AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS DO MODELO
EXPERIMENTAL DE ENCEFALITE CAUSADA PELO VÍRUS HSV-1
EM CAMUNDONGOS DEFICIENTES PARA SOCS2
Belo Horizonte
Universidade Federal de Minas Gerais
Larissa Fonseca da Cunha Sousa
AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS INFLAMATÓRIOS DO MODELO
EXPERIMENTAL DE ENCEFALITE CAUSADA PELO VÍRUS HSV-1
EM CAMUNDONGOS DEFICIENTES PARA SOCS2
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais para a obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Lucio Teixeira Co-orientadora: Profa. Dra. Milene Alvarenga Rachid
Belo Horizonte
A realização deste trabalho não teria sido possível sem a colaboração e estímulo de várias pessoas. Assim, gostaria de expressar toda a minha gratidão a todos que, de alguma forma, contribuíram para que ele se concretizasse.
Primeiramente agradeço aos meus pais, Dante e Thais, e ao meu irmão, Francisco César, pela compreensão, ao serem privados em muitos momentos da minha companhia e atenção, e pelo imenso apoio.
Agradeço à minha família, por acreditar em mim, em especial ao meu Tio Enio, por me direcionar ao caminho da pesquisa.
Ao Leonardo, por acreditar em meu potencial e por me incentivar a correr atrás de meus sonhos. Obrigada por todo o amor.
Ao professor Antônio Lúcio Teixeira, pela excelente orientação e pelo exemplo de pesquisador.
À minha co-orientadora, Dra. Milene de Alvarenga Rachid, por estar sempre presente e disposta a ajudar.
Ao professor Mauro Martins Teixeira, por disponibilizar a infra-estrutura do laboratório de Imunofarmacologia para o desenvolvimento desse trabalho
A Professora Erna Kroon, que colaborou na parte virológica desse trabalho e à Gra, pela paciência e disponibilidade, sempre com muita simpatia.
À Professora Fabiana Machado, pelo fornecimento dos animais SOCS2-/-.
Aos amigos do grupo de “Neuro”, Aline, Allan, Alline, Ana Assis, Bruno Engler, Bruno Costa, David, Érica, Izabela, Natália, Norinne, que sempre estiveram
dispostos a ajudar.
À Marcinha, pela imensa ajuda independente da distância.
À Ana Letícia, pela amizade e por tornar a rotina de experimentos mais descontraída.
À Ilma, já que sem você o laboratório não funcionaria!
O vírus Herpes Simplex Tipo 1 (HSV-1), membro da família Herpesviridae, é um patógeno humano que pode causar uma grande variedade doenças. Dentre elas, a encefalite herpética é a manifestação clínica mais grave dessa infecção viral. O papel do Supressor de Sinalização de Citocinas 2 (SOCS2) tem sido estudado na resposta imune de diferentes doenças de origem infecciosa e não infecciosa. Sabendo da importância dessa proteína para o desenvolvimento do Sistema Nervoso Central (SNC), o presente trabalho teve como objetivo estudar pela primeira vez os efeitos de SOCS2 nos parâmetros inflamatórios de camundongos C57BL/6 selvagens (WT) e de camundongos deficientes para o gene SOCS2 (SOCS2-/-), em resposta à infecção pelo vírus HSV-1 no SNC. Esses animais foram submetidos à inoculação intracraniana com 102 unidades formadoras de placa (PFU) de vírus HSV-1, já o grupo de animais controle recebeu inoculação de PBS através da mesma via. Os animais foram eutanasiados no terceiro dia pós-infecção para que os parâmetros inflamatórios dos tecidos cerebrais fossem avaliados. Os níveis de quimiocinas e citocinas foram mensurados pelo ensaio imunoenzimático ELISA. O perfil leucocitário foi avaliado através da citometria de fluxo. O recrutamento de neutrófilo foi analisado pelo teste de atividade da mieloperoxidase. Os títulos virais e as alterações histopatológicas foram analisados pelos métodos TCID50 e hematoxilina e eosina, respectivamente. Os dados foram expressos como média ± EPM e análise estatística foi realizada utilizando ANOVA ou t-student e para a curva de sobrevida foi utilizado o teste de Kaplan-Meier (p<0,05). Quando comparado com os camundongos WT, os animais SOCS2-/- responderam à infecção por HSV-1 com uma menor expressão de citocinas, menor recrutamento de neutrófilos, macrófagos e células TCD4+ e TCD8+, menor dano no tecido cerebral e sobrevida significativamente maior. SOCS2 parece ter participação relevante na resposta imune do modelo experimental de encefalite herpética por HSV-1 induzida
intracranialmente já que sua ausência ocasiona redução do processo inflamatório com conseqüente redução dos danos teciduais e da mortalidade
ABSTRACT
The Herpes Simplex Virus Type 1 (HSV-1), a member Herpesviridae family, is a human pathogen which can cause a wide variety of diseases. Among them, the herpetic encephalitis is the most severe manifestation of this viral infection. The role of Suppressor of Cytokine Signaling 2 (SOCS2) has been studied in the immune response of infectious and non infectious diseases. Knowing the importance of this protein for the development of the central nervous system (CNS), the present work aimed to study for the first time the effects of SOCS2 in the inflammatory parameters of C57BL/6 wild-type mice (WT) and mice deficient for the gene SOCS2 (SOCS2-/-), in response to infection with HSV-1 in the CNS. These animals were submitted to intracranial inoculation with 102 plaque forming units (PFU) of HSV-1, whereas the control group of animals received injection of PBS via the same route. The animals were euthanatized on the third day post-infection for the inflammatory parameters of brain tissues were evaluated. Animals were euthanatized on the third day post-infection to evaluate the inflammatory parameters of brain tissues. Levels of chemokines and cytokines were measured by ELISA immunoassay. Leukocyte profile was assessed by flow cytometry. The recruitment of neutrophils was analyzed by myeloperoxidase activity test. Virus titers and histopathological changes were analyzed by TCID50 and hematoxylin and eosin methods, respectively. Data were expressed as mean ± SEM and statistical analysis was performed using ANOVA or t-student and to the survival curve was used Kaplan-Meier test (p <0.05). Compared with the WT mice, SOCS2-/ - mice answered to infection by HSV-1 with a lower expression of cytokines, lower recruitment of neutrophils, macrophages and CD4 + and CD8 + T cells, less damage in brain tissue and survival significantly higher. SOCS2 appears to have relevant role in the immune response of the experimental model of herpetic encephalitis by HSV-1 induced intracranially since your absence causes reduction of the inflammatory process with consequent reduction of tissue
damage and mortality.
ATCC Banco de Células Americano (American Type Culture
Collection)
ATTC American Type Culture Collection
BSA Albumina de Soro Bovino
CCL2/MCP-1 Proteína quimioatraente para monócito 1
CCL3/MIP-1α Proteína quimioatraente de macrófagos, monócitos e
linfócitos T CD8+.
CCL5/RANTES Proteína quimioatraente de linfócitos T ativados e
eosinófilos
CEBIO Centro de Bioterismo
CETEA Comitê de Ética em Experimentação Animal
CMC Carboxi-metil-celulose
CMV Citomegalovirus
CXCL1/Kc Proteína quimioatraente de neutrófilos
DMSO Dimetilsulfóxido
dpi Dias após infecção
EBV Epstein-Barr vírus
EDTA Ácido etil-diamino-tetra-acético
ELISA Ensaio imunoenzimático (Enzyme Lynked ImmunoSorbent
Assay)
EPM Erro padrão da média
FACS fluorescence-activated cell sorting
g Grama
GH hormônio de crescimento (Growth hormone)
H2O2 Peróxido de hidrogênio
H2SO4 Ácido Sulfúrico
HE Coloração Hematoxilina-Eosina
HHV-6 Herpes Virus Humano tipo 6
HHV-7 Herpes Virus Humano tipo 7
HHV-8 Herpes Virus Humano tipo 8
HSE Encefalite herpética
HSV-1 Herpes simples tipo 1
HSV-2 Herpes simpleS tipo 2
IFN Interferon
IGF-1 Fator de crescimento insulina-símile-1 (Insulin-like growth
factor 1)
IL Interleucina
JAKs Janus kinase
KCl Cloreto de potássio
Kg Quilograma
L Litro
M Molar
M.O.I Multiplicidade de infecção
MEM Meio Mínimo de Eagle
μg Micrograma
Mg Miligrama
n Número de camundongos
Na2HPO4. Fosfato dissódico
Na3PO4 Fosfato de Sódio
NaCl Cloreto de Sódio
NK Natural killer
ºC Graus Celsius
PBS Tampão fosfato de sódio
PE Ficoeritrina
PE-Cy 5 Ficoeritrina-cianina 5
pH Potencial hidrogeniônico
RPM Rotações por minuto
RPMI Meio Roswell Park Memorial Institute
SFB Soro fetal bovino
SNC Sistema Nervoso Central
SNP Sistema Nervoso Periférico
SOCS Supressor de sinalização de citocinas
(“Suppressors of Cytokine Signaling” )
STAT Proteínas transdutoras de sinais e ativadoras de sinal de
transcrição
Th1 Linfócito T helper tipo 1
Th2 Linfócito T helper tipo 2
TLR Receptores do tipo toll (toll like receptors)
u.f.p Unidades formadoras de placa
VZV Varicella-Zoster vírus
1 - INTRODUÇÃO………...…………..13
1.1 - O vírus Herpes simplex tipo 1...13
1.2 - Manifestações clínicas...14
1.3 - Epidemiologia...16
1.4 - Estudo da encefalite herpética em modelos experimentais...17
1.5 - Resposta imune ao HSV-1...18
1.6 - SOCS2...21
2 - OBJETIVOS DO ESTUDO...24
2.1 - Objetivo geral...24
2.2 - Objetivos específicos...24
3 - METODOLOGIA...25
3.1 - Animais...25
3.2 - Células Vero...25
3.3 - Vírus...26
3.4 - Multiplicação do vírus...26
3.5 - Purificação do vírus...26
3.6 - Titulação por contagem de placas...27
3.7 - Inoculação dos camundongos...27
3.8 - Processamento das amostras cerebrais de camundongo...28
3.9 - Ensaio para detecção dos níveis de Mieloperoxidase (MPO) no tecido cerebral...29
3.10 - Determinação de citocinas e quimiocinas por ELISA...30
3.11 - Processamento de amostras para titulação...30
3.12 - Titulação por TCID50...31
3.13 - Análise de populações celulares por citometria de fluxo (FACS)...31
3.13.1 - Purificação de leucócitos seqüestrados no cérebro...32
3.14 - Técnica histológica...34
3.14.1 - Análise histopatológica...35
3.15 - Análise estatística...36
3.16. - Delineamento experimental...36
4 - RESULTADOS...37
4.1 - Curva de sobrevida...37
4.2 - Titulação viral...39
4.3 - Produção de citocinas e quimiocinas...41
4.4 - Detecção dos níveis de atividade de mieloperoxidase (MPO)...44
4.5 - Análise do perfil celular por citometria de fluxo (FACS)...45
4.6 - Análise histopatológica...48
5 - DISCUSSÃO...51
6 - CONCLUSÃO...57
1 - INTRODUÇÃO
1.1 - O vírus Herpes simplex tipo 1
O vírus Herpes simplex tipo 1 (HSV-1) é membro da família Herpesviridae, composta por mais de 100 integrantes que infectam desde ostras a seres humanos (Shukla & Spear, 2001). Além do HSV-1, existem mais sete Herpesvirus que infectam humanos: herpes simplex tipo 2 (HSV-2), Varicella-Zoster vírus (VZV), Citomegalovirus (CMV), Epstein-Barr vírus (EBV), herpes virus humano tipo 6 (HHV-6), herpes virus humano tipo 7 (HHV-7) e herpes vírus humano tipo 8 (HHV-8) (Baringer, 2008).
A família Herpesviridae é dividida em três subfamílias Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae (Shukla & Spear, 2001). O vírus HSV-1
pertence ao gênero Simplexvirus, dentro da subfamília Alphaherpesvirinae. O vírus em questão se caracteriza por possuir uma grande variedade de hospedeiros, tropismo por neurônios, um curto ciclo de replicação, acelerada disseminação em cultura celular, capacidade de provocar lise e de, em infecções primárias, estabelecer latência (Roizman, 1996).
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Figura 1 – Aspecto ultraestrutural do vírus HSV-1. (Rozenberg et al., 2011)
1.2 - Manifestações clínicas
As infecções pelo vírus HSV-1 acontecem, predominantemente, em crianças e se caracterizam por ocorrer de uma maneira inespecífica e muitas vezes sem aparecimento de sintomas (Gordon, 1990). A transmissão do HSV-1 pode ocorrer através de lesões ou secreções contaminadas. É sabido que o sua multiplicação tem
início em células epiteliais e, em seguida, em neurônios sensoriais locais, sendo capaz de alcançar o sistema nervoso central (SNC) (Weir, 2001). Dados na literatura sugerem que o HSV-1, apesar do seu neurotropismo, também é capaz de estabelecer latência na córnea (Liesegang, 2001).
A infecção primária pelo HSV-1 tem um período de incubação que varia de 1 a 28 dias e sua transmissão também pode ocorrer durante a fase assintomática, inclusive por crianças e adultos sem histórico de herpes labial (Mole et al., 1997).
No mínimo 90% da população mundial é infectada pelo HSV-1 (Perng & Jones, 2009). A infecção por esse vírus pode causar várias doenças, como:
gengivoestomatite, infecção neonatal e congênita, eczema herpeticum, lesões mucocutâneas, oculares, viscerais, herpes genital, meningite e encefalite, especialmente em indivíduos imunocomprometidos (Connolly et al.,2011; Liesegang, 2001; Gesser & Koo, 1997; Löhr et al.,1990).
A manifestação clínica mais séria da infecção por HSV-1 é a encefalite herpética (Baringer, 2008). Dentre as encefalites virais, a causada devido ao vírus em questão representa mais de 85% dos casos esporádicos (Rice, 2005).
A maioria desses casos ocorre por reativação do vírus e a rota mais comum para atingir o SNC é através do nervo olfatório. Os principais locais de latência são os gânglios trigêmeo e os olfatórios (Whitley, 2006). Contudo, a encefalite pode decorrer de primoinfecção em crianças (Schmutzhard, 2001). Quando neonatos são infectados pelo HSV-1 podem ocorrer dois outros padrões de infecção além da encefalite: o primeiro é uma infecção restrita à pele, olhos e boca; e a segunda que é a forma disseminada que envolve fígado, glândula adrenal e pulmão (Kurt-Jones et
al., 2004).
HSV tem uma afinidade particular pelos lobos temporais, o que reflete nos sintomas: crises epilépticas, distúrbios de memória, alterações de personalidade e do comportamento (Rice, 2005). Febre, dores de cabeça e confusão mental desenvolvem-se rapidamente em crianças ou adultos (Baringer, 2008).
A base do tratamento para essa encefalite é o aciclovir, que impede a replicação viral (bem como a celular) através da inibição da DNA polimerase em células infectadas, a qual é ativada apenas em células que contém vírus replicante. A taxa de mortalidade é de 70%, sendo que, com a terapia antiviral, esse valor cai para 30% (Steiner et al.,2007). Esse valor ainda é alto e, quando levado em consideração que 50% dos sobreviventes apresenta seqüelas neurológicas graves (Raschilas et al., 2002) é perceptível a necessidade de um aprofundamento do conhecimento sobre essa infecção a fim de proporcionar uma melhoria na saúde humana, especialmente devido ao fato de a encefalite viral ser responsável pela maioria dos casos.
As seqüelas mais comuns apresentadas por crianças que sobrevivem às
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1.3 - Epidemiologia
O vírus HSV-1 é ubíquo e endêmico em todo o mundo e tem o homem como o único hospedeiro natural (Umene & Sakaoka, 1999). O vírus é prevalente em 80-90% da população mundial, com a maioria das infecções primárias ocorrendo durante a primeira década de vida até os 40 anos de idade dependendo de fatores socioeconômicos e geográficos (Steiner et al.,2007).
Estudos realizados em populações de todas as idades demonstraram que, em 2005, na Síria, HSV-1 foi diagnosticado em 30% de 106 pacientes com encefalite; de 2007 a 2008, um estudo multicêntrico que explorou a etiologia da encefalite em 24 hospitais do Reino Unido tinha como principal agente viral o HSV (44%) e, na França, 42% das encefalites, em um estudo realizado em 2007 com 253 pacientes, eram devido o HSV (Stahl et al.,2011).
Em uma região endêmica de dengue no Brasil, foi realizada uma pesquisa em adultos e adolescentes com diagnóstico de encefalite viral ou meningite. Os dados gerados corroboraram com estudos anteriores ao mostrar que o HSV-1 é a principal causa de encefalite (Soares et al., 2011).
1.4 – Estudo da encefalite herpética em modelos experimentais
Modelos animais são preparações experimentais desenvolvidas em determinada espécie com o propósito de se estudarem fenômenos que ocorrem em outra espécie (Mckinney, 1984).
A importância desses modelos reside na possibilidade de se proporcionar uma melhor compreensão das doenças humanas, servindo como ferramentas para se tentar elucidar, por exemplo, as vias fisiopatológicas envolvidas nas doenças e possibilitando uma identificação de alvos que permitam o desenvolvimento de drogas terapêuticas (Moore, 1999).
Modelos experimentais animais de encefalite herpética por HSV-1 contribuem para nosso entendimento dos eventos que ocorrem no cérebro infectado e são extremamente importantes no contexto atual visto que a resposta imune contra o HSV-1 é bem complexa, seus componentes ainda não são totalmente esclarecidos e dentre as encefalites virais, a causada devido ao vírus em questão, representa mais de 85% dos casos (Rice, 2005).
O camundongo é um modelo útil de infecção do SNC humano por HSV-1 e estudos sobre a replicação e disseminação no SNC de murinos são abundantes. Existem vários modelos de encefalite por HSV-1, entre eles, há os que utilizam o modelo de infecção intranasal (Ashcraft et al., 2008), corneal (Wickham et al., 2005; Dong-Newsom et al., 2010) e através de injeção na musculatura da língua (DeLano & Mallery, 1998). Nesses modelos, o vírus segue uma rota retrógrada de disseminação através dos nervos e aloja-se no gânglio trigeminal ou no bulbo olfatório (Esiri, 1982). A partir desses locais de inoculação, o vírus, eventualmente, pode alcançar o tecido cerebral e causar um quadro de encefalite herpética.
Em alguns modelos experimentais o HSV-1 é inoculado em regiões mucosas periféricas dos animais. No entanto, a linhagem de camundongos C57BL/6 parece apresentar mecanismos inatos que impedem a disseminação do HSV-1 da mucosa nasal para o SNC (Mansur et al., 2005). A utilização do modelo de encefalite herpética induzida por via intracraniana em camundongos C57BL/6 se adequa à
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imune diretamente a partir do SNC, visando excluir a ativação imune na periferia (Vilela et al., 2010).
Os sinais clínicos da encefalite herpética nos camundongos incluem ataxia, perda de peso, postura arqueada, hipolocomoção e/ou ambulação irregular, lesões oculares, piloereção e tremores, além de convulsões e coma nos estágios terminais da doença (Vilela et al., 2010).
Uma vantagem em especial do modelo murino é a possibilidade de utilização de camundongos modificados geneticamente, como o deficiente em Supressor de Sinalização de Citocinas 2 (SOCS2-/-), a fim de estudo imunológicos mais específicos.
1.5 - Resposta imune ao HSV-1
A invasão viral induz várias respostas do hospedeiro que atuam a fim de controlar e eliminar o vírus. Como o surgimento das respostas imunes requer tempo para se desenvolver, o sistema imune inato desempenha um papel central na defesa do hospedeiro contra invasores virais. Essa primeira linha de defesa, a fim de controlar o HSV-1 durante a infecção primária, requer o envolvimento de células como monócitos, macrófagos, células dendríticas e células natural killer (NK) (Mossman & Ashkar, 2005).
Com o decorrer da infecção, mecanismos de defesa mais complexos são elaborados. Eles levam à indução de respostas a antígenos específicos envolvendo a ativação e regulação de células T, que controlam a replicação do vírus por meio da lise de células infectadas e a através da produção de citocinas. As células T podem diferenciar-se em duas subpopulações de linfócitos que são denominadas Th1 e Th2. Células Th1 produzem citocinas como fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interferon- (IFN- ) e interleucina-12 (IL-12), enquanto células Th2 produzem, por exemplo, IL-10. As infecções virais são eliminadas quando o hospedeiro dirige a resposta imune para a proliferação do subtipo Th1 (Mossman & Ashkar, 2005; Biron,
1998).
O IFN- é uma das principais citocinas envolvidas no controle, inibindo a
também, ambos os IFN-α/ são fundamentais no controle do HSV-1 em camundongos C57BL/6 nas primeiras horas de infecção. Esse tempo é suficiente
para controlar a replicação viral mesmo na ausência de células T, B e NK. Além disso, a citocina IFN- , em associação aos IFN-α/ , é um potente regulador da replicação do HSV-1 mesmo na ausência de células imunes (Vollstedt et al., 2004). O sistema IFN é, provavelmente, a mais crítica das defesas inatas do hospedeiro contra a infecção viral, com as funções para inibir a replicação do vírus, proteger células vizinhas de infecções secundárias e estimular o sistema imune através da ativação de células NK, macrófagos e linfócitos (Stark et al.,1998).
Assim, a infecção aguda é controlada, no entanto o vírus permanece em estado de latência nos gânglio do Sistema Nervoso Periférico (SNP), podendo, em determinadas situações, atingir o SNC (Lang & Nikolich, 2005).
A interação entre o vírus do herpes e a resposta imune inata do hospedeiro é complexa. Embora as células do hospedeiro tenham desenvolvido mecanismos para detectar a entrada de partículas de HSV-1 e para induzir respostas imediatas intercelulares antivirais, os herpesvírus desenvolveram estratégias para neutralizar cada passo da resposta do hospedeiro. Assim, o resultado de uma infecção por HSV-1 não depende apenas da intensidade da resposta imune do hospedeiro, mas também da capacidade do vírus em neutralizá-la (Mossman & Ashkar, 2005).
Citocinas quimiotáticas, ou quimiocinas, desempenham um papel importante no desenvolvimento de resistência imunológica à replicação do HSV-1, atuando como uma ponte entre o reconhecimento imunológico inato e adaptativo do patógeno e na subseqüente mobilização de leucócitos (Wuest & Carr, 2009).
As quimiocinas constituem uma classe de citocinas, proteínas secretadas por células da imunidade natural e adquirida as quais medeiam muitas das funções desempenhadas por tais células, (Abbas et al., 2008; Ransohoff, 2002), que apresentam propriedades quimioatraentes, ou seja, induzem células com receptores apropriados a migrarem no sentido de um gradiente químico. Elas são produzidas por uma diversidade de células, como linfócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e células endoteliais. A classificação das quimiocinas é baseada no número e na disposição de resíduos de cisteína conservados na cadeia N-terminal. Dessa forma, as famílias foram agrupadas em C, CC, CXC e CX3C e seus respectivos receptores
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Entre os mediadores inflamatórios relacionados com a ativação de neutrófilos e indução do seu recrutamento in vivo, muito interesse tem sido colocado sobre o
papel das quimiocinas CXC. Membros da família de quimiocinas CXC, como KC/CXCL1, tem 4 cisteínas invariantes. As duas primeiras delas são separadas por outro aminoácido (X) (Baggiolini et al.,1995). A família de quimiocinas mais numerosa e diversa é a CC e inclui membros como MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5. Membros desse grupo têm a capacidade de atrair e ativar monócitos, linfócitos T, basófilos e eosinófilos (Ono et al., 2003).
Nosso grupo de pesquisa demonstrou que a citocina quimiotática CCL5 possui papel relevante no recrutamento de leucócitos até o cérebro do animal infectado por HSV-1(Vilela et al.,2009). O recrutamento de células NK para o local da inflamação, necessário para o controle da infecção pelo vírus em questão, é realizado através da ação das quimiocinas CCL3 e CCL5 (Carr et al.,2006; Taub et
al.,1995). Além disso, também é necessário ressaltar que a citocina CCL5 tem papel
relevante no recrutamento de células T ao SNC (Balashov et al.,1999).
Além da quimiocina CCL5, foi relatada a produção de diversas outras quimiocinas no gânglio trigêmeo após a infecção pelo vírus em questão estudado. Entre essas quimiocinas estão MCP-1/CCL2 e MIP-1α/CCL3 (Lima et al.,2010; Wuest, 2008).
1.6 - SOCS2
SOCS, do inglês, “Suppressors of Cytokine Signaling”, compreendem um grupo de proteínas identificadas em 1997 por diferentes grupos de pesquisa (Starr et
al.,1997, Naka et al.,1997, Endo et al.,1997, Minamoto et al.,1997)
A família de proteínas SOCS consiste em 8 membros identificados (SOCS-1 a SOCS-7 e CIS) (Yoshimura et al.,2007) (Figura 2). Todas essas proteínas são caracterizadas por possuírem um domínio central SH2, um domínio C-terminal conservado denominado SOCS Box e um domínio N-terminal de variados comprimentos e composições. Além disso, uma pequena região inibidora de cinase é encontrada no domínio N-terminal do SOCS-1 e SOCS-3 (Yoshimura et al.,2007, Fugimoto & Naka, 2003).
Figura 2 – Família SOCS (Adaptado, Rico-Bautista et al., 2006)
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Embora hoje a sua maior importância seja considerada na regulação da via JAK/STAT, essas proteínas são induzidas por e regulam negativamente mais do que
apenas citocinas, sugerindo um papel como moduladores de sinal mais amplo do que o implicado pelos seus nomes (Larsen & Röpke, 2002).
Essas proteínas são induzidas em resposta a uma vasta gama de citocinas, fatores de crescimento e hormônios (Piessevaux et al.,2008). Além disso, podem não apenas inibir, mas também, modificar a resposta de citocinas (Croker et
al.,2003, Lang et al.,2003, Yasukawa et al.,2003).
SOCS2, nosso objeto de estudo, é uma proteína que tem sido principalmente ligada à sinalização do hormônio de crescimento (GH) e ao fator de crescimento insulina-símile-1 (IGF-1) devido ao fenótipo observado em camundongos sem SOCS2. Camundongos deficientes para SOCS2 (SOCS2-/-) são caracterizados por um aumento de 30-40% do peso corporal, com o aumento dos órgãos viscerais (Metcalf et al.,2000). Vários relatos indicam que SOCS2 não só regula a sinalização do receptor de GH (Rico-Bautista et al.,2005, Greenhalgh et al.,2002, Greenhalgh et
al.,2005), mas também possui ações importantes na regulação do metabolismo
(Rico-Bautista et al.,2006), na resposta imune, na resposta à infecção (Machado et
al.,2006), no desenvolvimento de glândulas mamárias (Harris et al.,2006), no câncer
(Wikman et al.,2002, Sutherland et al.,2004, Hendriksen et al.,2006) na regulação de outras vias dependentes de citocinas e no desenvolvimento do SNC (Polizzotto et al., 2000; Ransome and Turnley, 2005).
O papel dessa proteína tem sido estudado em diferentes doenças de origem não infecciosa e infecciosa. Sabe-se que SOCS2 está envolvido nas reações gliais e na neurogênese hipocampal de ratos submetidos à isquemia cerebral (Choi et al., 2009). Além disso, SOCS2 parece estar envolvido na regulação da resposta imune após a infecção in vivo por Toxoplasma gondii. Nesse modelo, a proteína e mRNA SOCS2 foram induzidos pela Lipoxina A4, um mediador eicosanóide com potentes propriedades anti-inflamatórias, através da ativação de dois receptores (AhR e LXAR) em células dendríticas (Machado et al.,2006).
Sobre o papel de SOCS2 no SNC, estudos têm demonstrado sua função no desenvolvimento, crescimento e diferenciação neural. Expressões elevadas do gene SOCS2 são observadas em neurônios do SNC em desenvolvimento e desenvolvido
sistema nervoso entre o 10º dia embrionário e 8º dia pós-natal, sendo máxima a sua expressão no dia 14º dia embrionário, que coincide com o pico de geração neuronal
(Polizzotto et al.,2000). Corroborando essas informações, é observado que cérebros de camundongos deficientes para SOCS2 possuem uma menor quantidade de neurônios e maior quantidade de células da glia (Turnley et al., 2002).
Pesquisas recentes sugerem que o HSV-1 pode exercer um efeito anti IFN-α e INF- pela ativação da proteína SOCS-3, regulando a atividade anti-viral (Yokota
et al., 2004). Fato semelhante foi observado em relação à SOCS-1, em que foi
desenvolvido um peptídeo antagonista dessa proteína (pJAK2). O antagonista compete com JAK2 por SOCS-1 e bloqueia a inibição de IFN- , que era feita por SOCS-1. Assim, pJAK2 juntamente com IFN- apresentam um forte estado anti-viral contra o HSV-1 (Frey et al., 2009)
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2 - OBJETIVOS DO ESTUDO
2.1 – Objetivo geral
Estudar o papel de SOCS2 na infecção experimental pelo HSV-1, comparando camundongos selvagens e deficientes para SOCS2 (SOCS2-/-).
2.2 – Objetivos específicos
x Avaliar a sobrevida de animais C57BL/6 selvagens e SOCS2-/- infectados com
102 u.f.p do vírus HSV-1.
x Analisar a quantificação viral, no tecido cerebral de camundongos C57BL/6 selvagens e SOCS2-/- infectados com 102 u.f.p do vírus HSV-1, através da técnica de titulação
x Estudar parâmetros inflamatórios no tecido cerebral de camundongos C57BL/6 selvagens e SOCS2-/- através de MPO (recrutamento de neutrófilos), ELISA (citocinas e quimiocinas) e citometria de fluxo (perfil leucocitário).
3 - METODOLOGIA
3.1 - Animais
Para o desenvolvimento deste trabalho, foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6 selvagens, do inglês “wild-type”, (WT), com idade entre oito e nove semanas, obtidos do Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (CEBIO-ICB-UFMG) e camundongos geneticamente deficientes para SOCS2 (SOCS2-/-) que foram generosamente cedidos pela professora Fabiana Simão Machado, do Departamento de Bioquímica e Imunologia, do Instituto de Ciências Biológicas (ICB/UFMG).
Os animais foram mantidos sob condições controladas de temperatura (24ºC) e luminosidade (ciclo claro/escuro de 12 horas) com livre acesso a ração e a água. Todos os procedimentos experimentais foram avaliados e aprovados pelo Comitê de Ética da UFMG, protocolo nº 252/2010.
3.2 - Células Vero
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3.3 - Vírus
Foi utilizada a amostra HSV-1 EK (Nogueira, 1998), denominada neste trabalho HSV-1. Esta amostra é um isolado clínico de HSV-1, proveniente de herpes labial em adulto saudável, que foi isolada em células de rim de macaco verde africano (células VERO - ATCC).
3.4 - Multiplicação do vírus
Células Vero foram infectadas com a multiplicidade de infecção (m.o.i.) de 1 da amostra semente e, 24h depois, quando o efeito citopático atingiu de 75 a 100% das células, o sobrenadante foi coletado sob refrigeração.
3.5 - Purificação do vírus
A purificação foi feita utilizando-se o protocolo adaptado de Mansur (2007). O sobrenadante foi precipitado com uma solução saturada de sulfato de amônio em banho de gelo, com o auxílio de um gotejador, até atingir 60% do volume final. A solução foi centrifugada a 8000 rpm (rotor GS-3, centrífuga RC-5B-Sorvall) por 30 minutos a 4ºC. O precipitado foi homogeneizado em 10 mL de Tris 10mM, pH 8,0.
Foi então preparado um colchão de sacarose 36% em tubo de ultra-centrífuga, com 10 mL da solução de sacarose 36% e acrescido de 26 mL da suspensão final. A amostra foi centrifugada a 14000 rpm, por 2 horas, a 4ºC na ultra-centrífuga Sorvall, rotor AH-629. O sedimento foi homogeneizado em 1,0 mL de TRIS 10 mM e submetido a uma nova centrifugação em colchão de sacarose semelhante à anterior. O sedimento foi coletado e transferido para outro tudo de ultra-centrífuga completando o volume para 36 mL com TRIS 10 mM, pH 8,0 e então
AH629. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento homogeneizado em 300 Pl de TRIS 10 mM, pH 8,0. A amostra foi aliquotada e posteriormente titulada.
3.6 - Titulação por contagem de placas
Para a titulação do vírus purificado, 2x106 células Vero foram implantadas por poço em placas de seis poços, em meio MEM com 1% soro fetal bovino (SFB), 24 horas antes da infecção. Diluições seriadas do vírus em base exponencial de 10 foram adsorvidas por uma hora em diferentes poços contendo as células, sob homogeneização de quinze em quinze minutos, e então foram adicionados 3 mL de MEM contendo 1,5% de Carboxi-metil-celulose (CMC) (GIBCO BRL, EUA). Após 72 horas a monocamada foi fixada com formalina a 10% em tampão fosfato de sódio (PBS) e corada com cristal violeta. O número de placas foi contado na diluição que apresentou entre 30 e 300 placas de lise. O título foi expresso em unidades formadoras de placa por mililitro (u.f.p./mL). A amostra utilizada nos experimentos possuía título de 2,0 x 109 u.f.p/mL.
3.7 - Inoculação dos camundongos
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Figura 3 – Inoculação intracraniana
3.8 - Processamento das amostras cerebrais de camundongo
O tecido cerebral dos animais C57BL/6 e SOCS2-/- infectados com o vírus HSV-1 e controle foram retirados. Esses tecidos foram, então, devidamente acondicionados e estocados a -20ºC até sua utilização. Cada amostra foi então pesada (100 mg) e colocadas em 1,0 mL de solução inibidora de proteases para extração de citocinas (NaCl 0,4 M; Fluoreto de Fenilmetilsufonila 0,1 mM; Cloreto de Benzetonio 0,1 mM; EDTA 10 mM; Tween 20 0,05%; Albumina de Soro Bovino - BSA - 0,5%; 20 UI de Aprotinina), preparada a partir de uma solução de tampão
etapa, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi submetido a lise hipotônica através da adição de 1,5 mL de solução de NaCl 0,2%, seguida, após 30 segundos,
de adição de igual volume de solução contendo NaCl 1,6% e glicose 5%. O conteúdo foi homogeneizado e as amostras foram centrifugadas a uma velocidade de 10.000 rpm, a 4ºC, por 15 minutos. O sobrenadante foi, posteriormente, descartado. Para o ensaio de MPO, as amostras foram ressuspensas em 1,5 mL de tampão fosfato (Na3PO4 0,05M; Brometo de Hexadeciltrimetilamonio - HTAB - 0,5%; pH 5,4), homogeneizadas e submetidas a três ciclos de congelamento/descongelamento utilizando-se nitrogênio liquido. Essas amostras foram, então, centrifugadas a 10.000 rpm, a 4ºC, por 15 minutos e o sobrenadante utilizado para o ensaio.
3.9 - Ensaio para detecção dos níveis de Mieloperoxidase (MPO) no tecido cerebral
Para avaliar a atividade dos neutrófilos no tecido cerebral foi utilizado o método de quantificação da atividade de mieloperoxidase como descrito previamente (Souza et al.,2002). Para isso, foram adicionados 25 μL de
sobrenadante das amostras de tecidos previamente processadas e 25 μL de uma
solução de 3,3’-5,5’- tetrametilbenzidina (TMB, Sigma) dissolvida em dimetilsulfóxido
(DMSO, Merck), com concentração final de 1,6 mM, a uma placa de 96 poços, que foi, então, incubada a 37 ºC, por 5 minutos. Após essa etapa, adicionaram-se 100μL de H2O2 diluída em tampão fosfato (Na3PO4 0,05 M; HTAB 0,5%; pH 5,4) numa concentração final de 0,003% v/v, e a placa foi novamente incubada a 37ºC por 5 minutos. Ao final dessa etapa, adicionaram-se 100 μL de H2SO4 4M para interromper a reação. As placas foram lidas em leitor de ELISA (Molecular Devices, Spectra Mac 190) a 450 nm.
O conteúdo de neutrófilos foi calculado com base na curva-padrão de MPO feita pela coleta de neutrófilos peritoneais recolhidos de animais estimulados com 3
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3.10 - Determinação de citocinas e quimiocinas por ELISA
Os kits para ELISA de camundongo para TNF-α, IFN- , IL-10, IL-12, KC/CXCL1, MCP-1/CCL2, MIP1-α/CCL3 e RANTES/CCL5 foram obtidos da R&D Systems (DuoSet), e utilizados de acordo com os procedimentos previamente descritos pelo manufaturador. As concentrações das citocinas e quimiocinas foram avaliadas no tecido cerebral processado em diluição 1:3 em solução PBS:BSA 1% e foram expressos por pg/100mg de tecido ou ng/100mg de tecido.
Em uma placa de 96 poços foram adicionados 100μL de uma solução
contendo concentração adequada do anticorpo de captura específico. Essa solução permaneceu em contato com a placa durante 18h a 4ºC e posteriormente foi lavada 5 vezes com PBS/Tween 0,1% em um lavador de placas automático. Logo após,
foram adicionados 200μL de solução de bloqueio contendo 1% de albumina de soro
bovino em PBS. O tempo de bloqueio foi de 2h. Foram adicionados os padrões de citocinas em concentração conhecida e as amostras. As placas foram incubadas por
mais 18h a 4ºC e, a seguir, foram lavadas. Foram adicionados 100μL de uma
solução de anticorpo de detecção que foi incubada por 1h. Transcorrido esse período e após lavagem, foi adicionada à placa uma solução contendo estreptovidina ligada à peroxidase (Pharmingen). Após 30min, a placa foi novamente lavada e depois foi adicionado o tampão substrato contendo o-fenilenodiamina (OPD, Sigma) e H2O2 (Merck). A reação foi parada com ácido sulfúrico 1M. O produto de oxidação do OPD foi detectado por colorimetria no espectofotômetro (Molecular Devices. Versamax tunable microplate reader) no comprimento de onda de 492nm.
3.11 - Processamento de amostras para titulação
Aproximadamente um quarto de cérebro dos animais foi macerado com
tubos para a titulação por TCID50. Os sobrenadantes foram imediatamente utilizados para a titulação, e em seguida armazenados em freezer -70 °C.
3.12 - Titulação por TCID50
Para a titulação do HSV-1 nos cérebros dos camundongos, células VERO foram implantadas em placas de 96 poços, na concentração de 6x104 células por poço, com MEM (Cultilab, São Paulo) contendo 5% de SFB (Cultilab, São Paulo).
Após 24 horas, o meio das células foi retirado, e foram acrescentados 100 PL
das diluições das amostras processadas (diluições 10-1 até 10-5), feitas em MEM (Cultilab, São Paulo) contendo 1% SFB (Cultilab, São Paulo) em banho de gelo. À coluna da placa correspondente ao controle de células foram acrescentados 100PL
de MEM (Cultilab, São Paulo) com 1% de SFB (Cultilab, São Paulo) em substituição às diluições dos vírus. As placas foram incubadas em atmosfera de 5% de CO2, a
37 °C. A leitura das placas foi feita a cada 24 horas durante 5 dias. O título viral foi calculado pelo método de REED & MUENCH (Lennette et al.,1979) após a leitura final.
3.13 - Análise de populações celulares por citometria de fluxo (FACS)
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3.13.1 - Purificação de leucócitos seqüestrados no cérebro
O cérebro foi removido e os leucócitos aderidos isolados, seguindo protocolos descritos anteriormente (Deb & Howe, 2009; Fauconnier et al., 2011), com pequenas modificações. O tecido cerebral foi removido e triturado em meio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (Life Technologies, Paisley, U.K.) contendo 5% de soro fetal bovino (SFB), utilizando um macerador de vidro. Devido a pequena quantidade de leucócitos recuperados no tecido cerebral, cada amostra corresponde a um pool de 2-3 cérebros. O homogenato de tecido cerebral foi filtrado em peneiras
estéreis de 70μm (Cell strainer – Becton Dickinson, Brasil) e centrifugado a 1.700
rpm a 4ºC por 10 minutos. O pellet celular foi ressuspenso em 5mL de Percoll 35%(Sigma –Aldrich) e depositado cuidadosamente em 5mL de Percoll 70%. Após centrifugação (3.400 rpm, a 22ºC por 20 minutos), e conseqüente retirada da mielina, os leucócitos foram coletados na interface entre os gradientes de Percoll. Após lavagem em meio de RPMI 1640, os leucócitos foram ressuspendidos em solução tampão (PBS contendo 1% de SFB e 0,01% de NaN3) e contados em câmara de Neubauer para estimar o número de leucócitos presentes na suspensão celular.
3.13.2 - Imunomarcação e análise
Após contagem em câmara de Neubauer, as células foram adicionadas em placa de 96 poços, com fundo em U e incubadas por 30 minutos com anticorpo específico diluído. Os leucócitos foram marcados com moléculas de expressão extracelular, utilizando-se anticorpos monoclonais. Para os leucócitos presentes no tecido cerebral, foi realizada uma combinação de anticorpos (como descrito na Tabela 1) para análise das seguintes populações celulares: neutrófilos, macrófagos e células T CD4+ e CD8+. Foram utilizadas as seguintes marcações para a análise
30-F11) e F4/80 conjugado a ficoeritrina (PE) (eBioscience; clone BM8) e de linfócitos T: CD3 conjugado a ficoeritrina-cianina 5 (PE-Cy5) (BD Pharmingen San
Diego, CA; clone 17A2), CD8 conjugado a ficoeritrina (PE) (BioLegend; clone 53-6.7) e CD4 conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) (BD Pharmingen San Diego, CA; clone L3T4).
Tabela 1- Marcações utilizadas para a análise de linfócitos T CD4+ e CD8+, macrófagos e neutrófilos no tecido cerebral por citometria de fluxo.
Populações analisadas
Anticorpos
Mix 1 Linfócitos T CD4+ CD4: FITC (BD Pharmingen San Diego, CA; clone L3T4)
CD3: PE-Cy5 (BD Pharmingen San Diego, CA; clone 17A2)
Linfócitos T CD8+ CD8: PE (BioLegend; clone 53-6.7)
CD3: PE-Cy5 (BD Pharmingen San Diego, CA; clone 17A2)
Mix 2 Neutrófilos Ly6G: FITC (eBioscience; clone RB6-8C5) CD45: PE-Cy 5 (eBioscience; clone 30-F11)
Macrófagos F4/80: PE (eBioscience; clone BM8)
CD45: PE-Cy 5 (eBioscience; clone 30-F11)
Após a marcação, as células foram lavadas para a remoção de anticorpos não ligados e, posteriormente, foram ressuspensas em PBS e fixadas em solução PBS/Azida 0.1% e paraformaldeído 4%. As células marcadas foram adquiridas no citômetro FACScan (Becton Dickinson, San José, CA, USA) e o perfil celular da amostra foi avaliado com relação ao tamanho (forward light scatter) e granulosidade (side lighter scatter) das células. Após a seleção da população de interesse, 10.000 células foram analisadas em cada cérebro.
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marcadores foram analisados baseando-se nas populações negativas e nos isotipos controles. Os leucócitos presentes no tecido cerebral foram expressos em número
de células por órgão, ajustando-se a porcentagem da população de interesse obtida do total de eventos adquiridos pela contagem de células em câmara de Neubauer.
A população de linfócitos no tecido cerebral foi delimitada com relação ao tamanho e a granulosidade das células. Para a população de linfócitos, células positivas para o marcador CD3 foram selecionadas através do histograma e, posteriormente, a população de células CD4+ CD8- e CD4- CD8+, do total de eventos adquiridos, foram ajustadas com a contagem de leucócitos na câmara de Neubauer e expressos como número de células CD4+ ou CD8+ presentes por cérebro (Amaral
et al.,2011).
Os macrófagos no cérebro foram selecionados de acordo com Mack et al (2003), utilizando a população de células CD45hi e F4/80+. Já para os neutrófilos, foram usados os marcadores CD45+ e Ly6G+. O total de eventos adquiridos foi ajustado pela contagem de leucócitos na câmara de Neubauer e expresso como número de neutrófilos ou macrófagos presentes por cérebro (Stevens et al.,2002)
3.14 - Técnica histológica
A fim de analisar as alterações provocadas pela infecção do vírus HSV-1 no SNC, foram realizados cortes histológicos nos encéfalos dos animais no terceiro dia pós-infecção. O hemisfério direito dos encéfalos foram coletados e incluídos em solução de formalina 10% tamponada. Todos os fragmentos foram submetidos à desidratação com a finalidade de remover a água presente nos mesmos. O processo de desidratação foi realizado em concentrações crescentes de álcool (alcoóis 70%, 80%, 95% e absolutos I, II e III), sendo que os fragmentos permaneceram imersos por um período de 30 minutos em cada álcool. Após a etapa de desidratação, foi realizado o processo de diafanização, que tem como objetivo tornar o tecido translúcido. A diafanização consistiu em submeter os fragmentos a dois banhos de xilol com duração de 20 minutos cada.
contendo os fragmentos do cérebro, foram submetidos à microtomia, sendo obtidos
cortes seriados com 4 μm de espessura. Cada corte foi colocado em banho-maria a
40-45ºC para que as fitas fossem esticadas e logo depois as lâminas foram colocadas em estufa para secarem à temperatura de 60ºC.
A coloração de rotina com Hematoxilina e Eosina (HE) foi realizada nas lâminas com cortes do tecido cerebral para uma observação geral das alterações histopatológicas.
O processo de coloração se iniciou com a imersão das lâminas em dois banhos de xilol, de duração de 15 minutos cada, para desparafinização. Em seguida, para hidratação, essas lâminas foram imersas em banhos de álcool absoluto, álcool 90%, álcool 80%, álcool 70%, e água, durando, cada um dos banhos, 5 minutos.
Apos a hidratação, as lâminas foram imersas no corante Hematoxilina (corante ácido) por 20 segundos, em seguida lavadas em água corrente por 5 minutos. A seguir foi feita a diferenciação com a passagem rápida das lâminas em álcool-acidulado. Novamente as lâminas foram lavadas em água corrente por 5 minutos. Finalizada esta etapa, as lâminas foram imersas no corante Eosina (corante básico), por 30 segundos, e em seguida lavadas em água corrente rapidamente, submetendo-se à nova desidratação por rápidas imersões em alcoóis 70%, 80%, 95% e absolutos I, II e III. Em seguida, as lâminas foram imersas em três banhos seqüenciais de xilol para diafanização e montadas com Entellan (Merck) e lamínula.
3.14.1 - Análise histopatológica
A análise histopatológica foi realizada no tecido cerebral de acordo com Amaral e colaboradores (2011). Cada área do encéfalo foi graduada em uma escala de 0 a 4 em que: 0 = sem patologia, 1 = destruição mínima tecidual e/ou inflamação leve/gliose; 2 = destruição tecidual leve e/ou inflamação moderada/gliose; 3 = destruição tecidual definida (perda neuronal, dano parenquimal) e inflamação intensa; 4 = necrose (perda total de todos os elementos do tecido associados com
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camadas celulares de inflamação; 3 = três camadas celulares de inflamação; 4 = quatro ou mais camadas celulares de inflamação. A densidade de neurônios
necróticos ou apoptóticos foi avaliada como não detectável (nenhum dano celular: 0); mínima (<10% de todas as células: 1), moderada (10-30% de todas as células: 2) e numerosa (> 30 % de todas as células: 3).
3.15 - Análise estatística
Os dados foram apresentados com média ± erro padrão da média (EPM). A análise da diferença entre dois ou mais grupos foi realizada, respectivamente, pelo teste t-Student e ANOVA seguida do pós-teste Student-Newman-Keuls. Para a curva de sobrevida, foi utilizado o teste estatistico Kaplan-Meier. A significância estatística foi estabelecida em P<0,05.
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