Efeito anti-inflamatórios e mecanismo de ação da proteína anexina A1 em modelo de uveíte induzida por endotoxina

Cam p u s d e São José d o R i o Pr eto

PROGR AM A DE PÓS -GR ADU AÇ ÃO EM GENÉTIC A

ANA PAULA GIROL

Efeitos anti-inflamatórios e mecanismo de ação da proteína

anexina A1 em modelo de uveíte induzida por endotoxina

T e s e a p r e s e n t a d a p a r a o b t e n ç ã o d o T í t u l o d e D o u t o r e m G e n é t i c a .

Ana Paula Girol

Efeitos anti-inflamatórios e mecanismo de ação da proteína anexina A1

em modelo de uveíte induzida por endotoxina

Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Genética, junto ao Programa de Pós-Graduação em Genética, Área de Concentração –

Genética Humana e Biologia Celular e Molecular, do Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas,

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São

José do Rio Preto.

Orientadora: Profª. Drª. Sonia Maria Oliani

Coorientadora: Profª. Drª. Cristiane Damas Gil

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE Campus de São José do Rio Preto – UNESP

Girol, Ana Paula.

Efeitos anti-inflamatórios e mecanismo de ação da proteína anexina A1 em modelo de uveíte induzida por endotoxina / Ana Paula Girol. – São José do Rio Preto: [s.n.], 2012.

175 f. : il. , 30 cm.

Orientador: Sonia Maria Oliani Coorientador: Cristiane Damas Gil

Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de

Biociências, Letras e Ciências Exatas

1. Bioquímica. 2. Anexina – Mecanismo de ação (Bioquímica). 3.

Peptídeos. 4. Uveíte. 5. Endotoxina. I. Oliani, Sonia Maria. II. Gil, Cristiane Damas. III. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. IV. Título.

ANA PAULA GIROL

Efeitos anti-inflamatórios e mecanismo de ação da proteína

anexina A1 em modelo de uveíte induzida por endotoxina

Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Genética, junto ao Programa de Pós-Graduação em Genética, Área de Concentração – Genética Humana e Biologia

Celular e Molecular, do Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas,

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do

Rio Preto.

Banca Examinadora

Prof

_{. Dr}

_{. Sonia Maria Oliani}

UNESP

–

São José do Rio Preto

Orientadora

Prof

. Dr

. Janetti Nogueira de Francischi

UFMG

–

Belo Horizonte

Prof. Dr. José Roberto Mineo

UFU

–

Uberlândia

Prof

. Dr

. Dorotéia Rossi Silva Souza

FAMERP

–

São José do Rio Preto

Prof

_{. Dr}

_{. Ana Elizabete Silva}

UNESP

–

São José do Rio Preto

Dedico este trabalho

Aos meus filhos, Pedro, João e Marina, minhas descobertas do amor incondicional e das profundas emoções, por me mostrar o que importa;

Ao Reinaldo, minha segurança,

por entender minhas necessidades e prioridades, e permanecer ao meu lado;

AGRADECIMENTOS

Porque nada é possível sem apoio, reconheço a importância e agradeço:

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelos auxílios concedidos ao desenvolvimento dessa pesquisa (CNPq Universal, processo 472056/2009-3 e FAPESP, processo 2011/00128-1).

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pela bolsa de Doutorado concedida.

À Profa. Dra. Lilian Madi-Ravazzi, Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Genética do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE-UNESP), por possibilitar a realização desse trabalho.

Às Faculdades Integradas da Fundação Padre Albino (FIPA) pelo auxílio financeiro nas viagens e pelo uso de suas dependências, o Laboratório de Histopatologia e Imuno-histoquímica e a Unidade Didática e de Pesquisas Experimentais (UDPE).

À minha coorientadora, Profa_{. Dr}a_{. Cristiane Damas Gil, pessoa admirável e} exemplo de ética, responsabilidade e dedicação, pela amizade e por compartilhar experiências e ensinamentos científicos com entusiasmo e alegria.

Ao Prof. Neder Abdo e à Profa_{. Dr}a_{. Cibelle Rocha Abdo, docentes das FIPA,} modelos de educadores, pelos ensinamentos e estímulo.

À Kallyne Kioko Mimura, amiga querida, persistente e entusiasmada com a ciência e o processo de aprendizagem, pela contribuição valiosa na finalização desse trabalho.

À Profª. Drª. Sandra Farsky pela doação dos camundongos usados no desenvolvimento desse trabalho e pela colaboração na busca de desvendar o mecanismo de ação da anexina A1.

À querida amiga Thaís Santana Gastardelo, por quem tenho carinho especial, pessoa dedicada, organizada, competente e equilibrada, pelo apoio e incentivo constantes.

Aos valiosos companheiros do Laboratório de Imunomorfologia do IBILCE Analice Andreoli da Silva, Ayla Blanco Poltronieri, Bruna Stuqui, Fabiane Ferreira Martins, Jéssica Zani Lacerda, Laila Toniol Cardin, Leandro Pires Araújo, Lucas Azevedo, Poatan da Silva Pinoti, Rubens de Paula Junior, Marina de Paula Silva e Tatiana Aparecida Pimentel, pela atenção, alegria constante e participação nas descobertas.

Às queridas Carla Patrícia Carlos e Nathália Martins Sonehara, pessoas especiais, pelo auxílio, carinho e interesse sempre presentes.

Aos colegas Caroline de Freitas Zanon, Marystela Favero de Oliveira e Pierre Sebastião da Silva com quem tive a oportunidade de desenvolver outros projetos, pelo convívio gratificante.

Às minhas irmãs queridas, Maria Isabel e Giovana, por compartilhar comigo alegrias e dificuldades, ensinamentos e esperança.

À aluna Sara Costa Souza pela confiança, carinho e vontade de aprender.

“Que eu continue com vontade de viver,

mesmo sabendo que a vida é, em muitos momentos,

uma lição difícil de ser aprendida.

Que eu permaneça com vontade de ter grandes amigos,

mesmo sabendo que, com as voltas do mundo,

eles vão embora de nossas vidas.

Que eu realimente sempre a vontade de ajudar as pessoas,

mesmo sabendo que muitas delas são incapazes de ver,

sentir, entender ou utilizar essa ajuda.

Que eu mantenha meu equilíbrio,

mesmo sabendo que muitas coisas que vejo no mundo

escurecem meus olhos.

Que eu realimente a minha garra,

mesmo sabendo que a derrota e a perda são ingredientes

tão fortes quanto o sucesso e a alegria.

Que eu atenda sempre mais à minha intuição,

que sinaliza o que de mais autêntico eu possuo.

Que eu pratique mais o sentimento de justiça,

mesmo em meio à turbulência dos interesses.

Que eu manifeste amor por minha família,

mesmo sabendo que ela muitas vezes

me exige muito para manter sua harmonia.

E, acima de tudo...

Que eu lembre sempre que todos nós

fazemos parte dessa maravilhosa teia chamada vida,

criada por alguém bem superior a todos nós!

E que as grandes mudanças não ocorrem por grandes feitos

de alguns e, sim, nas pequenas parcelas cotidianas

de todos nós!”

PREFÁCIO

Alguns fundamentos do papel da proteína anexina A1 (AnxA1) foram relatados nessa investigação. Os resultados mostram as ações anti-inflamatórias e o mecanismo de ação da AnxA1 e do seu peptídeo mimético Ac2-26 na uveíte induzida por endotoxina (EIU) em roedores e indicam essa proteína como potencial estratégia terapêutica no tratamento das doenças inflamatórias oculares, em substituição das atuais, que apresentam graves efeitos colaterais.

Os dados da tese, submetidos para publicação, foram correlacionados com os obtidos na dissertação de Mestrado da aluna Kallyne Kioko Mimura, que utilizou a linhagem de células epiteliais pigmentadas da retina humana (ARPE-19) induzidas ao estímulo inflamatório. A integração das investigações, nos modelos in vivo

(animal) e in vitro (humano) foi de fundamental importância para o esclarecimento do

papel da AnxA1 nos processos inflamatórios oculares e propiciou a confecção do manuscrito intitulado “Anti-inflammatory mechanisms of the annexin A1 protein and its mimetic peptide on in vivo and in vitro models of ocular inflammation”. Esse

trabalho foi submetido à publicação em revista indexada internacional.

Paralelamente ao trabalho desenvolvido no Doutorado, foi possível colaborar em outros projetos de pesquisa envolvendo a proteína AnxA1. O artigo “Mast cells modulate the inflammatory process in endotoxin-induced uveitis” está diretamente

relacionado ao assunto desenvolvido na tese e publicado na revista Molecular Vision

(2011). Esse artigo aponta os mastócitos como fonte de mediadores químicos fortemente associados à patofisiologia da EIU e, ainda, o efeito da proteína AnxA1 como mediadora na homeostase desse processo inflamatório.

O artigo “The impact of endogenous annexin A1 on glucocorticoid control of

inflammatory arthritis”, publicado no periódico Annals of the Rheumatic Diseases

(2012), juntamente com pesquisadores do William Harvey Research Institute de

Outro artigo, “Profile of the annexin A1 expression in gestational trophoblastic

diseases” será submetido para uma revista indexada internacional e mostra, pela

primeira vez na literatura, a expressão da AnxA1 nas molas hidatiformes parcial e completa e, a relação dessa proteína com processos de proliferação celular nas vilosidades coriônicas.

RESUMO

A proteína anexina A1 (AnxA1) apresenta importantes propriedades anti-inflamatórias e estudos sugerem que suas ações podem ser mediadas por receptores para peptídeos formilados (FPR). Embora os efeitos anti-inflamatórios da AnxA1 e de seus peptídeos miméticos, especialmente o Ac2-26, tenham sido explorados em diversas investigações, são raros os estudos da AnxA1 nas inflamações oculares. Em razão dos graves efeitos colaterais dos tratamentos atuais para a uveíte, uma importante causa de cegueira, investigamos, in vivo, os efeitos e

o mecanismo de ação da AnxA1 nos tecidos oculares de roedores na uveíte induzida por endotoxina (EIU). Ratos machos (Rattus novergicus) foram

anestesiados e inoculados, por via subcutânea, na pata direita com lipopolissacarídeo (LPS) (100μg) para o desenvolvimento da uveíte. Após, foram divididos em grupos experimentais (n=10/grupo): EIU por 24 e 48h; EIU por 24h e tratados farmacologicamente por administrações tópica e sistêmica do peptídeo Ac2-26 (100μg) e EIU 24h tratado sistemicamente com peptídeo e Boc2, antagonista do FPR (50μg/animal). Para confirmar a importância da AnxA1 endógena na resolução da inflamação ocular, camundongos selvagens e deficientes para AnxA1 (AnxA1-/-) foram induzidos à uveíte por 24h sem tratamento. Nesses animais AnxA1-/- _a resposta inflamatória foi exacerbada em comparação com os selvagens. Enquanto, nos olhos dos ratos, as análises quantitativas dos leucócitos, dosagens de interleucina (IL)-1β, IL-6, fator de necrose tumoral (TNF)-α, óxido nítrico (NO) e

administração do Boc2. Os resultados indicam, pela primeira vez na literatura, a expressão da proteína AnxA1 e do receptor fpr2 em tecidos oculares na EIU. Ainda, a modificação pós-traducional específica para AnxA1, que é fosforilada apenas em serina, sugere a sua ativação pela proteína quinase C e translocação para a membrana plasmática. A diminuição do extravasamento leucocitário e dos marcadores da inflamação após a administração sistêmica ou tópica do peptídeo Ac2-26 indicam os efeitos anti-inflamatórios da AnxA1, especialmente com o tratamento sistêmico. O aumento na expressão do fpr2 nos grupos tratados, em comparação com o controle e EIU 24h, assim como a inibição dos efeitos anti-inflamatórios do peptídeo na presença do Boc2, apontam o fpr2 como receptor das ações anti-inflamatórias da AnxA1. Em conjunto, os dados indicam que a proteína AnxA1 e o seu peptídeo mimético participam no controle da resposta inflamatória na EIU e podem representar uma terapia promissora no tratamento da uveíte.

ABSTRACT

Annexin A1 (AnxA1) is a protein that displays anti-inflammatory properties and some

studies suggest that its effects may be mediated by formyl peptide receptors (FPR).

Although the anti-inflammatory activities of AnxA1 and its mimetic peptides, including

Ac2-26, have been explored in several investigations, the role of AnxA1 in ocular

inflammatory processes has not yet been elucidated. Given the common side effects

of the current therapies used to treat uveitis, an important cause of blindness

worldwide, we investigated, in vivo, the AnxA1 effects and mechanism of action in

endotoxin-induced uveitis (EIU). Rattus norvegicus were induced to uveitis

(lipopolysaccharide - 100μg) and divided into experimental groups (n=10/group): EIU untreated for 24 and 48h, EIU treated with topical applications (4/4h) or a single

intravenous injection of Ac2-26 (100μg) and EIU systemically treated with the peptide and Boc2, the FPR antagonist (50μg/animal). To confirm the importance of

endogenous AnxA1 in the resolution of ocular inflammation, wild-type and AnxA1

deficient (AnxA1-/-) mice were also induced to uveitis without treatment for 24h.

AnxA1-/- mice showed exacerbated inflammation compared to wild-type animals. As,

quantitative analyses of leukocytes, interleukin (IL)-1β, IL-6, tumor necrosis factor

(TNF)-α, nitric oxide (NO) levels and cyclooxigenase (COX)-2 expression in ocular

tissues and/or in aqueous humor of rats eyes revealed the anti-inflammatory effects

of the peptide, which were abrogated in the Boc2 presence. Immunohistochemical

analysis of AnxA1, serine-or-tyrosine-phosphorylated AnxA1 (AnxA-S27-PO4 -

AnxA-Y21-PO4) in the ocular tissues showed AnxA1 and AnxA1-S27-PO4 expression in

epithelial (cornea, iris and ciliary processes) and nervous cells. These expressions

were increased in EIU 24h and Boc2 groups but reduced in 48h and after treatments.

There was no immunoreactivity for AnxA1-Y21-PO4 in either group. The expression of

fpr2 was similar to that observed for AnxA1, but interestingly, there was increased

expression in the groups treated with the peptide and decreased immunostaining in

the Boc2 group. The results indicate for the first time in the literature, the expression

suggests its activation by protein kinase C and translocation to the plasma

membrane. The reduction in leukocyte extravasation and inflammatory mediators

following the systemic or topical Ac2-26 administrations indicate the

anti-inflammatory effects of AnxA1, especially after systemic treatment. The increased

expression of fpr2 in the treated groups compared to control and EIU 24h, as well as

the inhibition of anti-inflammatory effects of the peptide in the presence of Boc2 point

the fpr2 as the receptor of the AnxA1 anti-inflammatory actions. All together, data

indicate that AnxA1 protein and its peptide mimetic are involved in the inflammatory

response in EIU and may represent a promising therapy for the treatment of uveitis.

Keywords: ocular inflammation, endotoxin-induced uveitis, annexin A1, peptide

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Estrutura da proteína anexina A1 (AnxA1) ... 4

Figura 2 Algumas das ações da AnxA1 ... 6

Figura 3 Hipótese do destacamento celular ... 8

Figura 4 Mobilização e clivagem da proteína AnxA1 ... 9

Figura 5 Migração leucocitária mediada por receptores FPR... 12

Figura 6 Fosforilação da AnxA1 ... 13

Figura 7 Análises histopatológicas dos tecidos oculares na EIU ... 26

Figura 8 Efeitos do peptídeo Ac2-26 na EIU ... 28

Figura 9 Expressão da enzima COX-2 nos tecidos oculares na EIU ... 29

Figura 10 Superexpressão da COX-2 nos tecidos oculares de camundongos deficientes para AnxA1 (AnxA1-/-) na EIU ... 30

Figura 11 Expressão da AnxA1 nos tecidos oculares na EIU ... 31

Figura 12 Expressão da AnxA1-S27-PO4 e AnxA1-Y21-PO4 na EIU ... 33

Figura 13 Comparação da expressão da AnxA1 e fpr2 nos tecidos oculares ... 34

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

μg Microgramas

μL Microlitros

A Alanina

ABC-transporter Sistema transportador cassete ligante do ATP

Ac2-26 Peptídeo mimético derivado da região N-terminal da anexina-A1 ANOVA Análise de variância

AnxA1 Anexina-A1

AnxA1 Gene da anexina-A1

AnxA1-/- Animais deficientes para AnxA1 AnxA1-S27-PO4 Anexina-A1 fosforilada em serina AnxA1-Y21-PO4 Anexina-A1 fosforilada em tirosina

ARPE-19 Células derivadas do epitélio pigmentado da retina humana

Boc1 e Boc2 Antagonistas não seletivos dos receptores para peptídeos formilados

BSA Albumina bovina

COX-2 Ciclo-oxigenase-2

cPLA2 Fosfolipase A2 citosólica Dleu Leucina esteroisômero

E Ácido glutâmico

EIU Endotoxin-induced uveitis = Uveíte induzida por endotoxina

F Fenilalanina

FPR Receptores para peptídeos formilados

Fpr Gene do receptor para peptídeos formilados

G Gramas

GCs Glicocorticoides

GPCR G protein-coupled receptor = receptor associado à proteina G

HÁ Humor aquoso

I Isoleucina

ICAM-1 Molécula de adesão intercelular-1

IL Interleucina

iNOs Sintase do óxido nítrico

K Lisina

K/BxN Soro artritogênico

kDa Kilodaltons

Kg Kilogramas

L Leucina

LPS Lipopolissacarídeo

LXA4 Lipoxina A4

M Metionina

MAPK Proteina quinase ativadora de mitógeno

MG Miligrama

mL Mililitros

mM Milimolar

mm2 Milímetros quadrados

mRNA Ácido ribonucleico mensageiro NF-κB Fator de transcrição nuclear κB

N Número de animais

N Aspargina

NO Nitric oxide = óxido nítrico

PBS Tampão fosfato de sódio

Pg Picogramas

PG2 Prostaglandina E2

Phe Fenilalanina

PI3K Fosfatidilinositol 3-quinase

PR3 Proteinase 3

Q Glutamina

RPM Rotações por minuto

S Serina

S.E.M. Standard error of mean = Erro padrão da média

SSA Amiloide sérica

T Treonina

TLR4 Receptor toll like 4

TNF-D Fator de necrose tumoral D

V Valina

vs. Versus

W Triptofano

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ... 1

1.1 UVEÍTE ... 2

1.2 ANEXINA A1 ... 3

1.3 EXPRESSÃO DA ANEXINA A1 NOS PROCESSOS INFLAMATÓRIOS ... 6

1.4 RECEPTOR FPR ... 10

1.5 ANEXINA A1 E OLHO ... 14

2 OBJETIVOS ... 16

2.1 OBJETIVO GERAL ... 17

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 17

3 MATERIAL E MÉTODOS ... 18

3.1 ANIMAIS ... 19

3.2 MODELO EXPERIMENTAL DE UVEÍTE E PROTOCOLOS DE ... 19

TRATAMENTO 3.3 ANÁLISES HISTOPATOLÓGICAS ... 21

3.3.1 Fixação, processamento e inclusão para microscopia de luz ... 21

3.3.2 Análises imuno-histoquímicas ... 21

3.4 ANÁLISE QUANTITATIVA DOS LEUCÓCITOS NO HUMOR ... 22

AQUOSO 3.5 ANÁLISES DE PROTEÍNAS NOS TECIDOS OCULARES APÓS ... 22

MACERAÇÃO 3.5.1 Análises quantitativas dos níveis de citocinas e NO ... 23

3.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 23

4 RESULTADOS ... 24

4.1 PEPTÍDEO AC2-26 INIBE O INFLUXO DE NEUTRÓFILOS NO ... 25

HUMOR AQUOSO E TECIDOS OCULARES NA EIU 4.2 ADMINISTRAÇÃO DO AC2-26 REDUZ O EXTRAVASAMENTO DE ... 27

PROTEÍNAS E LIBERAÇÃO DE MEDIADORES QUÍMICOS NA EIU 4.3 A EXPRESSÃO DA COX-2 NA EIU É INIBIDA APÓS TRATAMENTOS ... 28 COM AC2-26 E EXACERBADA NA PRESENÇA DO BOC2 E NOS

-/-4.4 ANXA1 ENDÓGENA AUMENTA DURANTE A INFLAMAÇÃO NOS ... 31

TECIDOS OCULARES 4.5 ANXA1 SOFRE FOSFORILAÇÃO ESPECÍFICA DURANTE A EIU... 32

4.6 RECEPTOR FPR2 É O INTERMEDIÁRIO DAS AÇÕES ... 33

ANTI-INFLAMATÓRIAS DA ANXA1 5 DISCUSSÃO ... 36

6 CONCLUSÕES ... 44

REFERÊNCIAS ... 47

APÊNDICE A: ANTI-INFLAMMATORY MECHANISMS OF ... 64

THE ANNEXIN A1 PROTEIN AND ITS MIMETIC PEPTIDE IN VIVO AND IN VITRO MODELS OF OCULAR INFLAMMATION APÊNDICE B: MAST CELLS MODULATE THE INFLAMMATORY ... 108

PROCESS IN ENDOTOXIN-INDUCED UVEITIS APÊNDICE C: THE IMPACT OF ENDOGENOUS ANNEXIN A1 ... 119

ON GLUCOCORTICOID CONTROL OF INFLAMMATORY ARTHRITS APÊNDICE D: PROFILE OF THE ANNEXIN A1 EXPRESSION IN ... 130

GESTATIONAL TROPHOBLASTIC DISEASES ANEXO A: APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA SOBRE ... 153

INTRODUÇÃO - 2

1.1. UVEÍTE

A uveíte é uma das mais prejudiciais condições oculares em humanos e uma das principais causas de cegueira no mundo (READ, 2006; AGRAWAL et al., 2010).

Esse processo inflamatório, que é caracterizado pelo acúmulo de leucócitos nos tecidos oculares, pode afetar qualquer parte do olho, sendo uma condição dolorosa e associada à fotofobia (BANSAL; GUPTA, V; GUPTA, A, 2010). A natureza recorrente dessa inflamação pode resultar em complicações secundárias como catarata, glaucoma, descolamento de retina e, por fim, destruição dos tecidos oculares e cegueira (JANCEVSKI; FOSTER, 2010; SRIVASTAVA; RAJAPPA; KAUR, 2010). A uveíte pode ser causada por organismos infecciosos ou processos imunomediados, entre os quais, a doença de Behçet, espondilite anquilosante, síndrome de Reiter e artrite reumatoide juvenil (HEILIGENHAUS et al., 2010).

O modelo animal de uveíte induzida por endotoxina (EIU) (ROSENBAUM et al.,

1980) tem sido usado por vários pesquisadores para o entendimento da patogênese dessa inflamação ocular (PLANCK et al., 2008; SRIVASTAVA; RAJAPPA; KAUR,

2010). Esse modelo serve como paradigma para a uveíte anterior humana (MCMENAMIN; CREWE, 1995; GUPTA et al., 2008), com algumas alterações no

segmento posterior (vítreo e retina) (RUIZ-MORENO; THILLAYE; KOZAK, 1992; ALTAN-YAYCIOGLU et al., 2006).

O lipopolissacarideo (LPS), usado como indutor da EIU, se liga a receptores toll-like 4 (TLR4) (CHANG; MCCLUSKEY; WAKEFIELD, 2006) e estimula a síntese e liberação de mediadores químicos proinflamatórios, como o óxido nítrico (NO) (GOUREAU et al., 1995; KOGA et al., 2002), fator ativador plaquetário, fator de

necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina 1β (IL-1β), interleucina 6 (IL-6) e outras

citocinas (CURNOW; MURRAY, 2006; MEDEIROS et al., 2008; LI et al., 2010). A

cascata de ativação mais frequentemente envolvida nesse modelo é a translocação do fator de transcrição nuclear кβ (NF-кβ) do citoplasma para o núcleo (MEDEIROS et al., 2008; KALARIYA et al., 2011).

Ainda, na EIU, como em outros modelos, o LPS induz o aumento na expressão da enzima ciclo-oxigenase-2 (COX-2), responsável pela produção da prostaglandina 2 (PG2) (MINGHETTI; LEVI, 1995; MINGHETTI et al., 1999; YADAV; SRIVASTAVA;

INTRODUÇÃO - 3

para o desenvolvimento da uveíte por meio da quebra da barreira hemato-ocular, o que leva a infiltração de células inflamatórias no humor aquoso (HA) e extravasamento de proteínas (DE KOZAK et al., 2007; MEDEIROS et al., 2008;

TOUCHARD, et al., 2010).

Na uveíte experimental, o início da transmigração dos neutrófilos na íris ocorre entre duas e quatro horas da administração da endotoxina (BECKER et al., 2000). O

processo inflamatório atinge o pico máximo em 24 horas após a injeção do LPS e, gradualmente, regride nas próximas 24 horas (YANG, P et al., 2003;

HAFEZI-MOGHADAM et al., 2007).

Atualmente, o tratamento farmacológico para uveíte inclui corticosteroides, agentes quimioterápicos e inibidores do TNF-α. No entanto, os efeitos colaterais

desses fármacos, como o aumento da pressão ocular ou citotoxidade, limitam os seus usos (HEILIGENHAUS et al., 2010; LEE; FOSTER, 2010; ROSENBAUM, 2010;

SRIVASTAVA; RAJAPPA; KAUR, 2010). Desse modo, os recentes avanços nos mecanismos da inflamação e a descoberta de vários mediadores endógenos anti-inflamatórios têm propiciado novas investigações sobre possibilidades terapêuticas para o tratamento da uveíte, em substituição das atuais, devido aos seus efeitos colaterais (RODRIGUESet al., 2007; MEDEIROS et al., 2008; BANSAL; GUPTA, V;

GUPTA, A, 2010; HEILIGENHAUS et al., 2010).

Entre os mediadores anti-inflamatórios, particularmente a proteína endógena anexina A1 (AnxA1), o primeiro membro caracterizado da superfamília das anexinas (FLOWER; BLACKWELL, 1979), atua para limitar o processo inflamatório (FLOWER, 1988; KAMAL; FLOWER; PERRETTI, 2005; D'ACQUISTO, 2009), e pode representar uma terapia alternativa para o tratamento da uveíte.

1.2. ANEXINA A1

INTRODUÇÃO - 4

descritos e clonados em mamíferos (PEPINSKY et al., 1988; RAYNAL; POLLARD, 1994), e em humanos, o gene AnxA1, está localizado na região cromossômica

9q12-9q21.2 (HUEBNERet al., 1988).

Estruturalmente, as anexinas compreendem dois domínios, uma pequena região N-terminal que varia em comprimento e composição e, um domínio C-central, formado por quatro a oito repetições de uma sequência de 70 a 80 aminoácidos, altamente conservada (MUNN; MUES, 1986; LIM; PERVAIZ, 2007). Dois sítios de ligação ao cálcio são expressos na região convexa de cada repetição. Essa região faz face à membrana celular, enquanto a região côncava, com o domínio N-terminal, permanece livre para interagir com as proteínas citosólicas (RESCHER; GERKE, 2004).

O domínio N-terminal é único para cada membro da superfamília, confere as atividades e funções específicas das anexinas e contém sítios para processos pós-traducionais, tais como, fosforilação, glicosilação e proteólise (PERRETTI; FLOWER, 2004; SOLITO et al., 2006; PERRETTI; D'ACQUISTO, 2009). A representação

esquemática da estrutura primária e o arranjo tridimensional da AnxA1 são mostrados na figura 1.

III

-

A B

COOH

AMVSEFLKQAWFIE NEEQEYVQTV CH ₃CO

CH 3COHNH

I II IV

Rescher & Gerke, 2004 Peptídeo Ac2 - 26

(resíduos acetilados 2-26)

Figura 1. Estrutura da proteína anexina A1 (AnxA1). (A) Representação esquemática da estrutura primária da AnxA1, com destaque do sítio ativo anti-inflamatório (peptídeo Ac2-26). (B) Ilustração do arranjo tridimensional dessa proteína (RESCHER; GERKE, 2004).

Uma importante característica da AnxA1, que também é compartilhada por outros membros da família, é a habilidade para alterar sua conformação durante a ligação aos cátions de cálcio (GERKE. CREUTZ; MOSS, 2005; PERRETTI; D´ACQUISTO, 2009). Na presença de concentrações de cálcio ≥ a 1mM a AnxA1 é reestruturada, o

INTRODUÇÃO - 5

expõe seus aminoácidos ao ambiente extracelular e gera a forma ativa da proteína (ROSENGARTH; GERKE; LUECKE, 2001; PERRETTI; D´ACQUISTO, 2009).

A AnxA1 é amplamente distribuída no organismo e pode ser encontrada em diversos tipos celulares como células endoteliais, epiteliais dos pulmões, intestinos, estômago, mama, rins e sinoviócitos (SAMPEY; HUTCHINSON; MORAND, 2000; ALLCOCK et al., 2001; OLIANI et al., 2001; OLIANI; PERRETTI, 2001; GIL et al.,

2006; PERRETTI; D'ACQUISTO, 2009; ARAUJO et al., 2012) e, também, em células

estromais, como os fibroblastos (TAGOE et al., 2008). No entanto, a expressão da AnxA1 tem sido observada especialmente em células relacionadas aos processos de defesa (KAMAL; FLOWER; PERRETTI, 2005) como neutrófilos (PERRETTI et al.,

2000; ALLCOCK et al., 2001; OLIANI et al., 2001; SOLITO et al., 2003a); mastócitos

(OLIANI et al., 2000; OLIANI et al., 2008), eosinófilos (OLIANI; DAMAZO;

PERRETTI, 2002), monócitos (GOULDING; LUYING; GUYRE., 1990; SOLITO et al.,

2001) e linfócitos (D'ACQUISTO et al., 2007; D'ACQUISTO et al., 2008).

Após a identificação da AnxA1 como um mediador endógeno das ações anti-inflamatórias dos GCs (FLOWER, 1988), o papel dessa proteína nos processos inflamatórios tem sido extensamente explorado por diversos pesquisadores. Revisões recentes da literatura têm evidenciado amplitude nos aspectos da biologia da AnxA1, que desempenha atividades desde o sistema nervoso central (SOLITO et al., 2008) até o imune adaptativo (D´ACQUISTO; PERRETTI; FLOWER, 2008; PERRETTI; D´ACQUISTO, 2009).

Devido ao fato de exercer múltiplas funções em diferentes sistemas, entre elas, a fusão de membranas, fagocitose, proliferação e apoptose (PERRETTI; FLOWER, 2004; KAMAL; FLOWER; PERRETTI, 2005; D´ACQUISTO; PERRETTI; FLOWER, 2008) a AnxA1 também pode ser relacionada a várias condições patológicas, como câncer e doenças autoimunes (ROVIEZZO et al., 2002; RODRIGUES-LISONI et al., 2006; OLIANI; GIL, 2006; LIM; PERVAIZ, 2007; SILISTINO-SOUZA et al., 2007). O

termo “anexinopatias” tem sido usado para definir as doenças humanas nas quais os

níveis anormais de anexina contribuem para a patogênese (RODRIGO et al., 2011).

INTRODUÇÃO - 6

Figura 2. Algumas das ações biológicas da AnxA1. A) Inibição da fosfolipase A2 (cPLA2) e ciclo-oxigenase-2 (COX-2). B) Inibição da diapedese leucocitária mediada pelo receptor FPR. C) Expressão aumentada da AnxA1 após tratamento com glicocorticoide (GR). D) Estimulação da fagocitose de células apoptóticas. E) Inibição da proliferação por meio de fosforilações. F) Indução da apoptose pela superexpressão da AnxA1 e sua translocação para o núcleo. Tirosina quinase do receptor do fator de crescimento endotelial (EGF-R), proteína quinase C (PKC), proteína quinase do receptor do fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGFR-TK), tirosina quinase do receptor do fator de crescimento dos hepatócitos (HGFR-TK), proteína promotora da apoptose (BAD), proteína inibidora da apoptose (BCL2). (LIM; PERVAIZ, 2007).

O nosso grupo de pesquisa tem, ao longo dos anos, investigado o efeito da AnxA1 nos processos alérgicos (SENA et al., 2006), na biologia tumoral (RODRIGUES-LISONI et al., 2006; SILISTINO-SOUZA et al., 2007) e, principalmente, nas inflamações experimentais (OLIANI et al 2001; DAMAZO et al., 2005; GASTARDELO et al., 2009; SILVA; GIROL; OLIANI, 2011), avaliando, sobretudo, a atividade dos neutrófilos e mastócitos.

1.3. EXPRESSÃO DA ANEXINA A1 NOS PROCESSOS INFLAMATÓRIOS

INTRODUÇÃO - 7

efeitos garantem que níveis suficientes de ativação celular sejam alcançados, mas não excedidos, o que proporciona a homeostase do processo inflamatório.

O desenvolvimento de uma linhagem de camundongos deficientes para o gene

AnxA1 (HANNON et al., 2003) contribuiu para melhorar o entendimento da proteína

nos processos inflamatórios. Pesquisas desenvolvidas com esse modelo animal mostraram aumento da expressão da COX-2 e cPLA2 no pulmão e timo (HANNON et al., 2003; CROXTALL et al., 2003). Esse fato sugeriu que a expressão das enzimas COX-2 e cPLA2 podem ser indiretamente afetadas pela deleção do gene

AnxA1 (HANNON et al., 2003; ROVIEZZO et al., 2002). Outros estudos com

camundongos deficientes para a AnxA1 (AnxA1-/-) também demonstraram expressão exacerbada da COX-2 em macrófagos após estímulo com CGs (YONA et al., 2005)

e, nos tecidos cartilaginoso e ósseo durante o desenvolvimento esquelético (DAMAZO et al., 2007). Ainda, no mesmo modelo animal, o aumento na expressão

da COX-2 foi demonstrado na medula espinhal durante episódios dolorosos (AYOUB; YAZID; FLOWER, 2008), indicando que a AnxA1 está relacionada à modulação da dor nociceptiva.

No modelo experimental de artrite induzida por antígeno, camundongos AnxA1 -/-desenvolveram doença articular severa (YANG, Y et al., 2004). A resposta inflamatória foi caracterizada por aumentos da migração celular para o líquido sinovial e expressão de RNAm das citocinas IL-1β, TNF-α e IL-6, o que indicou a

regulação endógena da AnxA1 na expressão desses mediadores proinflamatórios. A exacerbação da resposta inflamatória, com aumento na liberação de citocinas, também foi observada na peritonite experimental induzida por zimosan em camundongos AnxA1-/- (DAMAZO et al., 2006).

Após a descoberta de que a atividade biológica da AnxA1 poderia ser reproduzida pelos primeiros aminoácidos da porção N-terminal da proteína (peptídeo Ac2-26) (CIRINO et al., 1993), ou por alguns peptídeos menores (PERRETTI et al.,

2001), tornou-se uma prática comum o uso dessas moléculas em modelos experimentais de inflamação aguda (SOLITO et al., 2003a; GAVINS et al., 2007),

crônica (YANG; HUTCHINSON; MORAND, 1999; GIBBS et al., 2002) e sistêmica

(DAMAZO et al., 2005).

INTRODUÇÃO - 8

animais (DAMAZO et al., 2005). O efeito protetor da AnxA1 exógena, associado ao

processo isquêmia/reperfusão, foi observado por meio da redução do dano tecidual no miocárdio (LA et al., 2001a; GAVINS et al., 2005a,b), no cérebro (GAVINS et al.,

2007) e nos rins (ARAUJO et al., 2010; FACIO et al., 2011; ARAUJO et al., 2012).

Em leucócitos polimorfonucleares (PMNs) inativos, a AnxA1 está localizada no citoplasma, contudo, pode ser rapidamente mobilizada para a superfície celular, de maneira cálcio-dependente, após adesão dos leucócitos às monocamadas endoteliais (PERRETTI, 1997; PERRETTI, 2003). Análises de microscopia intravital de vasos inflamados, in vivo, limitaram o local de ação da AnxA1 em leucócitos

aderentes e, a administração da AnxA1 exógena ou de seus peptídeos derivados, reduziu a adesão e migração dos leucócitos no endotélio das vênulas pós-capilares (GAVINS et al., 2003).

Uma das hipóteses formuladas para o entendimento do mecanismo pelo qual a AnxA1, na superfície celular, inibe a adesão dos neutrófilos é conhecida como hipótese do destacamento (DE COUPADE; SOLITO; LEVINE, 2003; PERRETTI; GAVINS, 2003), cuja representação esquemática pode ser observada na figura 3. De acordo com esse modelo, a AnxA1 na superfície celular interage com seu receptor, o que leva a um aumento na concentração intracelular de cálcio e a quebra da L-selectina.

INTRODUÇÃO - 9

A atividade da AnxA1 na inibição da transmigração dos leucócitos também está associada ao desequilíbrio da firme adesão. Estudos mostram que os GCs usados no tratamento da asma e rinite alérgica bloqueiam a molécula de adesão integrina

β2 por meio da regulação da AnxA1, com inibição da translocação da cPLA2 para o

envoltório nuclear e diminuição da afinidade da integrina β2 às moléculas de adesão

intercelular-1 (ICAM-1) (LIU et al., 2005; MELITON et al., 2008). .

Além da adesão dos neutrófilos no endotélio das vênulas pós-capilares, como o evento principal na externalização da AnxA1 na membrana plasmática desses leucócitos (GIL et al., 2006), um processo de proteólise também pode ser observado (PERRETTI; FLOWER, 2004). As análises de microscopia eletrônica indicaram a predominância da AnxA1 intacta (37 kDa) na superfície celular dos neutrófilos aderentes, enquanto os transmigrados mostraram maior quantidade da AnxA1 clivada (33 kDa) intracelular, especialmente em vesículas de endocitose (OLIANI et al., 2001). Indicações para a síntese de novo da proteína nas células extravasadas

também foram observadas (OLIANI et al., 2001), e esse evento, pode estar

correlacionado aos efeitos proapoptóticos da AnxA1 (SOLITO et al., 2003a). Na

membrana plasmática dos neutrófilos, a AnxA1 age de maneira autócrina/parácrina para reduzir o extravasamento celular (SOLITO et al., 2001; SOLITO et al., 2003a;

PERRETTI; FLOWER, 2004). A figura 4 mostra a expressão alterada da AnxA1 durante o processo de transmigração do neutrófilo.

INTRODUÇÃO - 10

Estudos mostraram que a proteinase 3 (PR3) colocaliza-se com a AnxA1 em PMNs, sendo a enzima responsável pela clivagem da região N-terminal da proteína em três sítios: Alanina11, Valina22, e Valina36 (VONG et al., 2007). Contudo, a relevância funcional da clivagem da região N-terminal da AnxA1 gerou dúvidas sobre a possibilidade desse processo ser um mecanismo homeostático, limitando a função biológica da proteína, ou um evento de ativação, levando à liberação de peptideos miméticos bioativos derivados da região N-terminal, e, desse modo, sendo a proteína um profármaco (PEDERZOLI-RIBEIL et al., 2010; PERRETTI; D´ACQUISTO, 2009). Para elucidar essa questão foram desenvolvidos experimentos com uma forma mutante da AnxA1, resistente a PR3 nos três locais de clivagem, denominada SuperAnxA1 (PEDERZOLI-RIBEIL et al., 2010). Os resultados dessa investigação mostraram que a SuperAnxA1 exibe excelentes propriedades antimigratórias em processos inflamatórios de longa duração, indicando que a clivagem da AnxA1 não é um pré-requisito para sua eficácia biológica, mas sim, um evento catabólico. Uma investigação recente em modelo de artrite induzida por soro K/BxN (PATEL et al., 2012) mostrou que a administração diária da SuperAnxA1, acelerou a resolução do processo inflamatório e propiciou melhor preservação tecidual, em comparação com a AnxA1, sendo benéfica na modulação da inflamação articular.

Outro aspecto importante na biologia da AnxA1 tem sido o estudo do seu mecanismo de ação na superfície celular. A observação que a AnxA1 e os seus peptídeos miméticos ligam-se a uma classe específica de receptores transmembrana acoplados a proteína G, os receptores para peptídeos formilados (nFPR) (WALTHER; RIEHEMANN; GERKE., 2000) revolucionou o campo de

pesquisa da AnxA1. Esse estudo fundamental permitiu novas investigações nas relações funcionais e moleculares entre a AnxA1 e a família de receptores FPR (PERRETTI; DALLI, 2009).

1.4. RECEPTOR FPR

Várias investigações indicam que a ação regulatória da AnxA1 sobre a migração transendotelial leucocitária, pode ser mediada pelo FPR (PERRETTI et al., 2001;

INTRODUÇÃO - 11

apresenta divergência evolutiva significante em espécies de mamíferos, com notável expansão diferencial de genes em murinos (GAO et al., 1998).

Em camundongos, a família de genes Fpr é complexa e está localizada no

cromossomo 17, compreendendo sete membros. Enquanto, em humanos, apenas três tipos de receptores foram encontrados e incluem, FPR1, FPR2/ALX (também conhecido como FPRL-1) e FPR3 (antigamente designado com FPRL-2) (YE et al.,

2009). Ambos os genes FPR2/ALX e FPR3 estão colocalizados com o FPR1 na

região cromossômica 19q13.3 (BAO et al., 1992). Os receptores fpr1 e fpr2 de

roedores (anteriormente designados Fpr-rs1 e Fprs-rs2) correspondem, respectivamente, ao FPR1 e FPR2/ALX em humanos, com os quais compartilham homologias de 77 e 76% (GAO et al., 1998; YE et al., 2009; DUFTON; PERRETTI, 2010).

Embora os FPRs sejam classicamente conhecidos por agirem como receptores quimiotáticos, regulando a migração leucocitária, eles são expressos em populações celulares diversas e ativados por uma variedade de ligantes endógenos e exógenos que provocam respostas biológicas diferentes, tais como lipoxina A4 (LXA4), amiloide sérica A (SAA) e AnxA1 (LEet al., 2001); (DUFTON; PERRETTI, 2010). A

AnxA1 ativa somente o receptor FPR2/ALX (HAYHOE et al., 2006), já o peptídeo

Ac2-26, in vitro, ativa todos os três receptores da família FPR (RESCHER et al.,

2002; ERNST et al., 2004). No entanto, tais respostas são bloqueadas por

antagonistas não seletivos dos receptores FPRs, os antagonistas Boc1 e Boc2 (STENFELDT et al., 2007), por meio da inibição do fluxo de cálcio induzido pela

AnxA1 em PMNs (LA et al., 2001a).

INTRODUÇÃO - 12

A expressão do receptor FPR2 pode estar intimamente relacionada com a expressão da AnxA1. O estudo realizado por Sawmynaden e Perretti (2006) mostrou que o tratamento com dexametasona aumenta a expressão proteica da AnxA1 e do FPR2/ALX em monócitos. A hipótese proposta por Perretti e D'Acquisto (2009) é que os GCs, inicialmente, promovem rápida mobilização da AnxA1 na superfície celular onde o receptor está localizado, por mecanismos não-genômicos. Em seguida, levam ao aumento da expressão dos genes AnxA1 e FPR2 por mecanismos

genômicos. A interação dos receptores FPRs nas células inflamatórias é representada na figura 5.

INTRODUÇÃO - 13

Os mecanismos moleculares responsáveis pela mobilização da AnxA1 para a membrana plasmática são dependentes do tipo celular. A proteína pode ser externalizada pela exocitose dos grânulos de gelatinase dos neutrófilos ou após ativação do sistema transportador cassete ligante do ATP (ABC-transporter) nos

macrófagos (PERRETTI; D´ACQUISTO, 2009).

O acesso da AnxA1 endógena aos receptores de membrana pode, ainda, depender de processos de fosforilação que possibilitam a translocação da proteína do citoplasma para a superficie celular (SOLITO et al., 2003b; SOLITO et al., 2006;

SOLITO et al., 2008). Mecanismos não genômicos, mas que requerem as vias

proteina quinase C (PKC), fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) e proteina quinase ativadora de mitógeno (MAPK) foram observados em células pituitárias folículoestelares humanas, nas quais, os GCs e o LPS induziram a fosforilação da AnxA1 em serina e translocação da proteína recém-fosforilada para a superfície celular (SOLITO et al., 2003b; SOLITO et al., 2006). Curiosamente, a dexametasona

não teve efeito sobre a fosforilação da AnxA1 em tirosina (SOLITO et al., 2003b). A

figura 6 mostra o processo de fosforilação da AnxA1 em serina, induzido pelo LPS.

INTRODUÇÃO - 14

Os processos de fosforilação são, portanto, importantes para o acesso da AnxA1 endógena aos receptores de membrana após translocação. Modificações pós-traducionais também foram observadas, in vivo, no fígado de camundongos durante

o processo inflamatório (DAMAZO et al., 2008) e, estão relacionadas a resolução da resposta inflamatória.

1.5. ANEXINA A1 E OLHO

Como exposto, a proteína AnxA1 tem sido investigada em diversos modelos inflamatórios, contudo, é pouco explorada em tecidos oculares em condições normais ou patológicas, especialmente inflamatórias. Em olhos de moluscos a expressão da proteína foi observada na córnea e células sensoriais (KERSCHBAUM; DONATO; HERMANN, 1997), e sua regulação pela luz e serotonina (RAJU et al., 1993) indica a participação da proteína no mecanismo de sinalização intracelular relacionado ao ritmo circadiano.

A expressão da AnxA1 foi analisada em tecidos oculares durante o desenvolvimento embrionário em camundongos (WELLS et al., 2004), sugerindo uma possível ação dessa proteína na proliferação e diferenciação celular. O envolvimento da AnxA1 no desenvolvimento da catarata induzida por galactose foi estudado em ratos (KOSHIMOTO et al., 1992). A proteína foi detectada nas células

epiteliais da lente e apresentou um aumento gradual até o décimo dia do processo de desenvolvimento da catarata, com o máximo de densidade no décimo quarto dia, quando iniciou um rápido declínio. Polimorfismos de DNA que resultaram em alterações fisicoquímicas da AnxA1 foram observados em células do cristalino de camundongos (HOEHENWARTER et al., 2008), contudo não estão relacionados ao processo de cataratogênese.

Uma investigação recentemente desenvolvida no nosso laboratório (SILVA; GIROL; OLIANI, 2011) relata a expressão da AnxA1 nos leucócitos e HA na uveíte induzida por endotoxina em ratos e, aponta essa proteína como um dos mediadores essenciais na homeostasia do processo inflamatório.

INTRODUÇÃO - 15

OBJETIVOS - 17

2.1 . OBJETIVO GERAL

Em função dos raros estudos da proteína AnxA1 em tecidos oculares analisamos, in vivo, os efeitos anti-inflamatórios e o mecanismo de ação da AnxA1

nos tecidos oculares controles e EIU, seguidos ou não da administração do peptídeo Ac2-26 e do antagonista do receptor FPR, o Boc2.

2.2 . OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Verificar em ratos, nos tecidos oculares controles, EIU após 24 e 48 horas sem tratamento, EIU 24 horas após tratamentos tópico e sistêmico com Ac2-26 e administração sistêmica Ac2-26/Boc2, os seguintes aspectos:

i. Estudar os efeitos do peptídeo Ac2-26 na EIU, seguido ou não da administração do Boc2, por meio das análises quantitativas dos neutrófilos nos tecidos oculares e no HA;

ii. Avaliar nos sobrenadantes dos tecidos oculares, após maceração, as dosagens das proteínas totais pelo método de Bradford e, dos mediadores químicos TNF-α, IL1β, IL6 e NO pelo ensaio de ELISA;

iii. Analisar as expressões das proteínas AnxA1, AnxA1 fosforilada em serina (AnxA1-S27-PO4) e tirosina (AnxA1-Y21-PO4), do receptor fpr2 e da COX-2 nos tecidos oculares, por imuno-histoquímica.

Ainda, em camundongos selvagens e deficientes para AnxA1, nos grupos controles e EIU 24 horas, estudar:

iv. A expressão da COX-2 nos tecidos oculares por imuno-histoquímica.

MATERIAL E MÉTODOS - 19

3.1. Animais

Ratos machos, da espécie Rattus novergicus (Wistar), foram obtidos do Biotério da

Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), com 6 a 8 semanas de vida (150 a 200 g) e distribuídos em 6 grupos (n=10/grupo). Também foram usados camundongos machos (25 g) selvagens e deficientes para AnxA1 (AnxA1-/-), provenientes do Laboratório de Toxicologia Experimental da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP, e divididos em 4 grupos (n=3/grupo). Os animais foram mantidos em gaiolas, em ambiente com temperatura controlada (22 a 25oC), e receberam água e ração ad libitum.

Os procedimentos experimentais foram realizados no Laboratório de Imunomorfologia, IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto, e conduzidos de acordo com as normas da Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEEA) da FAMERP (Protocolo 0467/2009).

3.2. Modelo experimental de uveíte e protocolos de tratamento

Para o desenvolvimento da uveíte induzida por endotoxina (EIU), os ratos foram anestesiados com isoflurano (1%) e inoculados, por via subcutânea, na pata direita com 100 μg de lipopolissacarídeo (LPS, tipo Escherichia coli, sorotipo 0127: B8,

Sigma Chemical Co. Poole, Dorset, UK) diluído em 0,1 mL de solução salina tamponada (PBS) (SILVA; GIROL; OLIANI, 2011). Os animais foram mantidos nessas condições por 24 (n=10) e 48 (n=10) horas.

A eficácia terapêutica do peptídeo N-terminal Ac2-26 da AnxA1 (Ac-AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK) (RAYNAL; POLLARD, 1994) foi testada em dois grupos de animais EIU 24 horas (n=10/grupo), por administrações tópica e sistêmica, na dose de 1 mg/kg (100 μg/animal) diluído em PBS (LA et al., 2001a).

Para o tratamento tópico o peptídeo foi instilado em ambos os olhos, após 4, 8 e 12 horas da administração do LPS (1 gota de 30 μL/olho). Enquanto, no grupo tratado sistemicamente o Ac2-26, a administração foi realizada 2 horas após a injeção do LPS, por via subcutânea, na região dorso-cervical.

MATERIAL E MÉTODOS - 20

Pharmaceuticals, Basingstoke, UK) (50 μg/animal) diluído em PBS (GASTARDELO et al., 2009). Animais sem manipulação (n=10) foram usados como controles.

Para avaliar a importância da AnxA1 endógena, um segundo conjunto de experimentos foi desenvolvido com camundongos. Animais selvagens (n=3) e AnxA1-/- (n=3) receberam injeção intraperitoneal de 100 μg de LPS em 20 μL de PBS para o desenvolvimento da EIU (YAGCI et al., 2010) e sacrificados após 24 horas. Enquanto, outros camundongos selvagens (n=3) e AnxA1-/- (n=3) foram mantidos como controles, sem manipulação.

Os animais foram anestesiados com isoflurano (1%) antes de cada tratamento experimental. O sacrifício dos animais experimentais foi realizado por dose excessiva do anestésico.

O esquema abaixo mostra os animais experimentais e procedimentos metodológicos realizados.

Neutrófilos – tecidos (inclusão em resina LRGold) e HA (câmara de Neubauer);

Proteínas totais, citocinas (IL-1β, IL-6, TNF-α) e NO–maceração (Bradford e ELISA)

( Análises histopatológicas

e quantitativas

AnxA1, AnxA1-S27_-PO

4, AnxA1-Y21-PO4,,

COX-2, Fpr2

Imuno-histoquímica

(inclusão em parafina)

ANOVA e Bonferroni Análises estatísticas (quantificações e densitometria) Grupos Experimentais

EIU induzida por LPS

(1mg/Kg) Tratamentos farmacológicos com Ac2-26 (1mg/Kg) (24 hs) Aplicações tópicas

(3 x 4/4hs)

(n=10)

Injeção sistêmica

única

(n=10)

Injeção sistêmica + antagonista Boc2

(50_μg/animal) (n=10)

Sem tratamentos

24 hs (pico da inflamação) e 48 hs (remissão)

(n=10/grupo) Grupo Controle

(n=10)

Rattus norvegicusmachos - Wistar (200g)

Camundongos machos (25g)

Selvagens

•Controle (n=3) •EIU 24h (n=3)

LPS (100μg)

Deficientes para a AnxA1 (AnxA1-/-₎

•Controle (n=3) •EIU 24h (n=3)

MATERIAL E MÉTODOS - 21

3.3. Análises histopatológicas

3.3.1. Fixação, processamento e inclusão para microscopia de luz

Os olhos direitos (n=7/grupo), dos ratos controle e experimentais, foram fixados em paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 0,5%, tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,4, por 24 horas, a 4ºC. Em seguida, o material foi lavado no mesmo tampão, desidratado em série crescente de metanol e incluído na resina LRGold (London Resin Co., Reading, Berkshire, UK) (OLIANI et al., 2001). Diferentemente, os olhos esquerdos (n=7/grupo), após coleta do HA, foram fixados em formol a 10%, desidratados em ordem crescente de álcool e incluídos em parafina para as análises imuno-histoquímicas. Os olhos dos camundongos (n=3/grupo) também foram processados para inclusão em parafina.

As análises histopatológicas dos olhos e quantitativas dos neutrófilos transmigrados nos tecidos oculares foram realizadas no microscópio Axioskop 2-Mot Plus-Zeiss, do Laboratório de Imunomorfologia, IBILCE/UNESP. Para essas análises foram usadas secções de 1 μm do material incluído em LRGold e coradas com Azul de Toluidina a 1% em solução de bórax 1% (TAAB Laboratories, UK). Os neutrófilos foram quantificados em 10 secções/olho (com espaço de 30 μm entre as secções) e os valores obtidos foram expressos como número de neutrófilos por mm2.

3.3.2. Análises imuno-histoquímicas

MATERIAL E MÉTODOS - 22

câmara úmida a 4ºC, com os seguintes anticorpos primários policlonais rabbit:

anti-AnxA1 (1:2000) (Zymed Laboratories, Cambridge, UK); anti-anti-AnxA1-S27-PO4 (SOLITO et al., 2006) e anti-AnxA1-Y21-PO4 (1:1000) (DAMAZO et al., 2008); anti-fpr2 (1:2000) (GASTADELO et al., 2009) e anti-COX-2 (1:1000) (Invitrogen) diluídos em BSA a 1%; (f) lavados com PBS por 15 minutos (três lavagens de 5 minutos cada); (g) incubados com o anticorpo secundário biotinilado (kit LSAB DAKO) por 30 minutos; (h) lavados com PBS por 15 minutos (três lavagens de 5 minutos cada); (i) imersos em complexo estreptavidina peroxidase conjugada por 30 minutos; (j) lavados com PBS por 15 minutos (três lavagens de 5 minutos cada); (k) incubados em substrato diaminobenzidina (DAB) por 5 minutos a 37º C, no escuro, para revelação (Kit DAB+CHROMOGEN DAKO); (l) lavados em água destilada, contracorados com Hematoxilina e as lâminas montadas com BIOMOUNT (British Biocell International, Cardiff, UK).

As análises densitométricas foram realizadas com auxílio do software Axiovision.

Para essas análises foram usadas 3 lâminas diferentes de cada animal e 15 pontos foram analisados em 3 regiões da córnea, íris, processos ciliares e retina para a obtenção de uma média relacionada com a intensidade da imunomarcação. Os valores foram obtidos como unidades arbitrárias (DAMAZO et al., 2006).

3.4. Análise quantitativa dos leucócitos no humor aquoso (HA)

O HA foi coletado por punção da câmara anterior dos olhos esquerdos dos ratos (n=7/grupo) e 10 μL foram utilizados e corados em solução de Turk (90 μL). Os

neutrófilos foram quantificados na câmara de Neubauer. Os valores para quantificação dos leucócitos do HA foram demonstrados em número de células x 105 por mL.

3.5. Análises de proteínas nos tecidos oculares após maceração

MATERIAL E MÉTODOS - 23

preparo dessa solução, uma pastilha de coquetel de proteases foi dissolvida em 7 mL de água destilada, e adicionado 1 μL de Tween 20. O material foi incubado por 1 hora, a 4oC, sob agitação constante, e, em seguida, centrifugado a 14.000 rpm, por 10 minutos, a 4oC, sendo os sobrenadantes coletados e imediatamente congelados a - 70oC.

A determinação da concentração de proteínas, presentes nos sobrenadantes dos tecidos oculares após maceração, foi feita em ensaio de Bradford (Biorad, Hemel Hempsted, UK).

3.5.1. Análises quantitativas dos níveis de citocinas e NO

O aumento na expressão dos mediadores inflamatórios contribui para o desenvolvimento da uveíte, assim os níveis de IL-1β; IL-6, TNF-α e NO foram

analisados com kits de imunoensaio comercialmente disponíveis (R&D Systems, Minneapolis, MN) (MEDEIROS et al., 2008) e de acordo com as instruções do fabricante. Para os ensaios foram usados 50 μL dos sobrenadantes provenientes dos tecidos oculares após maceração. As respectivas concentrações dos mediadores químicos foram determinadas por um leitor de densidade óptica (Molecular Devices Sunnyvale, CA).

3.6. Análises estatísticas

RESULTADOS - 25

4.1. Peptídeo Ac2-26 inibe o influxo de neutrófilos no humor aquoso e tecidos oculares na EIU

Os leucócitos foram analisados nos olhos dos ratos controles e induzidos ao processo inflamatório por 24 (EIU 24h) e 48 horas (EIU 48h) sem tratamento. Outros animais foram induzidos à uveíte e tratados farmacologicamente com Ac2-26 por meio das administrações tópica (EIU/Ac2-26 tópico) e sistêmica (EIU/Ac2-26 sistêmico) e, ainda, com o peptídeo e Boc2 (EIU/Ac2-26/Boc2).

Nos olhos controles observamos ausência de leucócitos transmigrados nos segmentos anterior (figuras 7A e B) e posterior (figura 7C). Após 24 horas da inflamação intraocular com LPS ocorreu intenso influxo de leucócitos, principalmente neutrófilos, no segmento anterior do olho. Essas células foram observadas no HA, nas câmaras anterior e posterior e, também, no estroma da íris, corpo ciliar e processos ciliares (figuras 7D e E). Embora o processo inflamatório induzido pelo LPS tenha sido mais evidente no segmento anterior do olho, foi possível verificar alterações no segmento posterior. Nesse segmento, os neutrófilos foram observados extravasados no humor vítreo e na retina, principalmente na camada plexiforme interna (figura 7F).

A redução na transmigração dos neutrófilos no HA foi verificada após administração do Ac2-26 nos animais tratados por via subcutânea (15,83 ± 1,30, p<0,001) e instilações tópicas (19,00 ± 3,02, p<0,001) (figura 7M) quando comparamos ao grupo EIU 24h (55,67 ± 5,67). Nos tecidos oculares, também ocorreram reduções no número de leucócitos extravasados após os tratamentos sistêmico (204,0 ± 37,79, p<0,001) (figuras 7G-I e N) e tópico (313,0 ± 39,10, p<0,001) (figuras 7J-L e N) em relação à EIU 24h (747,8 ± 57,39). Entre os tratamentos, a diminuição na transmigração dos neutrófilos foi mais acentuada nos olhos dos animais que receberam Ac2-26 por via subcutânea.

RESULTADOS - 26

As análises relacionadas com os efeitos do Boc2 (antagonista do receptor fpr2, na EIU), mostraram que a administração conjunta Ac2-26/Boc2 anulou a ação inibitória do peptídeo sobre o extravasamento de neutrófilos no HA (47,67 ± 4,47) e nos tecidos oculares (623,9 ± 45,77) (figuras 7M e N).

Figura 7. Análises histopatológicas dos tecidos oculares na EIU. Ausência de leucócitos nos tecidos controles (A-C). Influxo de neutrófilos (setas) na íris (D) processos ciliares (E) e retina (F) após LPS 24 h. Diminuição do extravasamento celular após tratamentos sistêmico (G-I) e tópico (J-L) com Ac2-26. Cortes: 1 μm. Barras: 10 μm. Análises quantitativas dos neutrófilos no humor aquoso (HA) (M) e nos tecidos oculares (N). Os dados mostram média ± SEM de neutrófilos x 105 mL e de neutrófilos/mm2, respectivamente no HA e tecidos oculares de ratos controles, induzidos à uveíte (EIU 24h) e (EIU 48h) e tratados 26 sistêmico), 26 tópico) e (EIU/Ac2-26/Boc2) (n = 7 animais/grupo). *** p<0,001 e * p<0,05 versus controle, ††† _{p<0,001 versus EIU 24h,} ‡‡‡ _{p<0,001 e} ‡‡ _{p<0,01 versus EIU 48h,} §§§ _{p<0,001 versus EIU/Ac2-26 sistêmico,} ααα_{p<0.001 e} αα

RESULTADOS - 27

4.2. Administração do Ac2-26 reduz o extravasamento de proteínas e liberação

de mediadores químicos na EIU

As proteínas totais nos sobrenadantes dos tecidos oculares após maceração foram analisadas nos olhos dos ratos em todos os grupos experimentais. Após 24 horas do processo inflamatório sem tratamento, ocorreu aumento significante nos níveis de proteínas totais (p<0,001) quando comparamos ao controle. Esses níveis foram menores na EIU 48h (p<0,001) e nos animais tratados com Ac2-26 pelas vias subcutânea (p<0,001) e tópica (p<0,05) em relação à fase inicial do processo inflamatório (figura 8A). Enquanto, no grupo EIU/Ac2-26//Boc2 a concentração de proteínas totais foi similar à EIU 24h (figura 8A), mostrando reversão dos efeitos inibitórios do peptídeo e aumento na permeabilidade vascular.

As citocinas IL-1β, IL-6, TNF-α e, o NO, moléculas multifuncionais que

desempenham papel importante na defesa do hospedeiro nas reações inflamatórias de fase aguda, foram analisadas nos sobrenadantes dos tecidos oculares após maceração. Os resultados indicaram baixos níveis de IL-1β, IL-6, TNF-α e NO nos

olhos dos animais controles e, como esperado, aumento na EIU 24h (p<0,001) (figuras 8B-E). Quando o peptídeo foi administrado pelas vias subcutânea ou tópica, ocorreram reduções nas concentrações de IL-1β (p<0,001 em ambos os tratamentos), IL-6 (p<0,01 no grupo sistêmico), TNF-α (p<0,001 no grupo sistêmico e p<0,05 no tópico) e NO (p<0,001 e p<0,01 sistêmico e tópico, respectivamente) comparadas à EIU 24h. Diminuições similares da secreção de citocinas e produção de NO foram observadas na EIU 48h, indicando a resolução temporal do processo inflamatório (figuras 8B-E). Diferentemente, no grupo EIU/Ac2-26/Boc2 observamos níveis dos mediadores químicos equivalentes à EIU 24h, com aumentos significantes de IL-1β (p<0,001), IL-6, TNF-α (p<0,01) e NO (p<0,001) em relação ao controle (figuras 8B-E).

RESULTADOS - 28

Figura 8. Efeitos do peptídeo Ac2-26 na EIU. Diminuição nos níveis de proteínas totais (A), inibição de IL-1β (B), IL-6 (C), TNF-α (D) e NO (E) nos olhos de ratos. Os resultados são expressos como

média ± SEM de mg de proteínas/mL, pg de citocinas/mL e _μM de NO nos sobrenadantes após maceração dos tecidos oculares controles, induzidos à uveíte (EIU 24h) e (EIU 48h) e tratados (EIU/Ac2-26 sistêmico), (EIU/Ac2-26 tópico) e (EIU/Ac2-26/Boc2) (n = 6 animais/grupo). *** p<0,001, ** p<0,01 e * p<0,05 versus controle, ††† _p<0,001, †† _{p<0,01 e} † _{p<0,05 versus EIU 24h,} ‡‡ _{p<0,01 e} ‡

p<0,01 versus EIU 48h, §§§ p<0,001 e § p<0,05 versus EIU/Ac2-26 sistêmico.

4.3. A expressão da COX-2 na EIU é inibida após tratamentos com Ac2-26 e

exacerbada na presença do Boc2 e nos animais AnxA1-/-

Nos tecidos oculares dos ratos controles (figuras 9A-C) detectamos a expressão da COX-2 apenas na retina (figura 9C), onde é considerada constitutiva. Nos animais induzidos à uveíte não tratados (figuras 9D-F) e, após os tratamentos sistêmico (figuras 9G-I), tópico (figuras 9J-L) e Ac2-26/Boc2 (figuras 9M-O) observamos imunomarcação para COX-2 nos segmentos anterior e posterior. Não houve imunorreatividade no controle da reação (figura 9P).

RESULTADOS - 29

após os tratamentos sistêmico (p<0,001) e tópico (p<0,001) em relação à EIU 24h (figura 9Q). A imunorreatividade diminuída também foi observada nos tecidos oculares dos animais tratados sistemicamente comparada aos tópicos (p<0.05) e EIU 48h (p<0,001) (figura 9Q). Enquanto, os EIU/Ac2-26/Boc2 revelaram expressão aumentada da COX-2 (p<0,001) em relação aos tratados apenas com Ac2-26 (figura 9Q), mostrando reversão do efeito do peptídeo Ac2-26.

Figura 9. Expressão da enzima COX-2nos tecidos oculares na EIU. Ausência de imunomarcação nos epitélios da córnea (A) e processos ciliares (B) e, fraca expressão na retina (C) nos olhos controles. Células epiteliais e nervosas mostrando intensa imunorreatividade para COX-2 na córnea (D), processos ciliares (E) e retina (F) após LPS 24 horas. Diminuição da expressão após os tratamentos sistêmicos (G-I) e tópicos (J-L) com Ac2-26 e, intensa após Ac2-26 e Boc2 (M-O). Ausência de imunorreatividade no controle da reação (P). Contracoloração: Hematoxilina. Barras: 10

μm. Análise densitométrica da COX-2 (Q). Os resultados foram obtidos como média ± S.E.M. do índice densitométrico dos olhos de ratos controles, induzidos à uveíte (EIU 24h) e (EIU 48h) e tratados (EIU/Ac2-26 sistêmico), (EIU/Ac2-26 tópico) e (EIU/Ac2-26/Boc2) (n = 7 animais/grupo). *** p<0,001 e * p<0,05 versus controle, ††† _{p<0,001 versus EIU 24h,} ‡‡‡ _{p<0,001 e} ‡‡ _{p<0,01 versus EIU}

RESULTADOS - 30

Os experimentos desenvolvidos com camundongos mostraram padrão de expressão da COX-2 semelhante ao observado nos tecidos oculares de ratos, com aumento da imunorreatividade nos selvagens EIU 24h (p<0,001) (figuras 10D-F e N) comparado aos selvagens controles (figuras 10A-C e N). Expressão elevada da COX-2 também foi observada nos AnxA1-/- EIU 24h (p<0,001) (figuras 10J-L e N) comparada aos AnxA1-/- controles (figuras 10G-I e N). As análises densitométricas revelaram inflamação exacerbada nos tecidos oculares dos AnxA1-/- EIU24h (p<0,01) em relação aos selvagens induzidos à uveíte (figura 10N). O controle da reação confirma a especificidade da COX-2 (figura 10M).

Figura 10. Superexpressão da COX-2 nos tecidos oculares de camundongos deficientes para AnxA1 (AnxA1-/-)na EIU. Ausência de imunorreatividade nos epitélios da córnea e processos ciliares nos grupos controles e, fraca expressão na retina dos animais selvagens (A-C) e AnxA1-/- (G-I). Expressão intensa nos animais selvagens (D-F) e AnxA1-/- (J-L) após LPS 24 h. Ausência de imunorreatividade no controle da reação (M). Contracoloração: Hematoxilina. Barras: 10 μm. Análise densitométrica da COX-2 (N). Os resultados foram obtidos como média ± S.E.M. do índice densitométrico dos olhos de camundongos controles selvagens e AnxA1-/- e, selvagens e AnxA1-/- induzidos à uveíte por 24 h (n = 3 animais/grupo). *** p<0,001 versus selvagem controle, ††† _p<0,001

RESULTADOS - 31

4.4. AnxA1 endógena aumenta durante a inflamação nos tecidos oculares

A imunorreatividade para AnxA1 foi observada nos epitélios da córnea, íris, processos ciliares e na retina dos tecidos oculares dos ratos controles (figuras 11A-D), EIU 24h (figuras 11E-H), EIU 48h (figuras 11I-L), tratados com Ac2-26 (figuras 11M-P) e Ac2-26/Boc2 (figuras 11Q-S). A especificidade da marcação foi confirmada pelo controle da reação (figura 11T).

Figura 11. Expressão da AnxA1 nos tecidos oculares na EIU. Expressão nos epitélios da córnea (A), íris (B) e processos ciliares (C) e, na retina (D) dos ratos controles. Expressão aumentada após 24 h da indução da inflamação (E-H), diminuída após 48 h (I-L) e tratamento sistêmico com Ac2-26 (M-P) e, intensa após Ac2-26 e Boc2 (Q-S). Ausência de imunorreatividade no controle da reação (T). Contracoloração: Hematoxilina. Barras: 10 μm. Análise densitométrica da AnxA1 (U). Os resultados foram obtidos como média ± S.E.M. do índice densitométrico dos olhos controles, induzidos à uveíte (EIU 24h) e (EIU 48h) e tratados (EIU/Ac2-26 sistêmico), (EIU/Ac2-26 tópico) e (EIU/Ac2-26/Boc2) (n = 7 animais/grupo). *** p<0,001 e * p<0,05 versus controle, ††† _{p<0,001 e} ††

RESULTADOS - 32

As análises densitométricas da expressão da AnxA1 nos tecidos oculares (figura 11U) mostraram modulação no processo inflamatório, com aumento significante na EIU 24h (p<0,001) comparado ao controle. Ainda, ocorreu diminuição na EIU 48h (p<0,01) e após os tratamentos sistêmico (p<0,001) e tópico (p<0,001) comparada à EIU 24 horas. Os tecidos oculares tratados sistemicamente com Ac2-26 também mostraram menor densidade de imunomarcação em relação à EIU 48h (p<0,001) e aos tratados por instilações tópicas (p<0,001). Diferentemente, a expressão da AnxA1 no grupo EIU/Ac2-26/Boc2 foi semelhante à EIU 24h com imunorreatividade aumentada comparada aos demais grupos estudados, mostrando reversão dos efeitos do peptídeo nesse modelo experimental.

4.5. AnxA1 sofre fosforilação específica durante a EIU

As fosforilações são modificações pós-traducionais importantes para a translocação da AnxA1 do citoplasma para a superfície celular. As análises imuno-histoquímicas revelaram positividade para AnxA1-S27-PO4 nos segmentos anterior (figuras 12A e B) e posterior dos olhos dos ratos (figura 12C). Diferentemente, observamos ausência de imunorreatividade para AnxA1-Y21-PO4 (figuras 12D-F) em todos os grupos estudados. A especificidade da reação foi confirmada pelo controle da reação (figura 12G).

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Figura 12. Expressão da AnxA1-S27-PO4 e AnxA1-Y21-PO4 na EIU. Células epiteliais e nervosas expressam AnxA1-S27-PO4 na córnea (A), processos ciliares (B) e retina (C) dos ratos após LPS 24 h.

Ausência de imunorreatividade para AnxA1-Y21-PO4 (D-F) no controle da reação (G).

Contracoloração: Hematoxilina. Barras: 10 μm. Análise densitométrica da AnxA1-S27-PO4 (H). Os resultados foram obtidos como média ± S.E.M. do índice densitométrico dos olhos controles, induzidos à uveíte (EIU 24h) e (EIU 48h) e tratados (EIU/Ac2-26 sistêmico), (EIU/Ac2-26 tópico) e (EIU/Ac2-26/Boc2) (n = 7 animais/grupo). *** p<0,001 e ** p<0,01 versus controle, ††† _{p<0,001 e} †

p<0,05 versus EIU 24h, ‡ _{p<0,05 versus EIU 48h,} §§§ _{p<0,001 versus EIU/Ac2-26 sistêmico.}

4.6. Receptor fpr2 é o intermediário das ações anti-inflamatórias da AnxA1