DANIELA BATISTA LEITE
ANÁLISE DE POLIMORFISMOS NOS GENES CYP1A1, CYP 17, COMT,
GSTM1, RECEPTOR DE ESTROGÊNIOS E PROGESTERONA EM
MULHERES COM CARCINOMA DE OVÁRIO
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências
SÃO PAULO
DANIELA BATISTA LEITE
ANÁLISE DE POLIMORFISMOS NOS GENES CYP1A1, CYP 17, COMT,
GSTM1, RECEPTOR DE ESTROGÊNIOS E PROGESTERONA EM
MULHERES COM CARCINOMA DE OVÁRIO
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências
SÃO PAULO
Leite, Daniela Batista
Análise de polimorfismos nos genes CYP1A1, CYP17, COMT, GSTM1, receptor de estrogênios e progesterona em mulheres com carcinoma de ovário. / Daniela Batista Leite. -- São Paulo, 2009.
xvii, 110f.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de pós-graduação em Ginecologia.
Título em inglês: Analysis of polymorphisms in cytochrome P450c17 (CYP17), progesterone receptor (PROGINS), gluthatione S-transferase (GSTM1), Catechol-O-methyl transferase (COMT), and cytochrome P450c1A1 CYP1A1) in womens with ovarian cancer
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Afonso Celso Pinto Nazário
Coordenador do Curso de Pós-graduacão:
iv
DANIELA BATISTA LEITE
ANÁLISE DE POLIMORFISMOS NOS GENES CYP1A1, CYP 17, COMT, GSTM1,
RECEPTOR DE ESTROGÊNIOS E PROGESTERONA EM MULHERES COM
CARCINOMA DE OVÁRIO
Presidente da Banca: Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Luis A. F. Lopes
____________________________________________
Prof. Dr. Luis Garcia Alonso
____________________________________________
Prof. Dr. Sérgio M. Nicolau
____________________________________________
Suplentes:
Profa. Dra. Regina Affonso
v
vi Dedicatória
Aos meus pais, José R. Leite e Regina B. Leite; exemplos de amor incondicional, por todo apoio durante todas as etapas da minha vida. Amo muito vocês.
vii
Ao meu noivo, Tiago J. Fernandez, pelas palavras de carinho em todas as etapas desse trabalho, por me ensinar que vale à pena lutar pelos nossos sonhos.
viii
ix
Agradecimentos
Acredito que a elaboração de uma tese de doutorado é um produto coletivo, embora sua redação, responsabilidade e stress sejam predominantemente individuais. Várias pessoas contribuíram para que este trabalho chegasse a bom termo. A todas elas registro minha gratidão:
Ao Prof. Dr. Ismael D. C. Guerreiro da Silva, por ter me aceitado como sua aluna. Obrigada pelo apoio e confiança em meu trabalho, por me apoiar em todas as decisões e me aconselhar sempre.
Ao Prof. Dr. Wagner José Gonçalves e ao Prof. Dr. Sérgio M. Nicolau, pela colaboração e auxílio na coleta das amostras no Hospital São Paulo.
Ao Prof. Dr. Luis A. F. Lopes, pela oportunidade de coletar as nossas amostras também pelo Hospital do Servidor Público do Estado de São Paulo. Meus sinceros agradecimentos pela permanente solicitude nas explicações dos prontuários.
Aos meus queridos amigos e ex-orientadores Prof. Dr. Luiz R. Nunes e Profa. Dra. Regina C. de Oliveira, por me iniciarem no ambiente científico e me ensinarem que a busca pelo conhecimento deve ser contínua.
À Profa. Dra. Camila S. C. Guindalini, por me ajudar a entender os dados estatísticos.
Às funcionárias da Disciplina de Ginecologia da UNIFESP-EPM, Karim M. dos Santos e Zélia M. G. de Macedo, pelos inúmeros favores prestados.
x
A Cintia M. C. Kosugi, pelos inúmeros momentos de desabafo, conselhos e momentos de stress nas aulas da pós-graduação. Aos “trancos e barrancos”, nos conhecemos melhor e construímos uma amizade.
A Cristina V. de Carvalho, por colaborar de forma intensa na genotipagem dos controles, por fazer belíssimos géis que foram utilizados para ilustrar essa tese e por toda troca de experiências que me foram muito úteis durante essa jornada.
Às minhas queridas amigas Ana Maria de O. Taborda e Elenir M. de Santana Pereira, pela amizade verdadeira que construímos no dia-a-dia do laboratório. Obrigada por me ouvirem sempre e me ajudarem a entender o processo complicado da “adultice”.
À amiga Michele G. Junqueira, por ter me apresentado à UNIFESP-EPM de forma tão especial. Obrigada pela sincera amizade, pela companhia nas coletas das amostras, nos cafezinhos, almoços e afins. Sua ajuda foi imprescindível para a elaboração deste trabalho.
A UNIFESP-EPM (Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina) que possibilitou o desenvolvimento deste trabalho.
A FAPESP (Fundação de Amparo ao Ensino e à Pesquisa do Estado de São Paulo), pelo auxílio ao projeto temático e pela concessão da bolsa de doutorado.
À todas as Pacientes, as quais gentilmente participaram dessa pesquisa. Espero ter dado uma pequena contribuição ao longo árduo caminho na busca por um tratamento.
Agradeço a toda minha família e amigos, que sempre torceram e me apoiaram em cada etapa concluída desta tese.
xi
À tia Marina M. Dias, por me adotar como sua sobrinha e me apoiar em todos os momentos deste trabalho.
Ao meu noivo, Tiago Jabes Fernandez, pela compreensão e incentivo em todos os momentos. Agradeço por sempre me estimular, intelectual e emocionalmente.
Ao meu querido irmão Lucas V. B. Leite, por ser essa pessoa tão calma e bondosa, um exemplo. Aprendo com você a cada dia.
xii Sumário
Dedicatória... vi
Agradecimentos... ix
Lista de figuras... xiv
Lista de tabelas... xv
Lista de abreviaturas e siglas... xvi
Resumo... xvii
1. INTRODUÇÃO... 1
1.1 Câncer de ovário... 2
1.2 Biossíntese e ação dos estrogênios... 6
1.3 Metabolização dos Estrogênios... 8
1.4 Polimorfismos gênicos... 10
1.5 Polimorfismo na via de síntese de esteróides sexuais... 11
1.5.1 Polimorfismo do gene CYP 17... 11
1.6 Polimorfismos nas vias de ação dos esteróides sexuais... 13
1.6.1 Polimorfismo do Receptor de Progesterona (PROGINS)... 13
1.6.2 Polimorfismos no Receptor de Estrogênios Alfa... 16
1.7 Polimorfismos nas vias de metabolização dos esteróides sexuais... 21
1.7.1 Polimorfismo da Glutationa-S-transferase (GST)... 21
1.7.2 Polimorfismo da Catecol-O-metiltransferase (COMT)... 23
1.7.3 Polimorfismo do gene CYP1A1 24 2. PROPOSIÇÃO... 27
3. CASUÍSTICA E MÉTODO... 29
3.1 Casuística... 30
3.2 Métodos... 31
3.2.1 Coleta do material biológico... 31
3.2.2 Extração do DNA genômico... 31
3.2.3 Quantificação do DNA genômico... 31
3.2.4 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)... 32
3.2.5 Polimorfismo PROGINS... 32
xiii
3.3 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)…... 35
3.3.1 Polimorfismo no gene do CYP17... 35
3.3.2 Polimorfismo no Receptor de Estrógeno Alfa... 36
3.3.3 Polimorfismo COMT... 41
3.3.4 Polimorfismos no CYP1A1... 42
3.4 Análise Estatística... 45
4. RESULTADOS... 46
4.1 Homogenidade dos grupos em estudo... 47
4.2 Análise dos Polimorfismos... 50
4.2.1 Teste de Hardy-Weinberg... 50
4.2.2 Polimorfismo CYP17... 50
4.2.3 Polimorfismo PROGINS... 52
4.2.4 Polimorfismo do Receptor de Estrógeno Alfa... 55
4.2.5 Polimorfismo GSTM1... 59
4.2.6 Polimorfismo COMT... 60
4.2.7 Polimorfismo CYP1A1... 61
4.3 Inclusão de outras variáveis... 63
4.4 Cálculo do Poder da Amostra... 64
5. DISCUSSÃO... 66
6. CONCLUSÕES... 79
7. ANEXOS... 81
8. REFERÊNCIAS... 96
Abstract
xiv
Lista de figuras
Figura 1 – Biossíntese do estradiol a partir do colesterol... 7
Figura 2 – Metabolização dos Estrogênios... 10
Figura 3 – Localização do gene do CYP17... 12
Figura 4 – O Receptor de Progesterona e o polimorfismo PROGINS... 15
Figura 5 – O câncer de ovário e o complexo PROGINS... 16
Figura 6 – Localização do receptor de estrogênios alfa... 17
Figura 7 – Polimorfismos de base única (SNPs) identificados no Receptor de Estrogênio alfa... 19
Figura 8 – Localização do gene GSTM1... 22
Figura 9 – Localização do gene CYP1A1... 25
Figura 10 – Gel de agarose referente ao polimorfismo PROGINS... 33
Figura 11 – Gel de agarose referente ao polimorfismo do gene da GSTM1... 33
Figura 12 – Gel de agarose referente ao polimorfismo do gene CYP17... 36
Figura 13 – Géis de agarose referentes aos polimorfismos PvuII e XbaI do receptor de estrógeno alfa... 38
Figura 14 – Gel de agarose referente ao polimorfismo ER-HaeIII do receptor de estrógeno alfa... 39
Figura 15 – Gel de agarose referente ao polimorfismo ER-MspI do receptor de estrógeno alfa... 40
Figura 16 – Gel de agarose referente ao polimorfismo COMT... 42
Figura 17 – Gel de agarose referente ao polimorfismo CYP1A1-MspI... 43
Figura 18 – Gel de agarose referente ao polimorfismo CYP1A1-HincII... 44
Figura 19 – Desequilíbrio de Ligação entre os polimorfismos no receptor de estrogênios alfa... 57
xv
Lista de tabelas
Tabela 1 – Características descritivas das pacientes com carcinoma de ovário e do grupo controle I, assim como os valores de
significância estatística... 47
Tabela 2 – Características descritivas das pacientes com carcinoma de ovário e do grupo controle II, assim como os valores de
significância estatística... 49
Tabela 3 – Frequências do polimorfismo CYP17 de acordo com o grupo caso e controle... 50
Tabela 4 – Frequências alélica do polimorfismo CYP17 de acordo com o
grupo caso e controle... 51
Tabela 5 – Frequência do polimorfismo PROGINS nos grupos de casos e
controles... 52
Tabela 6 – Frequências alélicas do polimorfismo PROGINS de acordo com o grupo de casos e controles... 53
Tabela 7 – Frequência do polimorfismo PROGINS nos grupos de casos e
controles com agrupamento dos genótipos... 54
Tabela 8 – Frequências dos polimorfismos no receptor de estrógeno alfa de acordo com o grupo caso e controle... 55
Tabela 9 – Frequência alélica dos polimorfismos no receptor de estrógeno
alfa de acordo com o grupo caso e controle... 56
Tabela 10 – Frequências do polimorfismo GSTM1 de acordo com o grupo
caso e controle... 59
Tabela 11 – Frequência do polimorfismo COMT nos grupos de casos e
controles... 60
Tabela 12 – Frequência alélica dos polimorfismos no receptor de estrógeno
alfa de acordo com o grupo caso e controle... 60
Tabela 13 – Frequência dos polimorfismos CYP1A1 nos grupos de casos e
controles... 61
Tabela 14 – Frequência alélica dos polimorfismos CYP1A1 de acordo com o
grupo caso e controle... 62
Tabela 15 – Análise de haplótipos dos polimorfismos no CYP1A1 de acordo
com o grupo caso e controle... 63
xvi
Lista de abreviaturas e siglas
COMT Catecol-O-metiltransferase
CYP17 Citocromo P450c17
CYP1A1 Polimorfismo do citocromo P450c 1A1
DNA Ácido desoxirribonucléico
ER Estrógeno
FIGO Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia
GST Glutationa S-transferase
GSTM1 Glutationa S-transferase M1
H2O Água
H2O2 Peróxido de hidrogênio
HRT Terapias de reposição hormonal
HSPE-FMO Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo – Francisco Morato Oliveira
INCA Instituto Nacional do Câncer
n número
pb pares de bases
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PROGINS Receptor de progesterona
rpm Rotações por minuto
SULT sulfotransferases
UNIFESP Universidade Federal de São Paulo
% porcentagem °C Graus centígrados
xvii Resumo
Objetivos: Avaliar a associação entre os polimorfismos gênicos presentes nos genes do citocromo P450c17 (CYP17), receptor de progesterona (PROGINS) e estrógeno (ER), glutationa S-transferase (GSTM1), catecol-O-metiltransferase (COMT) e polimorfismo do citocromo P450c 1A1 (CYP1A1) em pacientes com e sem carcinoma de ovário e analisar a eventual associação dos referidos polimorfismos com as variáveis clínicas e anatomopatológicas. Métodos: Analisaram-se 103 pacientes com carcinoma de ovário atendidas no Ambulatório de Oncologia Ginecológica do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM) e no Ambulatório de Oncoginecologia do Serviço de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo – Francisco Morato Oliveira (HSPE-FMO). O grupo controle I foi constituído por 282 pacientes e o grupo controle II por 141 pacientes atendidas no Setor de Climatério da Disciplina de Endocrinologia Ginecológica do Departamento de Ginecologia da UNIFESP-EPM. O DNA foi extraído a partir de células da mucosa oral e a genotipagem para os polimorfismos foi realizada pela técnica de PCR-RFLP. Resultados: Observamos uma associação significativa entre a frequência do polimorfismo PROGINS e o desenvolvimento do câncer de ovário
(p<0,0001). Também foi observada uma associação significativa entre a frequência dos polimorfismos ER-PvuII, ER-XbaI e ER-HaeIII (p=0,03; p<0,00001 e p=0,04, respectivamente) e o desenvolvimento de câncer de ovário e uma tendência de associação entre a presença do polimorfismo ER-MspI (p=0,07) com o carcinoma. Com relação aos polimorfismos presentes nos genes do CYP17, GSTM1, COMT e CYP1A1, não foram observadas diferenças significativas entre o grupo de casos e controles ou entre as outras variáveis de risco analisadas, sugerindo que os mesmos não apresentam uma participação importante no desenvolvimento do carcinoma de ovário em nossa amostra. Não se observou nenhuma relação entre os polimorfismos estudados e TRH, dismenorréia, dispareunia, câncer de mama, hipertensão arterial, diabetes, tipo histológico, estado clínico e grau de diferenciação. Entretanto, foram observadas associações estatisticamente significantes para o polimorfismo PROGINS e antecedentes familiares (p=0,009).
2 Introdução
1.1 Câncer de ovário
O câncer de ovário ocupa o sexto lugar nas estatísticas de câncer no sexo feminino em todo o mundo (Sun et al, 2007). Embora não seja o mais frequente, possui a mais alta taxa de mortalidade por ser assintomático e difícil de ser detectado em fase inicial (Sellers et al, 2005). Mais de 68% das pacientes são diagnosticadas depois da doença já ter sido disseminada em ambos os ovários e a taxa de sobrevivência dentre essas mulheres em 5 anos é de apenas 29% (Beeghly et al, 2006).
Na Europa, estimativas sugerem que 61.000 novos casos são diagnosticados e 39.000 mortes ocorram por câncer de ovário anualmente (Colombo et al, 2006). Estimou-se que, em 2007, 22.430 novos casos seriam diagnosticados nos Estados Unidos e que 15.280 mulheres morreriam devido à doença. Para o ano de 2008, estimou-se 22.650 novos casos e 15.520 mortes (Jemal et al, 2007).
As taxas de incidência para o câncer de ovário são maiores nos países desenvolvidos, com taxas excedendo 9/100.000, exceto para o Japão (6.4/100.000), destacando que as taxas de incidência têm sido relativamente baixas nos países ocidentais. A incidência na América do Sul (7.7/100.000) é relativamente alta (Parkin et al, 2002). No Brasil, segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), o câncer de ovário ocupa o 8° lugar dentre as neoplasias malignas femininas (1,8%) (Lima et al, 2003).
Uma extensiva revisão sobre a etiologia do câncer de ovário do tipo epitelial concluiu que existem duas hipóteses que poderiam explicar o surgimento da doença. A primeira hipótese afirma que a ovulação incessante leva ao câncer através de rupturas na superfície do epitélio ovariano, formação de fissuras no estroma e inclusão de cistos. A segunda hipótese, chamada de hipótese das gonadotrofinas, sugere que a exposição do epitélio ovariano a níveis persistentemente elevados de gonadotrofinas estimularia a transformação das células ovarianas induzindo ao câncer (Risch, 1998).
3 Introdução
Originam-se no epitélio superficial do ovário (mesotélio modificado) os quais se acompanham de graus variáveis de proliferação do mesênquima subjacente. Classificam-se com base na diferenciação epitelial e potencial de malignidade. Destes, os mais encontrados são os tumores serosos e mucinosos (Carvalho e Carvalho, 1997).
Quanto a classificação dos tumores ovarianos, a Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO) propôs uma classificação, universalmente aceita, baseada nos estádios clínicos. Deve ser lembrado que, nos ovários, a classificação é feita por meio de dados clínicos-propedêuticos e cirúrgicos (Shepherd, 1989).
O tratamento para o câncer de ovário é dificultado devido ao fato de que, frequentemente, as pacientes já estão em estágio tardio da doença no momento do diagnóstico, na qual pode ser assintomática até os estágios mais avançados. Em contrapartida, a vasta maioria das mulheres (95%) reporta sintomas vagos experimentados antes do diagnóstico, tais como: abdominal (77%), gastrointestinal (70%), constitucional (50%), urinário (34%) ou pélvico (26%), sendo que 58% reportando dor. Infelizmente, mulheres que não procuram atenção médica para estes sintomas são geralmente diagnosticadas em estado avançado da doença (Risch, 1998).
O risco para tumores ovarianos de origem epitelial aumenta com a idade, sendo que a maioria dos casos ocorre predominantemente na peri e pós-menopausa (Colombo et al, 2006). A média de idade para as mulheres diagnosticadas com o câncer ovariano epitelial é de 60 anos (Risch, 1998), sendo que dificilmente ocorre antes dos 40 anos (Yancik et al, 1986).
4 Introdução
Além disso, nos casos de câncer de ovário e mama com histórico familiar, estão frequentemente relacionados com a presença de mutação induzida e perda de função nos genes BRCA1 (breast cancer 1 gene) ou BRCA2 (breast cancer 2 gene). Em contraste, somente alguns poucos marcadores genéticos estão disponíveis para os pacientes com a doença (equivalentes a 90-95%) sem histórico familiar positivo (Miki et al, 1994; Agoulnik et al, 2004).
Recentes estudos mostram que o uso de terapias de reposição hormonal (HRT) por períodos prolongados pode conferir um aumento de 1,5-2,0 na incidência de câncer de ovário (Lukanova, Kaaks, 2005). Por outro lado, diversos estudos não mostraram associação com a doença (Hempling et al, 1997), sendo este um fator de risco que merece ser mais profundamente estudado.
Em contrapartida, diversos estudos atestam à efetividade do uso de pílulas anticoncepcionais na proteção ao câncer de ovário devido à inibição da ovulação. Estima-se que o uso de anticoncepcionais por um período maior ou igual a 5 anos confere 30 a 50% de redução de risco para desenvolvimento da doença. Mais do que isso, efeitos favoráveis têm sido observados por pelo menos 10 a 15 anos desde o último uso e recentes estudos mostram que a proteção pode persistir ainda mais (Lukanova, Kaaks, 2005).
Outros fatores de risco têm sido associados ao câncer de ovário, incluindo o uso de talcos, infertilidade, endometriose, doença por inflamação pélvica, síndrome do ovário policístico e obesidade. O hábito de fumar também tem sido associado como um fator de risco, principalmente para os tumores do tipo mucinoso (Modugno, 2004).
5 Introdução
Fortes evidências sugerem também que as progesteronas desempenham um importante papel na etiologia do câncer de ovário. O efeito protetor da gravidez, atribuído ao aumento de pelo menos 100 vezes nos níveis de progesterona, exemplifica o importante papel desempenhado por esse hormônio (Sellers et al, 2005).
Quando analisado sob o ponto de vista de alterações moleculares, esses tumores apresentam amplificações, expressões alteradas e uma série de mutações em número considerável de oncogenes e genes supressores do crescimento tumoral. Com relação aos oncogenes aqueles que com mais frequência encontram-se superexpressos ou amplificados são o c-myc (Anticorpo monoclonal sc-40), em particular nos adenocarcinomas serosos (Tashiro et al, 1992).
Os tumores mucinosos apresentam o k-ras (Anticorpo sc-521) mutado em parcela importante de pacientes (Enomoto et al, 1991). Prognóstico mais sombrio é observado quando os genes c-erb-B2/Her2-neu (receptor do fator de crescimento humano epidermal 2) e c-fms (receptor do fator de estimulação de colônias 1) encontram-se envolvidos (Berchuck et al, 1990, Kohler et al, 1989, Kacinski et al, 1989).
O gene P13K (fosfatidilinositol 3-kinase-Akt) e seu efetor AKT2 também se mostraram amplificados numa proporção grande de tumores ovarianos (Zhang et al, 2003; Shayesteh et al, 1999; Bellacosa et al, 1995).
Dentre os genes supressores do crescimento tumoral a p53 pode ser encontrada mutada em ate 50% dos tumores em estágio avançado, raramente nos estágios iniciais e nos tumores borderline (Kihana et al, 1992). No entanto, mutações no gene PTEN (Fosfoidrolase) podem ser encontradas nos tumores endometrióides do ovário (Obata et al, 1998).
6 Introdução
(PROGINS) podem acarretar desde aumento nos níveis de estrogênios e/ou catecolestrogênios circulantes até modificações na resposta aos esteróides sexuais, fenômenos estes que podem estar envolvidos na gênese de neoplasias ginecológicas (Dirven et al, 1994; Kitawaki et al, 2001; Huber et al, 2002; Kado et al, 2002; Suspitsin et al, 2002; Worda et al, 2003).
1.2 Biossíntese e ação dos estrogênios
O estrogênio é o hormônio básico da mulher e sua produção começa na adolescência, quando é responsável pelo aparecimento dos sinais sexuais secundários, e vai até a menopausa. No menacme, a principal fonte de produção é o ovário, sendo que as supra-renais também podem sintetizá-lo, porém essa função parece ser mais definida após a menopausa (Lima et al, 2003).
A síntese de todos os esteróides tem como precursor o colesterol e os três estrogênios sintetizados pelo ovário são a estrona, o estradiol e o estriol, sendo que o estradiol é o hormônio de maior relevância no menacme e a estrona, no climatério (Kushner et al, 2000).
A forma de ação mais importante do estrogênio é a ligação com o seu receptor. Estrogênios se difundem pelo interior das células e se ligam ao ER, localizado no núcleo. Dessa forma, o complexo formado se liga a elementos de resposta ao estrógeno direta ou indiretamente por meio de interações proteína-proteína com o ativador de proteína-proteína (AP1) ou sítios SP1 na região promotora dos genes de resposta ao estrógeno, o que resulta no recrutamento de proteínas co-reguladoras (co-ativadoras ou co-repressoras) a fim de promover, aumentar ou decair os níveis de RNAm (ácido ribonucleico mensageiro) e a produção de proteínas associadas (Jakimiuk et al, 2007).
7 Introdução
segunda fase parece haver predominância da via delta-4 (a partir da progesterona), vista a direita da figura. Por sua vez, estão envolvidas na biossíntese do estradiol, enzimas da superfamília do citocromo P450, como CYP1A1, CYP17 e CYP19 bem como as hidroxiesteróides desidrogenases 3β -HSD e 17β-HSD (Thompson, Ambrosone, 2000).
Portanto, a clivagem da cadeia do colesterol pela ação da enzima CYP11A forma a pregnenolona que, pela ação da enzima 3β-HSD, é convertida em progesterona (pregnenolona e progesterona são esteróides C21). A hidroxilação e a subsequente clivagem do esteróide C21 pela ação da CYP17 produzem os esteróides C19, androstenediona e dehidroepiandrosterona; sendo a androstenediona a precursora para a formação da testosterona através da ação da enzima 17β-HSD (Mitrunen, Hirvonen, 2003).
Assim, a aromatização da androstenediona e testosterona, respectivamente, catalizadas pela ação da CYP19 (aromatase) forma, finalmente, os estrogênios estrona e estradiol (Thompson, Ambrosone, 2000).
Figura 1: Biossíntese do estradiol a partir do colesterol. Destaca-se na biossíntese do estradiol a participação das enzimas da superfamília do citocromo P450, como CYP1A1, CYP17 e CYP19.
Colesterol
CYP11A
CYP17 CYP17
3β‐HSD
17β‐HSD
17β‐HSD
CYP19 (Aromatose)
Pregnenolona 17α‐Hidroxipregnenolona
17α‐Hidroxiprogesterona
Progesterona Androstenediona
Dehidroepiandrosterona (DHEA)
Testosterona
8 Introdução
1.3 Metabolização dos Estrogênios
Os estrogênios são metabolizados por reações de oxidação e conjugação que podem levá-los à desativação e à sua subsequente eliminação (Figura 2). Alternativamente, as reações de oxidação e conjugação dos estrogênios podem gerar metabólitos que possuem atividades biológicas distintas, incluindo propriedade de alteração hormonal, genotoxicidade (através da formação de espécies ativas que modificam DNA e proteínas) e/ou propriedades quimioterápicas (através da formação de derivados que são antagônicos ao receptor de estrogênio) (Thompson, Ambrosone, 2000).
A metabolização dos estrogênios envolve dois tipos de enzimas: as de metabolismo mediado pelas oxidases de função mista, ou de Fase I e as enzimas de conjugação, ou de Fase II (Hayes et al, 2005).
As enzimas oxidativas da fase I são principalmente enzimas da superfamília do citocromo P450 (CYPs) (Raunio et al, 1995). As reações da Fase II envolvem a conjugação com substrato endógeno (glutationa) através das glutationa-S-transferases (GSTs) que agem como enzimas inativadoras dos produtos da Fase I, tornando tais metabólitos mais hidrofílicos e, dessa forma, passíveis de excreção (Raunio et al, 1995).
A metabolização do estradiol e estrona pode ocorrer por duas vias distintas: a hidroxilação do anel A ou do anel D. A hidroxilação do anel A leva à formação de catecolestrogênios (CEs), denominados 2 ou 4-hidroxiestrona e 2 ou 4-hidroxiestradiol, enquanto a hidroxilação do anel D forma a 16α-hidroxiestrona. Os catecolestrogênios são os principais metabólitos dos estrogênios, os quais são inativados principalmente pela O-metilação, catalizada pela catecol-o-metiltransferase (COMT) (Mitrunen, Hirvonen, 2003).
9 Introdução
A CE-2,3 Q pode-se ligar de forma estável ao DNA, enquanto a forma CE-3,4Q se liga ao DNA em regiões onde predominam bases púricas, as quais são perdidas através da clivagem das suas pontes glicosídicas. Supõe-se que o último evento possa causar iniciação tumoral (Mitrunen, Hirvonen, 2003).
As quinonas podem ser conjugadas com glutationa (GSH) por meio da ação das GSTs (Glutationa S-transferases) ou reduzidas a catecolestrogênios através da quinona redutase (Cavalieri et al, 1997). As semiquinonas podem reagir com o oxigênio molecular para formar radicais superóxidos, os quais são reduzidos a peróxido de hidrogênio (H2O2) espontaneamente ou então são catalisados por superóxidos desmutases, como o MnSOD (Superóxido Dismutase Dependente de Manganês) (Cavalieri et al, 1997; Liehr, 2000).
O peróxido de hidrogênio é neutro e não reativo, exceto na presença de íons de metais de transição reduzidos (Fe2+), o qual permite a formação do oxidante mais potente, o radical hidroxila (OH). O H2O2 também pode atravessar a membrana nuclear e celular, alcançando o DNA das células vizinhas (Cadet et al, 1999).
Diferenças existentes entre os indivíduos nas vias de conjugação dos estrogênios e catecolestrogênios podem definir subpopulações de mulheres com maior exposição a estes elementos ao longo da vida, podendo levar a um aumento das taxas de dano celular (Mitrunen e Hirvonen, 2003).
10 Introdução
Figura 2: Metabolização dos Estrogênios: destaca-se que metabolização envolve dois tipos de enzimas: as de metabolismo mediado pelas oxidases de função mista, ou de Fase I (citocromo P450 (CYPs) e as enzimas de conjugação, ou de Fase II (GSTs).
1.4 Polimorfismos gênicos
O DNA genômico possui um grande número de variações na composição de nucleotídeos entre os indivíduos. Essas variações são decorrentes de processos de substituição de nucleotídeos, inserções e/ou deleções de bases, que ocorreram ao longo do processo evolutivo humano, podendo ser transmitidos de geração em geração.
11 Introdução
substituições que não alteram a sequência protéica são denominadas de substituições sinônimas. Essas substituições em regiões não-codificantes, como promotores e íntrons, podem alterar a estrutura e a estabilidade do RNAm (Majewski e Ott, 2002), diminuindo ou aumentando a transcrição gênica (Majewski e Ott, 2002; Pharoah et al, 2004).
As substituições, inserções ou deleções que são transmitidas ao longo das gerações e que alcançam níveis iguais ou superiores a 1% na população, são denominadas de polimorfismos (Kwok, Gu, 1999).
Os polimorfismos de nucleotídeos únicos (Single Nucleotide Polymorphism - SNP) são comuns em todas as regiões do genoma humano; acredita-se que ocorra um SNP a cada 1.000 bases (Syvänen, 2005). O entendimento da influência de certos polimorfismos no fenótipo dos indivíduos vem sendo objeto de pesquisa de longa data.
Visto que mutações específicas em alguns genes podem aumentar a incidência de alguns tipos de câncer (Pharoah et al, 2004), a ocorrência de polimorfismos no genoma pode afetar a expressão gênica e, por conseguinte, ter relevância também na oncogênese (Zhu, Xia, 2004).
1.5 Polimorfismo na via de síntese de esteróides sexuais
1.5.1 Polimorfismo do Citocromo P45017 (CYP 17)
12 Introdução
O gene do CYP 17 é responsável pela hidroxilação da pregnenolona e progesterona em 17α-hidroxipregnenolona e 17α-hidroxiprogesterona, respectivamente, pela ação da 17α-hidroxilase. Os produtos dessa reação são posteriormente metabolizados pela ação da enzima 17,20-liase em dehidroepiandrosterona (DHEA) e androstenediona (Kristensen, Borresen-Dale, 2000; Huber et al, 2002). Portanto, uma alteração genética (polimorfismo) no CYP17 poderia alterar os níveis de expressão ou atividade da enzima P450c 17α (Shin et al, 2005; Huber et al, 2002), aumentando o risco para o desenvolvimento do câncer de ovário.
Um dos polimorfismos mais estudados do CYP17 é um SNP (rs743572) na posição 1931 na região 5’ do gene, 34 pb antes do ponto de início da transcrição (T Æ C). Essa alteração cria um promotor adicional tipo SP1 CCACC box, ao qual gera um sítio de reconhecimento para a enzima de restrição MspA1, produzindo um alelo selvagem (A1) e um alelo variante (A2), descrito primeiramente por Carey et al (1994).
O polimorfismo descrito acima pode alterar a transcrição gênica, podendo aumentar a atividade do promotor e a taxa de produção da enzima CYP17, e consequentemente, elevar os níveis de hormônios esteróides endógenos (Shin et al, 2005; Garner et al, 2002).
Estudos in vitro sugerem que o sítio adicional tipo SP1 5’ no CYP17 não estaria realmente ligado ao fator de transcrição (Kristensen et al, 1999). No entanto, existem fortes evidências indicando que este polimorfismo pode influenciar níveis de hormônios esteróides endógenos (Feigelson et al, 1998).
Figura 3: Localização do gene do CYP17. Destaca-se em vermelho a localização do CYP17 no cromossomo 10, obtido de NCBI –
