RESSALVA
Atendendo solicitação da autora, o texto
completo desta tese será
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
E
STUDO CITOGENÉTICO EM ARANHAS
(M
YGALOMORPHAE E
A
RANEOMORPHAE
)
COM ÊNFASE
NA EVOLUÇÃO DOS GENES DE
DNA
RIBOSSÔMICO
TATIANA GIMENEZ-PINHEIRO
Tese apresentada ao Instituto de Biociências, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Rio Claro, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular)
Rio Claro, São Paulo, Brasil Outubro de 2015
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
E
STUDO CITOGENÉTICO EM ARANHAS
(M
YGALOMORPHAE E
A
RANEOMORPHAE
)
COM ÊNFASE
NA EVOLUÇÃO DOS GENES DE
DNA
RIBOSSÔMICO
TATIANA GIMENEZ-PINHEIRO
Orientadora: Profa. Dra. Marielle Cristina Schneider
Tese apresentada ao Instituto de Biociências, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Rio Claro, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular)
Rio Claro, São Paulo, Brasil Outubro de 2015
Gimenez-Pinheiro, Tatiana
Estudo citogenético em aranhas (Mygalomorphae e Araneomorphae) com ênfase na evolução dos genes de DNA ribossômico / Tatiana Gimenez-Pinheiro. - Rio Claro, 2015 102 f. : il., figs., tabs.
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro
Orientador: Marielle Cristina Schneider
1. Aracnídeo. 2. Araneae. 3. Cariótipo. 4. Hibridação in situ fluorescente. 5. Região organizadora de nucléolo. 6. Sistema cromossômico sexual. I. Título.
595.44 G491e
AGRADECIMENTOS
Tentarei aqui agradecer a todos que de alguma forma participaram direta ou indiretamente dessa etapa da minha vida. Tenho certeza que palavras irão faltar para expressar todo meu agradecimento. Assim, agradeço de forma muito especial:
À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, campus de Rio Claro (SP), por oferecer a sede e estrutura do Departamento de Biologia para a realização deste trabalho.
À Universidade Federal de São Paulo, campus de Diadema (SP), por ceder as instalações e equipamentos do Laboratório de Genética Evolutiva, para a realização da parte prática dessa pesquisa.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Biologia Celular e Molecular, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, campus Rio Claro (SP).
À Universidade Estadual do Piauí, pelas liberações das minhas atividades institucionais para a realização dessa pesquisa.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (2011/19873-9) pelo apoio financeiro cedido para o desenvolvimento do projeto.
À Professora Dra. Marielle Cristina Schneider, minha orientadora, exemplo de profissional e ser humano, pela oportunidade de aprendizado a cada conversa realizada, por toda atenção e dedicação durante o período deste trabalho, apoio, incentivo e amizade durante esses quatro anos. Já te disse uma vez e irei repetir aqui, você sempre será uma inspiração de como devo realizar meu trabalho.
À Professora Dra. Kátia Cristina M. Pellegrino, pelo incentivo, apoio e momentos de descontração no Laboratório de Genética Evolutiva.
A todos os Professores do Curso de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, pelo aprendizado e oportunidades.
Aos funcionários da Seção Técnica de Pós-Graduação do Instituto de Biociências, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, campus Rio Claro (SP), em especial a Felipe M. Guimarães, pelos serviços prestados durante todo o curso, principalmente na finalização do trabalho.
que passamos juntos, boa convivência, conversas e risadas. Vocês foram muito importantes nesta minha jornada.
Às meninas e meninos do Laboratório de Genética Evolutiva e “agregados”, da Universidade Federal de São Paulo, campus Diadema, em especial à Viviane Fagundes de Mattos, Amália Torrezan Lopes, Crislaine Vanessa Ubinski, Juliana Figueiredo de Lima, Renata Clicia do Santos Costa, Juliete Oliveira Costa, Daniela Maggio, Marcel F. Neves e André Robson Justino, pelo companheirismo, conversas instrutivas, cafés da manhã/tarde, risadas durante todo o dia, trocas de experiências e pela amizade que vou levar para sempre. Vocês fizeram parte dos momentos felizes e angustiantes que passei, com tudo isso tod@s foram muito importantes nesta minha caminhada.
Às meninas da república, Caroline Fernanda de Paula, Tamires Barros Silva, Lídia Durço Coelho, Larissa Silva e Amália Torrezan Lopes, que me deram abrigo todas as vezes que precisei estar em Diadema, pelo carinho, amizade, alegrias e companheirismo nos dias frios dessa cidade.
À amiga Antônia Leidna Silva Brito, por todo o apoio, incentivo e companheirismo. Você foi muito importante para que tudo isso se concretizasse, sem você meus “filhotes” estariam perdidos.
Aos colegas de trabalho, da Universidade Estadual do Piauí, campus Heróis do Jenipapo, em especial aos Professores Rebeca Hennemann Vergara Souza, Ana Gabriela Nunes Fernandes, Hermeson Cassiano de Oliveira e Lucas Ramos Costa Lima, pelo apoio e incentivo a cada vez que eu me desestimulava, pelo companheirismo, boas conversas, vários almoços no laboratório. Sem vocês não conseguiria levar tudo isso até o final.
À amiga e irmã de coração Juliana do Nascimento Bendini, pela confiança, apoio, incentivo, amizade, alegrias e boas conversas. Você faz parte dessa conquista.
Aos meus pais, Neide Gimenez Pinheiro e Modesto Nunes Pinheiro, por todo o amor, exemplo, apoio e confiança. Sem a força de vocês não conseguiria trilhar esse caminho. Amo vocês mais que tudo nessa vida!!!!
À minha irmã Tamaris Gimenez Pinheiro, cunhado Edson Lourenço da Silva e meu querido sobrinho Samuel Lourenço Gimenez Pinheiro, por todo amor, apoio, confiança, trocas de experiências na área de Biologia e Ensino. Vocês são exemplos de profissionais e ser humano, tenho certeza que com o apoio de vocês consegui finalizar mais essa etapa. Amo vocês mais que tudo nessa vida!!!!
Ao meu irmão Wladimir Nunes Pinheiro e sobrinha querida Ana Carolina Dieter Nunes, pelo carinho, incentivo, apoio em tudo o que sempre precisei. Vocês fazem parte desta conquista. Amo vocês mais que tudo nessa vida!!!!
A Dona Aranha subiu pela parede Veio a chuva forte e a derrubou Já passou a chuva
O sol já vai surgindo
E a dona aranha continua a subir
Ela é teimosa e desobediente
Sobe, sobe, sobe e nunca está contente.
A Dona Aranha desceu pela parede Veio a chuva forte e a derrubou Já passou a chuva
O sol já vai surgindo
E a dona aranha continua a descer
Ela é teimosa e desobediente
Desce, desce, desce e nunca está contente.
(Cultura Popular)
“Mesmo quando tudo parece desabar, cabe a mim decidir entre rir e chorar, ir ou ficar, desistir ou lutar; porque descobri, no caminho incerto da vida, que o mais importante é o decidir”
RESUMO
Na ordem Araneae existem 45.741 espécies de aranhas descritas taxonomicamente, as quais estão distribuídas em duas subordens, Mesothelae e Opisthothelae, 114 famílias e 3.965 gêneros. Considerando o número de espécies de aranhas descritas taxonomicamente, as informações citogenéticas são muito escassas, pois menos de 2% dos representantes foram caracterizados até o momento. Dentre as 114 famílias de aranhas, 45 não possuem sequer uma espécie examinada citogeneticamente. Nas aranhas, o número diploide varia de 2nƃ=7 a 2nƃ=128, com sistema cromossômico sexual simples, como X0 e XY, ou múltiplo, como o X1X20, X1-X130, X1X2Y e
X1-X7Y, e cromossomos com morfologia meta/submetacêntrica ou subtelo/telocêntrica. Em
relação a regiões cromossômicas específicas, como as regiões organizadoras de nucléolo (RONs), somente cerca de 50 espécies de aranhas foram caracterizadas, principalmente através de impregnação pelo íon prata. Nas Mygalomorphae e Araneomorphae, as RONs estão localizadas predominantemente sobre a região terminal de um a três pares autossômicos. Porém, em algumas espécies foram observadas RONs sobre o cromossomo sexual X. Considerando as particularidades cromossômicas encontradas em Araneae e a escassez de informações citogenéticas, especialmente de regiões específicas como as RONs, este trabalho tem como objetivo estabelecer os mecanismos de evolução cromossômica em espécies de aranhas pertencentes a diferentes famílias de Mygalomorphae e Araneomorphae, levando-se em conta as características cariotípicas básicas e o padrão de distribuição das RONs. As análises cromossômicas foram realizadas através de coloração convencional, impregnação pelo nitrato de prata (Ag-RON) para identificar as RONs ativas e hibridização in situ fluorescente (FISH) para localizar os genes de rDNA 18S. As 17 espécies examinadas neste trabalho pertencem a três famílias de Haplogynae, cinco de Entelegynae (Araneomorphae), e três famílias de Mygalomorphae. Metáfases mitóticas de Sicarius cariri e Sicarius ornatus exibiram 2nƃ=16+X1X2Y e em Sicarius tropicus 2nƃ=18+XY, com Ag-RONs na região terminal do par
1. Em S. ornatus e S. tropicus, os resultados obtidos com FISH foram semelhantes a Ag-RON, no entanto em S. cariri, os sítios ribossomais foram localizados na região terminal do cromossomo sexual X1. A descrição de um sistema cromossômico sexual simples para Sicariidae
preenche uma lacuna na hipótese sobre a evolução cromossômica em aranhas Haplogynae, ajudando a entender como o sistema de cromossomos sexuais XY evoluiu a partir do sistema X1X2Y. O número diploide das outras Araneomorphae aqui estudadas variou de 2nƃ=15 a
2nƃ=33 e o sistema cromossômico sexual mais comum encontrado foi X1X20. Com relação ao
gene ribossomal, foi observada diferença nas outras três espécies do grupo Haplogynae, com marcação em um único par de cromossomos autossômicos em regiões distintas, como na região intersticial em Physocyclus globosus e terminal em Loxosceles amazonica, e marcação em dois pares autossômicos em Scytodes eleonorae. Em Entelegynae, as RONs estão presentes em um par de cromossomos autossômicos para todas as sete espécies estudadas. Podemos observar que RONs em cromossomos autossômicos é o padrão predominante em Araneomorphae, independentemente do tipo de sistema cromossômico sexual, e está presente em diferentes famílias deste clado. Entre as espécies de Mygalomorphae, Diplura sp. exibiu o maior número diploide, variando de 2nƃ=78-94. Idiops sp. e Acanthoscurria natalensis apresentaram 2nƃ =51-57 e 2nƃ=41-49, respectivamente, e Oligoxystre caatinga mostrou 2nƃ=22. Apesar dessa grande diferença de número cromossômico, nas quatro espécies os genes de rDNA 18S apareceram localizados apenas em um par de cromossomos autossômicos.
ABSTRACT
The order Araneae possesses 45,741 taxonomically described species, which are distributed in two suborders, Mesothelae and Opisthothelae, 114 families and 3,965 genera. The cytogenetic data in this order are scarce, considering that less than 2% of the species were studied up to now. Among the 114 families of Araneae, in 45 there are no species cytogenetically examined. In the spiders, the diploid number ranged from 2nƃ=7 to 2nƃ=128, with sex chromosome system of the simple (X0 and XY) or multiple (X1X20, X1-X130, X1X2Y e X1-X7Y) types, and chromosomes
with meta/submetacentric or subtelo/telocentric morphology. In relation to specific chromosome sites, such as the nucleolar organizer regions (NOR), only 30 species were investigated mainly through silver impregnation. In Mygalomorphae and Araneomorphae, the NORs were predominantly located in the terminal region from one to three autosomal pairs. However, in some species, the NORs occurred in the X sex chromosome. Considering the cytogenetic particularities observed in Araneae and the scarcity of information of specific chromosome regions, the purpose of this work was to establish the mechanism of chromosome evolution in Mygalomorphae and Araneomorphae spiders with the focus of the rDNA genes. The chromosome analyses were accomplished with standard staining, silver nitrate impregnation (Ag-NOR) to identify the active NORs and fluorescent in situ hybridization (FISH) to locate the 18S rDNA genes. The 17 species examined here belong to three families of Haplogynae, five of Entelegynae and three of Mygalomorphae. Mitotic metaphase cells exhibited 2nƃ=16+X1X2Y
in Sicarius cariri and Sicarius ornatus and 2nƃ=18+XY in Sicarius tropicus, with Ag-NORs on the terminal region of pair 1. In S. ornatus and S. tropicus, the FISH technique showed similar results to Ag-NOR, but in S. cariri, the ribosomal cistrons were located in the terminal region of the X1 sex chromosome. The description of a simple sex chromosome in Sicariidae fill a gap in
the hypothesis about the chromosome evolution in Haplogynae spiders, clarifying the origin of the XY system from the X1X2Y. In the 10 other Araneomorphae species studied here, the diploid
number ranged from 2nƃ=15 to 2nƃ=33, and the X1X20 was the most common type. The
location or number of the rDNA gene differed among the three species of Haplogynae, with signals in the interstitial region of one chromosome pair in Physocyclus globosus, terminal region of one autosomal pair in Loxosceles amazonica, and two chromosomal pairs of Scytodes
eleonorae. In all Entelegynae species, the NORs were located in one autosomal pair. In
Araneomorphae, autosomal NORs are frequently observed, occurring in species from different clades and with distinct types of sex chromosome system. Among the Mygalomorphae species,
Diplura sp. exhibited the high diploid number, which range from 2nƃ=78-94. Idiops sp. and
Acanthoscurria natalensis presented 2nƃ=51-57 and 2nƃ=41-49, respectively, and Oligoxystre
caatinga showed 2nƃ=22. Despite of this high difference in the diploid number, in the four Mygalomorphae species the 18S rDNA genes were located only in one autosomal pair.
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1. INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Araneae é uma das mais diversas ordens de animais da Terra e dentro da classe Arachnida
é ultrapassada em número de espécies apenas pela ordem Acari (CODDINGTON e LEVI, 1991).
Além disso, investigações recentes estimam que menos de um terço do total de espécies de
aranhas é conhecido atualmente, estando a maior riqueza ainda para ser descoberta nas regiões
Afrotropical e Neotropical. Segundo Brescovit (1999), cerca de 70% da fauna araneológica
Neotropical corresponde a espécies novas.
Atualmente, existem 45.741 espécies de aranhas descritas taxonomicamente, as quais
estão distribuídas em duas subordens, Mesothelae e Opisthothelae, com 114 famílias e 3.965
gêneros. A subordem Opisthothelae engloba as infraordens Mygalomorphae e Araneomorphae
(CODDINGTON e LEVI, 1991; WORLD SPIDER CATALOG, 2015). A infraordem
Araneomorphae é a que possui a maior riqueza de espécies, sendo que algumas famílias,
principalmente as cosmopolitas ou de ocorrência na região dos trópicos, detém mais de 1.500
espécies descritas (WORLD SPIDER CATALOG, 2015).
A subordem Mesothelae contém uma única família, Liphistiidae (oito gêneros, 91
espécies), com distribuição limitada as regiões Paleártica (China, Japão) e Oriental (Sudeste
Asiático e Sumatra) (WORLD SPIDER CATALOG, 2015). Esta subordem ocupa uma posição
basal dentro de Araneae, uma vez que inclui as aranhas com características morfológicas
consideradas primitivas, devido a segmentação do abdômen em numerosas placas dorsais e
presença sete ou oito fiandeiras, com localização na região mediana do abdômen
(CODDINGTON e LEVI, 1991).
As Mygalomorphae, com 16 famílias, 335 gêneros e 2.850 espécies, compreendem as
aranhas conhecidas popularmente como caranguejeiras, tarântulas, tecelãs de alçapão e túnel, que
estão distribuídas em todas as regiões biogeográficas (WORLD SPIDER CATALOG, 2015). As
espécies desta infraordem são caracterizadas pela presença de segmentação abdominal não
aparente externamente, seis ou menos fiandeiras localizadas na extremidade do abdômen, e garra
das quelíceras articuladas no mesmo plano que o eixo longitudinal do corpo (quelíceras
ortognatas) (CODDINGTON e LEVI, 1991). Morfologicamente, a monofiletismo de
migalomorfas baseia-se principalmente nos caracteres da fiandeira e genitais masculinos. Nas
aranhas deste grupo, não há qualquer vestígio de fiandeiras anteriores medianas presentes,
diferindo das mesoteles, e as fiandeiras anteriores laterais são muito reduzidas ou até mesmo
ausentes (CODDINGTON e LEVI, 1991).
11
praticamente todas as regiões biogeográficas. Morfologicamente, as aranhas deste grupo são
caracterizadas pela presença de abdômen não segmentado, articulação das quelíceras em ângulo
reto com o plano sagital do corpo (quelíceras labidognatas) e fiandeiras anteriores laterais
grandes e bem desenvolvidas (CODDINGTON e LEVI, 1991). O clado basal das
Araneomorphae é constituído por três famílias, Hypochilidae, Gradungulidae e Austrochilidae,
com apenas 12, 16 e nove espécies descritas, respectivamente. A grande maioria das
araneomorfas está agrupada nos clados Haplogynae (16 famílias e 5.239 espécies) e Entelegynae
(81 famílias e 37.561 espécies). As aranhas haploginas diferenciam-se das enteleginas pelo fato
das fêmeas apresentarem genitálias mais simples (CODDINGTON e LEVI, 1991; WORLD
SPIDER CATALOG, 2015).
Considerando o número de espécies de Araneae descritas taxonomicamente, as
informações citogenéticas são ainda muito escassas, pois menos de 2% dos representantes foram
caracterizados até o presente momento. Além disso, dentre as 114 famílias existentes, 45 não
possuem sequer uma espécie examinada citogeneticamente, o que resulta em uma grande lacuna
no conhecimento cromossômico do grupo como um todo (ARAUJO et al., 2015a). Porém, apesar
desta carência de estudos, os dados existentes na literatura têm revelado características bastante
interessantes em Araneae, do ponto de vista da evolução cromossômica.
A subordem Mesothelae possui apenas uma espécie examinada sob o ponto de vista
citogenético (Figura 1), a qual exibiu um dos maiores números diploides já registrados nas
aranhas, 2nƃ=±96, sistema cromossômico sexual múltiplo do tipo X1X20 e cromossomos com
morfologia acrocêntrica (SUZUKI, 1954). Dentro da subordem Opisthothelae, Mygalomorphae
(Figura 1) apresenta 49 espécies cariotipadas (ARAUJO et al., 2015a), as quais mostraram
números diploides bastante discrepantes, como 2nƃ=14 (Atypidae e Dipluridae) (ěEZAý et al.,
2006; KRÁL et al., 2013) e 2nƃ=128 (Ctenizidae) (KRÁL et al., 2013), sistemas cromossômicos
sexuais do tipo simples, como o XY e X0, ou múltiplos, como o X1X20, X1-X130 e X1-X7Y, e
morfologia dos cromossomos variando de meta/submetacêntrica a subtelo/acrocêntrica
12
13
Levando-se em conta que um número diploide alto está presente em Mesothelae e também
é predominante em espécies de Mygalomorphae, alguns autores sugeriram que o principal
mecanismo de diferenciação cariotípica das aranhas foi através da redução do número diploide
(SUZUKI, 1954; KRÁL et al., 2006). Porém, a descrição de número diploide extremamente
baixo, 2nƃ=14 e 2nƂ=16 (AKAN et al., 2005; ěEZAý et al., 2006; KRÁL et al., 2013), para
representantes de Mygalomorphae pertencentes a três diferentes famílias (Atypidae, Dipluridae
e Theraphosidae), indica que estudos citogenéticos adicionais devem ser realizados nesses
táxons, visando estabelecer as características cariotípicas plesiomórficas para as aranhas e
compreender os mecanismos de evolução cromossômica que tem ocorrido nos clados basais e
derivados filogeneticamente.
Dentre as Araneomorphae basais, há apenas duas espécies caracterizadas pertencentes às
famílias Hypochilidae e Austrochilidae (Figura 2), as quais revelaram 2nƃ=26+X1X2Y e
2nƃ=36+XY, respectivamente (KRÁL et al., 2006). Dentre outras aeromorfas, o grupo das
haploginas possui 61 espécies investigadas, com número diploide variando entre 2nƃ=7 a
2nƃ=40 (Figura 2) (SUZUKI, 1950, 1954; ěEZÁý et al., 2007; KOěÍNKOVÁ e KRÁL, 2013)
e cromossomos predominantemente meta/submetacêntrico, com exceção de representantes de
duas famílias, Dysderidae e Segestriidae, que exibiram cromossomos holocêntricos (SUZUKI,
1950, 1954; DIAZ e SAEZ, 1966; BENAVENTE e WETTSTEIN, 1980; BENAVENTE, 1982;
RODRÍGUEZ-GIL, 2002; KRÁL et al., 2006; ěEZÁý et al., 2007, 2014; DIAZ et al., 2010;
KOěÍNKOVÁ e KRÁL, 2013). Os sistemas cromossômicos sexuais já registrados nas
haploginas foram do tipo X0 em 56% das espécies, X1X20 em 16%, X1X2Y em 19%, e XY em
4% dos representantes (ARAUJO et al., 2015a).
Entelegynae, o grupo mais diversificado da infraordem Araneomorphae, detêm a maioria
dos dados cromossômicos das aranhas, com cerca de 679 espécie descritas (ARAUJO et al.,
2015a), e número diploide variando de 2nƃ=10 (PARIDA e SHARMA, 1987) a 2nƃ=52
(WALLACE, 1909). Em contraste com o que é observado nas espécies do grupo-irmão
Haplogynae, as aranhas enteleginas exibem cariótipo mais conservado quanto à presença de
sistema cromossômico sexual do tipo X1X20 e cromossomos na maioria das vezes
acro/telocêntrico (Figura 2). Além das 46 famílias presentes no cladograma proposto por
Coddington e Levi (1991) existem atualmente outras 30 famílias reconhecidas para o grupo das
Entelegynae, dentre as quais 12 foram examinadas citogeneticamente (ARAUJO et al., 2015a;
WORLD SPIDER CATALOG, 2015).
Embora em Entelegynae ocorra uma variação do número cromossômico, Král et al.
14
representativo de um estado ancestral para as aranhas desse grupo. Esta hipótese foi baseada no
fato que a fórmula cariotípica acima mencionada está presente em diversas famílias não
relacionadas bem como em clados basais de Entelegynae. No entanto, análises citogenéticas
adicionais, utilizando técnicas de coloração cromossômica convencional e diferencial, precisam
ser realizadas para confirmar esta hipótese e entender os processos de evolução cromossômica
15
16
Embora o emprego de técnicas que identificam regiões cromossômicas específicas tem
fornecido dados relevantes sobre a organização dos genomas e evolução dos cromossomos em
diversos grupos de animais, somente cerca de 60 e 50 espécies de aranhas foram caracterizadas
quanto à distribuição das regiões heterocromáticas constitutivas e organizadoras nucleolares,
respectivamente (ROY et al., 2005; DATSON e MURRAY, 2006; BOMBAROVÁ et al., 2007;
CABRAL-DE-MELLO et al., 2011).
As regiões organizadoras de nucléolo (RONs) correspondem a sítios cromossômicos
específicos, responsáveis pela formação e manutenção do nucléolo nos núcleos interfásicos; é no
nucléolo (porção fibrilar) que ocorre a transcrição dos genes do DNA ribossômico (rDNA) 18S,
5.8S e 28S, e montagem dos ribossomos (porção granular) (VERMA e BABU, 1995).
Em todos os organismos eucariontes, o rDNA é composto por uma unidade de transcrição
e um espaçador intergênico não-transcrito, denominado de NTS (Figura 3). Este conjunto, rDNA
e NTS, está organizado em múltiplas cópias repetidas em tandem, geralmente associado a regiões
de heterocromatina constitutiva. Estruturalmente, cada unidade de transcrição é formada pelos
genes que codificam o RNA ribossômico (rRNA) 18S, 5.8S e 28S, dois espaçadores transcritos
internos, ITS1 e ITS2, localizados entre os genes 18S-5.8S e 5.8S-28S, respectivamente, e um
espaçador transcrito externo (ETS), que é adjacente e antecede o gene 18S. Durante a expressão
gênica, estas unidades de transcrição são transcritas pela RNA polimerase I em um pré-RNA
45S, que é processado, através da remoção dos ITS e ETS, em moléculas maduras de rRNAs
18S, 5.8S e 28S. Estes rRNAs irão constituir as subunidades ribossomais maiores e menores,
através da associação com diversas proteínas e com a molécula de rRNA 5S. Na maioria das
espécies, o gene do rDNA 5S está localizado fora da região organizadora de nucléolo, ou seja,
não está associado ao rDNA 45S (LONG e DAWID, 1980).
Citologicamente, as RONs podem ser visualizadas nos cromossomos corados
convencionalmente de algumas espécies, como regiões da cromatina menos coradas e
condensadas, denominadas de constrições secundárias. No entanto, nem sempre as RONs
aparecem sob a forma de constrição secundária e algumas outras regiões do DNA, como as
heterocromáticas constitutivas, também podem apresentar um menor grau de condensação e/ou
17
Figura 3 – Representação esquemática da organização do gene de rDNA 45S, modificada de Pisano e Ghigliotti (2009).
A impregnação pelo íon prata é sem dúvida a técnica mais amplamente utilizada para
localizar as RONs (Ag-RONs) em diversos organismos, devido ao seu baixo custo, fácil e rápida
aplicação e boa qualidade dos resultados (GOODPASTURE e BLOOM, 1975; HOWELL e
BLACK, 1980). Contudo, esta metodologia evidencia de forma indireta as RONs, uma vez que
se baseia na propriedade argirofílica de certas proteínas, provavelmente daquelas de natureza
ácida, que se associam somente as RONs que foram ativas transcricionalmente durante a interfase
(VERMA e BABU, 1995). Adicionalmente, há evidências de que algumas regiões
cromossômicas marcadas pelo íon prata não correspondem às RONs (DOBIGNY et al., 2002).
Com o advento de técnicas citogenéticas moleculares, sequências repetidas do genoma,
como os genes de rDNA, são facilmente identificadas através da hibridação in situ com sonda
fluorescente (FISH). As RONs são marcadores cromossômicos úteis para o estudo da evolução
cariotípica, uma vez que podem representar sinapomorfias para determinados grupos, bem como
podem fornecer dados sobre os mecanismos responsáveis pelas diferenciações cromossômicas
intra e/ou interespecíficas (ZHANG e SANG, 1999; DATSON e MURRAY, 2006; PISANO e
GHIGLIOTTI, 2009; CABRAL-DE-MELLO et al., 2011).
A aplicação de ambas as técnicas, impregnação pelo íon prata e FISH com sonda de
rDNA, pode evidenciar heteromorfismo de atividade gênica entre diferentes populações de uma
espécie ou, até mesmo, entre indivíduos de uma população. Adicionalmente, a análise da FISH
e Ag-RON é pertinente para avaliar a atividade dos genes de rRNA e suas possíveis mudanças
durante a evolução (PETITPIERRE, 1996), como observado em híbridos interespecíficos de
Drosophila, nos quais ocorre uma dominância da atividade da RON de uma espécie sobre a outra,
o que pode ser um indício de que o controle da atividade desta região constitui um dos aspectos
18
detectados através da impregnação pelo íon prata podem não ser revelados pela técnica de FISH,
indicando a existência de RONs crípticas. Estas RONs possivelmente correspondem a novos
sítios de genes de rDNA nos cromossomos, os quais são muito pequenos para serem detectados
pela FISH, mas que possuem uma atividade de transcrição, ou não possuem homologia suficiente
com a sonda usada para haver hibridação (CABRERO e CAMACHO, 2008).
Nas Mygalomorphae e Araneomorphae derivadas, estudos envolvendo a localização das
regiões organizadoras de nucléolo foram realizadas somente em 47 espécies (5,5% das espécies
cariotipadas), através da técnica de impregnação pelo íon prata e/ou FISH (Tabela 1). Em
migalomorfas, 12 espécies foram caracterizadas quanto a distribuição das RONs, com a maioria
das marcações na região terminal de cromossomos autossômicos, com exceção de duas espécies
da família Dipluridae, Ischonothele caudata que apresentou marcação na região subterminal dos
cromossomos X e Y e Linothele megatheloides com marcação intersticial em um cromossomo
X pequeno (KRÁL et al., 2013). Em enteleginas, as RONs foram registradas em apenas 24
espécies e nas haploginas em 11 espécies. Nestes dois grupos, as RONs estão localizadas
predominantemente sobre a região terminal de um a três pares autossômicos. Porém, entre as
aranhas Haplogynae portadoras de sistema cromossômico sexual simples do tipo X0 e XY, as
RONs foram observadas sobre os cromossomos autossomos e sexual X (Dysderidae, Pholcidae
e Tetrablemmidae) ou apenas sobre o cromossomo sexual X (Leptonetidae, Ochyroceratidae e
Scytodidae). Recentemente, em espécies de Entelegynae portadoras do sistema cromossômico
sexual X1X20 foi observada a ocorrência de RONs sobre cromossomos autossômicos e sexuais
(Nephilidae) ou apenas sobre o cromossomo sexual X2 (Tetragnathidae) (WISE, 1983;
BARRION et al., 1989; ARAUJO et al., 2005, 2008, 2014, 2015b; KRÁL et al., 2006, 2011,
2013; KRÁL, 2007; OLIVEIRA et al., 2007; RODRÍGUEZ-GIL et al., 2007; STÁVALE et al.,
2010, 2011; DOLEJŠ et al., 2011; FORMAN et al., 2013).
No entanto, considerando a escassez de dados sobre a distribuição das RONs em aranhas
ainda é impossível verificar se: 1) a presença destas regiões sobre os cromossomos autossomos
e sexuais constitui um caráter compartilhado pelos grupos basais ou ocorre também em clados
derivados; 2) alterações no padrão de distribuição das RONs estão relacionadas com a
diferenciação dos sistemas cromossômicos sexuais; 3) existe uma correlação positiva entre o
número cromossômico das espécies e o número de RONs; 4) variações na localização desta
região podem ser úteis para diferenciar espécies com cariótipos altamente conservados, como a
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Tabela 1 – Espécies de aranhas que foram caracterizadas quanto à distribuição das regiões organizadoras de nucléolo (RONs). *Número diploide e sistema cromossômico sexual (SCS) estabelecido somente através da análise de indivíduos fêmeas. +Espécies com RONs através da técnica de FISH. A denominação taxonômica das espécies segue
World Spider Catalog, 2015.
Espécies Número diploide e sistema cromossômico
sexual (ƃ)
Localização das RONs Referência Mygalomorphae
Mecicobothriidae
Megahexura fulva 43, X0 Região terminal dos pares 2 e 4 Král et al., 2013
Dipluridae
Diplura cf. petrunkevitchi 90, X1X2X3X40 Região terminal de dois pares
autossômicos
Král et al., 2011
Euagrus lynceus 59, X1X2X3X4X50 Dois pares autossômicos Král et al., 2013
Ischnothele caudata 14, XY Pares 1 e 2;
Região subterminal do X e Y
Král et al., 2013
Linothele megatheloides 86, X1X2X3X4X5X60 Região terminal de um par metacêntrico e
um par acrocêntrico;
Região intersticial de um cromossomo X
Král et al., 2013
Nemesiidae
Acanthogonatus pissii 61, X1X2X30 Região terminal dos pares 1 e 14 Král et al., 2013
Iberesia machadoi 76, X1X20(?) Região terminal de um par metacêntrico Král et al., 2013
Theraphosidae
Brachypelma albopilosum+ 74, X
1X2X3X40 Região terminal de um par metacêntrico Král et al., 2013
Idiothele mira 25, X0 Região intersticial do par 7 Král et al., 2013
Pterinochilus murinus 43, X0 Região terminal do par 2 Král et al., 2013
Antrodiaetidae
Aliatypus californicus 27, X0 Região terminal dos pares 8 e 11 Král et al., 2013
Antrodiaetus riversi 47, X0 Região terminal de dois pares autossômicos
Král et al., 2013
Araneomorphae basal Hypochilidae
Hypochilus pococki 29, X1X2Y Região intersticial e terminal de dois
pares autossômicos
Král et al., 2006
Araneomorphae/Haplogynae Tetrablemmidae
Monoblemma muchmorei 23, X0 Região intersticial de um par autossômico;
Região subterminal de um braço e região terminal de outro braço do cromossomo X
Král et al., 2006
Dysderidae
Dysdera crocata 13, X0 Região terminal de um par autossômico; Cromossomo X
Král et al., 2006
Pholcidae
Crossopriza lyoni 23, X0 Região terminal dos pares 4 e 6; Região terminal do cromossomo X
Oliveira et al., 2007
Physocyclus globosus 15, X0 Região intersticial do par 2 Oliveira et al., 2007
Ochyroceratidae
Ochyrocera sp. 13, X0 Cromossomo X Král et al., 2006
Leptonetidae
Leptoneta infuscata 14, XY Cromossomo X Král et al., 2006
Scytodidae
Scytodes fusca 31, X0 Região terminal do par 1 Araujo et al., 2008
Scytodes globula 13, X0 Região terminal dos pares 1 e 2 Araujo et al., 2008
Scytodes itapevi 17, X0 Região terminal do par 4 Araujo et al., 2008
Scytodes thoracica 19, X0 Cromossomo X Král et al., 2006
Araneomorphae/Entelegynae Agelenidae
Tegenaria campestres 43, X1X2X30 Região subterminal de um par
autossômico
Král, 2007
Tegenaria ferruginea 40, X1X2X3X4X5Y Região subterminal de um par
autossômico
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Sparassidae
Polybetes punctulatus 44, X1X1X2X2* Região terminal de dois pares
autossômicos
Rodríguez-Gil et al., 2007
Polybetes pythagoricus 42, X1X20 Região terminal de dois pares
autossômicos
Rodríguez-Gil et al., 2007
Polybetes rapidus 44, X1X1X2X2* Região terminal de dois pares
autossômicos
Rodríguez-Gil et al., 2007
Ctenidae
Ctenus ornatus 28, X1X20 Região terminal do par 10 Araujo et al., 2014
Phoneutria nigriventer 28, X1X20 Região terminal do par 10 Araujo et al., 2014
Viracucha andicola 29, X1X2X30 Região terminal dos pares 10 e 16 Araujo et al., 2014
Lycosidae
Arctosa alpigena lamperti 28, X1X20 Região terminal dos pares 3 e 11 Dolejš et al., 2011
Arctosa lutetiana 28, X1X20 Região terminal dos pares 8 e 11 Dolejš et al., 2011
Tigrosa georgicola 28, X1X20 Região terminal de dois pares
autossômicos
Wise, 1983
Xerolycosa miniata 22, X1X20 Região terminal dos pares 3 e 6 Dolejš et al., 2011
Xerolycosa nemoralis 22, X1X20 Região terminal dos pares 3 e 6 Dolejš et al., 2011
Wadicosa fidelis+ 28, X
1X20 Região terminal do par 6 Forman et al., 2013
Oxyopidae
Hamataliwa sp. 28, X1X20 Região terminal e intersticial de dois
pares autossômicos
Stávale et al., 2011
Oxyopes javanus 23, X0 Par 8 Barrion et al., 1989
Oxyopes salticus 11, X0 Região terminal dos pares 2, 3 e 5 Stávale et al., 2011
Theridiidae
Argyrodes elevatus 21, X0 Região terminal dos pares 2, 3 e 4 Stávale et al., 2010
Nesticodes rufipes 22, X1X20 Região terminal do par 4 Stávale et al., 2010
Nephilidae
Nephila clavipes 24, X1X20 Região terminal dos pares 5 e 6 e dos
cromossomos X1 e X2
Araujo et al., 2015b
Nephila sexpunctata 24, X1X20 Região terminal dos pares 1, 2, 3, 5, 6, 11
e dos cromossomos X1 e X2
Araujo et al., 2015b
Nephilingis cruentata 26, X1X1X2X2* Região terminal dos pares 1 e 2 Araujo et al., 2005
Tetragnathidae
Meta menardi 24, X1X20 Região terminal do cromossomo X2 Král et al., 2011
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5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados obtidos através da análise citogenética das 17 espécies de aranhas estudadas
no presente trabalho permitiram verificar que:
- Através das análises realizadas em três espécies do gênero Sicarius foi observado a presença de
um sistema cromossômico sexual simples, do tipo XY, o qual é inédito para a família Sicariidae,
auxiliando no entendimento dos processos de evolução dos cromossomos sexuais em aranhas
Haplogynae.
- Nas espécies de Sicarius, a comparação entre os resultados obtidos com impregnação com o
íon prata e hibridação in situ, revelou que nem todas as marcações de Ag-RON correspondem a
sítios de rDNA. Alternativamente, essa incongruência dos dados obtidos com essas duas técnicas
pode estar relacionada com a presença de RONs crípticas.
- Em Haplogynae, a diversidade do número diploide e sistema cromossômico sexual é
acompanhada pela variação no número e localização dos sítios de rDNA.
- Nas aranhas do clado Entelegynae, os sítios de rDNA presente nos cromossomos autossômicos
corresponde ao padrão mais frequente. No entanto, variação em número e localização das RONs
ocorre entre espécies da mesma família.
- No grupo Mygalomorphae, a ocorrência de número diploide alto não é condizente com um
aumento de sítios de rDNA, uma vez que a presença de duas RONs foi observada em espécies
com número cromossômico discrepantes.
- Houve um aumento de 1/3 nas informações sobre os sítios de rDNA para os clados de
Araneomorphae e Mygalomorphae. Além disso, esse é o primeiro estudo em aranhas onde todas
as espécies foram analisadas através da técnica de FISH para a determinação do número e
