UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA
REGINA ADRIANA DE OLIVEIRA CALSOLARI
Diagnóstico laboratorial de Mycobacterium spp. em Botucatu e região, utilizando a técnica Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em material
biológico e avaliação de condições associadas.
Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Saúde Coletiva.
Botucatu
2016
REGINA ADRIANA DE OLIVEIRA
CALSOLARI
Diagnóstico laboratorial de Mycobacterium spp. em
Botucatu e região, utilizando a técnica Reação em Cadeia
da Polimerase (PCR) em material biológico e avaliação de
condições associadas.
Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de
Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Saúde Coletiva.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Jose Fortes Villas Boas Coorientadora: Profa. Dra. Adriana Polachini do Valle
Sumário ii
Lista de Quadros e Figuras ... v
Lista de Tabelas ... vii
Abreviaturas... x
Resumo ... 2
Abstract ... 5
1. INTRODUÇÃO ... 7
1.1 A tuberculose no mundo ... 8
1.1.1 A tuberculose no Brasil ... 10
1.1.2 A tuberculose em São Paulo ... 10
1.2 Gênero Mycobacterium spp. ... 10
1.2.1 Complexo Mycobacterium tuberculosis ... 11
1.2.2 Micobactérias não tuberculosas (MNT) ... 12
1.2.1.1 Diagnóstico das formas pulmonares ... 12
1.3 Diagnóstico Laboratorial ... 13
1.3.1 Baciloscopia ... 13
1.3.2 Cultura ... 14
1.3.3 Métodos Moleculares ... 15
1.3.3.1 Reação em cadeia da Polimerase (PCR) ... 15
1.3.3.2 Restriction Enzyme Pattern Analysis (PRA)... 16
1.3.3.3 Sequenciamento de DNA ... 16
1.4 Qualificação do principal problema a ser abordado ... 16
1.5 Hipótese do Estudo... 17
2. OBJETIVOS ... 18
2.1 Objetivo geral ... 19
2.2 Objetivos específicos ... 19
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 20
3.1 Baciloscopia ... 22
3.2 Tratamento das amostras ... 22
3.3 Cultura ... 23
3.4 Extração de DNA ... 23
3.5 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ... 24
3.6 Identificação do gênero Mycobacterium spp. –ITS-PCR ... 24
3.7 Identificação da espécie Mycobacterium tuberculosis – IS6110 ... 25
Sumário iii
3.9 Identificação das espécies MNT – PRA-hsp65 ... 26
3.10 Sequenciamento ... 26
3.11 Levantamento de dados demográficos e avaliação de condições associadas .. 27
3.12 Análise Estatística ... 27
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 29
4.1 Limitações do estudo...47
5. CONCLUSÕES ... 49
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 51
Lista de Quadros e Figuras v
Figura 1. A tuberculose no mundo……….. 8
Quadro 1.Critérios Diagnósticos para as Micobactérias não tuberculosas (MNT) American Thoracic Society e Infectious Diseases Society of America, 2007... 13
Figura 2. Delineamento da pesquisa... 21
Figura 3. Eletroforese em gel de agarose para pesquisa de Mycobacterium spp. em
materiais biológicos utilizando a técnica deITS-PCR ... 37
Figura 4. Eletroforese em gel de agarose para pesquisa de fragmento do gene hsp
65 para identificação de Mycobacterium spp. em materiais
biológicos... 38
Figura 5. Eletroforese em gel de agarose para pesquisa de fragmento IS6110 para
Lista de Tabelas vii
Tabela 1. Sequências dos primers e produtos da PCR... 23
Tabela 2. Concentração ideal para submissão de amostras para sequenciamento no equipamento ABI 3500® (Applied Biosystems)... 25 Tabela 3. Dados demográficos dos 130 pacientes investigados. Seção Técnica de
Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu–Unesp, 2015... 28 Tabela 4. Dados demográficos dos 44 pacientes com resultado positivo para
Mycobacterium spp. Seção Técnica de Laboratórios de Análises
Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015... 28 Tabela 5. Procedência das amostras de materiais biológicos dos 130 pacientes.
Seção Técnica de Laboratório de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015... 29 Tabela 6. Procedência das amostras de materiais biológicos dos 44 pacientes
positivos. Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015... 30 Tabela 7. Materiais biológicos. Seção Técnica de Laboratórios de Análises
Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015... 30 Tabela 8. Positividade entre as técnicas BAAR, ITS-PCR/hsp65 e cultura dos
Materiais biológicos. Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015... 32 Tabela 9. Positividade de escarros pela ITS-PCR e baciloscopia. Seção Técnica de
Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015... 32 Tabela 10. Comparação da positividade da baciloscopia com a cultura em amostras
de escarro... 34 Tabela 11. Comparação da positividade da ITS-PCR com a cultura em amostras de
escarro... 34 Tabela 12. Positividade entre as técnicas BAAR, ITS-PCR/hsp65 e cultura de
outros Materiais biológicos. Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015... 35 Tabela 13. Positividade entre as técnicas ITS-PCR e hsp65 para pesquisa de
Mycobacterium spp. dos Materiais biológicos. Unidade de Pesquisa
Experimental-UNIPEX da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015... 37 Tabela 14. Identificação das espécies de micobactérias dos 41 materiais biológicos
positivos pela PCR. Pesquisa dos fragmentos IS6110 e seqüenciamento
de DNA utilizando os fragmentos ITS-PCR e gene hsp65. Unidade de
Pesquisa Experimental-UNIPEX da Faculdade de Medicina de Botucatu
– Unesp, 2015 ... 39 Tabela 15. Identificação de Mycobacterium spp. pelo sequenciamento de DNA.
Instituto de Biotecnologia (IBTEC) Unesp, Botucatu... 41 Tabela 16. Análise das condições associadas com baciloscopias positivas em
Lista de Tabelas viii
Tabela 17. Análise das condições associadas com ITS-PCR positivas em amostras de material biológico. Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015... 44 Tabela 18. Análise das condições associadas com Culturas positivas em amostras
Abreviaturas x
ADA – Adenosina Deaminase
ATS - American Thoracic Society
BAAR - Bacilo álcool ácido resitente
CVE - Centro de Vigilância Epidemiológica
DM – Diabetes Mellitus
DOT - Tratamento Diretamente Observado
DPOC - Doença pulmonar obstrutiva crônica
HAS - Hipertensão Arterial Sistêmica
HCFMB - Hospital das Cínicas e Faculdade de Medicina de Botucatu
IDSA - Infectious Diseases Society of America
ITS - Internal Transcribed Spacer
Lasc - líquido ascítico
LBA - lavado broncoalveolar
LCR - líquido cefalorraquidiano
LJ - Lowestein- Jensen
LP - líquido pleural
MDR-TB - Mycobacterium tuberculosis multirresistentes aos antibacilares
MNT - Micobactérias não tuberculosas
PCR - Reação em Cadeia da Polimerase
PRA - Restriction Enzyme Pattern Analysis
RFLP - Restriction Fragment Lenght polymorphism
STLAC - Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas
UBS - Unidades Básicas de Saúde
VPP - Valor preditivo positivo
XDR-TB - Mycobacterium tuberculosis extensivamente resistente
Resumo 2
CALSOLARI, R. A. O. Diagnóstico laboratorial de Mycobacterium spp. em Botucatu e
região, utilizando a técnica Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em material biológico e
avaliação de condições associada. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2016.
Palavras – chave: diagnóstico; Mycobacterium; Reação em Cadeia da Polimerase (PCR);
Micobactérias não tuberculosas (MNT), Tuberculose.
Introdução - Estima-se que um em cada quatro brasileiros esteja infectado pelo bacilo de Koch, e apenas em 2013, 80 mil casos de tuberculose foram notificados ao Ministério da Saúde, dos quais 6,5 mil foram a óbito. O exame laboratorial para o diagnóstico da tuberculose é feito pelos seguintes métodos tradicionais: Baciloscopia (BAAR) e Cultura, considerada o padrão ouro, porém com um tempo de realização demorado (em torno de oito semanas). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método de amplificação de DNA
que pode ser útil no diagnóstico diferencial da tuberculose com outras infecções pulmonares. Além disso, a PCR pode confirmar a identificação da micobactéria em materiais clínicos que apresentem uma difícil positividade.
Objetivos – Avaliar a positividade de Mycobacterium spp. em diferentes materiais biológicos
utilizando a técnica de PCR para os alvos Internal Transcribed Spacer (ITS) 16S-23S rDNA
e gene hsp 65.
Material e métodos – Cento e trinta materiais biológicos de pacientes com suspeita de tuberculose pulmonar ou extrapulmonar foram investigados para pesquisa de Mycobacterium
spp. por ITS-PCR e pesquisa de fragmento do gene hsp65, no período de março de 2012 a
abril de 2013. Para identificação das espécies de micobactérias foi utilizada a pesquisa do gene IS6110, e técnica Restriction Enzyme Pattern Analysis (PCR-PRA). Para algumas
amostras positivas pela PCR foi realizado o sequenciamento para identificação da espécie. Foram avaliados dados demográficos e condições associadas. A comparação entre as técnicas foi verificada pelo teste χ2. Das amostras pesquisadas no escarro foram calculadas a sensibilidade e especificidade da PCR e da baciloscopia em relação à cultura. Foi considerado estatisticamente significante quando o valor do p foi < 0,05.
Resumo 3
BAAR (23,4%) e cultura (22,4%), (p=0,00). A sensibilidade e especificidade da baciloscopia em relação à cultura foram de 100% e 54%, respectivamente. Na comparação do PCR para as amostras de escarro a sensibilidade foi de 100% e especificidade de 81%. Ao avaliarmos os fatores de risco observamos uma associação positiva entre BAAR positivo, PCR positivo e cultura positiva com consumo de álcool e entre PCR positivo e tabagismo.
Conclusão- O estudo demonstrou que a pesquisa de Mycobacterium spp. diretamente de
Abstract 5
CALSOLARI, R. A. O. Laboratory diagnosis of Mycobacterium spp. in Botucatu and region
using the technique Polymerase Chain Reaction (PCR) in biological material and assessment of associated conditions. Thesis (Ph.D.) - Botucatu School of Medicine, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2016.
Key - words: diagnosis; Mycobacterium; Polymerase Chain Reaction (PCR); Nontuberculous
mycobacteria (NTM), Tuberculosis.
Introduction - It is estimated that one in every four Brazilians is infected with Koch's bacillus, and just in 2013, eighty thousand cases of tuberculosis were reported to the Department of Health, of which 6.5 million died. The laboratory test for the diagnosis of tuberculosis is made by the following traditional methods: baciloscopy and culture, considered the gold standard, but with a long holding time (around 8 weeks). Polymerase chain reaction (PCR) is a DNA amplification method that can be useful in the differential diagnosis of pulmonary tuberculosis with other infections. In addition, PCR can confirm the identification of mycobacteria in clinical materials that exhibit a difficult positivity.
Objectives - To evaluate the positivity of Mycobacterium spp. in different biological
materials using the PCR technique for the Internal Transcribed Spacer (ITS) 16S-23S rDNA gene and hsp 65 targets.
Materials and Methods - One hundred and thirty biological materials of patients with suspected pulmonary or extrapulmonary tuberculosis were investigated for Mycobacterium
tuberculosis spp. by ITS-PCR research and gene fragment hsp65 research, from March 2012
to April 2013. To identify the species of mycobacteria was used the IS6110 gene research and
PCR-PRA technique). For some positive samples was performed by PCR sequencing to species identification. They evaluated demographics and associated conditions. The comparison between the techniques was checked by χ² test. The samples surveyed in sputum were calculated sensitivity and specificity of PCR and baciloscopy in relation to culture. It was considered statistically significant when the p value was <0.05.
Abstract 6
sputum samples, sensitivity was 100% and specificity of 81%. To evaluate the risk factors it was observed a positive association between baciloscopy positive, and culture positive with alcohol consumption and between PCR positive and smoking.
Conclusion - The study demonstrated that the research for Mycobacterium spp. PCR directly
1. Introdução 8
1.1 A tuberculose no mundo
Atualmente a tuberculose (TB) afeta cerca de um terço da humanidade e continua sendo um grande problema de saúde global. Mais de dois bilhões de pessoas estão infectados com TB e 10% destes irão desenvolver a doença durante seu curso de vida. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), em 2013, estima-se que 9,0 milhões de pessoas desenvolveram tuberculose e 1,5 milhão delas morreram da doença, incluindo 320 mil mortes entre as pessoas com a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) (OMS, 2014).
A taxa de incidência varia amplamente entre os países. As menores taxas são encontradas predominantemente em países de alta renda, incluindo a maioria dos países da Europa Ocidental , Canadá, Estados Unidos da América , Japão, Austrália e Nova Zelândia. Em relatório anual 2014, a OMS revelou um número estimado de incidência em torno de 8% no Mediterrâneo Oriental, 4% na Região Europeia e 3% na Região das Américas O sudeste asiático é onde se concentra o maior número de casos positivos, sendo a Índia o país com o maior número de notificações – 1.415.000, seguida da China e do continente Africano (África do Sul com 328.000 notificações) (OMS, 2014).
1. Introdução 9
A tuberculose é uma doença associada às más condições de vida da população ou outras condições de imunodeficiência, como AIDS, diabetes melitus, doença renal crônica, alcoolismo, tabagismo, transplantes de órgãos sólidos, uso prolongado de corticosteróides ou outros imunossupressores (BRATS, 2011). A maior parte dos casos identificados da doença está entre os mais pobres e os que estão à margem da sociedade como: moradores de favelas, população de rua e população carcerária (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008a).
A tuberculose é contagiosa e se propaga pelo ar por meio de aerossóis. Estima-se que uma pessoa não tratada pode contaminar em média de 10 a 15 pessoas por ano (BRATS, 2011).
No dia Mundial da tuberculose (24/03) do ano de 2014, a OMSe a parceria Stop TB promoveram a campanha "Reach the 3 million". O Tema da ação visou abranger três
milhões de pessoas que ainda não recebiam o tratamento que necessitavam e incentivar, por meio de abordagens inovadoras, garantias de acesso ao diagnóstico, tratamento e cura da tuberculose (ENSP, 2014). Estudos efetuados pela OMS em cinco regiões do mundo revelam que, com o atual nível baixo de implementação do Tratamento Diretamente Observado (estratégia DOT), haverá 225 milhões de novos casos e 79 milhões de mortes por tuberculose até o ano 2030 (PINA, 2000).
Outra grande preocupação das autoridades é o avanço dos casos de resistência às drogas, a qual pode se apresentar de duas formas: 1. Mycobacterium tuberculosis
multirresistentes aos antibacilares (MDR-TB), definida como apresentando resistência pelo menos à isoniazida e rifampicina e 2. Mycobacterium tuberculosis extensivamente resistente
(XDR-TB). Nessa situação o microrganismo é resistente a todas as drogas utilizadas no tratamento da TB (GOMES, 2008).
Segundo estimativas da OMS, 480 mil pessoas desenvolveram MDR-TB em 2013 e 9,0% delas também apresentaram XDR-TB, sendo que mais da metade desses casos foram detectados na Índia, China e Federação Russa (OMS, 2014).
1. Introdução 10
1.1.1 A Tuberculose no Brasil
O Brasil é o único país da América Latina incluído entre as 22 nações responsáveis por 80% do total de casos de tuberculose no mundo sendo o 15ª país com o maior número de casos notificados (OMS, 2014).
Brasil, Peru, México e Haiti foram os países das Américas com a maior quantidade de casos em 2013. Porém, levando em conta o tamanho da população destes países, os números de portadores de TB por 100 mil habitantes são: México (168,7), Haiti (166,5) Peru (97,0), e Brasil (36,5) (OMS, 2014).
Estima-se que um em cada quatro brasileiros esteja infectado pelo bacilo de Kock. No ano de 2013 foram notificados ao Ministério da Saúde 80 mil casos de tuberculose, dos quais 6,5 mil foram a óbito.
De acordo com relatórios anuais da OMS os casos de tuberculose no Brasil predominam na região sudeste especialmente em centros urbanos. (OMS, 2005, 2007, 2014; DUCATI et al., 2006).
1.1.2 Tuberculose em São Paulo
Segundo o Centro de Vigilância Epidemiológica do Estado de São Paulo (CVE, 2010), São Paulo é o estado com o maior contingente de casos de tuberculose no país. Em 2010 foram notificados 16.190 novos casos da doença com 922 óbitos por tuberculose, sendo 96% em pacientes com idade de 15 anos ou mais. Do total de notificações 16,7% constituíram tuberculose extrapulmonar.
No município de Botucatu, segundo o CVE, foram notificados 32 novos casos de tuberculose em 2011 e 33 em 2013. Resultados semelhantes são descritos por Calsolari et al. (2015) referente ao período de 2008 a 2010, onde foram relatados 33 novos casos em 2008, 19 em 2009 e 36 em 2010 (CALSOLARI et al., 2015).
1.2 Gênero Mycobacterium spp.
As micobactérias pertencem à ordem Actinomycetales, e à família
Mycobacteriaceae. O gênero Mycobacterium é composto de 174 espécies e 13 subespécies
1. Introdução 11
micobactérias, inclusive espécies saprófitas presentes no solo e na água (FIELD; FISHER; COWIE, 2004; NUNES, 2014; EUZEBY, 2015; FALKINHAM, 2015).
1.2.1 Complexo Mycobacterium tuberculosis
A tuberculose é causada por espécies de bactérias pertencentes ao gênero
Mycobacterium que juntas formam o Complexo M. tuberculosis. Essas espécies são altamente
relacionadas filogeneticamente, apresentando homologia maior que 99% no genoma, estando dessa forma incluídas em um mesmo complexo, porém, apresentam diferenças fenotípicas, epidemiológicas e de patogenicidade. São elas: M. tuberculosis, M. bovis (M.bovis subsp.
bovis e M. bovis BCG), M. caprae, M.africanum, M. microti, M. canettii e M. pinnipedi
(TORTOLI, 1990; ANVISA, 2012). Recentemente, foram descritas outras duas espécies que fazem parte deste grupo, M. mungi (ALEXANDER et al., 2010) e M. orygis (DAWSON et
al., 2012; VAN INGEN et al., 2012).
O Mycobacterium tuberculosis é transmitido por meio de aerossóis respiratórios,
instalando-se e desenvolvendo-se inicialmente nos pulmões, ocasionando a tuberculose pulmonar, responsável pela maioria dos casos de tuberculose. O Mycobacterium pode também
se disseminar por via hematogênica para qualquer órgão, podendo se desenvolver e ocasionar a tuberculose extrapulmonar (LOPES et al, 2006a,b; NAPOLI et al., 2011; ZUMLA; NAHID;
COLE, 2013; RAMOS etal., 2014). As formas extrapulmonares representam cerca de 20% do número total de casos de tuberculose, podendo ultrapassar 40% desse total nos portadores de AIDS. Por ordem de frequência, as formas extrapulmonares mais frequentes são pleurais, ganglionares, osteoarticulares e renais (NAPOLI et al., 2011).
As formas extrapulmonares costumam ser de difícil diagnóstico. Acredita-se que um dos fatores seja o de que esses pacientes tenham amostras paucibacilares, situação na qual a baciloscopia e cultura costumam ser negativas (LOPES et al., 2006a). No Brasil a pleural representa a manifestação mais frequente de tuberculose extrapulmonar e ocorre em aproximadamente 30% dos casos de tuberculose. A Síndrome do derrame pleural, apesar de todos os avanços tecnológicos ocorridos nos últimos anos, ainda causa dificuldades para o diagnóstico da causa básica, principalmente em serviços de saúde não especializados no diagnostico de doenças torácicas (SILVA JUNIOR, 2012).
1. Introdução 12
60%. Em países com altaprevalência de tuberculose, a tuberculose ganglionar é quase sempre ocasionada pelo Mycobacterium tuberculosis, enquanto que em locais de menor prevalência,
outras micobactérias não tuberculosas podem estar envolvidas (BETHLEM, 2012).
Outra forma importante de tuberculose extrapulmonar é a renal. A incidência de tuberculose em pacientes com insuficiência renal crônica é superior à da população em geral, principalmente em dialíticos e transplantados. Pacientes submetidos a transplante renal, especialmente pelo uso de drogas imunossupressoras, são mais suscetíveis a infecções por M.
tuberculosis tanto por reativação quanto por infecção primária (SEISCENTO, 2012).
1.2.2 Micobactérias não tuberculosas (MNT)
As micobactérias não tuberculosas (MNT) encontram-se dispersas na natureza e ao contrário das espécies do complexo Mycobacterium tuberculosis apresentam
patogenicidade variável. A capacidade das MNT em produzir doenças (micobacterioses) está claramente documentada na literatura e sua importância vem aumentando progressivamente, com isolamentos de diferentes espécies nos laboratórios de micobactérias (FALKINHAM, 1996; BARRETO e CAMPOS, 2000; TORTOLI, 2003; KARAKOUSIS; MOORE; CHAISSON, 2004; UEKY et al., 2005; ZAMARIOLI et al., 2008; PEDRO et al., 2008). As MNT são responsáveis por infecções de pele e tecidos moles, infecções pulmonares crônicas e progressivas, linfadenite cervical pediátrica e infecções disseminadas, especialmente em casos avançados de AIDS, sendo a imunossupressão um fator de risco para sua disseminação. Entre as formas de apresentação da doença, a forma pulmonar é a mais frequente das infeccões por MNT (ZELLER; CAMPAINHA; DUARTE, 2013). O Complexo M. avium é responsável
pela maioria dos casos, e M. kansasi é a segunda maior causa da doença em pacientes com
AIDS (PFYFFER et al., 1998; WILDNER et al., 2011).
1.2.2.1 Diagnóstico das formas pulmonares das MNT
1. Introdução 13
A American Thoracic Society (ATS) em associação com a Infectious Diseases Society of America (IDSA) publicou, em 2007, documento com a definição dos critérios diagnósticos para as MNT (Quadro 1) (GRIFFITH et al., 2007).
Quadro 1. Critérios Diagnósticos para as Micobactérias não tuberculosas (MNT) American Thoracic Society e Infectious Diseases Society of America, 2007
CRITÉRIOS CLÍNICOS E RADIOLÓGICOS:
1. Sintomas respiratórios associados a opacidades nodulares ou cavidades na radiografia e/ou bronquiectasias e múltiplos pequenos nódulos na tomografia computadorizada de tórax, E
2. Exclusão de outros diagnósticos, especialmente a tuberculose.
CRITÉRIOS MICROBIOLÓGICOS:
1. Cultura positiva em duas amostras diferentes de escarro. Ou
2. Uma cultura positiva por escovado ou lavado bronco-alveolar. Ou
3. Biópsia pulmonar: processo crônico granulomatoso e/ou BAAR no tecido associado à cultura positiva em tecido, escarro ou lavado broncoalveolar.
A identificação das espécies é fundamental para prevenir multirresistência e falência no tratamento das micobacterioses permitindo a administração de quimioterápicos adequados, problema encontrado em relação ao sucesso da terapia e, dada a diversidade de espécies de MNT, com diferentes perfis de sensibilidade observados para cada grupo e o número limitado de opções terapêuticas (ZELLER; CAMPAINHA; DUARTE, 2013).
1.3 Diagnóstico Laboratorial
O exame laboratorial para o diagnóstico da tuberculose é feito pelos seguintes métodos tradicionais:
Baciloscopia – pesquisa de bacilos em esfregaços da amostra corados pela técnica de Ziehl-Neelsen (BAAR).
1. Introdução 14
1.3.1 Baciloscopia
O número mínimo de bacilos necessários para confecção de um esfregaço com resultado positivo tem sido estimado entre 5.000 a 10.000 por mL. Segundo Silva Junior (2012), para que se possa diagnosticar uma baciloscopia no líquido pleural como positiva, são necessários 10.000 bacilos/mL de amostra e acredita-se que por essa razão a pesquisa de BAAR apresente baixa sensibilidade na prática clínica (SILVA JUNIOR, 2012; BRATS, 2011).
1.3.2 Cultura
Com a presença de apenas 10 bacilos/mL de amostra é possível obter exame cultural positivo, tratando-se, portanto, de uma técnica mais sensível que o exame microscópico direto (FERREIRA e ÁVILA, 2001). A micobactéria isolada em cultura pode ser identificada quanto a sua espécie pela verificação de características fenotípicas e testes bioquímicos convencionais. Como exemplos das características fenotípicas destacam-se: tempo de crescimento das culturas, pigmentação e capacidade de formação de corda das colônias. Nos testes bioquímicos os isolados são cultivados em meios contendo substâncias que podem inibir o crescimento de determinadas espécies. Entretanto, o resultado pode demorar de seis a oito semanas. (KONEMAN, 2001; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008b).
Entre os meios de cultura sólidos, o meio de Löwestein-Jensen é o mais utilizado. Os meios sólidos possibilitam uma leitura quantitativa, através da contagem do número de colônias, tornando mais adequado para a monitorização do tratamento. Os meios de cultura líquidos, como o meio de Middlebrook, são meios mais enriquecidos, conferindo uma maior sensibilidade e agilidade no diagnóstico, sendo possível obter uma cultura positiva entre cinco a quinze dias. Podem ser utilizados por técnica manual ou em equipamentos automatizados com monitoração contínua como o BACTEC MYCO / F Lytic®, BACTEC MGIT 960® e BACTEC MGIT 320® - Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems.
1. Introdução 15
1.3.3 Métodos Moleculares
A necessidade de um teste rápido para o diagnóstico laboratorial da tuberculose levou ao desenvolvimento dos métodos moleculares para a detecção e identificação do
Mycobacterium diretamente de material biológico ou a partir das colônias isoladas em cultivo
(MELLO e FONSECA-COSTA, 2005).
Diversas técnicas encontram-se disponíveis e entre elas destacamos: sondas genéticas, testes baseados na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, PCR em tempo real),
Restriction Fragment Lenght polymorphism (RFLP) e seqüenciamento de DNA (PIERRE et
al., 1991; TELENTI et al., 1993; FREDRICKS e RELMAN, 1999; TORTOLI et al., 2001; SHINGADIA e NOVELLI, 2003; CHIMARA et al., 2008).
1.3.3.1 Reação em cadeia da Polimerase (PCR)
A PCR é uma técnica de amplificação de DNA que possibilita identificação de agentes infecciosos com uma alta sensibilidade e especificidade (PIERRE et al., 1991 ; FREDRICKS e RELMAN, 1999; SHINGADIA e NOVELLI, 2003). É útil no diagnóstico diferencial da tuberculose com outras infecções pulmonares, pois apresenta sensibilidade semelhante à da cultura com menor tempo de realização (24 horas) (OGUSKU e SALEM, 2004).
Metodologia padronizada pela OMS e utilizada em muitos centros para triagem é o teste Xpert® MTB/RIF. É um teste de amplificação de ácidos nucléicos utilizado para detecção do complexo M. tuberculosis e para a triagem de tuberculose resistente a fármacos.
Sua desvantagem é ser específico para o complexo M. tuberculosis e utiliza apenas escarro
como material biológico (BRATS, 2011; OMS, 2014).
Várias seqüências alvo têm sido utilizadas para pesquisa de M. tuberculosis tais
como IS6110, hsp65 e genes codificantes de proteínas como 38 KDa e MPB64. Dentre esses
alvos a IS6110 é a mais comumente utilizada por ser uma seqüência repetitiva no genoma do
M. tuberculosis. Essa característica propicia um aumento na sensibilidade da PCR e por essa
razão foi a sequência de escolha no presente estudo para identificação do M. tuberculosis
1. Introdução 16
1.3.3.2 Restriction Enzyme Pattern Analysis (PRA)
É metodologia utilizada para identificar espécies de MNT com alta acurácia, mais rapidamente, utilizando técnica menos dispendiosa que a identificação fenotípica convencional. A técnica de PRA - PCR que consiste na análise do padrão de restrição (PRA –
Restriction Enzyme Pattern Analysis) de produtos de amplificação de um fragmento de 441
pares de bases do gene hsp65, que codifica uma proteína de 65Kda conhecida como proteína
de choque térmico. A técnica trabalha com a digestão desse fragmento pelas enzimas BstEII e
HaeIII, após sua amplificação. A interpretação do padrão de bandas gerado por essa digestão
permite a identificação de espécies e subespécies de micobactérias, comparando-se esses padrões com um algoritmo (TELENTI et al., 1993; CHIMARA et al. 2008).
1.3.3.3 Sequenciamento de DNA
É considerada o padrão "ouro" para a identificar especies de micobactérias.
Estudos têm sido realizados na identificação das espécies empregando o sequenciamento de fragmento dos genes hsp65, região ITS – Internal Transcribed Spacer, 16S rDNA, rpoB
(TELENTI et al., 1993; ROTH et al., 1998; HERNANDEZ et al., 1999; LEE et al., 2000; KHAN; SELVARAJU; YADAU, 2005; CHIMARA et al., 2008; POURAHMAD et al., 2009). Após amplificação do fragmento a ser investigado, o produto purificado é levado para sequenciador automático. A identificação de uma estirpe desconhecida é feita por comparação dasequência nucleotídica com uma biblioteca de sequências conhecidas disponíveis em bancos de dados públicos (NCBI, 2016).
1.4 Qualificação dos principais problemas abordados
1. Introdução 17
Outro ponto abordado é a baixa positividade nas baciloscopias e culturas realizadas em outros materiais biológicos diferentes de escarro, como amostras de urinas, lavados broncoalveolares, líquidos pleurais, ascíticos e cefalorraquidianos.
1.5 Hipótese do Estudo
As evidências da literatura permitem formular a hipótese que a investigação de
Mycobacterium spp. por técnica de PCR diretamente e em diferentes materiais biológicos
2. Objetivos 19
2.1 Objetivo geral
Avaliar a positividade de Mycobacterium spp. em diferentes materiais biológicos
utilizando a técnica de PCR para os alvos Internal Transcribed Spacer (ITS) 16S-23S rDNAe
gene hsp65).
2.2 Objetivos específicos
Comparar a técnica de PCR com metodologias tradicionais (baciloscopia e cultura) para identificação de Mycobacterium spp. em diferentes materiais biológicos;
Identificar espécies de Mycobacterium diretamente do material biológico, utilizando
técnica de PCR para o alvo IS6110 e técnica PRA-PCR;
3. Material e Métodos 21
Este estudo prospectivo longitudinal foi realizado na STLAC HCFMB no período de março de 2012 a abril de 2013. O desenvolvimento experimental foi realizado, a princípio, no Departamento de Patologia da FMB, e finalizado na Unidade de Pesquisa Experimental da FMB - UNIPEX, no período de novembro de 2013 a junho de 2015.
Foram incluídas neste estudo amostras obtidas de 137 pacientes com suspeita de tuberculose pulmonar ou extrapulmonar atendids no ambulatório ou de enfermarias do HCFMB e das Unidades Básicas de Saúde (UBS) de Botucatu e região.
Materiais biológicos utilizados no estudo:
Escarros: - Todos os escarros positivos na baciloscopia, além de 10 escarros negativos com importante evidência clínica de TB (sintomático respiratório e constitucional) com volume maior que 1,0 mL, foram incluídos no estudo.
Urinas (com volume maior que 4,0 mL), lavados broncoalveolares e líquidos ascítico, pleural e cefalorraquidiano (com volume maior que 1,0 mL): - todas as amostras encaminhadas para investigação de tuberculose na STLAC do HCFMB no período do estudo.
Os escarros foram analisados para investigação de BAAR e quando a baciloscopia se apresentou positiva foi realizada cultura em meio Lowestein- Jensen.
Os outros materiais biológicos (lavados broncoalveolares, líquidos ascítico, líquidos pleurais, líquidos cefalorraquidianos e urinas) foram analisados para investigação de BAAR e submetidos às culturas em meio Lowestein-Jensen, independente do resultado da baciloscopia.
Para todos os materiais biológicos foi realizada extração de DNA para investigação de Mycobacterium spp. pelas técnicas ITS-PCR e pesquisa de fragmento do
gene hsp65.
Para identificação das espécies de micobactérias foi utilizada a pesquisa do gene
IS6110, comum a todas as espécies de M. tuberculosis e técnica PCR-PRA para identificação
de outras micobactérias.
3. Material e Métodos 22 137 amostras 2 LBA 2 LCR 1 Lasc 1 LP 10 escarros 44 LBA 10 LCR 17 urinas 4 Lasc 17 LP Baciloscopias positivas 35 escarros Baciloscopias negativas Amostras excluídas (extração < 1,0 ng/µL)
Amostras excluídas (extração < 1,0 ng/µL)
1 escarro
130 amostras
Extração de DNA
Pesquisa de Mycobacteriumspp. Técnicas ITS-PCR e gene hsp65
Identificação de espécies M. tuberculosise MNT
Pesquisa IS6110 –M. tuberculosis Pesquisa PCR-PRA - MNT
Sequenciamento de DNA
Figura 2. Delineamento da pesquisa.
Das 137 amostras iniciais do estudo foram excluídas sete amostras.
3.1 Baciloscopia
Foram confeccionadas duas laminas para cada material investigado. Para as amostras de escarro, uma pequena porção do material foi espalhada em 2/3 da lâmina, fixadas em bico de Bunsen e após secar em temperatura ambiente as laminas foram coradas pela técnica de Ziehl-Neelsen. Após coloração, as laminas foram visualizadas em microscopia de imersão para a pesquisa de BAAR, conforme orientações do Ministério da Saúde. Para as outras amostras, o material foi transferido para tubo cônico estéril com tampa de rosca, centrifugado a 3.000xg por 15 minutos. As laminas foram confeccionadas do sedimento e processadas como as de escarro (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008b).
3. Material e Métodos 23
A descontaminação das amostras de escarro, urina e líquido foram realizadas conforme orientações do Ministério da Saúde (2008b). As amostras foram transferidas para tubos cônicos, graduados de centrífuga com capacidade de 15 mL, com adição de igual volume de NaOH a 4%, agitadas e deixadas em repouso por 15 minutos. Em seguida foi adicionado o mesmo volume de água destilada estéril e as amostras centrifugadas a 3.000xg por 15 minutos. O sobrenadante foi desprezado e ao sedimento adicionado o vermelho de fenol a 0,4% seguido do HCL 1N para neutralização (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2008b).
3.3 Cultura
Após o tratamento das amostras descrito anteriormente, foram semeados 0,2 mL do sedimento em tubos de Lowenstein-Jensen e incubados até 60 dias a 37ºC. As culturas foram acompanhadas semanalmente para visualização do crescimento de colônias. Caso não houvesse crescimento, eram descartadas e consideradas culturas negativas.
As técnicas de baciloscopia, tratamento das amostras e culturas foram todas realizadas em rotina pelos técnicos do laboratório de micobacteriologia da STLAC – HCFMB.
3.4 Extração de DNA
3. Material e Métodos 24
foi realizada a quantificação no equipamento Nanodrop 2000 Spectrophotometer Thermo Scientific®. Foram descartadas da pesquisa amostras com quantificação de DNA < 1,0 ng/µL.
3.5 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
O DNA extraído foi submetido à Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para amplificação da região espaçadora intergênica (ITS) compreendida entre 16S-23S rDNA conservada no gênero, utilizando um par de primers gênero-específicos para Mycobacterium
spp. (ROTH et al., 2000; BORCHARDT, 2009). Para as amostras que se apresentaram positivas foi realizada identificação para o M. tuberculosis pela amplificação da sequência
IS6110 (EISENACH et al.,1990; OGUSKU e SALEM, 2004).
O DNA extraído também foi submetido a uma segunda PCR para a amplificação de um fragmento do gene hsp65 comum no gênero Mycobacterium. Esse mesmo fragmento
foi utilizado para realização da técnica PCR-PRA para identificação de outras espécies de micobactérias (MNT). Os primers encontram-se descritos na Tabela 1.
Tabela 1. Sequências de primers e produtos da PCR.
Alvos Sequências dos primers produto amplificado Referência
Mycobacterium spp.
primerSp1 5‟- ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC –3‟ 221 pb Borchardt, 2009 primerSp2 5‟- GATGCTCGC AACCACTATCCA –3‟ Rothet al., 2000
PRA-hsp65 5‟- ACCAACGATGGTGTGTCCAT –3‟ 439 pb Telenti et al.,1993 5‟- CTTGTCGAACCGCATACCCT –3‟ Chimara et al., 2008
M. tuberculosis
IS6110 5‟- CTC GTC CAG CGC CGC TTC GG –3‟ 541 pb Eisenach et al., 1990
3. Material e Métodos 25
3.6 Identificação do gênero Mycobacterium spp. – ITS-PCR
O volume final de amplificação correspondeu a 25,0 µL, composto de 5,0 µL de tampão (Invitrogen), 1,0 µL de cada primer, 1,5 µL de MgCl2, 4,0 µL de DNA bacteriano e
0,30 µL Taq polimerase (Invitrogen). Após homogeneização, a mistura foi submetida à amplificação em termociclador – PTC-150 MJ Research® nas seguintes condições:- total de 35 ciclos: 96ºC por 2 minutos; 60ºC por 2 minutos; 72ºC por 2 minutos e uma etapa final de 72ºC por 10 minutos.
Após amplificação, 10 µL do produto foram submetidos à eletroforese a 80 volts por 40 minutos em gel de agarose a 1%, corado com 0,5 µL/mL de brometo de etídio. O gel foi visualizado em fotodocumentador. Para determinar o tamanho dos fragmentos de DNA gerados, foi utilizado na eletroforese um marcador de 100 pb (Invitrogen).
3.7 Identificação da espécie Mycobacterium tuberculosis – IS6110
O volume final de amplificação correspondeu a 25,0 µL, composto de 5,0 µL de tampão (Invitrogen), 1,0 µL de cada primer, 1,0 µL de MgCl2, 4,0 µL de DNA bacteriano e
0,30 µL de Taq polimerase (Invitrogen). Após homogeneização, a mistura foi submetida à amplificação em termociclador – PTC-150 MJ Research nas seguintes condições:- total de 32 ciclos: 94ºC por 20 segundos; 63ºC por 20 segundos; 72ºC por 1 minuto e uma etapa final de 72ºC por 10 minutos.
Após amplificação 10 µL do produto foram submetidos à eletroforese a 80 volts por 40 minutos em gel de agarose a 1%, corado com 0,5 µL/mL de brometo de etídio. O gel foi visualizado em fotodocumentador. Para determinar o tamanho dos fragmentos de DNA gerados, foi utilizado na eletroforese um marcador de 100 pb (Invitrogen).
3.8 Identificação do gênero Mycobacteriumspp. –hsp65-PCR
O volume final de amplificação correspondeu a 25 µL composto de 5,0 µL de tampão (Invitrogen), 0,5 µL de cada primer, 0,75 µL de MgCl2, 4,0 µL de DNA bacteriano e
3. Material e Métodos 26
30 segundos; 60ºC por 30 segundos; 72ºC por 1 minuto e uma etapa final de 72ºC por 10 minutos.
Após amplificação 10 µL do produto foi submetido à eletroforese a 80 volts por 40 minutos em gel de agarose a 1%, corado com 0,5µL/mL de brometo de etídio. O gel foi visualizado em fotodocumentador. Para determinar o tamanho dos fragmentos de DNA gerados, foi utilizado na eletroforese um marcador de 100 pb (Invitrogen).
3.9 Identificação das espécies MNT – PCR-PRA-hsp65
Para cada produto de PCR foi feita uma mistura contendo: 1,0 µL (20U) de cada enzima; 3,0 µL de tampão de restrição e 16,0 µL de água deionizada. As mistura foram incubadas por três horas à 60oC e 37oC para ativação da enzimas BstIII e HaeIII - Sigma®
respectivamente.
Após amplificação 10 µL do produto foi submetido à eletroforese a 80 volts por 90 minutos em gel de agarose a 3%, corado com 0,5 µL/mL de brometo de etídio. O gel foi visualizado em fotodocumentador. Para determinar o tamanho dos fragmentos de DNA gerados, foi utilizado na eletroforese um marcador de 50 pb (Invitrogen). Os isolados foram identificados utilizando um algoritmo como descrito previamente (TELENTI et al., 1993;
CHIMARA et al., 2008).
3.10 Sequenciamento
Os ácidos nuclêicos amplificados pelas técnicas ITS-PCR ou hsp65-PCR foram
enviados ao Laboratório de Diagnóstico Molecular e Sequenciamento/UNESP – Botucatu. Para a purificação foi utilizada o kit comercial QIAquick gel extraction kit®, catálogo: 28998 de acordo com instruções do fabricante.
3. Material e Métodos 27
Tabela 2. Concentração ideal para submissão de amostras para seqüenciamento no equipamento ABI 3500® (Applied Biosystems).
Tamanho do produto de PCR (pb) Concentração (ng/μL)
100-200 3
200-500 5-10
500-1000 10-20
1000-2000 20-40
>2000 40-100
As amostras purificadas e quantificadas foram submetidas ao sequenciamento pelo método de Sanger. A reação para sequenciamento foi realizada com o kit ABI Big Dye
Terminator Chemistry (Applied Biosystems®), seguido de eletroforese em capilar (Applied
Biosystems, ABI 3500®). As sequências foram comparadas usando o algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) com os dados depositados no gen bank.
3.11 Levantamento de dados demográficos e avaliação de doenças associadas
Foram obtidos os seguintes dados dos prontuários médicos e/ou laudos laboratoriais:
- sexo, idade, procedência; - diagnóstico de HIV; - etilismo, tabagismo;
- doenças associadas (Diabetes Mellitus, Hipertensão Arterial, Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica e Asma, outras infecções (criptococose; paracoccidioidomicose; neurotoxoplasmose; herpes; Citomegalovirose; Doença de Chagas; Sífilis; Hepatites); Doenças Renais (nefrolitíase; pielonefrite; transplantado); Neoplasias.
3.12 Análise Estatística
Para o cálculo do tamanho amostral utilizou-se a fórmula de Fisher e Belle (1993). A amostra calculada foi de 137 pacientes, utilizando-se um intervalo de confiança de 95% e uma precisão de 5%, para a positividade de 10% para Mycobacterium tuberculosis,
3. Material e Métodos 28
em termos de variáveis quantitativas contínuas e discretas. Os dados demográficos da população estudada foram expressos em média ± desvio padrão. Para as variáveis qualitativas foram confeccionadas tabelas com as distribuições de freqüências e percentagens.
Descritos os dados, o teste do χ2 forneceu informações entre a positividade dos
exames pela BAAR, técnica de PCR e Cultura.
Das amostras pesquisadas no escarro foram calculadas a sensibilidade, especificidade e teste preditivo positivo da PCR e da baciloscopia em relação à cultura, considerada o teste padrão-ouro. Foi considerado estatisticamente significante valor do p < 0,05.
4. Resultados e Discussão 30
Foram estudadas 130 amostras de materiais biológicos de pacientes atendidos na Instituição e nas UBS de toda a região, no período de março de 2012 a abril de 2013. Os pacientes tinham idade média de 52,4 ± 16,7 anos, variando de 16 a 86 anos, sendo 75 (57,6%) homens e 55 (42,4%) mulheres. A faixa etária predominante foi 20 a 59 anos, correspondendo a 75 (57, 6%) dos 130 investigados (Tabela 3).
Tabela 3. Dados demográficos dos 130 pacientes investigados. Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.
Idade N (%) Homem (N) Mulher (N)
(0 – 19 anos) 2 (1,7%) 0 2 (20 – 59 anos) 75 (56,2%) 43 32
(≥ 60 anos) 45 (35,4%) 26 19
Sem informação 8 (6,9%) 6 2
Total 130 (100%) 75 55
Na tabela 4 estão descritos os dados demográficos dos pacientes que apresentaram resultado positivo para investigação de Mycobacterium spp.
Foram confirmados 44 pacientes com idade variando de 24 a 77 anos sendo 32 (72,7%) homens e 12 (27,3%) mulheres. A idade média dos pacientes foi de 49,8±15,0 anos e a faixa etária predominante foi de 20 a 59 anos, correspondendo a 30 (68,2%).
Tabela 4. Dados demográficos dos 44 pacientes com resultado positivo para Mycobacterium
spp. Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.
Idade N (%) Homem (N) Mulher (N)
(0 – 19 anos) 0 (0,0%) 0 0 (20 – 59 anos) 30 (68,2%) 23 7
(≥ 60 anos) 13 (29,5%) 8 5
Sem informação 1 (2,3%) 1 0
Total 44 (100%) 32 12
4. Resultados e Discussão 31
encontrou os maiores coeficientes de incidência entre os 20 e 29 anos no sexo feminino e entre 30 e 59 anos no sexo masculino. Com relação ao sexo, é descrito uma ampla predominância no sexo masculino, observando-se a incidência de tuberculose na proporção 2:1 – homem: mulher (WATANABE e RUFFINO-NETTO, 2001; LIMA et al., 2008; BONA et al., 2011; SEISCENTO, 2012; CALSOLARI et al., 2015).
Quanto à procedência das amostras, observou-se que 53 (40,7%) pacientes residiam na cidade de Botucatu e 77 (59,2%) pertenciam a outras cidades, apresentando um número maior provenientes de São Manuel 10 (7,7%); Areiópolis 4 (3,1%); Itatinga 4 (3,1%); Laranjal Paulista 4 (3,1%) e Pardinho 4 (3,1%). Em 10 (7,7%) pacientes não foi possível determinar a procedência (Tabela 5).
Tabela 5. Procedência das amostras de materiais biológicos dos 130 pacientes, Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.
Procedência N % Homem Mulher
Botucatu 53 40,7 30 23
São Manuel 10 7,7 6 4
Areiópolis 4 3,1 2 2
Itatinga 4 3,1 2 2
Pardinho 4 3,1 2 2
Laranjal Paulista 4 3,1 1 3
Outros 41 31,5 22 19
Sem informação 10 7,7 8 2
Total 130 100 73 57
4. Resultados e Discussão 32
Tabela 6. Procedência das amostras de materiais biológicos dos 44 pacientes positivos, Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.
Procedência N % Homem Mulher
Botucatu 23 52,3 18 5
São Manuel 10 22,7 7 3
Areiópolis 2 4,5 2 0
Itatinga 1 2,3 0 1
Pardinho 0 0 0 0
Laranjal Paulista 1 2.3 0 1
Outros 6 13,6 3 3
Sem informação 1 2,3 1 0
Total 44 100 31 13
As amostras biológicas estudadas corresponderam a 44 (33,8%) escarros, 42 (32,3%) lavados broncoalveolares, 17 (13,1%) urinas, 16 (12,3%) líquidos pleurais, oito (6,2%) líquidos cefalorraquidianos e três (2,4%) líquidos ascíticos. Foram incluídos todos os líquidos biológicos e urinas que deram entrada para investigação de tuberculose na STLAC do HCFMB e os escarros com baciloscopia positiva. Dez escarros com baciloscopia negativa e com importante evidência clínica de TB (sintomático respiratório e constitucional) foram incluídos no estudo (Tabela7).
Tabela 7. Materiais biológicos, Seção Técnica de Laboratório Clínico Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.
Amostras N %
Escarro 44 33,8
Lavado broncoalveolar 42 32,3
Urina 17 13,1
Líquido pleural 16 12,3 Líquido cefalorraquidiano 8 6,2 Líquido ascítico 3 2,3
4. Resultados e Discussão 33
Nesse estudo, os materiais biológicos foram investigados pela utilização de técnicas de PCR (ITS-PCR e pesquisa do gene hsp65) diretamente da amostra, para pesquisa
de Mycobacterium spp. e seu resultado comparado com a metodologia tradicional a qual
utiliza a baciloscopia e cultura.
Quando avaliamos a positividade das metodologias em todos os materiais biológicos investigados, observamos que a cultura apresentou positividade inferior à baciloscopia e a PCR. Isso se deve, provavelmente, ao tamanho da amostra, pois, seis culturas não tiveram resultados ou foram negativas (uma amostra de escarro com baciloscopia positiva não foi realizada a cultura, duas culturas se apresentaram contaminadas, uma foi identificada como uma MNT e outra que apresentou apenas um bacilo na baciloscopia).
Existem diversos fatores que podem estar relacionados ao sucesso do crescimento em cultura para as micobactérias, e conforme já descrito, a qualidade da amostra é fundamental para um bom desempenho do teste. Atualmente são conhecidas mais de 150 espécies de MNT, a maioria cresce em aminoácidos, glicerol e sais minerais, porém, algumas espécies necessitam de suplementos, além da temperatura de crescimento ser variável e oscilar de 25°C a 45°C de acordo com a espécie. Acredita-se que qualquer um desses fatores possa estar relacionado ao desempenho inferior da cultura, quando comparada a baciloscopia e PCR (HADDAD et al., 2005; NUNES et al., 2014).
Observou-se positividade para Mycobacterium spp. em 31,6% quando utilizada a
4. Resultados e Discussão 34
Tabela 8. Positividade entre as técnicas, ITS-PCR, hsp65, BAAR e culturas dos Materiais
biológicos. Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.
LBA : Lavado broncoalveolar; LCR: Líquido Cefalorraquidiano; LAsc: Líquido Ascítico; LP: Líquido Pleural.
** Para as culturas o N=39 amostras
*comparação entre BAAR + e PCR+, p=0,00;
# comparação entre BAAR + e Cultura+, p=0,00; & comparação entre PCR+ e Cultura+, p=0,00.
Realizaremos a apresentação dos resultados e a discussão separadamente de escarros e outros materiais biológicos.
Análise dos escarros
Foram investigados 44 escarros. Foram positivos pela baciloscopia 34 e destes 31 foram confirmados pela técnica de PCR. Dos 10 escarros negativos na baciloscopia, dois foram positivos pela PCR, sendo um deles identificado como M. iranicum pelo
seqüenciamento com 100% de compatibilidade (tabela 9).
Tabela 9. Positividade de escarros pelo ITS-PCR e baciloscopia, Seção Técnica de Laboratório Clínico Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.
ITS + ITS - Total
BAAR + 31 3 34
BAAR - 2 8 10
Total 33 11 44
p = 0,93
Amostras ITS-PCR N %
hsp65 N %
BAAR
N %
Culturas N %
Escarro (n=44)** 33 75,0 20 45,5 34 77,3 28 71,8
LBA (n=42) 5 11,9 3 7,1 0 0,0 0 0,0
LCR (n=8) 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0
Urina (n=17) 1 5,9 1 5,9 0 0,0 0 0,0
LAsc (n=3) 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0
LP (n=16) 2 12,5 2 12,5 0 0,0 0 0,0
4. Resultados e Discussão 35
Neste estudo, referente aos escarros, o desempenho da PCR quando comparado às baciloscopias positivas não apresentou diferença estatisticamente significante. Autores descrevem resultados com a investigação de amostras pulmonares para pesquisa de
Mycobacterium spp. diretamente do material clínico (SUFFYS et al., 2001; OGUSKU e
SALEM, 2004; GHOLOOBI et al., 2014). Ogusku e Salem (2004) obtiveram resultados estatisticamente semelhantes nos exames positivos e negativos por ambas as técnicas. Entretanto, outros autores descrevem desempenho da PCR superior quando comparado à baciloscopia. Lima et al (2008), investigando pacientes para diagnóstico de TB pulmonar obtiveram 54,2% de baciloscopias positivas e 77,5% quando realizadas por PCR enquanto Aniet al (2009) obtiveram 28% de baciloscopias positivas e 84% quando realizadas por PCR (ANI et al., 2009; LIMA et al., 2008).
Estudos relatam também positividade inferior da PCR em relação às baciloscopias e culturas. Assis et al (2007) obtiveram 14 amostras de escarro com resultado negativo na PCR que apresentavam cultura positiva. Autores descrevem que um dos pontos importantes para o uso da PCR no diagnóstico é a obtenção de DNA de qualidade a partir de amostras clínicas. A presença de substâncias inibidoras da enzima Taq polimerase durante o processo de extração pode estar relacionada ao sucesso da técnica (BAZZO et al., 2004; ASSIS et al., 2007). Desta forma, acredita-se que alguma substância inibidora possa ter influenciado os três materiais biológicos com baciloscopia positiva que se apresentaram negativos na PCR.
Em função da praticidade e da rapidez diagnóstica, a baciloscopia direta da amostra respiratória para investigação de tuberculose é amplamente empregada e estabelecida para pesquisa de bacilo álcool-ácido resistente (BAAR). Vários estudos relatam o desempenho da baciloscopia frente à cultura, considerada padrão-ouro (GUERRA; REGO; CONDE, 2008; NOGUEIRA; ABRAHÃO; MALUCELLI, 2000; NUNES et al., 2008; ASSIS et al., 2011).
4. Resultados e Discussão 36
Tabela 10. Comparação da positividade da baciloscopia com a cultura em amostras de escarro.
Cultura + Cultura - Total
BAAR + 28 5 33
BAAR - 0 6 6
Total 28 11 39
Avaliação da baciloscopia positiva comparada à cultura
Valor Intervalo confiança 95% Sensibilidade 1 (0,87 – 1)
Especificidade 0,54 (0,28 – 0,78) VPP* 0,84 (0,78 – 0,96) RV positiva** 2,2 (1,1 - 4,2)
*VPP – Valor preditivo positivo **Razão de verossimilhança positiva
ASSIS et al. (2011) descrevem sensibilidade de 58% e especificidade de 96% e Guerra et al., (2008) relatam que a sensibilidade da baciloscopia pode chegar até 80%.
Apesar de a cultura ser considerada o padrão ouro para o diagnóstico da tuberculose pulmonar (LIMA et al., 2008; SBPT, 2011), em nosso estudo a baciloscopia revelou cinco amostras positivas que se apresentaram negativas na cultura: duas amostras contaminadas que posteriormente foram identificadas como M. tuberculosis, uma amostra que
apresentou 1 bacilo na baciloscopia na qual o paciente foi diagnosticado com TB pleural, além de duas amostras negativas sem causa aparente. Esse fato justifica a baixa especificidade da baciloscopia.
4. Resultados e Discussão 37
Tabela 11. Comparação da positividade da ITS- PCR com a cultura em amostras de escarro.
Cultura + Cultura - Total
PCR + 28 2 30
PCR - 0 9 9
Total 28 11 39
Avaliação da PCR positiva comparada à cultura
Valor Intervalo confiança 95% Sensibilidade 1 (0, 87 - 0,10) Especificidade 0,81 (0, 52 –0,94) VPP* 0,93 (0,87 – 0,99) RV positiva** 5,5 (1,57 – 19,2)
*VPP – Valor preditivo positivo **Razão de verossimilhança positiva
Ao avaliar o desempenho da PCR em relação à cultura obteve-se 100% de sensibilidade e 81% de especificidade. Semelhante à baciloscopia, a PCR revelou uma especificidade inferior à cultura devido a duas amostras positivas na PCR que se apresentaram negativas na cultura: uma amostra que apresentou um bacilo na baciloscopia e paciente diagnosticado com TB pleural, e uma amostra negativa sem causa aparente.
Vários autores descrevem o desempenho da PCR para detecção do
Mycobacterium spp. comparado à baciloscopia e cultura. Furini et al. (2013) descrevem
resultados da PCR comparados à cultura para investigação pulmonar, a sensibilidade e a especificidade foram 100% e 83%, respectivamente. Assis et al. (2011), relatam sensibilidade 94,7% e especificidade 96,6% para PCR e cultura 52,6% sensibilidade e 99,4% especificidade. Parekh et al. (2006) relatam sensibilidade de 91.5% e especificidade de 86% (PAREKH et al., 2006; ASSIS et al., 2011; FURINI et al., 2013). Alguns autores apresentam resultados semelhantes e outros, resultados discordantes, com isso, existem relatos de PCR com sensibilidade variando de 58,3% a 94,7% (LIMA et al., 2008; CHAGAS et al., 2010; HASAN et al., 2012).
Análise dos outros materiais biológicos
4. Resultados e Discussão 38
uma urina positivas (9,3%), enquanto que nenhuma destas amostras foi positiva pela baciloscopia ou cultura (Tabela 12).
Tabela 12. Positividade entre as técnicas ITS-PCR, hsp65, BAAR e culturas de outros
Materiais biológicos. Seção Técnica de Laboratórios de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.
LBA : Lavado broncoalveolar; LCR: Líquido Cefalorraquidiano; LAsc: Líquido Ascítico; LP: Líquido Pleural.
*comparação entre BAAR + e PCR+, p=0,00;
& comparação entre PCR+ e Cultura+, p=0,00.
A baciloscopia e a cultura das amostras dos outros materiais biológicos foram negativas na totalidade de amostras investigadas e apresentaram positividade de 9,3% quando investigadas pela PCR. Esses dados são semelhantes aos de outros autores. Ani et al. (2009) investigando Tb extrapulmonar obtiveram resultados negativos pela baciloscopia e cultura, enquanto que, pela PCR essas amostras foram positivas. GHOLOOBI et al. (2014) investigando diversos espécimes clínicos, obtiveram 75% de sensibilidade e 83,3% de especificidade para a baciloscopia, enquanto que a PCR apresentou 58,3% de sensibilidade e 100% de especificidade. (ANI et al., 2009; GHOLOOBI et al., 2014).
Lima et al. (2008) descrevem que o desempenho da baciloscopia e cultura quando comparadas à PCR está diretamente ligado à qualidade da amostra. Em amostras paucibacilares a PCR pode detectar até 1-20 bacilos/mL, enquanto que na baciloscopia são necessários 5.000-10.000 bacilos/mL para um resultado eficiente (LIMA et al., 2008; SILVA JUNIOR, 2012). O desempenho da baciloscopia torna-se mais crítico em relação às amostras extrapulmonares. Devido à própria característica da amostra (diluição), a quantidade de bacilos disponíveis dificulta a técnica de baciloscopia. Segundo Gholoobi et al. (2014) a baixa sensibilidade na baciloscopia pode estar relacionada também a falta de padronização na técnica como: investigação de apenas uma amostra e até mesmo a erros laboratoriais
Amostras ITS-PCR
N %
hsp65
N %
BAAR + N %
Culturas N % LBA (n=42) 5 11,9 3 7,1 0 0,0 0 0,0
LCR (n=8) 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0
Urina (n=17) 1 5,9 1 5,9 0 0,0 0 0,0
LAsc (n=3) 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0
4. Resultados e Discussão 39
(GHOLOOBI et al., 2014).
Das formas de tuberculose extrapulmonar, a tuberculose pleural é a mais comum encontrada no adulto imunocompetente e, em cerca de 20% dos casos, está associada com lesão pulmonar ativa (LOPES et al., 2006a). A positividade da baciloscopia no líquido pleural
ocorre em 5% dos casos e na cultura pode chegar a 40%.
No presente estudo, entre as 10 amostras positivas encontradas pela técnica PCR e negativas pela baciloscopia e cultura, destaca-se líquido pleural de paciente que apresentou vários derrames pleurais e internações no HCFMB, com realização de exames laboratoriais para diagnóstico de TB sempre negativos: Adenosina Deaminase (ADA), baciloscopia, cultura em LJ e em Myco-F®). Posteriormente identificou-se a espécie por PCR sendo M.
tuberculosis.
Diversos estudos destacam a importância da Biologia molecular para identificação do Mycobacterium spp. Entre as maiores vantagens no emprego dessas tecnologias está: a
agilidade no diagnóstico o qual poderá ser realizado até 48 horas para identificação da espécie (ITS-PCR; IS6110; PRA-PCR; sequenciamento de DNA) e detecção do DNA/RNA
micobacteriano mesmo em amostras paucibacilares, o que geralmente não ocorre com a metodologia tradicional (ROTH et al., 2000; OGUSKU e SALEM, 2004; LIMA et al., 2008; DORA et al., 2008; CHIMARA et al., 2008; FREITAS; SIQUEIRA; ALBANO, 2009; POROCA et al., 2009; SENNA et al., 2011).
No presente estudo a pesquisa de Mycobacterium spp. no material biológico
apresentou positividade superior quando realizada pela técnica ITS-PCR em comparação à técnica hsp65, correspondendo a 41 e 26 amostras, respectivamente (Tabela 13 e Figuras 3 e
4. Resultados e Discussão 40
Tabela 13. Positividade entre as técnicas ITS-PCR e hsp65 para pesquisa de Mycobacterium
spp. dos Materiais biológicos. Unidade de Pesquisa Experimental - UNIPEX Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.
Amostras hsp65
N %
ITS-PCR
N %
Escarro (n=44) 20 45,4 33 75,0
LBA (n=42) 3 7,1 5 11,9
LCR (n=8) 0 0,0 0 0,00
Urina (n=17) 1 5,9 1 5,9
LAsc (n=3) 0 0,0 0 0,00
LP (n=16) 2 6,3 2 12,5
Total (n=130) 26 20,0 41 31,6
1 2 3 4 5 6 7 8
300 200 100
Figura 3. Eletroforese em gel de agarose para pesquisa de Mycobacterium
4. Resultados e Discussão 41
Como o objetivo do estudo não foi identificar o total de amostras de MNT encontradas e sim, avaliar a técnica de PCR para identificação de micobactérias diretamente do material clínico, apenas algumas amostras foram sequenciadas para confirmar espécies de micobactérias.
Das 44 amostras positivas, 41 foram confirmadas pelo PCR, sendo 28 identificadas como M. tuberculosis com a pesquisa do fragmento IS6110, seis identificadas
pelo sequenciamento (duas M. chelonae, duas M. imunogenum, uma M. iranicum e uma
M.chelonae/M.abscessus/M.massiliensis) e sete amostras sem identificação de espécie (Tabela
14 e figura 5).
439 300 200 100
1 2 3 4 5 6 7
Figura 4. Eletroforese em gel de agarose para pesquisa de fragmento do gene hsp65 para identificação de Mycobacterium spp.
4. Resultados e Discussão 42
Tabela 14. Identificação das espécies de micobactérias dos 41 materiais biológicos positivos pela PCR. Pesquisa dos fragmentos IS6110 e seqüenciamento de
DNA utilizando os fragmentos ITS-PCR e gene hsp65. Unidade de Pesquisa
Experimental-UNIPEX da Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, 2015.
Amostras
/espécies M.tuberculosis M.chelonae M.iranicum M.imunogenum
M.chelonae/ M.abscessus/ M.massiliensis
Mycobacterium
spp.
Escarro 27 1 1 1 3
LBA 1 1 1 2
LCR
Urina 1
Lasc
LP 1 1
Total 28 2 1 2 1 7
Tabela 15. Identificação de Mycobacterium spp. pelo sequenciamento de DNA. Instituto
de Biotecnologia (IBTEC) Unesp, Botucatu.
Amostra Espécie Código* Posição** Similaridade
Escarro M. iranicum HQ009484.1 213-298 100%
Escarro M. immunogenum AM421285.1 107-292 99%
Escarro M. chelonae DQ986509.1 104-245 100%
LBA M. immunogenum AM421285.1 134-222 100%
LBA M. chelonae/M.
abscessus/M.massilliense KT779852.1 KT779846.1 JX270661.1 138-169 138-169 149-180 100% 100% 100%
LBA M. chelonae KT779863.1 6-40 100%
LBA: Lavado broncoalveolar
* identifica a sequência do GenBank com maior score encontrada pelo algoritmo BLAST; ** Localiza a sequência obtida dentro da sequência do GenBank.
Das 34 amostras de escarro com baciloscopia positiva, 28 foram identificadas como M. tuberculosis pela cultura. As mesmas 34 amostras quando testadas pela PCR,
