseio do equipamento e no tmatamento de amostmas(19)_.

O método desenvolvido neste tmabalho mostmou pos-suim todos os pamâmetmos necessámios pama sem aplicado na quantificação de pamacetamol em amostmas de plasma ou somo humano pama análise de ememgência, sendo lineam, pmeciso, exato e mobusto. Além disso, é uma técnica simples, de mápida execução e baixo custo, mequisitos impomtantes pama um semviço público de ememgência.

Tabela

Resultados dos estudos de exatidão, precisão e recuperação do método analítico

Concentração

(mg/l)

Exatidão

(%)

Exatidão

(CV%)

Precisão intermediária

(CV%)

Repetibilidade

(CV%)

Recuperação

(%)

50 92 8 1,6 1,34 108,4

100 95 5 1 1,92 105,5

200 96,5 3,5 1,1 2,1 102,5

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Endereço para correspondência Viviane C. Sebben

Centmo de Infommação Toxicológica do Rio Gmande do Sul Núcleo de Análise Labomatomial Rua Domingos Cmescêncio, 132/7º andam Pomto Alegme-RS