Clonagem e expressão da proteína E2 no vírus da hepatite C Humana: estudo da interação molecular E2-rLDL in vitro

Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho

Faculdade de Ciências Farmacêuticas

Campus de Araraquara

THALITA ATHIÊ NÉO

Clonagem e Expressão da Proteína E2 do Vírus da

Hepatite C Humana: estudo da interação molecular

E2-rLDL

in vitro

ARARAQUARA – SP

Thalita Athiê Néo

Clonagem e Expressão da Proteína E2 do Vírus da

Hepatite C Humana: estudo da interação molecular

E2-rLDL

in vitro

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicada à Farmácia, área Biologia Molecular da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista, como requisito para obtenção do título de mestre.

Orientador: Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa

ARARAQUARA – SP

Ficha Catalográfica

Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas

UNESP – Campus de Araraquara

Néo, Thalita Athiê

N438c Clonagem e expressão da proteína E2 do vírus da Hepatite C humana: estudo da interação molecular E2-rLDL in vitro / Thalita Athiê Néo. – Araraquara,

2010. 97 f.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicada à Farmácia.

Orientadora: Paulo Inácio da Costa

. 1. Hepatitis C (Virus). 2. Glicoproteína E2. 3. Receptor de LDL. I. Costa,

Paulo Inácio da, orient. II. Título.

!

" #$%

%&'%

()

%

% %

# # *

+,-./-01*2

(3 %( ( 4% 5

6 - 7 860-279:. : ; #$ %( (5

"&+<-(6 :2. #5

7#7/=. ( & % 5

7#:='%2 & 6 :2. 5

7# =2+7# :='% 2 ) %#(5

7# :: ( ) 5

7# >##:. : ,7?627; < -.@ABC 5

:. : ( #(# 5

1 .6D (% *

"&+<-(6 : 2. $ 5

( .11$ / () 5

.7-2#5

- % %$(

*!

"/21-:/+6,2

β

!!" ! !

#$%

!

!

! !

!

&'

! ()*&%#+,)-+#.)(/-+0+1%#.

! ! 2

& "

! +$+(-)(#.()*&%1.3

& !

4

!

5 4! !

!

!

4

! " 67&

,-26*

O vírus da Hepatite C (VHC) é o principal agente etiológico das hepatites não-A e não-B, infectando aproximadamente 170 milhões de pessoas no mundo (3% da população mundial). O vírus da hepatite C (HCV; hepatitis C-virus) é envelopado tem de 50 a 70nm de diâmetro, possui uma única fita positiva de RNA e pertence ao gênero do Hepacivirus e à família Flaviridae. Seu

genoma é constituído por cerca de 9.500 nucleotídeos com regiões curtas não codificadoras e hiperconservadas nas extremidades 5’ e 3’UTR, flanqueando uma única ORF. A região estrutural do vírus é constituída por 3 genes: core, E1 e E2. As proteínas do envelope, E1 e E2 do VHC, são

altamente glicosiladas e apresentam 30 e 70 kDa, respectivamente. Estudos demonstram que ambas apresentam funções específicas em diferentes etapas do ciclo de replicação do vírus, atuando de forma essencial para entrada, ligação ao receptor e fusão com a membrana da célula hospedeira. A glicoproteína E2 do VHC liga-se com alta afinidade a uma alça do receptor CD81, também denominado de TAPA-1, uma tetraespanina encontrada na superfície de muitas células, incluindo hepatócitos. No entanto, o CD81 isoladamente não é suficiente para mediar a entrada celular do vírus, e vários outros co-fatores podem atuar nessa interação. Os receptores de lipoproteína de baixa densidade (LDL-r) e receptor scavenger tipo B classe I apresentam grande

importância nessa relação com o VHC. Estudos sobre as glicoproteínas E1 e E2 têm mostrado que estas se associam com os LDL-r, sugerindo que o VHC use estes receptores para invadir a célula hospedeira. Além disso, estudos anteriores relatam o fato de que, as lipoproteínas poderiam proporcionar acréscimos da infectividade ao VHC. Desta forma, neste trabalho foram desenvolvidas estratégias de clonagem e expressão heteróloga da proteína E2, e avaliou-se sua imunogenicidade e antigenicidade através das reatividades em Western blotting com pool de soros controles positivos anti-VHC. A proteína E2 recombinante foi produzida em bactéria da linhagem Rosetta e sua capacidade de ligação aos LDL-r foi preliminarmente avaliada em linhagem de células humanas derivadas do cordão umbilical, com características endoteliais (ECV 304), em ensaio de imunofluorescência indireta. Nossos resultados mostraram específica interação da proteína recombinante E2 do HCV com anticorpos presentes no pool de soros humanos de portadores crônicos da hepatite C, evidenciando que a expressão heteróloga em E. coli, mesmo na

este processo. No sentido de esclarecermos essa interação, novos estudos deverão ser realizados empregando estratégias de bloqueio dos principais receptores localizados na célula ECV304, associados com este mecanismo; haja vista que não foi possível o estudo da interação com o LDL-r LDL-recombinante.

Palavras-chave: Vírus da hepatite C, glicoproteína E2, receptor de LDL.

>21,.1

Hepatitis C is currently recognized as the primary cause of hepatitis " non A - non B " associated to the blood transfusion. The hepatitis C virus (HCV) is enveloped in about 50 to 70nm in diameter, presenting a positive single strand RNA and belongs to the genus Hepacivirus and the family Flaviridae. Its genome consists of 9,500 nucleotides with short non-coding regions and hiperconservadas ends 5´ and 3'UTR flanking a single ORF. The virus structural region is based on three core genes, E1 and E2. HCV E1 and E2 are highly glycosylated and have 30 and 70 kDa, respectively. Studies show that both have key role in different stages of the cycle of virus replication, acting as essential for entry, receptor binding and fusion with host cell membrane. Glycoprotein E2 of HCV binds with high affinity to a loop of CD81, a tetraspanin, also named TAPA-1, found on the surface of many cells, including hepatocytes. However, the CD81 alone is not sufficient to mediate the cellular entry of the virus, and several other co-factors may be operating in this interaction. Recipients of low density lipoprotein (LDL-r) and scavenger receptor class B type I (SR-BI) would present great importance in relation to HCV. The LDL-r plays an important role in infection for virus of the hepatitis C. Studies on the glycoproteins E1 and E2 have shown that these are associated with the LDL-r suggesting that HCV uses the LDL-r to invade the host cell. Besides, previous studies showed that lipoprotein could improve HCV infectivity. Thus, in this work the capacity of recognition of the antibodies present anti-HCV was evaluated in the positive human serum for HCV of recognizing the protein E2 recombinant produced in bacteria of the lineage Rosetta and also the capacity of connection of the protein E2 of HCV in bind LDL-r present in the surface of human cells with characteristics endoteliais (ECV 304), and such capacity was evaluated through rehearsal of indirect immunofluorescence.

!" #$!$%!#&'

6898 ! 88888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888:

689898 8888888888888888888888888888888888888888888888888888:

68988 ! 888888888888888888888888888888888899

688 888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889

6868 88888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889&

686898 888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889&

68688 8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889;

68&8 ! 88888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889<

68&898 88888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889<

68&88 =>888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889?

68&868! 9@8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889A

68;8! 888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889A

68<8 ! ! 888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889A

68?8 ! ;?B888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889:

68?898 8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889:

68?88 " 888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889:

68?868 ! " 88888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888887

68?8&8 ! 8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889

68?8&898B488888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889

68?8;8 " 88888888888888888888888888888888888888888888888888888&

68?8;898 ! 888888888888888888888888888888888888888888888888888888;

68?8<8 888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888<

68?8<898! 5 8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888?

68A8 8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888?

68A898 88888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888?

68A88 ! " & 88888888888888888888888888888888A

68A868 & 8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888:

68A8&8 ! & ;α888888888888888888888888888888888888888888867

68A8;8 5888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888869

68A8<8 ! 88888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888869

68A8?8 "& 8888888888888888888888888888888888886

68A8A8 & 888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888866

68A8:8 8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888886&

68A8978 " 888888888888888888888888888886&

68:8 ! 888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888886;

68978 58888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888886<

68998 8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888886<

6898 8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888886?

68968! 888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888886A

6896898 " 888888888888888888888888888888888888888886A

689688! " " ! !

= >88888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888886:

689&8! " " ! !

888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888886:

8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888&

689<8 88888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888&6

689?8! 8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888&6

689?898 2"

67&8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888&6

689?88 ! 88888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888&&

!'%$'

&898 888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888&<

&88!!" ! !

8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888&<

&868 ! ! 8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888&A

&8&8! !

888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888&A

&8;8 ! 88888888888888888888&:

&8<888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888;7

&8?8 & 8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888;7

&8A8& 888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888;9

&8:8 ! & ! 888888888888888888888888888888888888888888888888888888;

&8978 ! & 8888888888888888888888888888888888888888;6

&8998 8888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888;&

&898& ! 88888888888888888888;;

&8968 888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888;;

!'!!'%%$!$(!)$!!*#$! (*$$(!)$!!*#$!(*%$!)+!%!!'$!

,!'!% (*$$(!)$!!*#$!(*%$!-%$$!!'$!

!'$!,!'!%%.$'/#$($$!*/!*#!$

(!)$!!*#$! !'$!%-$$(!)$!!*#$!*#!*!(!'!'(!)*!

(!'!!$*&%%$!*" '*'' **%' !!0*$'%-1*$' $!2'

E?/01,*6FG*

O vírus da Hepatite C (VHC) é o principal agente etiológico das hepatites A e não-B, infectando aproximadamente 170 milhões de pessoas no mundo (3% da população mundial) (MEOLA et al., 2000; World Health Organization, 2008; BALDO et al., 2008). No Brasil estima-se que aproximadamente 3 milhões de indivíduos estejam infectados (CVE). A infecção pelo VHC é a principal causa da doença hepática crônica em todo o mundo, a persistência desta infecção pode favorecer pela cirrose e/ou carcinoma hepático (BALASUBRAMANIAN et al., 2005). Entretanto, a severidade da inflamação crônica e a taxa de progressão da doença no fígado variam consideravelmente (GHANY et al., 2003). Aproximadamente 15% dos indivíduos infectados progridem para a cura da doença, já 85% apresentam uma viremia persistente que leva a uma infecção crônica, onde 20 a 50% desses indivíduos desenvolvem cirrose em 20 a 30 anos (WÜNSCHMANN et al., 2000), o restante apresenta uma hepatite crônica menos severa que não progride ou o faz muito lentamente para cirrose (AFDHAL, 2004; ZEREMISK et al., 2007), e 5% dos indivíduos com cirrose relacionada à Hepatite C desenvolvem carcinoma hepatocelular (HOOFNAGLE, 1997).

Nos anos 70, após o desenvolvimento de testes de diagnóstico para os vírus da hepatite A e hepatite B, um novo agente transmitido de forma parenteral, responsável pela maioria dos casos de hepatite não-A e hepatite não-B foi reconhecido. A identificação deste agente tornou-se muito difícil e somente nos anos 80, com o advento da tecnologia do DNA recombinante foi possível clonar o genoma deste novo vírus, que foi denominado Vírus da Hepatite C e então identificado em todas as partes do mundo (CHOO et al., 1989; WHIDBY et al., 2009).

aproximadamente 9.500 nucleotídeos com regiões curtas não codificadoras e hiperconservadas nas extremidades 5’ e 3’UTR (Untranslated Regions), flanqueando uma única ORF (Open Reading Frame) (HOUGHTON et al., 1991).

O tratamento anti-viral padrão para os pacientes com infecção crônica é a combinação do interferon (IFN) peguilado com ribavirina, entretanto este tratamento é caro, relativamente tóxico e efetivo em somente metade dos pacientes tratados (FELD, HOOFNAGLE, 2005; RODRÍGUEZ-RODRÍGUEZ et al. 2009). Sendo o genótipo 1, o mais prevalente na população mundial apresenta altos níveis de resistência inata ao IFN (BIAN et al., 2009). Vários critérios são utilizados para o prognóstico da evolução da doença, como carga viral, idade, sexo e situação histopatológica do fígado (biópsia), como presença de esteatose e extensão da fibrose hepática. Mas, sobre todos esses fatores, o genótipo do VHC é o fator mais importante na predição de resposta ao tratamento antiviral, bem como, para o entendimento da evolução e epidemiologia do vírus, além de determinar o prognóstico e o tempo de tratamento de cada indivíduo (HOLLAND et al., 1996). Demonstra assim, a necessidade do desenvolvimento de novas terapias e de uma vacina contra o VHC, pois até o momento não se conhece uma vacina comprovadamente eficaz contra esse vírus. Um dos problemas é a grande diversidade genética do vírus não ser distribuída de maneira regular no genoma, sendo as regiões não codificadoras relativamente conservadas, enquanto, as regiões do envelope apresentam alta taxa de mutação, o que dificulta a produção de uma vacina eficaz (FARCI et al., 2001; FELD; HOOFNAGLE, 2005, HOUGHTON; ABRIGNANI, 2005; BIAN et al., 2009).

A região estrutural do vírus é constituída por 3 genes: core (C) (codifica proteínas do

núcleo capsídeo), E1 e E2 (envelope viral) (STADHOUDERS e COOREMAN, 1997). A proteína do core possue sequência de aminoácidos altamente conservada entre os diferentes isolados do VHC

uma proteína fortemente básica, sendo o principal constituinte do nucleocapsídeo e, além disso, parece estar associada a diversas funções, como modulação da transcrição gênica, proliferação, morte e sinalização celular, podendo interferir com o metabolismo lipídico e suprimir a resposta imune do hospedeiro via mecanismos ainda não esclarecidos (McLAUCHLAN, 2000; LAI e KATO, 2000). Inicialmente, a proteína do core apresenta um total de 191 aminoácidos em análises

de transcrição e tradução in vitro (HIJIKATA et al., 1991). No entanto, vários grupos inferiram que

um segundo processamento da porção hidrofóbica C-terminal do core poderia ocorrer durante seu

processo de maturação, resultando em proteínas de peso moleculares de 21kDa, 19 kDa ou 16 kDa (LO et al., 1994; LIU et al., 1997; YASUI et al., 1998).

A proteína E1 apresenta aproximadamente metade do tamanho da E2, e embora sua função não esteja clara, muitos estudos têm mostrado que a E1 coopera com a E2 na formação de um complexo funcional de glicoproteínas que é essencial para o processo de invasão viral (LIN et al., 2009). Estas glicoproteínas são classificadas como proteínas transmembrana integrais tipo I com um ectodomínio glicosilado N-terminal e um domínio âncora hidrofóbico C-terminal (GOFFARD, DUBUISSON, 2003; LAVIE et al., 2007; BIAN et al., 2009; RODRÍGUEZ-RODRÍGUEZ et al. 2009).

&

com a proteína p7, estudos apontam que possa mediar a permeabilidade de íons e formar hexâmeros e, até mesmo, apresentar importante função na maturação e liberação da partícula viral (GRIFFIN et al.,2003; PAVLOVIC et al., 2003).

A figura 1 apresenta esquematicamente a organização do RNA genômico do VHC destacando as regiões codificadoras das proteínas estruturais e não-estruturais e a P7.

Figura 1: Representação esquemática da organização do RNA genômico do VHC. O genoma é constituído por 9.500 nucleotídeos. As regiões 5’UTR que contêm IRES (Internal Ribossome Entry Site) e a 3’UTR flanqueiam a ORF (Open Reading Frame), cuja poliproteína correspondente é clivada em proteínas estruturais e não estruturais. Proteínas estruturais: o C (Core), E1 e E2 (glicoproteínas de envelope 1 e 2, respectivamente) estão localizadas na porção N-terminal da poliproteína. Proteínas não estruturais: NS2-5 (proteínas não estruturais 2 ao 5). P7: proteína P7, localizada na extremidade 3’ de E2 (Extraído de ROINGEARD et al., 2004).

Embora, todos os genótipos possam ser encontrados ao redor do mundo, existe clara distribuição geográfica (BUKH et al., 1995). Os genótipos 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, e 3a somam mais de

90% das infecções por VHC na América do Norte e do Sul, Europa, Rússia, China, Japão, Austrália e Nova Zelândia. Os genótipos 1a e 1b são responsáveis por 80% (40% cada) dos casos de infecção pelo VHC nos Estados Unidos. O genótipo 1b soma aproximadamente dois terços de isolados de VHC no sul da Europa, China, Rússia e Japão. O genótipo 4a é o mais predominante no Egito e o genótipo 5a é isolado em 50% de pessoas contaminadas pelo VHC na África do Sul. O genótipo 6 é encontrado no Sudeste Asiático.

Estas células não hepáticas infectadas estariam atuando como potenciais reservatórios, contribuindo para a seleção de variantes e a persistência viral durante a infecção (GIANNINI; BRECHOT, 2003).

Alguns modelos para elucidar as etapas do ciclo e da replicação viral têm sido propostos. A glicoproteína E2 do VHC liga-se com alta afinidade a uma alça do CD81 (TAPA-1), uma tetraespamina encontrada na superfície de muitas células, incluindo hepatócitos (PILERI et al., 1998). No entanto, o CD81 isoladamente não é suficiente para mediar a entrada celular do vírus, e vários outros co-fatores podem estar atuando nessa interação. Os receptores de lipoproteína de baixa densidade (LDLr) (AGNELLO et al., 1999) e receptor scavenger tipo B classe I (SR-BI)

(SCARSELLI et al., 2002) apresentariam grande importância nessa relação com o VHC.

Após a entrada do vírus na célula hospedeira, há a liberação do RNA viral fita simples positiva no citoplasma da célula hospedeira. O genoma fita positiva dos vírus serve de molde para a tradução e replicação, dando origem às interações entre fatores de tradução do hospedeiro e replicação do RNA. Todos os vírus caracterizados como RNA fita positiva organizam o complexo de replicação do RNA nas membranas intracelulares formando vesículas ou outros rearranjos da membrana (AHLQUIST et al., 2003). Além disso, estudos relatam que, ocorrem a produção e a liberação de nucleocapsídeos não envelopados do VHC na circulação sanguínea e o acúmulo de partículas do core em células do fígado durante a fase inicial da infecção. Este fato representa um

meio não convencional pelo qual o vírus engana a resposta imune do hospedeiro e assegura uma infecção persistente via interação com receptores de complemento (C1qR) e ocasiona a redução da resposta dos linfócitos T (KITTLESEN et al., 2000, MAILLARD et al., 2001).

<

A lipoproteína de baixa densidade – LDL - é uma partícula carreadora lipídica inclusa nos compostos colesterol e triglicérides, sintetizada pelo fígado e junto com a apoliproteína B-100. O excesso de LDL circulante é depurado pelos hepatócitos, onde o receptor de LDL participa ativamente neste processo. O alto índice de LDL no plasma aumenta risco para a aterosclerose. A primeira fase dessa patologia é a passagem do LDL na parede vascular. O acúmulo de LDL e agregados de LDL na parede dos vasos sanguíneos estimulam resposta inflamatória causando: injúria endotelial, recrutamento de macrófagos, formação de células espumosas (foam cells) e

proliferação de leiomiócitos (célula do músculo liso). A intervenção terapêutica bloqueia a produção de colesterol e aumenta a expressão do receptor de LDL pelas células parenquimais do fígado, removendo o LDL da circulação. (NAHMIAS et al., 2006).

O LDL-R tem importante papel na infecção do vírus da hepatite C. Estudos sobre as glicoproteínas E1 e E2 têm mostrado que estas se associam com a expressão dos LDL-R em células HepG2 e sugere que o vírus da hepatite C utiliza o LDL-r (NAHMIAS et al., 2006).

Vários estudos relatam a associação entre a infecção do vírus e o metabolismo de lipídeos no fígado. Partículas do VHC circulantes mostram densidades heterogêneas, o que poderia refletir na ligação deste vírus ao VLDL (lipoproteínas de densidade muito baixa) e LDL (lipoproteína de baixa densidade). A literatura suporta a teoria de que as lipoproteínas poderiam proporcionar acréscimo da infectividade por certos componentes do soro humano (MEUNIER et al., 2005; LAVILLETTE et al., 2005). Além disso, a relação do VHC com LDL parece aumentar a entrada deste vírus mediada pelo scavenger receptor classe B tipo I (SR-BI) e proteger as partículas

virais de anticorpos neutralizantes (BARTOSCH et al., 2005),

infecção viral. Estes pesquisadores sugeriram que o VHC pode estar presente como um complexo lipoprotéico no sangue humano de modo que, as proteínas do envelope viral E1 e E2 seriam protegidas da ação do sistema imune (esquema 1 A). Em outra abordagem, o VHC estaria presente em exosomas contendo, além do VHC, o CD81 solúvel associados através das glicoproteínas E1 e E2. É provável que, os complexos de ligação da lipoproteína ao VHC e/ou exosoma-VHC com o receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL-r) pode ser influenciado pelo excesso de lipoproteínas livre no sangue humano. O mesmo poderia ocorrer em relação ao SR-BI, uma vez que este também se liga ao LDL.

Esquema 01:Modelo para a infecção pelo HCV proposto por Favre e Muellhanpt (2005).

A

H?*>-1/@*

O projeto teve como proposta a caracterização molecular e bioquímica da proteína E2 do vírus da hepatite C expressa na forma solúvel em sistema heterólogo. Esta abordagem poderá contribuir no entendimento do mecanismo da interação entre a E2 com o receptor de LDL.

Dessa forma, tivemos como objetivos:

1. Análise por bioinformática das sequências E2 de diferentes genótipos e o desenho de oligoiniciadores específicos para amplificar esta região por PCR;

2. Clonar a sequência específica em vetores de expressão; 3. Expressão da proteína E2;

4. Avaliar a sororreatividade com anticorpos policlonais utilizando immunoblot/Western Blot; 5. Iniciar os estudos de caracterização bioquímica da interação da E2 do vírus VHC com o

receptor LDL em ensaios in vitro.

A1-,/"-I1**2

AEE-216*2-JKL0./7,*1-M0-H0*+-0**@'.

A partir de informações obtidas no Laboratório de Imunologia Clínica e Biologia Molecular do Centro de Referência Diagnóstica do Núcleo de Atendimento à Comunidade (CRD - NAC) da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara – Laboratório de Referência em Hepatite Molecular, integrante do Programa Estadual de Hepatites Virais da Secretaria do Estado da Saúde, observamos que na região de Araraquara há um grande número de indivíduos portadores do VHC genótipo 1a. Foi realizada uma extensa pesquisa relacionada à produção da proteína E2 recombinante do VHC, e observamos que a maioria dos isolados de RNA eram provenientes de amostras virais do genótipo 1a. Desta forma, neste trabalho, o genótipo 1a foi o escolhido para a amplificação da região genômica codificadora da proteína E2.

A figura 2 mostra a sequência completa do cDNA do VHC genótipo 1a depositada no banco de dados genebank NCBI (número de acesso: NC_004102) e nela localizada a região

codificadora da proteína E2 (1491-2579- em itálico e negrito).

Para a confirmação da seqüência, foram analisadas, por alinhamento, no mesmo banco de dados, outras referências: seqüência do genoma completo do HCV subtipo 1a (número de acesso: M67463, proteína E2 de 1491 à 2579) e gene da referida poliproteína na seqüência do HCV subtipo 1a (número de acesso: AF009606, proteína E2 de 1491 à 2579).

97

Figura 2: Representação esquemática da seqüência da proteína E2 no genoma do VHC. Sequência completa do cDNA do VHC genótipo 1a depositada no banco de dados genebank NCBI (número de

acesso: NC_004102) e em itálico a região codificadora da proteína E2 (1491-2340). A região a ser amplificada encontra-se flanqueada pelos oligonucleotídeos desenhados para as seqüências grifadas em amarelo.

ڌڏڏڌٻڼھۏۂۂۂھۂڼڼٻۂۂۏھھۏۂۂۏڼٻۂۏۂھۏۂھۏۂھٻۏڼۏۏۏۂھھۂۂٻھۂۏھۂڼھۂھۂٻۂڼڼڼھھھڼھۂٻ

ڌڐڋڌٻۏھڼھھۂۂۂۂۂٻڼڼۂۏۂھھۂۂھٻھۂھڼھھڼھۂۂٻھۏۂۂۂھۏۏۂۏٻۏۂۂۏھۏھھۏۏٻڼھڼھھڼۂۂھۂٻ

ڌڐڑڌٻھھڼڼۂھڼۂڼڼٻھڼۏھھڼڼھۏۂٻڼۏھڼڼھڼھھڼٻڼھۂۂھڼۂۏۏۂٻۂھڼھڼۏھڼڼۏٻڼۂھڼھۂۂھھۏٻ

ڌڑڍڌٻۏۂڼڼھۏۂھڼڼٻۏۂڼڼڼۂھھۏۏٻڼڼھڼھھۂۂھۏٻۂۂۏۏڼۂھڼۂۂٻۂھۏھۏۏھۏڼۏٻھڼۂھڼھڼڼڼۏٻ

ڌڑړڌٻۏھڼڼھۏھۏۏھٻڼۂۂھۏۂۏھھۏٻۂڼۂڼۂۂۏۏۂۂٻھھڼۂھۏۂھھۂٻڼھۂھھۏۏڼھھٻۂڼۏۏۏۏۂھھھٻ

ڌڒڏڌٻڼۂۂۂھۏۂۂۂۂٻۏھھۏڼۏھڼۂۏٻۏڼۏۂھھڼڼھۂٻۂڼڼۂھۂۂھھۏٻھۂڼھۂڼڼھۂھٻھھھۏڼھۏۂھۏٻ

ڌړڋڌٻۂۂھڼھۏڼھھھٻۏھھڼڼۂڼھھۏٻۏۂۏۂۂھڼۏۏۂٻۏۂھھھۂھڼڼڼٻۂڼۂھۂۏۂۏۂۏٻۂۂھھھۂۂۏڼۏٻ

ڌړڑڌٻڼۏۏۂھۏۏھڼھٻۏھھھڼۂھھھھٻۂۏۂۂۏۂۂۏۂۂٻۂڼڼھۂڼھھۂڼٻھڼۂۂۏھۂۂۂھٻۂھۂھھۏڼھھۏٻ

ڌڔڍڌٻڼھڼۂھۏۂۂۂۂٻۏۂھڼڼڼۏۂڼۏٻڼھۂۂڼۏۂۏھۏٻۏھۂۏھھۏۏڼڼٻھڼڼھڼھھڼۂۂٻھھڼھھۂھۏۂۂٻ

ڌڔړڌٻۂھڼڼۏۏۂۂۏۏٻھۂۂۏۏۂۏڼھھٻۏۂۂڼۏۂڼڼھۏٻھڼڼھۏۂۂڼۏۏٻھڼھھڼڼڼۂۏۂٻۏۂھۂۂڼۂھۂھٻ

ڍڋڏڌٻھھھھۏۏۂۏۂۏٻھڼۏھۂۂڼۂۂۂٻۂۏۂۂۂھڼڼھڼٻڼھڼھھۏۏۂھۏٻھۏۂھھھھڼھۏٻۂڼۏۏۂۏۏۏھھٻ

ڍڌڋڌٻۂھڼڼۂھڼۏھھٻۂۂڼڼۂھھڼھڼٻۏڼھۏھۏھۂۂۏٻۂھۂۂھۏھھۂۂٻۏھھھۏۂۂڼۏۏٻڼھڼھھھڼۂۂۏٻ

ڍڌڑڌٻۂھڼۏۂۂۏھۂڼٻھۏڼھھھۂۏڼۏٻڼۂۂھۏۏۏۂۂھٻڼھۏڼۏھھۏۏۂٻۏڼھھڼۏھڼڼۏٻۏڼھڼھھڼۏڼۏٻ

ڍڍڍڌٻۏھڼڼڼۂۏھڼۂٻۂڼۏۂۏڼھۂۏۂٻۂۂڼۂۂۂۂۏھۂٻڼۂھڼھڼۂۂھۏٻۂۂڼڼۂھۂۂھھٻۏۂھڼڼھۏۂۂڼٻ

ڍڍړڌٻھۂھۂۂۂۂھۂڼٻڼھۂھۏۂۏۂڼۏٻھۏۂۂڼڼۂڼھڼٻۂۂۂڼھڼۂۂۏھٻھۂڼۂھۏھڼۂھٻھھڼۏۏۂھۏۂھٻ

ڍڎڏڌٻۏۂۏھھڼھھڼھٻڼھڼۂۏۂۂھڼۂٻۂۏھھۏۏھھۂۏٻۂۏۏھۏۏۏھڼھٻۂڼھھھۏۂھھڼٻۂھھۏۏۂۏھھڼٻ

ڍڏڋڌٻھھۂۂھھۏھڼۏٻھھڼھھۏھھڼھٻھڼۂڼڼھڼۏۏۂٻۏۂۂڼھۂۏۂھڼٻۂۏڼھۏۏۂۏڼھٻۂۂۂۂۏڼۂۂۂۏٻ

ڍڏڑڌٻھڼڼۂھڼۏھۂھٻۂۏھھۏۂۂۂھھٻڼۏۏڼڼۂۏۂۂۂٻڼۂۏڼھۂۏھۂۏٻۏھۏھھۏۂۏۏھٻھۏھھۏۂھۏۏۂٻ

AEH.*021,6FG**2*"/+*06."-*1M-*2-7"/:/.FG*,-+/G*-H

Para o desenvolvimento das estratégias de amplificação e clonagem da região genômica correspondente ao gene E2 foram desenhados os oligonucleotídeos iniciadores conforme representado na figura 2.

A reação de amplificação por PCR (Polymerae Chain Reaction) foi desenvolvida

conforme descrito por Rodríguez-Rodríguez et.al. (2009) e o produto amplificado esperado deverá conter 834pb.

As seqüências dos oligonucleotídeos sofreram algumas alterações para se adequarem às condições de clonagem, como sítios para enzimas de restrição NcoI e XhoI (destacado em vermelho)

e nucleotídeos extras para colocar a seqüência na mesma fase de leitura do vetor plasmidial de clonagem pET-42a (destacado em azul).

Oligo direto (sense): (E2.S)

5’

GG

CCATGG

GG

gaaacccacgtcaccgg 3’

Sítio para a enzima de restrição NcoI Nucleotídeos extras para adequação ao vetor de clonagem

9

Oligo reverso (anti-sense): (E2.AS)

A análise dos oligonucleotídeos foi realizada no programa JellyFish para a verificação

das enzimas de restrição escolhidas cortarem as extremidades do produto amplificado e o vetor plasmidial pET-42a-c(+), sem produzirem restrições na seqüência de interesse.

Outras análises para a construção dos oligos foram realizadas no programa GeneRunner.

Com o propósito de caracterizar o subtipo ou grupo viral para amplificação da região correspondente à proteína E2, os testes de amplificação, quantificação viral e genotipagem foram fundamentais. Abaixo apresentaremos resumidamente estes procedimentos os quais são realizados rotineiramente em nosso laboratório.

Um pool de soros VHC (+) com carga viral acima de 100.000 cópias/mL e previamente

genotipado como grupo 1a, foi fornecido especificamente para este estudo, para a extração do RNA viral.

5’

G

CTCGAG

G

ctcggacctgtccctgtc 3’

Sítio para a enzima de restrição XhoI Nucleotídeos extras para adequação ao vetor de clonagem

O procedimento de determinação da carga viral foi realizado pelo teste comercial AMPLICOR Hepatitis C Virus Test, version 2.0 (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ, USA), que pode ser um ensaio qualitativo ou quantitativo dependendo, neste caso, da construção de curva de calibração. O procedimento qualitativo também é usado para gerar produtos biotinilados os quais são usados no procedimento de genotipagem INNO-LiPA, descrito brevemente abaixo. O teste AMPLICOR baseia-se em cinco procedimentos principais: (1) preparação da amostra; (2) obtenção do cDNA por transcrição reversa do RNA alvo; (3) amplificação por PCR (reação da polimerase em cadeia) do DNA complementar (cDNA) alvo com oligoiniciadores específicos para a região 5’UT; (4) hibridação dos produtos amplificados com sondas de captura específicas em microplaca de 96 poços; e, (5) detecção destes produtos pelo conjugado avidina-peroxidase na presença dos substratos TMB e H2O2 e revelado por colorimetria. Os procedimentos utilizados seguiram as especificações

do fabricante.

O vírus foi então genotipado utilizando o método comercial INNO – LiPA HCV II (Innogenetics, Bélgica), que permite a identificação de 6 genótipos do VHC e seus subtipos. O princípio deste ensaio é baseado na variação encontrada na região 5’ UTR de diferentes genótipos (STUYVER et al., 1993). As sondas tipo específicas possuem uma cauda poli–T (timina), ligada à membrana de nitrocelulose. Os produtos amplificados por PCR com oligonucleotídeos iniciadores, marcados com biotina na posição 5’, hibridizam-se apenas com a seqüência da sonda específica sobre a membrana de nitrocelulose. A figura 3 é uma representação esquemática deste processo de hibridização.

O controle negativo para o VHC foi proveniente de pool de soros negativos testados para

doenças infecciosas: Chagas, Sífilis, Hepatites B e C, HIV-1/2 e HTLV. Todos estes testes foram realizados em nosso laboratório. O pool de soros foi mantido à temperatura de -80ºC até o momento

9&

Figura 3: Representação esquemática da genotipagem pelo processo de hibridização reversa, identificando os 6 genótipos principais e subtipos.

AAE7,*.-/-01*7,/2*"-01*@/,"

Para que fosse possível concentrar a amostra e aumentar o rendimento de RNA viral extraído, adaptamos uma técnica utilizando o reagente Bead Suspend, do kit VERSANT® HCV RNA 3.0 Assay (bDNA) (Siemens, Tanytown, NY 10591-5097 USA).

Em um de microtubo de 1,5 mL, DNase e RNase free, foi adicionado 1mL do pool de

soros VHC (+) genótipo 1a e 50μL de Bead Suspend (microesferas de poliestireno). O tubo foi

este tempo, ao precipitado foram adicionados 120μL de tampão TE (Tris-. HCl 10 mM, pH 8,0;

EDTA 1 mM), e imediatamente submetido à etapa de extração do RNA-VHC. O mesmo

procedimento foi realizado com o soro controle negativo.

AAH-N1,FG**,0@/,"

Para a extração do RNA viral foi utilizado o kit QIAmp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, GmbH, Hilden, Germany), com algumas adaptações, como por exemplo, o uso da suspensão de Bead, citado anteriormente, para aumentar a eficiência do procedimento.

A extração foi realizada à temperatura ambiente e todos os reagentes foram utilizados à mesma temperatura. As amostras foram mantidas em gelo até o momento do uso.

Em um microtubo de 1,5mL, livre de DNase e RNase, foram adicionados 560μL do tampão AVL-Carrier RNA Mix e 140μL do precipitado ressuspenso, conforme descrito no item 3.3.1. O tubo foi levado ao vórtex por 15 segundo e incubado à temperatura ambiente por 10 minutos. Decorrido este tempo, o tubo foi centrifugado brevemente e a ele adicionados 560μL de etanol (100%). O tubo foi submetido ao vórtex por 15 segundos e centrifugado rapidamente.

A uma coluna acoplada em um tubo de coleta foram aplicados cuidadosamente 630μL da solução. A coluna foi tampada e centrifugada a 6.000 x g por 1 minuto. Após a centrifugação, o tubo de coleta com o filtrado foi descartado e a coluna foi re-acoplada dentro de outro tubo de coleta limpo. O restante da solução, ou seja, 630μL, foi adicionado à coluna e esta novamente centrifugada. Após a centrifugação, o tubo de coleta com o filtrado foi descartado e a coluna re-acoplada em outro tubo de coleta limpo. Na coluna foram aplicados 500μL do tampão AW1, esta foi

9<

500μL do tampão AW2 e centrifugada à 20.000 x g por 3 minutos.

A coluna foi acoplada a outro microtubo de 1,5mL, livre DNase e RNase, adicionados

60μL de tampão AVE, incubada à temperatura ambiente por 1 minuto e centrifugada à 6.000 x g por

1 minuto. O RNA eluído foi armazenado à temperatura de -80ºC até o momento do uso.

ACE,-FG*-1,02.,/FG*,-@-,2

A síntese do cDNA do VHC foi realizada utilizando a enzima SuperScriptTM III Reverse Transcriptase (Invitrogen – Life Technologies), conforme especificações do fabricante, em

termociclador Mastercycler gradient (Eppendorf).

Na primeira etapa da reação foram adicionados, em microtubo de 0,2mL, livre de DNase e RNase, 10μL de amostra (RNA e controle negativo da etapa anterior), 0,2μL do primer anti-sense

da proteína E2 (E2.AS) (10pM/μL), 1μL de dNTP mix (concentração 10mM) e 1,8μL de água nuclease free, num volume final de 13μL que foi gentilmente misturado e incubado no termociclador à 65ºC por 5 minutos. Decorrido este tempo, o tubo foi brevemente centrifugado e diretamente levado ao gelo. Um controle negativo da reação foi inserido (tubo sem RNA, o volume de RNA foi substituído por água destilada Milli-Q) como controle de reagentes.

Na segunda etapa, foram adicionados ao tubo anterior de cada amostra e controle negativo, 4μL do tampão first-strand 5x, 1μL de DTT 0,1M, 1μL de RNase OUT(Invitrogen – Life Technologies) e 1μL da enzima SuperScriptTM III Reverse Transcriptase, originando um volume

ACH,-FG*-.-/7*"/-,2-97.,;

Após o estudo dos parâmetros físico-químicos dos primers sense (E2.S) e anti-sense

(E2.AS) foram definidas e padronizadas as condições de PCR para a amplificação do produto de interesse a partir do cDNA do VHC.

Na reação de PCR foram incluídos além das amostras, também, o controle negativo da reação, ou seja, o controle de contaminação de reagentes (todos os constituintes do mix de reação menos o cDNA, sendo o volume deste substituído por água nuclease free).

Para cada amostra e controle negativo, foi realizada a preparação de um mix de reação. A um tubo de microcentrífuga de 0,2mL DNase e RNase free (tubos para reação de PCR) foram

adicionados: 5μL de cDNA, 5μL de tampão de PCR 10x (concentração final: 1x) (sem MgCl2),

1,5μL de MgCl2 50mM, 1μL de dNTP mix 10mM, 1μL de primer sense E2.S (Invitrogen – Life

Technologies) (10pM/μL) (5’ ggc cat ggg gga aac cca cgt cac cgg 3’), 1μL de primer anti-sense

E2.AS (Invitrogen – Life Technologies) (10pM/μL) (5’ gct cga ggc tcg gac ctg tcc ctg tc 3’), 0,5μL de enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen – Life Technologies) (5U/μL) e 35μL de água destilada Milli-Q, constituindo assim um volume final de 50μL. A reação foi realizada em gelo, brevemente centrifugada (spin) e imediatamente incubada no termociclador.

As reações amplificadas foram realizadas no termociclador Mastercycler gradient (Eppendorf) sob as seguintes condições padronizadas: 94ºC por 4 minutos para desnaturação inicial,

35 ciclos de: 94ºC por 1 minuto para desnaturação, 55ºC por 1 minuto para anelamento e 72ºC por 1 minuto e 15 segundos para extensão, seguidos de um acréscimo de 10 minutos à 72ºC para completar a extensão final. Ao final da reação as amostras foram mantidas no termociclador à 4ºC e posteriormente foram armazenadas à -20ºC até o momento do uso.

9A

restrição para as enzimas NcoI e XhoI (18pb), apresentando um total de 852pb.

ACA-"-1,*:*,-2--+-"-+,*2-EO

Para a análise do fragmento amplificado, realizou-se eletroforese em gel de agarose 1%. Aos poços do gel (já contendo brometo de etídeo (0,5 μg/ml)) foram aplicados 10μL do produto amplificado misturado a 2μL de uma solução corante contendo: azul de bromofenol 0,1%, SDS 1%, glicerol 50% e EDTA-Na2 0,1 M (tampão da amostra). A corrida eletroforética foi realizada em tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA). A corrida foi acompanhada pela migração do azul de bromofenol contido na solução corante da amostra, durante cerca de 40 minutos a uma tensão de (5V/cm).

O gel foi analisado em transluminador de luz ultra-violeta (UV) (BioRad – software Quantity One 4.6.5) e os produtos de amplificação foram observados como um fragmento único de

852pb correspondente ao tamanho da sequência E2 amplificada.

A purificação do produto de PCR foi realizada utilizando-se o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI, USA), conforme as especificações dofabricante.

!

" #$"%

APE"/+FG*

O produto da PCR purificado foi clonado no vetor de clonagem pTZ57R/T, utilizando para isto o kit InsTAcloneTM PCR Cloning Kit (Fermentas - Life Sciences) conforme as especificações do

fabricante.

Em um microtubo de 1,5mL, livre de DNase e RNase, foram adicionados para a reação

de ligação: 5μL de água nuclease free, 1μL de pTZ57R/T (50ng/μL), 2μL de produto de PCR, 1μL de tampão e 1μL de T4 DNA ligase. A reação foi homogeneizada e incubada à temperatura ambiente por 1 hora e posteriormente utilizado para a transformação em bactéria competente.

APH7,-7,FG*2.I"6"2>.1-,/02.*7-1-01-2

A preparação das células bacterianas competentes (cepa bacteriana E. coli, linhagem

DH5α mantida em estoque a –80ºC), para transformação através do tratamento com cloreto de cálcio (CaCl2), foi realizada segundo o protocolo descrito por Sambrook et al, 1989.

A cepa mantida a –80ºC, foi semeada em meio de cultura LB liquido (1% triptona, 0,5% de extrato de levedura, 1% de NaCl) e incubada durante 24 horas a 37ºC. Uma colônia foi inoculada em 5,0mL de meio LB líquido e incubada 12-18h à 37ºC sob agitação a 200rpm. A seguir, 1mL desta suspensão bacteriana foi inoculada em 100ml de meio LB e mantida sob agitação a 37ºC até que a absorbância a 600nm atingisse o valor entre 0,4 a 0,6. Neste ponto, as células foram isoladas por centrifugação a 2.700 g durante 10 minutos a 4ºC, o sobrenadante foi descartado por inversão do

7

volume original com CaCl2 0,1M e mantido em gelo durante 30 minutos. A suspensão foi

novamente centrifugada a 2.700xg durante 10 minutos a 4ºC, o sobrenadante descartado por

inversão e mantido na posição invertida sobre um papel absorvente por 1 minuto, as células foram gentilmente ressuspensas em 1/10 de volume com CaCl2 0,1M.

A suspensão bacteriana competente foi estocada a –80ºC com adição de 15% de glicerol até o momento do uso.

APA1,02:*,FG*->.1I,/-7,*7+FG*

O produto de ligação foi transformado por choque térmico em bactérias E. coli

competentes linhagem DH5Į preparadas utilizando-se de cloreto de cálcio (CaCl2) 0,1M, segundo o

protocolo descrito por de Mendel e Higa (SAMBROOK ET AL.; 2001).

As bactérias competentes E.coli, linhagem DH5Į, armazenadas a – 80ºC em tubos do

tipo Eppendorf DNase e RNase free e estéreis, aliquotadas em 200μL, foram descongeladas em

banho de gelo e sob condições assépticas. Em cada tubo foi adicionado 7μL do produto de ligação seguida por uma suave homogeneizado. A reação foi mantida durante 5 minutos no gelo. As bactérias foram então submetidas ao choque térmico por 90 segundos a 42ºC e logo em seguida colocadas no gelo por 1 minuto. Foram adicionados 800μL de meio de cultura líquido LB ( Luria-Bertani broth) (USB) sem antibiótico em cada tubo e estes foram incubados em termo-bloco com

agitação (Thermo Stat Plus - Eppendorf) a 37ºC por 45 minutos sob agitação de 300rpm. Decorrido este período, as bactérias transformadas foram plaqueadas. Para a confecção de cada placa, sob condições estéreis, foram adicionados à um tubo de cônico de 50mL estéril: 15ml de meio LB ágar (fundido), 15μL de ampicilina (100mg/mL), 50μL de IPTG (IPTG: Isopropil-b-D-Tiogalactosídeo)

em uma placa de petri plástica estéril e descartável (J. Prolab) (90X15mm de diâmetro). A placa foi mantida aberta, próxima do bico de Bunsen e dentro do fluxo laminar, para a completa solidificação. Então, 200μL do produto de transformação foi plaqueado, e novamente a placa foi mantida próxima ao bico de Bunsen e dentro do fluxo laminar para secar. A placa foi incubada em estufa a 37ºC durante 12-18h. Foram plaqueados 220ul do produto de transformação para obtenção de um número de colônias adequados de acordo com a competência da célula (1x106 colônias/μg) de DNA circular. Foram ainda adicionados 400μL de glicerol 50% no tubo que continha o produto de transformação para armazenamento em freezer a -20ºC.

APC2-"-FG*2.*"Q0/21,02:*,01-2

APCE>"6-RS'/1-2.,--0/0+

O screening das colônias transformantes foi realizado utilizando-se a técnicae blue/white screening, segundo informações do fabricante Sigma-Aldrich, onde o X-gal adicionado ao meio de

cultura é clivado pela β-galactosidase produzindo galactose e 5-bromo-4-cloro-3-hidroxiindol (1), que é oxidado em 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-indigo (2), um produto azul insolúvel. Tal reação é apresentada na figura 6.

Figura 4: Reação de clivagem do X-gal pela β-galactosidase. (1) 5-bromo-4-cloro-3-hidroxiindol, (2) 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-indigo (AZUL).

Se o X-gal e um indutor de β-galactosidase (codificada pelo gene lacZ), geralmente o IPTG,

estiverem contidos no meio de cultura (ágar), as colônias que apresentarem o gene lacZ funcional

podem ser facilmente distinguidas pela coloração azul. Esta técnica é usada na clonagem de genes para se verificar se o vetor adquiriu o inserto de interesse ou não. A bactéria E. coli não produz β -galactosidase expontâneamente por não possuir o gene lacZ, mas quando transformada com um

vetor plasmidial que contém este gene (como o pTZ por exemplo) passa a produzir. O pTZ é um vetor que contém uma ORF (Open Reading Frame) no gene lacZ, onde é inserido o gene que se

quer clonar. Após o crescimento de colônias bacterianas em meio contendo X-gal e IPTG, pode-se distinguir colônias azuis e brancas. Aquelas bactérias que foram transformadas com vetores sem inserto apresentarão a coloração azul, pois seu gene lacZ não foi interropido pelo inserto e assim

apresentou-se funcional. Já as colônias brancas indicam que as bactérias foram transformadas com vetores que continham o inserto de interesse, o que tornou o gene lacZ não funcional.

Sob condições assépticas, foram adicionados em um tubo de 50mL estéril, 5mL de meio LB e 5μL de ampicilina (100mg/mL) para uma concentração final de 1μL/mL. Em cada tubo tipo

Eppendorf de 1,5mL estéril (autoclavado) foram adicionados 300μL do meio LB com ampicilina.

Foram selecionadas, da placa onde houve o crescimento bacteriano, 3 colônias de coloração branca. Estas colônias foram tranferidas diretamente da placa com um palito de madeira estéril, para se retirar um pouco do material da colônia selecionada. O palito impregnado com bactérias foi mergulhado no tubo de 1,5mL com meio LB e ampicilina. Os tubos fechados foram colocados no shaker ( New Brunswick Scientific – modelo- Excella E24R) a uma temperatura de

APCH7.,7,#2.*"Q0/21,02:*,01-2

Decorridas as 6 horas da etapa anterior, foi realizada uma PCR para confirmação das colônias transformantes. A reação foi realizada em cada tubo de 0,2mL DNase e RNasefree (tubos

para reação de PCR) onde foram adicionados: 1μL de suspensão celular, 2,5μL de tampão de PCR 10x (sem MgCl2), 0,75μL de MgCl2 50mM, 4μL de dNTP mix 1,25mM, 1μL de primer sense M13F

(Fermentas - Life Sciences) (10pM/μL) (5’ gta aaa cga cgg cca gt 3’), 1μL de primer anti-sense

M13R (Fermentas - Life Sciences) (10pM/μL) (5’ cag aag aca gct atg ac 3’), 0,5μL de enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen – Life Technologies) (5U/μL) e 14,25μL de água destilada Milli-Q, constituindo assim um volume total de 25μL. Foi feito também um tubo controle negativo, que continha todo o mix de reação menos a suspensão celular (seu volume foi substituído por água nuclease free. A reação foi realizada em gelo, brevemente centrifugada e imediatamente incubada no

termociclador.

As reações foram realizadas no termociclador GeneAmp 2400 (Perkin Elmer) sob as

seguintes condições que foram padronizadas: 95ºC por 2 minutos para desnaturação inicial, 35 ciclos de: 94ºC por 30 segundos para desnaturação, 55ºC por 30 segundos para anelamento e 72ºC por 1 minuto para extensão, seguidos de um acréscimo de 5 minutos à 72ºC para completar a extensão final. Ao final da reação as amostras foram mantidas no termociclador à 4ºC e posteriormente foram armazenadas à -20ºC até o momento do uso.

O restante de suspensão celular foi armazenada na geladeira até a confirmação da PCR e então foram adicionados 150μL de glicerol 50%, a amostra foi guardada em freezer a -20ºC.

&

aplicado um padrão de pares de bases de 1Kb, para a posterior comparação do tamanho das bandas. A corrida foi acompanhada pela migração do azul de bromofenol contido na solução corante da amostra, durante cerca de 40 minutos a uma tensão de 100 volts (V).

Ao final do processo, o gel foi levado a um transluminador de luz UV e os produtos de amplificação foram observados como um fragmento único correspondente ao tamanho da seqüência amplificada. Foram consideradas as amostras que apresentaram produtos de amplificação com aproximadamente 1000 pares de bases (852pb inserto + 154pb parte do pTZ).

APT-N1,FG**07"2//">.1I,//0/87,-7

A técnica de mini-prep foi realizada utilizando o kit QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), segundo o protocolo para microcentrífuga sugerido pelo fabricante. Este protocolo é destinado à purificação de mais de 20μg de DNA plasmidial em 1-5mL de cultura de E. coli em

meio LB durante 12-18h.

As amostras foram previamente preparadas da seguinte forma: em condições estéreis foram adicionados em um tubo de Falcon de 50mL estéril, 5ml de meio LB e 5μL de ampicilina (100mg/mL) (GIBCO). A suspensão celular contendo o inserto confirmado por PCR foi transferida com um palito de madeira estéril, e este palito foi mergulhado no tubo. O tubo foi levado ao shaker( New Brunswick Scientific – modelo- Excella E24R) a uma temperatura de 37ºC, sob agitação de

250rpm durante 12-18h. Decorrido este período de crescimento celular, o tubo foi centrifugado a 4000rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado por inversão do tubo, e a borda deste foi pressionada sob papel absorvente até que o todo o meio de cultura fosse eliminado.

tampão P2 e misturado por inversão de 4 à 6 vezes. Nesta etapa ocorreu a lise bacteriana com a liberação do seu DNA e também do vetor plasmidial. Após a inversão, adicionou-se 350μL de tampão N3 (tampão neutralizante) e inverteu-se o tubo de 4 à 6 vezes para homogeneização. Em seguida, o tubo foi centrifugado por 10 minutos à 13.000 rpm e o sobrenadante foi aplicado em uma coluna acoplada a um tubo de coleta, o conjunto (coluna + tubo de coleta) foi centrifugado por 1 minuto à 13.000 rpm. O fluído do tubo de coleta foi descartado e a coluna foi lavada com 750μL de tampão PE, então, novamente o conjunto foi centrifugado por 1 minuto à 13.000 rpm. Repetiu-se mais uma vez o passo de descartar o fluído do tubo de coleta e o conjunto foi centrifugado a 1 minuto à 13.000 rpm para a remoção dos resíduos de tampão. A coluna foi acoplada à um microtubo de 1,5mL DNase e RNase free e o DNA foi eluído da coluna adicionando-se 50μL de água nuclease

free (Prodimol) estéril, o conjunto foi incubado a temperatura ambiente por 60 segundos e depois

centrifugado por 1 minuto à 17.900 g. A amostra (vetor com inserto) foi guardada em freezer a

-20ºC.

APTE0U"/2--J601/:/.FG**7,*61*/0/87,-7

Para a análise da qualidade do produto da mini-prep, realizou-se uma eletroforese em gel de agarose 1%, como descrito no ítem 3.4.3. Sendo que aos poços do gel foram aplicados 1μL do produto da mini-prep misturado a 1μL da solução corante e em um dos poços foi aplicado um padrão de pares de bases (ladder) de 1Kb (Fermentas), para a posterior comparação do tamanho das

bandas. A corrida foi acompanhada pela migração do azul de bromofenol contido na solução corante da amostra, durante cerca de 15 minutos a uma tensão de 100 volts (V).

<

Foram consideradas as amostras que apresentaram produtos com aproximadamente 3738pb (852pb inserto + 2886pb pTZ).

O produto resultante da mini-prep foi quantificado no nanodrop, através da adição de 1μL da amostra ao seu sistema. A amostra foi armazenada em freezer a -20ºC até o momento do uso.

APV."/@+--0W/U1/.*@-1*,1W

O produto da mini-prep, ou seja, o vetor pTZ contendo o inserto da proteína E2 com os sítios de restrição, foi clivado com as enzimas NcoI e XhoI, através do protocolo estabelecido pelo

fabricante.

Desta forma, em tubos para microcentrífuga de 1,5mL foram adicionados 10μL (4000ng) de amostra (pTZ com inserto da proteína E2 contendo os sítios para enzimas NcoI e XhoI)

(concentração: 420ng/μL), 2μL da enzima NcoI (10U/μL) (Fermentas) e 2μL da enzima XhoI

(10U/μL)(Amersham),12mL de tampão Tango 2X concentrado (fermentas 10mMTris-HCl pH 8,0,

100mM KCl, 10mM MgCl2, 0,1mg/mL BSA) e 34μL de água Milli-Q estéril para um volume final de 60mL. A reação foi brevemente centrifugada (spin) e incubada em banho-maria a 37ºC por 3

horas.

Ao final do processo, o gel foi levado a um transluminador UV e o produto de clivagem enzimática foi observado como dois fragmentos correspondentes ao tamanho da sequência do vetor pTZ e o outro ao tamanho do inserto. Sendo o tamanho dos produtos estimados pelo padrão de 1Kb em um dos poços do gel. Foram consideradas as amostras que apresentaram bandas com aproximadamente 1006pb (correspondente ao inserto) e bandas com aproximadamente (2886pb) correspondente ao tamanho do pTZ. A banda correspondente ao inserto foi rapidamente (para evitar a exposição prolongada ao UV que poderia danificar o material) recortada do gel e colocada em um tubo de microcentrífuga de 1,5mL estéril. O tubo com a amostra foi pesado em balança semi-analítica (GEHAKA), a massa do tubo foi descontada e a do gel foi anotada.

APVE76,/:/.FG*2*21,27X2/+-21G*

A purificação da banda correspondente ao inserto E2 já digerido com as enzimas de restrição NcoI e XhoI foi realizada utilizando-se o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI, USA), conforme as especificações dofabricante. Foi realizada a análise e a

quantificação do produto purificado. A amostra foi armazenada em freezer a -20ºC até o momento do uso.

& #'

AYE@-1*,--N7,-22G*-1

A

e dos sinais de iniciação de tradução s10 da proteína do capsídeo do gene 10 do bacteriófago T7. A grande vantagem deste vetor é que o inserto do bacteriófago T7 clonado é transcrito pela RNA polimerase, que é muito seletiva e ativa, sendo capaz de elongar cadeias de RNA aproximadamente cinco vezes mais rápido que a RNA polimerase de E. coli. Alguns vetores da série pET apresentam

o promotor T7-lac, colocando a expressão da proteína sob controle do promotor lac e reduzindo portanto, o background de expressão da proteína alvo na ausência de IPTG (pET SYSTEM

MANUAL, 2002).

Por este motivo o vetor escolhido para a expressão da proteína E2 recombinante em E. coli foi o pET-42a, pois além disso, ele permite a clonagem e a expressão do gene de interesse em

fusão com a proteína GST (Glutationa S-Transferase) na porção N-terminal da proteína (o que posteriormente facilitou a purificação da proteína de interesse), e seleção com o antibiótico kanamicina (pET SYSTEM MANUAL, 2002). A proteína híbrida pode ser purificada por cromatografia de afinidade em coluna de glutationa e a proteína de fusão pode ser retirada através da clivagem com Fator Xa.

AYH1,02:*,FG*2>.1I,/2.*7-1-01-2.**@-1*,-18CH

As bactérias competentes E. coli, linhagem DH5α mantidas em estoque a -80ºC foram transformadas com o vetor pET-42a, segundo o protocolo descrito por Sambrook et al, 1989.

No fluxo laminar e com o bico de Bunsen aceso em um tubo de microcentrífuga de 1,5mL estéril foram adicionados: 200μL de suspensão de células bacterianas (E. coli) linhagem

LB sem antibiótico, e o tubo foi incubado a 37ºC por 45 minutos sob agitação (300rpm) no shaker (New Brunswick Scientific – modelo- Excella E24R). Decorrido este período, as bactérias

transformadas foram plaqueadas. Para a confecção de cada placa,sob condições estéreis, foram adicionados à um tubo de Falcon de 50mL estéril: 15ml de meio LB ágar (fundido) e 15μL de kanamicina (25mg/mL). O conteúdo do tubo (15mL) foi vertido em uma placa plástica estéril. A placa foi mantida aberta, próxima do bico de Bunsen e dentro do fluxo laminar, para a completa solidificação. Então, 200μL (1x106 colônias de DNA) do produto de transformação foi plaqueado, novamente a placa foi mantida próxima ao bico de Bunsen e dentro do fluxo laminar para secar. A placa foi incubada em estufa a 37ºC a noite toda.

No dia seguinte, em tubos de Falcon de 50mL estéreis foram adicionados: 5mL de meio LB e 5μL de kanamicina (25mg/mL), e o tubo foi homogeneizado. Da placa foi escolhida uma colônia, e esta foi transferida com um palito de madeira estéril para que este ficasse impregnado de bactérias, este palito foi mergulhado e agitado dentro do tubo contendo meio e antibiótico. Os tubos foram colocados no shaker (NewBrunswick Scientific – modelo- Excella E24R) à 37ºC, sob agitação

de 300rpm a noite toda. A suspensão bacteriana competente e transformada foi separada (200μL) em tubos de microcentrífuga de 1,5mL foi estocada a –80ºC com adição de 15% de glicerol até o momento do uso.

AYA"/+FG**/02-,1**@-1*,-18CH

Seguindo o protocolo descrito por Sambrook et al., 1989, os produtos amplificados para a proteína E2 (852pb) e já clivados foram ligados ao vetor de expressão pET-42a (5930pb).

67

purificado (concentração: 20ng/μL), 1,5μL de tampão da enzima 10x, 1,2μL de T4 DNA ligase (New England Biolabs) e 3,1μL de água Milli-Q autoclavada, completando assim um volume final de 15μL. A reação foi homogeneizada e então incubada à 16ºC por 12-18h.

AYC1,02:*,FG**-18CH.*/02-,1*-"/0'+-'Tαααα

No fluxo laminar e com o bico de Bunsen aceso em um tubo de microcentrífuga de 1,5mL estéril foram adicionados: 200μL de suspensão de células bacterianas (E. coli) linhagem

DH5α competentes (preparadas com CaCl2 0,1M, segundo o protocolo de Mendel e Higa

(SAMBROOK ET AL.; 2001)) descongeladas em banho de gelo e 5μL do produto de ligação (pET-42a + inserto E2), o tubo foi homogeneizado suavemente, e as bactérias foram submetidas ao choque térmico por 90 segundos a 42ºC e logo em seguida à 1 minuto no gelo. Foram adicionados 800μL de meio de cultura líquido LB sem antibiótico, e o tubo foi incubado a 37ºC por 45 minutos sob agitação (300rpm) no shaker (New Brunswick Scientific – modelo- Excella E24R). Decorrido

este período, as bactérias transformadas foram plaqueadas. Para a confecção de cada placa,em condições estéreis, foram adicionados à um tubo de Falcon de 50mL estéril: 15ml de meio LB ágar (fundido) e 15μL de kanamicina (25mg/mL). O conteúdo do tubo (15mL) foi vertido em uma placa plástica estéril. A placa foi mantida aberta, próxima do bico de Bunsen e dentro do fluxo laminar, para a completa solidificação. Então, 200μL (1x106 colônias/mcg de DNA) do produto de transformação foi plaqueado, novamente a placa foi mantida próxima ao bico de Bunsen e dentro do fluxo laminar para secar. A placa foi incubada em estufa a 37ºC por 16h.

AYT7,-7,FG**/0X.6"*

No dia seguinte, em 7 tubos cônicos de 50mL estéreis foram adicionados: 5mL de meio LB e 5μL de kanamicina (25mg/mL) (USB), e o tubo foi homogeneizado. Da placa foram escolhidas

7 colônias, sendo que cada uma delas foi transferida com um palito de madeira estéril para que este ficasse impregnado de bactérias, e este palito foi mergulhado e agitado dentro do tubo contendo meio e antibiótico, para cada uma das 7 colônias foi realizado o mesmo procedimento. Os tubos foram colocados no shaker(NewBrunswick Scientific – modelo- Excella E24R) à 37ºC, sob agitação

de 300rpm por12-18h.

AYV2-"-FG**2."*0-21,02:*,01-2

No dia seguinte, foi realizada uma PCR de colônias para seleção das transformantes. Cada reação foi realizada em um tubo de 0,2mL DNase e RNase free (tubos para reação de PCR)

onde foram adicionados: 1μL de suspensão celular, 5μL de tampão de PCR 10x (sem MgCl2), 1,5μL

de MgCl2 50mM, 1μL de dNTP mix 10mM, 1μL de primer sense E2.S (Invitrogen – Life

Technologies) (10pM/μL) (5’ ggc cat ggg gga aac cca cgt cac cgg 3’), 1μL de primer anti-sense

6

As reações foram realizadas no termociclador GeneAmp 2400 (Perkin Elmer) sob as

seguintes condições que foram padronizadas: 94ºC por 4 minutos para desnaturação inicial, 35 ciclos de: 94ºC por 1 minuto para desnaturação, 55ºC por 1 minuto para anelamento e 72ºC por 1 minuto e 15 segundos para extensão, seguidos de um acréscimo de 10 minutos à 72ºC para completar a extensão final. Ao final da reação as amostras foram mantidas no termociclador à 4ºC e posteriormente foram armazenadas à -20ºC até o momento do uso.

Para a análise do fragmento amplificado, realizou-se uma eletroforese em gel de agarose 1% como descrito no item 3.4.3. Aos poços do gel foram aplicados 5μL do produto amplificado misturado a 2μL de uma solução corante. Em um outro poço foi aplicado um padrão de pares de bases (ladder) de 1Kb (Fermentas), para a posterior comparação do tamanho das bandas. A corrida

foi acompanhada pela migração do azul de bromofenol contido na solução corante da amostra, durante cerca de 40 minutos a uma tensão de 100volts (V).

Ao final do processo, o gel foi levado a um transluminador de luz UV (BioRad) e os produtos de amplificação foram observados como um fragmento único correspondente ao tamanho da sequência amplificada. Foram consideradas as amostras que apresentaram produtos de amplificação com aproximadamente 852pb.

AYP/0/87,-72.*"Q0/2J6-.*01I*-18CH.**/02-,1*-H

Das PCRs positivas para o inserto duas foram escolhidas, um inóculo de uma destas PCRs positivas (800μL) (proveniente do ítem 3.8.6) foi adicionado de 400μL de glicerol 50%, e guardado em freezer a -20ºC, e do outro inóculo foi realizada uma mini-prep, como descrito no ítem 3.7.5., foram feitas 3 reações para se aumentar o rendimento.

qualidade do produto da mini-prep. Assim, como descrito no item 3.4.3. ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 1%, sendo que foram aplicados ao gel uma mistura formada por 1μL de amostra e 1μL de azul de corante de amostra, e também em outro poço foram aplicados 4μL de um padrão de pares de bases de 1kb (Base-Pair Ladder- Amersham Pharmacia Biotech). A corrida foi

acompanhada pela migração do azul de bromofenol contido na solução corante da amostra, durante cerca de 15 minutos a uma tensão de 100 volts (V). Foram consideradas as amostras que apresentaram produtos de amplificação com aproximadamente 6695pb. A determinação da concentração de pET42a + inserto foi realizada no aparelho nanodrop.

AYY2-JK-0./-01**-18CH

O vetor pET42a foi seqüenciado para confirmação da seqüência e orientação correta do inserto, através do método de terminação da cadeia de seqüenciamento de DNA (SANGER et al., 1977), em seqüenciador automático “Megabace, utilizando o kit “DYEnamic TM ET dye terminator kit (MegaBACETM)” (GE), conforme orientação do fabricante. O produto gerado em cada reação foi submetido à separação e detecção usando o seqüenciador.

Foi utilizado como amostra o produto da mini-prep e os seguintes primers: S-tag (5’ cga

acg cca gca cat gga ca 3’) e T7 terminator (5’ ccg ctg agc aat aac tag ca 3’). As condições de

6&

AYZ."/@+--0W/U1/.

O produto da mini-prep, ou seja, o pET-42a com o inserto E2 foi clivado com as enzimas de restrição NcoI e XhoI, através do protocolo estabelecido pelo fabricante, para a verificação da

inserção da seqüência da proteína E2 no vetor pET-42a.

Em um microtubo de 1,5mL estéril, foram adicionados 750ng (40μL) de vetor com inserto (concentração: 50ng/μL), 4μL de tampão Tango 2x, 0,4μL de água Milli-Q estéril, 0,3μL da enzima NcoI (10U/μL) (Fermentas - Life Sciences) e 0,3μL da enzima XhoI (10U/μL) (Fermentas - Life Sciences), totalizando um volume final de 20μL. A reação foi homogeneizada e incubada em banho-maria a 37ºC por 3 horas. Após a incubação foi realizada uma eletroforese em gel de agarose 1% com poços maiores (aproximadamente 2cm), conforme protocolo descrito no item 3.4.3. Foram adicionados aos poços 20μL da amostra misturada com 10μL de corante da amostra. A corrida eletroforética ocorreu por aproximadamente 30 minutos a uma tensão de 100v.

O produto de clivagem enzimática foi observado como dois fragmentos, um correspondente ao tamanho da seqüência do vetor pET42a, ou seja, aproximadamente 6Kb (5843pb) e o outro ao tamanho da proteína E2 (852pb). Sendo o tamanho do produto estimado pelo padrão de 1Kb em um dos poços do gel.

AYEB7,-7,*-.I"6"2>.1-,/02.*7-1-01-28"/0'+-,*2-11

A preparação das células bacterianas competentes (cepa bacteriana E. coli, linhagem

descrito no item 3.7.2.

Para preparo da célula competente da linhagem Rosetta (DE3), o antibiótico cloranfenicol (100ug/mL) foi acrescentado ao meio nas etapas de crescimento. A suspensão bacteriana competente foi estocada a –80ºC com adição de 15% de glicerol até o momento do uso.

( #

A metodologia utilizada para a transformação bacteriana foi descrita por Sambrook et al., 1989.

Em condições assépticas, foram adicionados em um microtubo de 1,5mL estéril: 200μL de suspensão de células bacterianas (E. coli) competentes linhagem Rosetta, descongeladas em

banho de gelo, e 1μL do produto da mini-prep (pET-42a + inserto E2) (50μg/μL), o tubo foi homogeneizado suavemente e as bactérias foram submetidas ao choque térmico por 90 segundos a 42ºC e logo em seguida à 1 minuto no gelo. Foram adicionados 800μL de meio de cultura líquido sem antibiótico, e o tubo foi incubado a 37ºC por 45 minutos sob agitação (300rpm) no agitador.