RECEPTOR FPR

Várias investigações indicam que a ação regulatória da AnxA1 sobre a migração transendotelial leucocitária, pode ser mediada pelo FPR (PERRETTI et al., 2001; GAVINS et al., 2003; ERNST et al., 2004; DUFTON et al., 2010). A família FPR

INTRODUÇÃO - 11

apresenta divergência evolutiva significante em espécies de mamíferos, com notável expansão diferencial de genes em murinos (GAO et al., 1998).

Em camundongos, a família de genes Fpr é complexa e está localizada no cromossomo 17, compreendendo sete membros. Enquanto, em humanos, apenas três tipos de receptores foram encontrados e incluem, FPR1, FPR2/ALX (também conhecido como FPRL-1) e FPR3 (antigamente designado com FPRL-2) (YE et al., 2009). Ambos os genes FPR2/ALX e FPR3 estão colocalizados com o FPR1 na região cromossômica 19q13.3 (BAO et al., 1992). Os receptores fpr1 e fpr2 de roedores (anteriormente designados Fpr-rs1 e Fprs-rs2) correspondem, respectivamente, ao FPR1 e FPR2/ALX em humanos, com os quais compartilham homologias de 77 e 76% (GAO et al., 1998; YE et al., 2009; DUFTON; PERRETTI, 2010).

Embora os FPRs sejam classicamente conhecidos por agirem como receptores quimiotáticos, regulando a migração leucocitária, eles são expressos em populações celulares diversas e ativados por uma variedade de ligantes endógenos e exógenos que provocam respostas biológicas diferentes, tais como lipoxina A4 (LXA4), amiloide sérica A (SAA) e AnxA1 (LE et al., 2001); (DUFTON; PERRETTI, 2010). A AnxA1 ativa somente o receptor FPR2/ALX (HAYHOE et al., 2006), já o peptídeo Ac2-26, in vitro, ativa todos os três receptores da família FPR (RESCHER et al., 2002; ERNST et al., 2004). No entanto, tais respostas são bloqueadas por antagonistas não seletivos dos receptores FPRs, os antagonistas Boc1 e Boc2 (STENFELDT et al., 2007), por meio da inibição do fluxo de cálcio induzido pela AnxA1 em PMNs (LA et al., 2001a).

A função do receptor FPR nas ações antimigratórias da AnxA1 e dos seus peptídeos derivados também foi demonstrada com o uso de camundongos deficientes para o FPR na peritonite (PERRETTI et al., 2001), na microcirculação mesentérica após isquemia-reperfusão e no edema de pata induzido por carragenina (DUFTON et al., 2010). Investigações realizadas no nosso laboratório mostraram, pela primeira vez na literatura, a colocalização ultraestrutural da AnxA1 com o receptor Fpr-rs2 (fpr2) em neutrófilos de camundongos induzidos à peritonite aguda, indicando que a ação anti-inflamatória da AnxA1 pode ser mediada pelo receptor fpr2 (GASTARDELO et al., 2009).

INTRODUÇÃO - 12

A expressão do receptor FPR2 pode estar intimamente relacionada com a expressão da AnxA1. O estudo realizado por Sawmynaden e Perretti (2006) mostrou que o tratamento com dexametasona aumenta a expressão proteica da AnxA1 e do FPR2/ALX em monócitos. A hipótese proposta por Perretti e D'Acquisto (2009) é que os GCs, inicialmente, promovem rápida mobilização da AnxA1 na superfície celular onde o receptor está localizado, por mecanismos não-genômicos. Em seguida, levam ao aumento da expressão dos genes AnxA1 e FPR2 por mecanismos genômicos. A interação dos receptores FPRs nas células inflamatórias é representada na figura 5.

Figura 5. Migração leucocitária mediada por receptores FPRs. O aumento de ligantes peptídeos formilados leva a uma resposta bem caracterizada dos leucócitos circulantes. O FPR1 é um receptor que pode ser ativado por baixas concentrações de peptídeos formilados (amarelo). O aumento da concentração do agonista (laranja) pode afetar a sinalização do FPR2. A interação do FPR2 com agonistas endógenos promove o destacamento dos neutrófilos (AnxA1/ lipoxina A4-LXA4) ou acúmulo dos mesmos nos tecidos (amiloide sérica A-SAA). Altas concentrações do agonista (vermelho) podem levar à desensibilização do receptor. Macrófagos e mastócitos também expressam receptores FPRs importantes na potencialização e resolução da inflamação (DUFTON; PERRETTI, 2010).

INTRODUÇÃO - 13

Os mecanismos moleculares responsáveis pela mobilização da AnxA1 para a membrana plasmática são dependentes do tipo celular. A proteína pode ser externalizada pela exocitose dos grânulos de gelatinase dos neutrófilos ou após ativação do sistema transportador cassete ligante do ATP (ABC-transporter) nos macrófagos (PERRETTI; D´ACQUISTO, 2009).

O acesso da AnxA1 endógena aos receptores de membrana pode, ainda, depender de processos de fosforilação que possibilitam a translocação da proteína do citoplasma para a superficie celular (SOLITO et al., 2003b; SOLITO et al., 2006; SOLITO et al., 2008). Mecanismos não genômicos, mas que requerem as vias proteina quinase C (PKC), fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) e proteina quinase ativadora de mitógeno (MAPK) foram observados em células pituitárias folículoestelares humanas, nas quais, os GCs e o LPS induziram a fosforilação da AnxA1 em serina e translocação da proteína recém-fosforilada para a superfície celular (SOLITO et al., 2003b; SOLITO et al., 2006). Curiosamente, a dexametasona não teve efeito sobre a fosforilação da AnxA1 em tirosina (SOLITO et al., 2003b). A figura 6 mostra o processo de fosforilação da AnxA1 em serina, induzido pelo LPS.

Figura 6. Fosforilação da AnxA1. O lipolpolissacarídeo (LPS) induz a fosforilação da AnxA1 em serina, via proteína quinase C (PKC) (1), e sua translocação para a membrana celular (2 e 3) (SOLITO et al., 2006).

INTRODUÇÃO - 14

Os processos de fosforilação são, portanto, importantes para o acesso da AnxA1 endógena aos receptores de membrana após translocação. Modificações pós- traducionais também foram observadas, in vivo, no fígado de camundongos durante o processo inflamatório (DAMAZO et al., 2008) e, estão relacionadas a resolução da resposta inflamatória.

1.5. ANEXINA A1 E OLHO

Como exposto, a proteína AnxA1 tem sido investigada em diversos modelos inflamatórios, contudo, é pouco explorada em tecidos oculares em condições normais ou patológicas, especialmente inflamatórias. Em olhos de moluscos a expressão da proteína foi observada na córnea e células sensoriais (KERSCHBAUM; DONATO; HERMANN, 1997), e sua regulação pela luz e serotonina (RAJU et al., 1993) indica a participação da proteína no mecanismo de sinalização intracelular relacionado ao ritmo circadiano.

A expressão da AnxA1 foi analisada em tecidos oculares durante o desenvolvimento embrionário em camundongos (WELLS et al., 2004), sugerindo uma possível ação dessa proteína na proliferação e diferenciação celular. O envolvimento da AnxA1 no desenvolvimento da catarata induzida por galactose foi estudado em ratos (KOSHIMOTO et al., 1992). A proteína foi detectada nas células epiteliais da lente e apresentou um aumento gradual até o décimo dia do processo de desenvolvimento da catarata, com o máximo de densidade no décimo quarto dia, quando iniciou um rápido declínio. Polimorfismos de DNA que resultaram em alterações fisicoquímicas da AnxA1 foram observados em células do cristalino de camundongos (HOEHENWARTER et al., 2008), contudo não estão relacionados ao processo de cataratogênese.

Uma investigação recentemente desenvolvida no nosso laboratório (SILVA; GIROL; OLIANI, 2011) relata a expressão da AnxA1 nos leucócitos e HA na uveíte induzida por endotoxina em ratos e, aponta essa proteína como um dos mediadores essenciais na homeostasia do processo inflamatório.

Diante dessas considerações, e da necessidade de novas terapias para o tratamento da uveíte em substituição das atuais que apresentam efeitos adversos (READ, 2006; LEE; FOSTER, 2010), o estudo da proteína AnxA1 endógena e do

INTRODUÇÃO - 15

seu peptídeo mimético Ac2-26 em modelo de uveíte induzida por endotoxina é extremamente importante, pois poderá ocasionar novas descobertas terapêuticas para o tratamento dessa importante inflamação ocular.

OBJETIVOS - 17

2.1 . OBJETIVO GERAL

Em função dos raros estudos da proteína AnxA1 em tecidos oculares analisamos, in vivo, os efeitos anti-inflamatórios e o mecanismo de ação da AnxA1 nos tecidos oculares controles e EIU, seguidos ou não da administração do peptídeo Ac2-26 e do antagonista do receptor FPR, o Boc2.

2.2 . OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Verificar em ratos, nos tecidos oculares controles, EIU após 24 e 48 horas sem tratamento, EIU 24 horas após tratamentos tópico e sistêmico com Ac2-26 e administração sistêmica Ac2-26/Boc2, os seguintes aspectos:

i. Estudar os efeitos do peptídeo Ac2-26 na EIU, seguido ou não da administração do Boc2, por meio das análises quantitativas dos neutrófilos nos tecidos oculares e no HA;

ii. Avaliar nos sobrenadantes dos tecidos oculares, após maceração, as dosagens das proteínas totais pelo método de Bradford e, dos mediadores químicos TNF-α, IL1β, IL6 e NO pelo ensaio de ELISA;

iii. Analisar as expressões das proteínas AnxA1, AnxA1 fosforilada em serina (AnxA1-S27-PO4) e tirosina (AnxA1-Y21-PO4), do receptor fpr2 e da COX-2 nos

tecidos oculares, por imuno-histoquímica.

Ainda, em camundongos selvagens e deficientes para AnxA1, nos grupos controles e EIU 24 horas, estudar:

iv. A expressão da COX-2 nos tecidos oculares por imuno-histoquímica.

MATERIAL E MÉTODOS - 19

3.1. Animais

Ratos machos, da espécie Rattus novergicus (Wistar), foram obtidos do Biotério da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), com 6 a 8 semanas de vida (150 a 200 g) e distribuídos em 6 grupos (n=10/grupo). Também foram usados camundongos machos (25 g) selvagens e deficientes para AnxA1 (AnxA1-/-), provenientes do Laboratório de Toxicologia Experimental da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP, e divididos em 4 grupos (n=3/grupo). Os animais foram mantidos em gaiolas, em ambiente com temperatura controlada (22 a 25oC), e receberam água e ração ad libitum. Os procedimentos experimentais foram realizados no Laboratório de Imunomorfologia, IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto, e conduzidos de acordo com as normas da Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEEA) da FAMERP (Protocolo 0467/2009).