UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
LÍVIA DE LOURDES DE SOUSA PINTO
ANÁLISE ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO DO EFEITO DO
CONDROITIM SULFATO EXTRAÍDO DE TILÁPIA (
Oreochromis
niloticus
) EM MODELO DE PERITONITE AGUDA
LÍVIA DE LOURDES DE SOUSA PINTO
ANÁLISE ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO DO EFEITO DO
CONDROITIM SULFATO EXTRAÍDO DE TILÁPIA (
Oreochromis
niloticus
) EM MODELO DE PERITONITE AGUDA
Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Luciana Guimarães Alves Filgueira.
Co-orientadora: Prof.ª Dr.ª Giulianna Paiva Viana de Andrade Souza.
LÍVIA DE LOURDES DE SOUSA PINTO
ANÁLISE ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO DO EFEITO DO CONDROITIM SULFATO EXTRAÍDO DE TILÁPIA (Oreochromis niloticus) EM MODELO DE PERITONITE
AGUDA
Dissertação apresentada ao Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Aprovado em: ____/____/2015.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________ Prof.ª Dr.ª Luciana Guimarães Alves Filgueira
Departamento de Bioquímica – UFRN Orientadora
______________________________________________ Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedroza
Departamento de Farmácia - UFRN 1º Examinador
______________________________________________ Prof.ª Dr.ª Celina Maria Pinto Guerra
Dedico esta obra
Aos meus pais, Vilmar e Rosimar, que deram-me apoio em todos os momentos que precisei.
AGRADECIMENTOS
A Deus, meu Senhor, dono da minha vida e autor da minha história. A Ele toda minha gratidão por cada desafio vencido. Jesus é bom!!!
Aos meus pais por todo amor, incentivo e suporte. Sei que posso contar com vocês em toda e qualquer circunstância, independente do dia ou hora.
A Vagner, meu marido. É tão bom ter você por perto. Sou muito grata por sua vida, todo o amor, cuidado, compreensão e por você querer sempre o melhor pra mim.
Aos meus irmãos, Lucas Henrique, Lino Augusto, Luís Eduardo, Lauro Samuel, Levi Rodrigo e também a minha cunhada Pollyana, por me animarem e estarem sempre
na torcida por mim. À Lino, em especial, por tanta paciência em me auxiliar com o editor de referências.
À igreja de Jesus, pelas orações, suporte e ânimo. Em especial, à tia Benalva e Luci e à família Moura por todo cuidado e serviço de vocês.
À Sabrina Diógenes, pela amizade como de uma irmã, que me ouviu tantas vezes e me animou a continuar a enfrentar os obstáculos.
À Ana Katarina, como uma mãe desde a graduação. Obrigada por cada ensino, cada carona e também pelos puxões de orelha. Obrigada por abrir mão do seu
tempo, horas, manhãs e até dias. Obrigada pela ‘mãozinha’ essencial nos
experimentos com animais. Enfim, me faltam palavras para te agradecer. Você me incentivou a ir além do que achei que poderia.
À professora Luciana Guimarães por aceitar ser minha orientadora.
À professora e co-orientadora, Giulianna Andrade, por me aceitar como orientanda, mesmo com toda minha inexperiência. Sou muito grata pela oportunidade que me
concedeu, sua orientação, paciência e palavras de incentivo.
À professora Fernanda Wanderley, pela oportunidade no laboratório e apoio durante a pesquisa.
À professora Suely Chavante, por me aceitar no laboratório. Agradeço ainda pelos
juntamente com os demais membros da banca de Qualificação, Jailma Almeida e Ivan Lopes.
À professora Janeusa Souto (Departamento de Microbiologia e Parasitologia da UFRN), por permitir o uso de equipamentos do laboratório002E
Aos professores do Departamento de Bioquímica, por ceder equipamentos sem os quais a pesquisa não poderia prosseguir e pela grande contribuição que deixaram
para minha vida acadêmica e profissional.
À amiga, Ingrid Caroline, pela cumplicidade, pelas discussões na busca por soluções, e por todo auxílio nos experimentos... dias de grande trabalho juntas!!!
Aos demais companheiros de laboratório. Adriana Brito, Rômulo Cavalcante e Laís Palhares, obrigada pelos questionamentos e problemas que me ajudaram a
solucionar. Jefferson Duarte e Diogo Jackson, o humor de vocês melhora o ambiente de trabalho. Airton Júnior, agradeço por auxiliar nos processos de obtenção de amostra. Marlyanne Carvalho, Jonathan Medeiros e Alyne Monteiro, agradeço por todo empenho e dedicação de vocês nos experimentos. Cada um de
vocês contribuiu de alguma maneira. Muito obrigada!
À Fernanda Azevedo, que me auxiliou em diferentes fases dos experimentos.
À minha turma de mestrado, por dividir as aflições, a leitura e discussão de artigos, ao longo de noites mal dormidas. Que todos tenham sucesso!
A todos os funcionários do Departamento, sempre prontos a ajudar.
Ao professor Dr. Marcelo Lima, pelo auxílio com os experimentos de Ressonância magnética nuclear.
Ao biotério da Universidade Potiguar, por nos ceder os animais necessários aos experimentos.
À Capes, pela bolsa concedida.
“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível”.
RESUMO
Condroitim sulfato (CS) é um glicosaminoglicano natural presente na matriz extracelular de tecidos conectivos, podendo ser extraído e purificado desses tecidos. O CS está envolvido em diversas funções biológicas, o que pode estar relacionado à variabilidade estrutural que possui, apesar da simplicidade da cadeia linear dessa molécula. Pesquisas na área biotecnológica e farmacológica com rejeitos provenientes da aquicultura vem sendo desenvolvidas no Brasil. Nas últimas décadas, a tilápia (Oreochromis niloticus), peixe nativo da África, tem sido uma das
espécies mais cultivadas em várias regiões do mundo, inclusive no Brasil. A tilapicultura é uma atividade economica cujo principal inconveniente é a grande quantidade de resíduos que são descartados pelos produtores. Entende-se que o material descartado pode ser aproveitado em pesquisas como fonte de moléculas com importante aplicação biotecnológica, o que também contribui na redução de impactos ambientais e favorece o desenvolvimento dessa atividade de maneira ecologicamente correta. Dessa forma, vísceras de tilápias nilótica foram submetidas à proteólise, em seguida os glicosaminoglicanos foram complexados com resina de troca iônica (Lewatit), fracionados com volumes crescentes de acetona e purificados através da cromatografia de troca iônica DEAE-Sephacel. Na sequência, a fração foi analisada através de eletroforese em gel de agarose e ressonância magnética nuclear (RMN). O perfil eletroforético do composto, a análise dos espectros 1H de
RMN e a correlação do HSQC permitem afirmar que o composto corresponde a uma molécula de condroitim sulfato. O ensaio de MTT foi utilizado para avaliação da viabilidade celular na presença do CS isolado de tilápia e mostrou que o composto não é citotóxico a células normais provenientes do fibroblasto de embrião de camundongos (3T3). Então, o composto foi testado quanto a capacidade de reduzir o influxo de leucócitos em modelo de peritonite aguda (in vivo) induzida por
tioglicolato de sódio. Nesse contexto, foi realizada a contagem total e diferencial de leucócitos do sangue e líquido peritoneal coletadas, respectivamente, da veia cava e do lavado peritoneal de cada animal submetido ao experimento. O condroitim sulfato, pela primeira vez isolado de tilápia (CST), foi capaz de reduzir a migração de
leucócitos à cavidade peritoneal de camundongos inflamados em até 80,4% na dose de 10µg/kg. Os resultados mostram ainda que houve redução significativa (p<0,001)
da população de polimorfonucleares do lavado peritoneal nas três doses testadas (0,1µg/kg; 1µg/kg e 10µg/kg) quando comparado ao controle positivo (apenas tioglicolato). Portanto, uma vez que a estrutura e o mecanismo de ação do CST
tenham sido totalmente elucidados, esse composto pode apresentar potencial para uso terapêutico em doenças inflamatórias.
ABSTRACT
Chondroitin sulfate (CS) is a naturally glycosaminoglycan found in the extracellular matrix of connective tissues and it may be extracted and purified those tissues. CS is involved in various biological functions, which may be related to the having structural variability, despite the simplicity of the linear chain structure from this molecule. Researches in biotechnology and pharmaceutical field with wastes from aquaculture has been developed in Brazil. In recent decades, tilapia (Oreochromis niloticus),
native fish from Africa, has been one of the most cultivated species in various regions of the world, including Brazil. The tilapia farming is a cost-effective activity, however, it generates large amount of wastes that are discarded by producers. It is understood that waste from tilapia can be used in research as a source of molecules with important biotechnological applications, which also helps in reducing environmental impacts and promote the development of an ecofriendly activity. Thus, nile tilapia viscera were subjected to proteolysis, then the glycosaminoglycans were complexed with ion exchange resin (Lewatit), it was fractionated with increasing volumes of acetone and purified by ion exchange chromatography DEAE-Sephacel. Further, the fraction was analyzed by agarose gel electrophoresis and nuclear magnetic resonance (NMR). The electrophoretic profile of the compound together the analysis of 1H NMR spectra and the HSQC correlation allow to affirm that the compound
corresponds to a molecule like chondroitin sulfate. MTT assay was used to assess cell viability in the presence of CS tilapia isolated and showed that the compound is not cytotoxic to normal cells such as cells from the mouse embryo fibroblast (3T3). Then, this compound was tested for the ability to reduce the influx of leukocytes in model of acute peritonitis (in vivo) induced by sodium thioglycolate. In this context, it
was done total and differential leukocytes counting in the blood and peritoneal fluid collected respectively from vena cava and the peritoneal cavity of the animals subjected to the experiment. The chondroitin sulfate for the first time isolated from tilapia (CST) was able to reduce the migration of leukocytes to the peritoneal cavity of
inflamed mice until 80.4 per cent at a dose 10µg/kg. The results also show that there was a significant reduction (p<0.001) of the population of polymorphonuclear
leukocytes from peritoneal cavity in the three tested doses (0.1µg/kg; 1µg/kg and 10µg/kg) when it was compared to the positive control (just thioglycolate). Therefore, since the CST structure and mechanism of action has been completely elucidated,
this compound may have potential for therapeutic use in inflammatory diseases.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Principais tipos de condroitim sulfato conhecidos...21
FIGURA 2. Etapas da migração de leucócitos ao local da inflamação...24
FIGURA 3. Foto e classificação biológica da espécie Oreochromis niloticus (tilápia
nilótica) ...29
FIGURA 4. Esquema de extração de glicosaminoglicanos...34
FIGURA 5. Esquema do fracionamento dos GAGs presentes na F3.0M com volumes crescentes de acetona...35
FIGURA 6. Perfil eletroforético de GAGs obtidos de Oreochromis niloticus...40
FIGURA 7. Perfil eletroforético de GAGs obtidos após fracionamento com acetona41
FIGURA 8. Purificação do composto presente na fração F 0.8v utilizando DEAE-Sephacel...42
FIGURA 9. Espectro de Ressonância Magnética Nuclear 1H de condroitim sulfato
isolado da Oreochromis niloticus...43
FIGURA 10. Espectros de Ressonância Magnética Nuclear 1H/13C de condroitim
sulfato isolado da Oreochromis niloticus...44
FIGURA 11. Efeito do condroitim sulfato isolado de tilápia na viabilidade de fibroblastos de camundongos (3T3) ...45
FIGURA 13. Diferenciação celular em números absolutos de leucócitos polimorfonucleares e mononucleares do líquido peritoneal de camundongos seis horas após indução da inflamação peritoneal...48
FIGURA 14. Contagem total de leucócitos do sangue de camundongos seis horas após indução da inflamação peritoneal...49
LISTA DE QUADROS
LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS
C1 Carbono 1
C2 Carbono 2
C3 Carbono 3
C4 Carbono 4
C5 Carbono 5
C6 Carbono 6
CS Condroitim sulfato
CST Condroitim sulfato de Tilápia C4s Condroitim-4- sulfato
C6s Condroitim-6-sulfato
CS-A Dissacarídeo A de condroitim sulfato
CS-B Dissacarídeo B de condroitim sulfato
CS-C Dissacarídeo C de condroitim sulfato
CS-D Dissacarídeo D de condroitim sulfato
CS-E Dissacarídeo E de condroitim sulfato
CETAVLON Brometo de cetiltrimetilamônio
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais
CN Controle negativo
CP Controle positivo
DC Diclofenaco
DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbeccos
DS Dermatam sulfato
D-GlcA Ácido D-glucurônico
D-GalNAc N-acetilgalactosamina
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA Ensaio de ligação imunoenzimática
F 0.5M Fração 0,5 molar
F 1.0M Fração 1,0 molar
F 3.0M Fração 3,0 molar
F 0.5v Fração 0,5 volume de acetona
F 0.6v Fração 0,6 volume de acetona
F 0.7v Fração 0,7 volume de acetona
F 0.8v Fração 0,8 volume de acetona
F 1.0v Fração 1,0 volume de acetona
GAGs Glicosaminoglicanos
H1 Hidrogênio 1
H2 Hidrogênio 2
H3 Hidrogênio 3
H5 Hidrogênio 5
H6 Hidrogênio 6
HA Ácido hialurônico
HS Heparan sulfato
Hep Heparina
IL-1β Interleucina-1β
LPS Lipopolissacarídeos
MTT Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium
MEC Matriz extracelular
MN Mononuclear
NaCl Cloreto de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
NF-kB Fator nuclear kappa B
OA Osteoartrite
PDA Diaminopropano acetato
PMN Polimorfonuclear
QS Queratam sulfato
RMN Ressonância Magnética Nuclear
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 17
1.1 GLICOSAMINOGLICANOS ... 17
1.2 CONDROITIM SULFATO... 19
1.3 CONDROITIM SULFATO E INFLAMAÇÃO ... 21
1.4 GLICOSAMINOGLICANOS DE ESPÉCIES AQUÁTICAS ... 25
2 OBJETIVOS ... 28
2.1. OBJETIVO GERAL ... 28
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 28
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 29
3.1. MATERIAIS BIOLÓGICOS ... 29
3.1.1 Tilápia do Nilo ... 29
3.1.2 Animais ... 29
3.2 GLICOSAMINOGLICANOS PADRÕES ... 30
3.3 REAGENTES ... 30
3.4 EQUIPAMENTOS ... 31
3.5 MÉTODOS ... 33
3.5.1 Extração e purificação dos glicosaminoglicanos ... 33
3.5.2 Eletroforeses em gel de agarose ... 35
3.5.3 Ressonância Magnética Nuclear ... 36
3.5.4 Viabilidade celular ... 36
3.5.5 Avaliação do efeito de condroitim sulfato na inflamação ... 37
3.5.6 Obtenção, contagem total e diferencial das células do líquido peritoneal ... 38
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 39
4 RESULTADOS ... 40
4.1 PERFIL ELETROFORÉTICO DOS GAGs DAS VÍSCERAS DA TILÁPIA ... 40
4.2 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR ... 42
4.3 EFEITO DO CST NA VIABILIDADE CELULAR ... 44
4.4 AVALIAÇÃO DO PAPEL DE CST EM MODELO DE INFLAMAÇÃO AGUDA .. 45
5 DISCUSSÃO ... 52
6 CONCLUSÕES ... 61
1 INTRODUÇÃO
1.1 GLICOSAMINOGLICANOS
Avanços na área biotecnológica têm instigado o estudo de novas biomoléculas extraídas de fontes naturais e que apresentem aplicação biológica e farmacológica. Muitos organismos apresentam moléculas com características e propriedades que instigam o interesse pela pesquisa visando o desenvolvimento de produtos que tenham aplicação biomédica (SILVA et al., 2012). Polissacarídeos, por exemplo, são polímeros de monossacarídeos de grande disponibilidade em uma diversidade de organismos vivos. Podem ser modificados química e bioquimicamente, são altamente estáveis, não tóxicos, hidrofílicos, formam géis e são biodegradáveis (SINHA & KUMRIA, 2001).
Os glicosaminoglicanos (GAGs) são polissacarídeos sulfatados constituídos por unidades dissacarídicas repetidas de uma hexosamina e um açúcar não nitrogenado, unidos através de ligação glicosídica. Um dos monossacarídeos da unidade dissacarídica dos GAGs é sempre um amino-açúcar (α-D-glucosamina ou β -D-galactosamina), o outro é um ácido urônico (ácido-D-glucurônico ou ácido-L-idurônico) ou uma galactose (DIETRICH, 1983; KJELLEN & LINDAHL, 1991; LAMARI & KARAMANOS, 2006; AFRATIS, 2012; ANOWER-E-KHUDA & KIMATA, 2015).
Quadro 1 - Unidades dissacarídicas constituintes dos principais glicosaminoglicanos sulfatados. Fonte: Adaptado de Papy-Garcia et al., 2011.
ácido hialurônico, todos os GAGs são encontrados nos tecidos na forma de proteoglicanos, onde as cadeias de polissacarídeos estão covalentemente ligadas à um core proteico (PRYDZ & DALEN, 2000; CAMPO et al. 2005; SAMPAIO et al. 2006; AFRATIS et al. 2012).
O fato dos glicosaminoglicanos diferirem entre si em vários aspectos como quanto à composição monossacarídica, ao tipo de ligação glicosídica inter- e intra- dissacarídica, à região de ligação às proteínas, ao tamanho molecular das cadeias e às proporções das unidades dissacarídicas, bem como quanto ao padrão e o grau de sulfatação, amplia seus papéis biológicos, podendo apresentar função anticoagulante, antitrombótica, antiviral, anti-inflamatória, antitumoral, entre outras (DIETRICH, 1983; NADER & DIETRICH, 1989; VIOLA et al., 2012; XIONG, LI & HOU, 2012). O estudo da estrutura e função dos glicosaminoglicanos influencia significativamente a compreensão de uma variedade de processos biológicos.
1.2 CONDROITIM SULFATO
-D-galactose-β-Dxilose (BEATY & MELLO, 1987 ; VOLPI & MACCARI, 2006; CAMPO et al, 2009; VOLPI, 2009; SOUICH et al., 2009; CAÑAS et al., 2010; EGEA et al., 2010; BAUEROVA et al., 2011).
A cadeia de CS pode exibir mais de 100 unidades dissacarídicas, as quais podem ser não sulfatadas (CS-O) ou sulfatados em posições variadas (FLANGEA et al., 2009 ; VOLPI, 2009). De acordo com as características estruturais dos dissacarídeos constituintes da molécula de CS, como o padrão de sulfatação, são conhecidos diferentes tipos de CS (Figura 1) (BAUEROVA et al. 2011, VOLPI, 2011). O padrão de sulfatação é uma importante modificação pós-traducional que regula a interação dessas moléculas com cadeias de proteínas. (PROPERZI, ASHER & FAWCETT, 2003; VOLPI & MACCARI, 2006; FLANGEA et al., 2009).
Figura 1 – Principais tipos de condroitim sulfato conhecidos. Fonte: Adaptada de Volpi, 2009.
A variabilidade estrutural característica da molécula de condroitim sulfato pode justificar sua diversidade funcional (SUGAHARA, 2003; VOLPI, 2006).
1.3 CONDROITIM SULFATO E INFLAMAÇÃO
domínios sacarídeos específicos dentro das cadeias (SUGAHARA et al. 2003; VOLPI, 2011).
O condroitim sulfato já tem sido usado no tratamento de osteoartrite (OA) como um fármaco capaz de reverter, retardar ou estabilizar essa patologia (VOLPI, 2006; CAÑAS et al., 2010). A inflamação é um componente crucial do início e evolução da OA. A degradação da cartilagem que acontece com o desenvolvimento da doença, está relacionada ao aumento de mediadores inflamatórios (PECCHI et al, 2012).
A inflamação é uma consequência vital às lesões dos tecidos associada a várias causas, como trauma, invasão de partículas estranhas, infecção de microrganismos, neoplasia maligna, e reações auto-imunes. Ou seja, trata-se de um tipo de resposta biológica essencial aos organismos à medida que os protege de maiores danos, pois sinaliza a necessidade de eliminar fatores nocivos e promover a reparação tecidual e cicatrização de injúrias, além de estabelecer memória imunológica, o que favorece resposta mais rápida e específica contra os mesmos estímulos em outro dado momento (VOLPI, 2011). Nesse contexto, entende-se que a inflamação não é algo inerentemente prejudicial, contudo, a desregulação de mecanismos biológicos e moleculares que o envolvem pode estar relacionada a uma série de doenças, como por exemplo, sepse, doenças infecciosas, trauma, asma, alergia, doenças autoimunes, rejeição de transplantes, câncer, doenças neurodegenerativas, obesidade e aterosclerose (VODOVOTZ, et al., 2008).
Figura 2 – Etapas da migração de leucócitos ao local da inflamação (Mesquita Jr. et al, 2008).
Uma vez que os leucócitos migraram para o tecido-alvo, podem executar várias atividades do sistema imunológico, tais como a eliminação do patógeno e reparo tecidual. Surpreendentemente, este processo de extravasão ocorre com pouca ou nenhuma evidência de danos ao endotélio (PARISH, 2006).
moléculas naturais, como o condroitim sulfato. O potencial do CS em modular a resposta inflamatória no sistema nervoso central, foi investigado por Cañas et al. (2010). Este estudo mostra que o CS é capaz de reduzir a inflamação induzida por lipopolissacarídeos (LPS) em astrócitos por um mecanismo envolvendo a inibição do fator nuclear kappa B (NF-kB) e a redução da indução de TNF-α. Estudos de
Bauerova et al. (2011) também confirmam o potencial anti-inflamatório do CS in vivo,
afirmando que a droga é capaz de reduzir o grau de severidade da artrite em ratos pré-tratados com condroitim sulfato, e, associa essa função à diminuição de citocinas pró-inflamatórias e regulação da atividade do NF-kB.
O crescente interesse na aplicabilidade dos polissacarídeos é uma das principais razões para o estudo de diferentes espécies e otimização das condições de extração de vários GAGs na última década (XIONG, LI & HOU, 2012). Recentemente, o condroitim sulfato (CS) foi isolado e estudado de diferentes fontes (ARIMA et al. 2013), como da traquéia de porco e boi, cartilagem de tubarão (MUCCI, SCHENETTIA & VOLPI, 2000), cartilagem do esturjão (MACCARI, FERRARINI & VOLPI, 2010); cartilagem de frango (NAKANO, BETTI & PIETRASIK, 2010); do sub-produto de desossa mecânica de frango (NAKANO et al., 2012) e a partir de cartilagem de diferentes espécies de peixes (KRYLOV et al. 2011; ARIMA et al. 2013).
1.4 GLICOSAMINOGLICANOS DE ESPÉCIES AQUÁTICAS
variedade de estímulos (VOLPI, 2011). Compostos tipo heparina com potencial anticoagulante e baixo risco hemorrágico obtidos de caranguejo e de rejeitos da carcinicultura foram descritos recentemente (BRITO et al, 2008; ANDRADE et al., 2013).
A aquicultura se tornou o setor de maior crescimento no mundo da indústria de produção alimentícia (HAMLI, 2013). Por décadas, sua taxa de crescimento foi de 8,9% ao ano, o que correspondeu a um percentual muito maior do que o de outros setores de produção de alimentos de origem animal (FAO, 2006; AMIRKOLAIE, 2011). A produção mundial de pescado atingiu aproximadamente 168 milhões de toneladas em 2010. Entre os países da América do Sul, o Brasil ocupou o terceiro lugar.
No Brasil, a maior parcela da produção aquícola vem sendo oriunda da aquicultura continental, na qual se destaca a piscicultura continental, que representou 86,6% da produção total nacional no ano de 2011. Nesse mesmo ano, a região Nordeste do Brasil apresentou 24,7% do total da produção aquícola continental, com 134.292,6 toneladas (MINISTÉRIO DA PESCA, 2011).
A tilapicultura tem sido considerada uma das cadeias produtivas mais importantes da piscicultura, apresentando taxa de expansão crescente desde 1990 (EL- SAYDE, 2006; FAO, 2012). A tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) é um peixe
2 OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Isolar e caracterizar a estrutura de um condroitim sulfato obtido a partir das vísceras da tilápia (Oreochromis niloticus) e avaliar o efeito do composto na inflamação.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Extrair e purificar condroitim sulfato das vísceras da tilápia.
Analisar o composto obtido da tilápia através de eletroforese em gel de agarose.
Caracterizar a estrutura do condroitim através de ressonância magnética nuclear.
Avaliar o efeito do condroitim sulfato obtido sob a viabilidade de células de linhagem normal (3T3).
Analisar o papel do condroitim sulfato no processo de migração leucocitária à cavidade peritoneal dos animais em modelo de peritonite aguda.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. MATERIAIS BIOLÓGICOS
3.1.1 Tilápia do Nilo
Vísceras provenientes da espécie Oreochromis niloticus (Figura 3),
adquiridas do cultivo de viveiros da Região do Mato Grande, estado do Rio Grande do Norte/Brasil, foram utilizadas como matéria bruta no processo de obtenção de GAGs. Após a coleta, as vísceras foram acondicionadas em recipiente refrigerado, mantido a -20 ºC até o processamento.
3.1.2 Animais
Para avaliação da migração leucocitária, foram utilizados camundongos da linhagem Swiss, machos e fêmeas com 6 - 8 semanas de idade e peso médio de 20-35g. Os animais, cedidos pelo Biotério da Universidade Potiguar, foram mantidos com livre acesso à água e alimentos em condições controladas de iluminação (ciclo de 12 horas claro/escuro). A pesquisa realizada com esses animais foi previamente aprovada pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade
Figura 3.Foto e classificação biológica da espécie Oreochromis niloticus (tilápia nilótica).
Disponível em < http://www.forestryimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5431136> Acesso em: 24 de março de 2015.
Reino: Animalia
Filo: Chordata
Classe: Actinopterygii
Ordem: Perciformes
Família: Cichlidae
Gênero: Oreochromis
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) onde os experimentos foram realizados (Protocolo Nº 044/2010).
3.2 GLICOSAMINOGLICANOS PADRÕES
Heparina sódica de mucosa suína foi obtida do Laboratório Derivati Organici (Trino Vercellese, Itália). Condroitim sulfato, extraído de cartilagem de baleia e dermatam sulfato extraído de mucosa intestinal bovina, foram obtidos da Seikagaku Kogyo Co. (Tóquio, Japão).
3.3 REAGENTES
1,3-diaminopropano acetato (PDA), brometo de cetiltrimetilamônio (CETAVLON), e tolueno fornecida pela Aldrich Chemical Co. Inc. (Milwaukee,WI, EUA);
Acetona, metanol e benzina fornecida pela Cromato Produtos Químicos Ltda. (Diadema – SP);
Agarose (standard-Low-Mr) adquirida fornecida pela BioRad Laboratories (Richmond, CA, EUA);
Azul de toluidina e vermelho de cresol, fornecida pela Sigma Chemical Company (St.Louis, MO, EUA);
Cloreto de Sódio, fornecida pela Vetec Química Fina Ltda (Rio de Janeiro, RJ, Brasil);
Corante Panóptico (LB, Laborclin®);
Diclofenaco de sódio (Voltaren®, Novartis);
Enzima Superase fornecida pela Prozyn Indústria e Comércio Ltda.;
MTT – Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium (Sigma Aldrich, USA);
Resina de troca-iônica LEWATIT da Bayer S/A (São Paulo);
Solução salina 0,9% (estéril).
3.4 EQUIPAMENTOS
Além dos equipamentos usuais de laboratório, utilizou-se:
Balança eletrônica – Tecnal (mod. B-tec 2200);
Bancada de Fluxo Laminar (PACHANE Pa300);
Banho Maria (Tecnal);
Câmara de Neubauer (Loptik Labor);
Câmara para eletroforese horizontal em gel de agarose, modelo desenvolvido por Jaques e col. (1968), (Técnica Permatron Ltda., São Paulo, SP, Brasil);
Centrífuga Eppendorf 5804 R;
Centrífuga refrigerada, modelo CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltda (Tóquio, Japão);
Contador de células sanguíneas CCS-01 Kacil;
CytoSpin;
Espectrofotômetro;
Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear BRUKER DRX 600 (600MHz);
Fontes de corrente contínua regulável, desenvolvidas pelo Dr. H. Rzeppa, Técnica Permatron Ltda. (São Paulo, SP, Brasil);
Leitor de microplacas de ELISA;
Microscópio da contagem Olympus CX 25;
3.5 MÉTODOS
3.5.1 Extração e purificação dos glicosaminoglicanos
Víscersas de tilápias adultas foram homogeneizados em solução de cloreto de sódio 0,5 M de NaCl, na proporção de 10 ml de solução para cada 1g de peso seco do material, e, submetidas à proteólise pela adição da enzima superase (Prozyn Indústria e Comércio Ltda) na proporção de 20mg da enzima para 1g de massa seca. O pH foi ajustado periodicamente para 8,0 com auxílio de hidróxido de sódio (NaOH). A mistura permaneceu sob uma fina película de tolueno, a fim de evitar crescimento bacteriano. Após aproximadamente 40 horas sob temperatura de 60 °C, a mistura proteolisada foi filtrada. Ao filtrado foi adicionada resina de troca iônica Lewatit (Bayer, SP, Brasil) em agitação por 24 horas para complexação dos polissacarídeos. A resina foi então recolhida por filtração. Em seguida, os compostos complexados à resina foram eluídos com concentrações crescentes de NaCl, obtendo-se a fração 3M de NaCl, que foi submetida à precipitação com 2 volumes de metanol. Após 18 h o material foi centrifugado (5000 x g, 30 min./ 4 ºC) e o precipitado resultante foi seco a vácuo, solubilizado em água, dialisado e liofilizado (Figura 4).
Figura 5 – Esquema do fracionamento dos GAGs presentes na F3.0M com volumes crescentes de acetona.
3.5.2 Eletroforeses em gel de agarose
azul de toluidina (0,1% de ácido acético e 50% de etanol) e ainda descorados com a mesma solução sem o corante (DIETRICH, McDUFFIE & SAMPAIO, 1977).
3.5.3 Ressonância Magnética Nuclear
Os sinais do espectro 1H de ressonância magnética nuclear (RMN) e a
correlação heteronuclear 1H/13C (HSQC) foram obtidos usando Espectrômetro
Bruker DRX 600 (600MHz). Os polímeros foram dissolvidos em 0,5 mL de água deuterada a 99.9% e todos os espectros foram obtidos a 60 °C com supressão da água por pressaturação. Os experimentos com RMN foram realizados na Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP/São Paulo).
3.5.4 Viabilidade celular
O possível efeito citotóxico do composto foi analisado pelo método do MTT, previamente descrito por Mosmann (1983). Esse é um ensaio colorimétrico in vitro
que se baseia na medida da atividade de enzimas desidrogenases mitocondriais, que estão ativas apenas em células viáveis. Portanto, esse método permite analisar a viabilidade das células através da redução de sais de tetrazólio pela atividade da mitocôndria das células (MOSMANN, 1983, ARAÚJO et al., 2008).
Os testes foram realizados com células fibroblásticas de camundongos (3T3), utilizando-se meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. As células foram cultivadas em placa estéril de 96 poços (aproximadamente 5 x 104 células por
incubadas na estufa de C02 (5%) à 37ºC pelos períodos de 24 e 72 horas. Após
esse período, o meio foi desprezado e acrescentou-se 100μL de meio contendo MTT
(concentração final de 5mg/ml) em cada poço. As placas foram novamente incubadas a 37°C por 4 horas. O sobrenadante foi removido e 100μL de etanol foram adicionados em cada poço para solubilização dos cristais de formazan. A análise espectrofotométrica foi realizada em um leitor de microplacas de ELISA (absorbância de 570nm).
Poços contendo apenas meio DMEM foram utilizados como controle de viabilidade (100% de células viáveis) e esse percentual foi considerado como base para o cálculo de viabilidade das células incubadas com CST a partir da média da
triplicata das respectivas absorbâncias. Foi aplicado o princípio matemático da Regra de Três para obter o percentual das células viáveis de todos os testes.
3.5.5 Avaliação do efeito de condroitim sulfato na inflamação
O potencial anti-inflamatório do condroitim sulfato foi avaliado através de indução de peritonite aguda usando tioglicolato de sódio 3%, baseando-se na metodologia descrita por Xie e colaboradores (2000).
Os ensaios com GAGs de interesse foram desenvolvidos de modo semelhante, considerando que os animais foram pré-tratados com o glicosaminoglicano padrão condroitim-4-sulfato (Sigma) ou com condroitim sulfato obtido de tilápia, ambos diluídos em 200µl de solução salina estéril, nas doses de 0,1µg/Kg; 1µg/Kg e 10µg/Kg. O Diclofenaco de sódio (Voltaren ®), anti-inflamatório amplamente utilizado na prática clínica, foi preparado em condições estéries como as demais amostras e aplicado como pré-tratamento dos camundongos utilizando-se a dose normalmente aplicada em humanos (1,07mg/kg). Posteriormente, foi induzido o processo de inflamação em todos os animais por período de 06 (seis) horas, exceto no grupo controle negativo. O efeito do composto foi avaliado baseando-se na contagem total e diferencial das populações de células que foram estimuladas a migrar para o peritônio.
3.5.6 Obtenção, contagem total e diferencial das células do líquido peritoneal
Após o período de seis horas (enquanto houve indução da inflamação peritoneal), foi administrada em cada animal dose letal (1ml) de tiopental sódico (Thiopentax®) preparado na concentração de 20mg/ml. Os animais foram manipulados ainda vivos, mas, sob efeito do anestésico. Inicialmente, foi coletado aproximadamente 1ml de sangue proveniente da veia porta dos animais em experimentação. A amostra foi utilizada para preparação imediata de esfregaço sanguíneo em duplicata para posterior contagem diferencial de leucócitos. O volume restante de sangue foi acondicionado em eppendorfs contendo citrato (proporção 9:1) e realizada a contagem total de leucócitos em microscopia eletrônica, usando câmera de Neubauer.
de cada animal. O líquido peritoneal foi acondicionado em tubos com EDTA (BD Vacutainer®). Então, foi transferido para tubos do tipo Falcon e centrifugados a 405 x g, por tempo de 3 minutos sob refrigeração (4°C). O sobrenadante foi descartado e o “pellet” de células ressuspenso com 500µl de solução salina. A partir dessa suspensão de células, 20µl de cada amostra foi diluída em 380µl (diluição 1:20) de solução de Turk (ácido acético a 3 %), e, realizada contagem total de leucócitos em microscopia de luz, pela câmera de Neubauer, em objetiva de 40x (aumento total de 400x).
Da mesma suspensão de células foram retiradas alíquotas para preparação das lâminas pelas quais se fez a contagem diferencial das populações de leucócitos do líquido peritoneal. O esfregaço foi preparado em duplicata, utilizando uma centrífuga específica (CytoSpin). As lâminas foram coradas com Panóptico (LB, Laborclin®). A contagem das diferentes populações de células foi realizada em microscopia de luz e objetiva de 100x, com auxílio de contador manual de células sanguíneas. Dessa forma, foi avaliado o número de polimorfonucleares (PMN) e mononucleares (MN) provenientes do lavado peritoneal dos animais estudados.
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados do teste d foram com expressos
Os resultados do ensaio de peritonite e viabilidade celular foram expressos como média ± DP e analisados utilizando-se a análise de variância (ANOVA). A diferença entre grupos foi realizada pelos pós-testes Bonferroni e Tukey-Kramer, respectivamente. O nível de significância atribuído nos testes foi de 0,1%. Os dados foram analisados utilizando-se os softwares GraphPad Prism 5 e GraphPad Instat
4 RESULTADOS
4.1 PERFIL ELETROFORÉTICO DOS GAGs DAS VÍSCERAS DA TILÁPIA
Os glicosaminoglicanos das vísceras de tilápia obtidos após proteólise, complexação com resina Lewatit e descomplexação por eluição com NaCl 3M (F3.0M) foram analisados através de eletroforese em gel de agarose em tampão PDA. A fração F3.0M apresentou GAGs com migração eletroforética semelhante aos três glicosaminoglicanos utilizados como padrão (P), condroitim sulfato (CS), dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato/heparina (HS) (Figura 6).
Figura 6 – Perfil eletroforético de GAGs obtidos de Oreochromis niloticus. Eletroforese em
sistema de tampão PDA de compostos eluídos com 3,0M de NaCl após etapa de complexação com resina de troca iônica Lewatit. Or – Origem. P – Padrão de Glicosaminoglicanos (HS - Heparam sulfato; DS - Dermatam sulfato e CS - Condroitim sulfato). HEP – Heparina.
semelhante ao heparam, dermatam e condroitim. A F 0.6v apresenta duas bandas metacromáticas de migração eletroforética semelhante a heparam e dermatam sulfato. Na F 0.7v, identifica-se a presença de um composto que se assemelha principalmente ao dermatan-sulfato. Enquanto as demais frações (F 0.8v e F 1.0v) revelam predominância de compostos com migração eletroforética característica de condroitim sulfato (Figura 7).
Figura 7 - Perfil eletroforético de GAGs obtidos após fracionamento com acetona. Eletroforese em sistema de tampão PDA. Or – Origem. P – Padrão de Glicosaminoglicanos (HS - Heparam sulfato; DS - Dermatam sulfato e CS - Condroitim sulfato). HEP – Heparina. Frações (F 0.5v – 1.0v).
para estudos posteriores. Esse composto isolado de vísceras de tilápia, presente na F 0.8v e subsequente fração de eluição F 0.8M, apresentou perfil eletroforético similar ao do condroitim sulfato, e por isso foi denominado CST.
A. B.
Figura 8 - Purificação do composto presente na fração F 0.8v utilizando DEAE-Sephacel. A. A linha central mostra o gradiente de NaCl utilizado. As frações foram monitorizadas à 525 nm, utilizando ácido urônico como padrão. B. Eletroforese em sistema de tampão PDA. Or – Origem. P – Padrão de Glicosaminoglicanos (HS - Heparam sulfato; DS - Dermatam sulfato e CS - Condroitim sulfato). HEP – Heparina. Or – Origem. CS - condroitin-4-sulfato utilizado como padrão. F 0.5M; F 0.8M e 1.0M - frações do gradiente de NaCl utilizadas para eluição.
4.2 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR
Com o intuito de obter dados estruturais mais específicos do condroitim sulfato proveniente de tilápia, o composto foi submetido à análises utilizando RMN. Dados 1H de RMN do CST (Figura 9) mostram um sinal proeminente em 2,02 ppm,
que representa o grupo acetil do composto. Todos os outros sinais de prótons de CST são encontrados em regiões de espectros entre 3,00 e 5,00 ppm (Figura 9). Os
Outro sinal de 1H proeminente é mostrado em 4,73 ppm, evidenciando a presença
de β-GalNAc4s. Os sinais correspondentes aos H3 e H5/H6 característicos dessa galactosamina também são mostrados em 4,00 ppm e 3,79 ppm, respectivamente. Sinais de H2 (4,01ppm) e H6 (4,21 ppm) característicos da GalNAc6S também foram evidenciados na estrutura desse condroitim sulfato (Figura 9).
Figura 9 - Espectro de Ressonância Magnética Nuclear 1H de condroitim sulfato isolado da
Oreochromis niloticus.
Obteve-se também o espectro HSQC de RMN (Figura 10), que mostra a correlação direta entre os sinais de prótons e carbono (1H/13C). O grupamento acetil
da molécula está identificado em 2,02/25,54 ppm. Todos os demais sinais são encontrados na região de 50 - 110 ppm. RMN do CST revelou sinais em 4,00/78,90
4,20/70,58 ppm foram atribuídos à H6/C6 da GalNAc4s e GalNAc6s, respectivamente. O H2/C2 da GalNAc6s foi identificado em 4,01/54,65 ppm. Finalmente, foram identificados também espectros correspondentes a H1/C1 (4,49/106,98 ppm); H2/C2 (3,38/75,28 ppm) e H3/C3 (3,60/76,88 ppm) do ácido glucurônico.
Figura 10. Espectros de Ressonância Magnética Nuclear 1
H/13C de condroitim sulfato isolado
da Oreochromis niloticus. Correlação entre sinais de prótons (H) e carbonos (C).
4.3 EFEITO DO CST NA VIABILIDADE CELULAR
O ensaio de redução do MTT foi aplicado para avaliação da viabilidade de células fibroblásticas (3T3) expostas à presença do condroitim sulfato isolado de tilápia. Ao observar a Figura 11, pode-se compreender que a amostra testada não
13
C
(p
interferiu na viabilidade das células nas diferentes concentrações aplicadas em ambos os tempos (24h e 48h) já que após os períodos de incubação com o composto, houve aumento no percentual de viabilidade celular baseado nas médias das absorbâncias detectadas. Portanto, CST não demonstrou ser citotóxico e pode
ser utilizado em estudos in vivo (Figura 11).
Figura 11 – Efeito do condroitim sulfato isolado de tilápia na viabilidade de fibroblastos de camundongos (3T3). *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 vs controle (DMEM). Os valores foram expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
4.4 AVALIAÇÃO DO PAPEL DE CST EM MODELO DE INFLAMAÇÃO AGUDA
O composto em estudo foi avaliado quanto a capacidade de reduzir o influxo de leucócitos em modelo de peritonite aguda induzida por tioglicolato.
A média do número total de leucócitos provenientes da análise do lavado peritoneal dos animais submetidos ao experimento (Figura 12) denota aumento
*
***
*
***
*
**
**
***
Controle 0,1 1 10 100 1000
expressivo (p<0,001) do influxo celular no controle positivo (CP) quando comparado
com o grupo considerado controle negativo (CN). A administração do fármaco diclofenaco de sódio (DC), já conhecido e utilizado na clínica médica (BARBOSA, et al. 2010), foi capaz de reduzir a migração de leucócitos em aproximadamente 92,7%, portanto, não apresentou diferença estatística do controle negativo (Figura 12). Em camundongos nos quais foi administrado o CS isolado de tilápia previamente à injeção de tioglicolato, houve redução significativa (p<0,001) das
proporções de leucócitos do lavado peritoneal nas três doses testadas comparadas ao CP. A administração de 10µg/kg do CST reduziu a migração de leucócitos em
80,4%, enquanto as concentrações 1µg/kg e 0,1µg/kg do CST reduziram,
respectivamente, 73,1% e 75,7% do influxo celular (Figura 12). No entanto, o número absoluto (mm3) de células que migraram com o uso de cada uma das três
doses do CST testadas, foi estatisticamente igual quando comparadas entre si
(Dados não mostrados). O percentual de inibição dos leucócitos por C4S foi capaz de inibir 87,4% (10µg/kg), 94% (1µg/kg) e 85,8% (0,1µg/kg) do número de células. Entretanto, a média de leucócitos (mm3) em todos os grupos tratados com CST foi
estatisticamente igual ao dos grupos CN, DC e C4S (p>0,001) quando comparado
ao controle positivo. Também não houve diferença estatística entre CST e C4S nas
Figura 12 – Contagem total de leucócitos do líquido peritoneal de camundongos seis horas após indução da inflamação peritoneal. CP – Controle positivo. CN – Controle Negativo. DC – Diclofenaco (1,07mg/kg). C4S – Chondroitin-4-sulfate (doses 0,1µg/kg; 1µg/kg e10µg/kg). CST –
Condroitim sulfato isolado de tilápia (doses 0,1µg/kg; 1µg/kg e 10µg/kg). Os valores médios dos leucócitos, que não compartilham letras iguais no gráfico, são estatisticamente diferentes (p<0,001) comparando com o controle positivo de acordo com ANOVA (Two-way) e o pós-teste Bonferroni. A diferença de letras (a,b) indica diferença significativa entre as amostras e o controle positivo/ (c,d) indica
diferença significativa entre CST e C4s na mesma concentração.
Os tipos de populações resultantes da diferenciação dos leucócitos após o tempo de indução da inflamação também foram avaliados. A figura 13 mostra que o número absoluto de polimorfonucleares - PMN (neutrófilos, eosinófilos e basófilos) foi superior ao de mononucleares - MN (linfócitos e monócitos, principalmente) com exceção do controle negativo. O número de PMN em animais do grupo CN, DC e em ambos os grupos tratados com condroitim (C4s e CST) foi expressivamente menor
(p<0,001) do que o controle positivo. O percentual de inibição de PMN
desencadeado pelo uso de diclofenaco correspondeu a 77,6%. C4S foi capaz de inibir 73%; 75,7% e 66,8% nas doses de 0,1µg/kg, 1µg/kg e 10µg/kg, respectivamente. Em animais tratados com CST o influxo de polimorfonucleares foi
reduzido em 61% com administração da menor concentração (0,1µg/kg), 54,3% com 1µg/kg e 60% com o uso de CST na maior dose testada (10µg/kg). A migração de
PMNs foi considerada estatisticamente diferente entre CST e C4s apenas sob a
b b
bc bc bc bc
bc bc
CP CN DC
administração de doses reduzidas (0,1µg/kg, 1µg/kg). Estatisticamente, CST e C4s
apresentam efeito equivalente sob o influxo de polimorfonucleares ao peritônio na dose 10µg/kg. Não houve diferença significativa de MN entre os grupos submetidos a tratamento comparados com o controle positivo (Figura 13). As diferentes doses de CST comparadas entre si também não apresentaram significância estatística
quanto a inibição de PMNs e MNs (Dados não mostrados).
Figura 13 – Contagem diferencial em números absolutos de leucócitos polimorfonucleares e mononucleares do líquido peritoneal de camundongos seis horas após indução da inflamação peritoneal. CP – Controle positivo. CN – Controle Negativo. DC – Diclofenaco (1,07mg/kg). C4S – Chondroitin-4-sulfate (doses 0,1µg/kg; 1µg/kg e10µg/kg). CST – Condroitim sulfato isolado de tilápia
(doses 0,1µg/kg; 1µg/kg e 10µg/kg). MN – Mononuclear. PMN – Polimorfonuclear. Os valores médios dos leucócitos, que não compartilham letras iguais no gráfico, são estatisticamente diferentes (p<0,001) comparando com o controle positivo de acordo com ANOVA (Two-way) e o pós-teste Bonferroni. A diferença de letras (a,b) indica diferença significativa de PMN entre as amostras e o
controle positivo/ (a’,b’) indica diferença significativa de MN entre as amostras e o controle positivo. (c,d)
indica significativa diferença de PMN entre CST e C4s na mesma concentração/ (c’,d’) indica
significativa diferença de MN entre CST e C4s na mesma concentração. a'c'
a' a
a'c' a'c' a'c' a'c'
a'c' a' bc bc bd bc bc bd b a' a' b DC CP 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
0,1g/kg 1g/kg 10g/kg
CP CN DC C4s CST MN P M N P M N P M N P M N P M N P M N P M N MN MN MN MN MN
MN MN PM
A contagem total de leucócitos no sangue de animais tratados com o CST
mostrou 42,6%, 46% e 38,2% de inibição do influxo celular nas doses de 0,1µg/Kg, 1µg/Kg e 10µg/Kg, respectivamente, quando comparado à média em animais não tratados. No entanto, a administração de CST nessas doses não foi considerada
estatisticamente diferente do controle positivo (p>0,001). O percentual de inibição
celular do C4s foi de 46,3%, 62,5% e 57,4% nas respectivas doses de 0,1µg/Kg, 1µg/Kg e 10µg/Kg. Foi identificada diferença estatística entre C4s e CST apenas
quando administrado 1µg/Kg (Figura 14).
ac bc ac ac a b b ac ac
CP CN DC
0,1µ g/kg 1µg/ kg 10µg /kg 0 2000 4000 6000 8000 10000 C4s CP CN DC CST L e u có ci to s (m m 3 )
Figura 14 – Contagem total de leucócitos do sangue de camundongos seis horas após indução da inflamação peritoneal. CP – Controle positivo. CN – Controle Negativo. DC – Diclofenaco (1,07mg/kg). C4S – Chondroitin-4-sulfate (doses 0,1µg/kg; 1µg/kg e10µg/kg). CST – Condroitim
sulfato isolado de tilápia (doses 0,1µg/kg; 1µg/kg e 10µg/kg). Os valores médios dos leucócitos, que não compartilham letras iguais no gráfico, são estatisticamente diferentes (p<0,001) comparando com o controle positivo de acordo com ANOVA (Two-way) e o pós-teste Bonferroni. A diferença de letras
(a,b) indica diferença significativa entre as amostras e o controle positivo/ (c,d) indica diferença
significativa entre CST e C4s na mesma concentração.
número absoluto de PMN e MN foi maior no grupo tioglicolato (CP), cujos animais foram submetidos a inflamação sem nenhum tipo de tratamento. Não há diferença estatística quanto a leucócitos polimorfonucleares e mononucleares entre os grupos CN e DC. O uso de diclofenaco reduziu o número de PMN em 85,4% e de MN em 60,9%.
Os demais grupos apresentaram perfil muito similar quanto aos leucócitos polimorfonucleares, com redução significativa do número de PMN sob a administração de CST ou C4S, exceto para a dose de 0,1µg/Kg do CST (24,7% de
inibição). A administração das demais doses de CST (1µg/Kg e 10 µg/Kg) reduziu os
leucócitos PMN em 62,9% e 59,3%, respectivamente. Quando os animais foram pré-tratados com condroitim 4-sulfato o número de polimorfonucleares foi reduzido em 78,8% (0,1µg/Kg), 76,3% (1µg/Kg) e 65,8% (10µg/Kg). No entanto, não houve diferença estatística entre os respectivos grupos nas doses 1µg/Kg e 10µg/Kg quanto à PMN apesar da pequena diferença no percentual de inibição de células (Figura 15).
A população MN de C4S (0,1µg/Kg) e CST (10µg/Kg) não foram
considerados diferentes (p>0,001) quando comparados ao controle positivo para
inflamação. Nas demais doses de C4s utilizadas, o percentual de inibição celular (MN) foi bastante aproximado (1µg/kg = 53,9% e 10µg/Kg = 52,2% de inibição da migração). CST foi capaz de atuar sobre os leucócitos mononucleares principalmente
com a administração de 0,1µg/Kg, com a qual houve 54,1% de redução dessas células quando comparado ao controle positivo. Entre os grupos C4s e CST, o
entre si em relação a inibição de células mononucleares e polimorfonucleares (Dados não mostrados).
Figura 15 – Contagem diferencial em números absolutos de leucócitos polimorfonucleares e mononucleares do sangue de camundongos seis horas após indução da inflamação peritoneal. CP – Controle positivo. CN – Controle Negativo. DC – Diclofenaco (1,07mg/kg). C4S – Chondroitin-4-sulfate (doses 0,1µg/kg; 1µg/kg e10µg/kg). CST – Condroitim sulfato isolado de tilápia
(doses 0,1µg/kg; 1µg/kg e 10µg/kg). MN – Mononuclear. PMN – Polimorfonuclear. Os valores médios dos leucócitos, que não compartilham letras iguais no gráfico, são estatisticamente diferentes (p<0,001) comparando com o controle positivo de acordo com ANOVA (Two-way) e o pós-teste Bonferroni. A diferença de letras (a,b) indica significativa diferença de PMN entre as amostras e o
controle positivo/ (a’,b’) indica significativa diferença de MN entre as amostras e o controle positivo. (c,d)
indica diferença significativa de PMN entre CST e C4s na mesma concentração/ (c’,d’) indica diferença
5 DISCUSSÃO
A piscicultura representa uma modalidade de cultivo de elevada produtividade, baixos custos de implantação e racionamento de custos de produção. O cultivo de peixes, particularmente tilápia, em tanques‐rede instalados em corpos
d’água apresentam grande potencial para o desenvolvimento da aquicultura
continental no país, visto que a tilápia do Nilo se tornou uma das espécies mais cultivadas no Brasil (MARENGONI, 2006; OSTRENSK, BORGHETTI & SOTO, 2007). Entretanto, os impactos podem advir, por exemplo, do conflito com o uso de
corpos d’água, pela sedimentação e obstrução dos fluxos de água, através da
hipernutrificação e eutrofização, da descarga dos efluentes de viveiros e da poluição por resíduos químicos empregados nas diferentes fases do cultivo, da introdução e disseminação de espécies exóticas (OSTRENSK, BORGHETTI & SOTO, 2007).
Portanto, é importante propor métodos para minimizar os impactos e criar condições para que essa atividade de desenvolva de maneira sustentável, como o aproveitamento de resíduos sólidos advindos da piscicultura. Feltes et al., 2010 aborda alternativas para o aproveitamento sustentável de resíduos gerados na indústria pesqueira, como o aproveitamento dos subprodutos do pescado para o consumo animal ou humano e produção de biodiesel.
Na tilapicultura, tilápias adultas são evisceradas pelos pescadores no momento da despesca dos viveiros e as vísceras não são utilizadas para comercialização industrial. Portanto, nesta pesquisa, vísceras descartadas do cultivo de tilápia foram aproveitadas como fonte de glicosaminoglicanos naturais.
cartilagem de espécies de peixes como tubarão (MUCCI, SCHENETTIA & VOLPI, 2000), esturjão (MACCARI, FERRARINI & NICOLA, 2010) e outras espécies marinhas (ARIMA et al. 2013) foram descritas. Krylov et al. 2011 isolou e caracterizou CS e DS de diferentes tecidos de uma variedade de famílias de peixe. Escamas da espécie O. niloticus foram usadas para obtenção de GAGs (KRYLOV et
al. 2011). Porém, até o momento não foram encontradas referências da literatura para condoritim obtido de vísceras da tilápia nilótica.
O procedimento de extração de GAGs aplicado se assemelha aos que foram descritos anteriormente com a finalidade de obter glicosaminoglicanos a partir de diferentes invertebrados (MEDEIROS et. al 2000) e de espécies marinhas, como camarão e carangueijo, dos quais foram extraídos heparan sulfato e compostos tipo heparina (DIETRICH et al. 1999; BRITO et al 2008; CHAVANTE et al. 2000; ANDRADE et al. 2013). O perfil eletroforético da fração eluída com 3,0M NaCl mostra que, de fato, diferentes glicosaminoglicanos podem ser obtidos com o processo.
cromatografia de troca iônica DEAE-Sephacel. As duas bandas metacromáticas semelhantes ao CS de mamíferos observadas na eletroforese PDA, foram resultantes da eluição com concentrações 0,5M e 0,8M de NaCl. A amostra de maior rendimento, ou seja, com maior concentração de urônico dosado (DISCHE, 1947), foi utilizada para análise estrutural.
Dados de ressonância magnética nuclear são utilizados para caracterização estrutural de CS (MUCCI, SCHENETTIA & VOLPI, 2000; MACCARI, FERRARINI & VOLPI, 2010; KRYLOV et al. 2011). A análise da RMN (1H e HSQC) do CST revelou
sinais espectrais referentes ao ácido glucurônico e N-acetil- galactosamina com grupos sulfato nas posições 4 ou 6, confirmando que o composto trata-se de um condroitim sulfato.
O espectro de prótons de condroitim obtido de organismos de fonte suína, bovina e do tubarão mostra que o grupo acetil está presente entre 2,00 e 2,10 ppm (MUCCI, SCHENETTIA & VOLPI, 2000). Sinais entre 2,00 – 2,06 ppm são atribuídos ao condroitim sulfato, corroborando com os resultados de CST descritos (ÜSTÜN et
al. 2011). Os demais sinais 1H de RMN do CST estão na mesma faixa (3-5 ppm)
descrita por Mucci, Schenettia & Volpi (2000) para caracterização de CSs naturais obtidos de vertebrados, e, os pontos onde ressonam H1, H2 e H3 do GlcA, bem como o H1 da GalNac4s foram muito aproximados dos identificados na estrutura do condroitim isolado da tilápia. Quanto aos dados do 13C de RMN, com exceção do
CS obtido a partir do esturjão. Os espectros referentes ao carbono 6 da GalNAc4s e da GalNAc6s do CST, ressonam exatamente no mesmo ponto do condroitim sulfato
purificado por Maccari, Ferrarini & Volpi (2010), os demais sinais 13C de RMN do
CST são semelhantes aos que foram descritos por Mucci, Schenettia & Volpi (2000).
A estrutura do CS é distinguida pela sua sulfatação. No entanto, dissacarídeos com números e posições de grupos sulfato variados podem ser localizados em diferentes porcentagens dentro da cadeia polissacarídica (VOLPI, 2009; BAUEROVA et al. 2011). A heterogeneidade dessa molécula é responsável pela variedade e especificidade das funções que desempenha (SUGAHARA, 2003; VOLPI, 2006). Dentre elas, o CS já tem sido usado no tratamento da osteoartrite devido seu potencial anti-inflamatório e antiapoptótico (VOLPI, 2006; MONFORT et al. 2008; CAÑAS et al., 2010; PECCHI, 2012). Nos últimos anos, várias pesquisas foram desenvolvidas com o intuito de avaliar o potencial do condroitim sulfato em modelos de processos inflamatórios distintos (IOVU, 2008; SOUICH et al. 2009; CAÑAS et al., 2010; BAUREOVA, 2011). A capacidade do CS de interferir em processos inflamatórios foi associada à inibição de expressão de moléculas pró-inflamatórias, como IL-1β, TNF-α e a translocação nuclear de NF-kB (LAUDER,
2009; VALLIÈRES & SOUICH, 2010).
inflamatória devem ser resolvidos a fim de se evitar a progressão de outros fatores que promovam a inflamação crônica e doenças relacionadas (SERHAN, CHIANG & VAN DYKE, 2008).
A administração de fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais é um meio importante de supressão da resposta inflamatória no contexto clínico e tem a capacidade de inibir manifestações iniciais e tardias. No entanto, o uso prolongado destes agentes terapêuticos é seguido por complicações, incluindo perfurações gástricas, úlceras estomacais e hemorragias (IWALEWA et al., 2007). Portanto, há grande interesse em compostos anti-inflamatórios com poucos efeitos colaterais (VANDERLEI et al., 2010; VOLPI, 2011).
Desse modo, buscou-se avaliar a resposta (morte ou viabilidade) de células normais (3T3) submetidas aos períodos de 24 e 48h na presença do CS purificado a partir das vísceras da tilápia, através do método de redução do MTT. Esse ensaio permite inferir sob o uso do composto/amostra em testes in vivo. Para não ser
considerado citotóxico, um composto não deve ocasionar a morte das células, nem afetar suas funções celulares (ARAÚJO et al., 2008). O MTT, quando incubado com células vivas, tem seu substrato quebrado por enzimas mitocondriais, sendo transformado de um composto amarelo (solúvel em água) em um composto de coloração roxa, o formazan (insolúvel em água). Ou seja, a formação de cristais de formazan pela atividade mitocondrial da célula, reflete o estado funcional da cadeia respiratória, e, portanto, a viabilidade celular (ARAÚJO et al, 2008; PERES et al., 2008). Conforme descrito anteriormente, o período de 24h de cultivo, as células células incubadas com diferentes doses de CST permaneceram viáveis, e, depois de
absorbâncias equivalente ao aumento de produtos resultantes da redução de MTT, conforme significante diferença estatística (p< 0,001) indicada nas doses 1, 10 e 100
µg/100µl.
Com base nessas considerações, o composto isolado (CST) foi testado in vivo
em modelo de inflamação do peritônio induzida por tioglicolato de sódio. A injeção de tioglicolato na cavidade peritoneal de ratos foi capaz de induzir a inflamação aguda e infiltração neutrofílica (BRITO et al., 2008). Portanto, neste estudo, o aumento de leucócitos no local inflamado de camundongos Swiss em experimentação foi considerado como evidência de que um processo inflamatório foi desencadeado. De fato, a análise da contagem total e diferencial de células no sangue e líquido peritoneal dos grupos de animais estudados demonstrou diferença significativa (p<0,001) do número de leucócitos no controle positivo (CP) comparado
com o controle negativo.
Todos os processos inflamatórios envolvem ou dependem do recrutamento de leucócitos para o local da inflamação (HAJISHENGALLIS & CHAVAKIS, 2013). Visto que o peritônio contém muitos linfócitos, incluindo leucócitos peritoneais residentes (KIPARI et al., 2009), o número de células do controle negativo foi considerado basal e a diferença entre CP e CN representou o número de leucócitos que migraram após o estímulo inflamatório (100% de migração). Com base nisto, foi calculado o percentual de inibição da migração de células de todos os grupos.
O significativo percentual de inibição (p<0,001) do número total de leucócitos
no líquido peritoneal nas três doses de CST testadas (10µg/kg; 1µg/kg; 0,1µg/kg)
dose-dependente. Quanto à análise celular do sangue dos animais, a contagem total mostrou que a administração de CST não foi estatisticamente diferente do controle
positivo. A resposta inflamatória é caracterizada por coordenar a ativação de várias vias de sinalização que regulam a expressão dos mediadores inflamatórios em células teciduais residentes e leucócitos recrutados a partir do sangue (LAWRENCE, 2009; GEERING et al, 2013). Considerando que não houve redução significativa do número total de leucócitos no sangue dos camundongos pré-tratados com CST,
porém o influxo celular ao local inflamado foi reduzido, pode significar que um estímulo inflamatório proporcionou a liberação de células na corrente sanguínea, contudo, algum componente presente no organismo do animal impediu a migração de leucócitos ao peritônio. Condroitim sulfato pode estar associado a inibição de interações específicas entre L- e P-selectinas com quimiocinas, as quais por sua vez estão envolvidas no tráfego de leucócitos e consequentemente em doenças inflamatórias (SUGAHARA et al. 2003).
inflamatório inicial é seguido pelo recrutamento de monócitos e linfócitos inflamatórios (HAJISHENGALLIS & CHAVAKIS, 2013).
CST foi capaz de reduzir consideravelmente o influxo de polimorfonucleares
ao peritônio (mais de 50% de inibição da migração) nas doses de 0,1 µg/Kg, 1µg/Kg e 10µg/Kg, porém, pareceu não interferir no número de mononucleares que migraram à cavidade peritoneal. Esses resultados foram estatisticamente semelhantes ao de animais tratados com C4s, não havendo diferença estatística entre ambos os grupos quanto ao influxo de MNs, nem também quanto ao número de PMNs na dose 10µg/Kg.
A análise do sangue dos animais mostrou que houve significativa redução (média de 60%) do número de PMN com as doses 1µg/Kg e 10µg/Kg do CST.
Enquanto o percentual de inibição de MN foi consideravelmente significativo com a administração de 0,1µg/Kg de CST. Os números absolutos referentes à PMNs no
sangue foram muito aproximados de quando foi administrado diclofenaco na dose 1.07mg/kg. Contudo, a inibição de mononucleares com o uso de diclofenaco de sódio foi consideravelmente superior referente ao CST. C4s provocou a inibição de
leucócitos mononucleares numa média de 50% nas doses de 1µg/Kg e 10µg/Kg enquanto CST mostrou esse percentual de inibição apenas com uso de 0,1µg/Kg. No
entanto, C4s e CST foram estatisticamente semelhantes quanto à diferenciação de
células do sangue, diferindo apenas no influxo de polimorfonucleares com o uso de 0,1µg/Kg de ambas as amostras.
Considerando todos os resultados experimentais desenvolvidos em camundongos, é evidente que o condroitim sulfato extraído e purificado de rejeitos biológicos de O. niloticus é capaz de interferir no recrutamento de leucócitos
