MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
IMUNOTERAPIA DE ÚLCERAS VENOSAS COM
ββββ
-(1
→
3)
GLUCANA INSOLÚVEL
SARAH DANTAS VIANA MEDEIROS
Orientadora: Profa. Dra. Valéria Soraya de Farias Sales
Co-Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha
SARAH DANTAS VIANA MEDEIROS
IMUNOTERAPIA DE ÚLCERAS VENOSAS COM
ββββ
-(1
→
3)
GLUCANA INSOLÚVEL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas – Área de Concentração Bioanálises e Medicamento.
Catalogação da publicação na fonte. M488i
Medeiros, Sarah Dantas Viana.
Imunoterapia deúlcera venosas com β−(1→3) glucana
insolúvel / Sarah Dantas Viana Medeiros. - Natal-RN, 2009. 91f.: il.
Orientadora: Profª. Drª Valéria Soraya de Farias Sales. . Coorientador: Profº Drº Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.
Dissertação (Mestrado ) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
1. Imunoterapia - Dissertação. 2. β−(1→3) glucana insolúvel - Dissertação. 3. Úlcera Venosa - Dissertação. 4. Úlcera Varicosa – Dissertação. I. Sales, Valéria Soraya de Farias. II. Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira. III. Título.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais,
Rui Medeiros e Silvina Dantas Viana Medeiros, pelo dom da vida, por todo o amor, por acreditarem nos meus sonhos e me proporcionarem uma plataforma de vôo.
Aos pacientes,
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela orientação superior em todos os momentos da vida.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela formação concedida ao longo da Graduação e Pós-Graduação.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, representado pela Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende, e ao corpo docente pelos ensinamentos transmitidos.
À CAPES, pela concessão de bolsa de estudo durante a realização deste curso.
À Fundação de Apoio a Pesquisa no Rio Grande do Norte (FAPERN) pelo apoio financeiro.
Ao Prof. Dr. José Ricardo Lagreca de Sales Cabral, Diretor do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL/UFRN), que nos permitiu a realização desta pesquisa na referida instituição.
À Profa. Dra. Valéria Soraya de Farias Sales, pela orientação, dedicação, amizade e por acreditar nos meus sonhos e no meu trabalho.
Ao Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, pela co-orientação e total apoio na realização do estudo de caracterização da glucana.
Ao Prof. Dr. Irami Araújo Filho, pela colaboração na execução das biópsias, dispondo-se de maneira incondicional.
À Profa. Msc. Keyla Borges Ferreira Rocha, pela colaboração no estudo histopatológico, e pela torcida constante.
Aos Professores Elizabeth Maia de Oliveira e Luiz Reginaldo Menezes da Rocha, pela colaboração na realização do processamento e colorações histológicas.
Ao médico cirurgião vascular Eduardo Baptista Dantas de Faria pela colaboração na avaliação e acompanhamento dos pacientes.
À enfermeira Julianny Barreto Ferraz, pela colaboração no acompanhamento dos pacientes, pelo exemplo de profissional e por ter me permitido vivenciar o universo da Enfermagem.
À enfermeira Maria do Ó de Oliveira Ferreira e aos técnicos de Enfermagem do Ambulatório de Angiologia e Cirurgia Vascular, pelo apoio e disponibilidade.
À toda a equipe do Centro Cirúrgico do HUOL, pela acolhida e cuidado com os pacientes quando da realização das biópsias.
À Profa. Msc. Teresa Neuma de Souza Brito, pela amizade e apoio na realização dos exames laboratoriais.
Ao Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior, pelo apoio, incentivo e sugestões.
À Profa. Dra. Telma Maria Araújo Moura Lemos, Chefe do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da UFRN, pelo apoio e incentivo na realização deste trabalho. Às amigas do Mestrado: Camila Regalado Galvão, Luzia Leiros de Sena Fernandes e Milena Thaísa Figueirêdo de Araújo, pelo convívio ao longo desses dois anos e constante troca de experiências.
À minha família, pelo apoio incondicional, em especial aos meus irmãos Rui Medeiros Júnior e Daniel Dantas Viana Medeiros e minhas avós Suzana Medeiros e Marina Dantas de Araújo.
À todos que fazem o Laboratório de Biopolímeros do Departamento de Bioquímica da UFRN, em especial à aluna de iniciação científica Sara Lima Cordeiro.
Ao Prof. Dr. Edvaldo da Silva Trindade e ao Prof. Dr. Guilherme Lanzi Sassaki do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de Curitiba, pela colaboração na realização da ressonância magnética nuclear da glucana.
Às secretárias do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas: Maria Aureliana Nascimento Bezerra e Fábia Cristina Miranda de Araújo Freire, pelo apoio e amizade.
À amiga e Farmacêutica Amália Cinthia Meneses do Rêgo, pelo apoio e incentivos constantes.
À bolsista de iniciação científica Jéssica Escorel Chaves Cavalcanti, pela amizade e colaboração.
Ao meu namorado Fernando Costa Fernandes Gomes, por todo o amor, cuidado e dedicação.
Ao taxista Bartolomeu Juvêncio, pela disponibilidade e zelo em acompanhar os pacientes às suas residências após a realização das biópsias.
AO FARMACÊUTICO
Quando alguém de ti precisar, observa como és indispensável. Tens o bálsamo que pode aplacar
o sofrer que é tão lamentável.
Reveste-te do saber e do desejo de curar, vencendo qualquer obstáculo.
Persevera descobrindo no ensejo a força da Ciência – teu sustentáculo.
RESUMO
Uma glucana insolúvel foi isolada de fermento biológico (Saccharomyces cerevisiae), o qual foi submetido a um tratamento com base e o resíduo acidificado. Análises químicas e ressonância magnética nuclear (NMR) em uma e duas dimensões (1D e 2D) mostraram que uma β-(1→3) glucana linear foi purificada, a qual não estava contaminada com outros carboidratos, proteínas ou compostos fenólicos. Os efeitos desta glucana na cicatrização de feridas foi avaliado em úlceras venosas humanas por análise histopatológica após 30 dias de tratamento. A β-(1→3) glucana favoreceu a cicatrização das úlceras, promovendo o aumento da hiperplasia epitelial, das células inflamatórias, angiogênese e proliferação fibroblástica. Este foi o primeiro estudo que investigou o efeito da β-(1→3) glucana na cicatrização de úlceras venosas em humanos. Os achados sugerem que a glucana é um potente modificador da resposta biológica na cicatrização de feridas.
ABSTRACT
Water-insoluble glucan was isolated from the baker's yeast Saccharomyces cerevisiae. The yeast cells were treated with alkali and the residue then with acid. Chemical and NMR (1D and 2D) analyses showed that a linear (1→3)-β-glucan was purified that was not contaminated with other carbohydrates, proteins or phenolic compounds. The effects of the glucan on wound healing were assessed in human venous ulcers by histopathological analysis after 30 days of topical treatment. (1→3)-β-glucan enhanced ulcer healing and increased epithelial hyperplasia, as well as increased inflammatory cells, angiogenesis and fibroblast proliferation. This is the first study to investigate the effects of (1→3)-β-glucan on venous ulcer healing in humans; our findings suggest that this glucan is a potential natural biological response modifier in wound healing.
LISTA DE SIGLAS
AGE: Ácidos Graxos Essenciais ALT: Alanina Aminotransferase AVC: Acidente Vascular Cerebral AP-1: Proteína Ativadora 1 AST: Aspartato Aminotransferase CEP: Comitê de Ética em Pesquisa CNS: Conselho Nacional de Saúde CR3: Receptor de Complemento Tipo 3 EGF: Fator de Crescimento Epidérmico FGF: Fator de Crescimento Fibroblástico GGT: Gamaglutamiltransferase
GM-CSF: Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos-Monócitos HCl: Ácido Clorídrico
HE: Hematoxilina-Eosina
HUOL: Hospital Universitário Onofre Lopes IL-1β: Interleucina 1Beta
IL-6: Interleucina 6 IL-8: Interleucina 8 IL-10: Interleucina 10 IL-12: Interleucina 12
INSS: Instituto Nacional de Seguridade Social IVC: Insuficiência Venosa Crônica
LIAC: Laboratório Integrado de Análises Clínicas NaOH: Hidróxido de Sódio
NF-1: Fator Nuclear 1 NK: “Natural Killer”
PAMPs: Padrões Moleculares Associados aos Patógenos PDGF: Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas PSF: Programa de Saúde da Família
RMN13C: Ressonância Magnética Nuclear do Carbono 13 SP-1: Proteína Específica 1
SUS: Sistema Único de Saúde TCA: Ácido Tricloroacético
TCLE: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TGF-α: Fator Transformador Alfa
TGF-β: Fator Transformador Beta TNF-α: Fator de Necrose Tumoral Alfa
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Classificação CEAP da doença venosa de acordo com o Fórum Venoso Americano.
20
Figura 2: Espectro de RMN 13C da amostra de glucana obtida a partir do
Saccharomyces cerevisiae. O número de átomos de carbono foi marcado em cada
ponta para se referir à posição. A caixa na parte superior da figura mostra a análise de DEPT da região C-6.
36
Figura 3: Espectro 1H-13C RMN da amostra de glucana insolúvel obtida a partir de
Saccharomyces cerevisiae. O 13C RMN é exibido no eixo vertical e o 1H RMN no eixo horizontal.
37
Figura 4: Hematoxilina-Eosina (100X) evidenciando hiperplasia epitelial típica e angiogênese na margem da úlcera venosa no pré-tratamento.
39
Figura 5: Hematoxilina-Eosina (400X) evidenciando alterações epiteliais reativas e reparativas do epitélio escamoso estratificado da úlcera venosa no pré-tratamento.
40
Figura 6: Hematoxilina-Eosina (100X) evidenciando necrose com deposição de fibrina, edema e resposta inflamatória na área ulcerada no pré-tratamento.
40
Figura 7: Hematoxilina-Eosina (100X) exibindo poucos vasos, edema e resposta inflamatória, que se estende desde a derme papilar até a porção média, na área ulcerada no pré-tratamento.
41
Figura 8: Hematoxilina-Eosina (400X) exibindo a presença de resposta inflamatória neutrofílica, angiogênese, edema e fibroblastos jovens da úlcera venosa no pré-tratamento.
41
Figura 9: Hematoxilina-Eosina (400X) exibindo a presença de resposta inflamatória linfoplasmocitária da úlcera venosa no pré-tratamento.
42
Figura 10: Hematoxilina-Eosina (400X) evidenciando edema, angiogênese e ocasionais fibroblastos jovens da úlcera venosa no pré-tratamento.
42
Figura 11: Tricrômio de Masson (100X) exibindo deposição de colágeno jovem na área ulcerada e colágeno senescente na profundidade da úlcera no pré-tratamento.
43
Figura 12: Tricrômio de Masson (400X) exibindo detalhe do fibroblasto jovem em meio à deposição de colágeno na área ulcerada no pré-tratamento.
43
Figura 13: Picrosirius red (100X) mostrando pouca deposição de colágeno jovem na superfície da área ulcerada e presença de colágeno senescente depositado na profundidade da úlcera venosa no pré-tratamento.
44
Figura 14: Hematoxilina-Eosina (100X) evidenciando fibroblastos jovens associados a edema, extravasamento de hemácias e células inflamatórias mononucleares e polimorfonucleares na profundidade da área ulcerada no pré-tratamento.
Figura 15: Hematoxilina-Eosina (100X) evidenciando área de reepitelização com alterações epiteliais reparativas e reativas, resposta inflamatória e angiogênese na área ulcerada no trigésimo dia de tratamento.
45
Figura 16: Hematoxilina-Eosina (100X) mostrando necrose superficial, com deposição de fibrina, polimorfonucleares e debris celulares associado a edema na porção papilar da derme na área ulcerada no trigésimo dia de tratamento.
46
Figura 17: Hematoxilina-Eosina (100X) exibindo resposta inflamatória, angiogênese e edema na área ulcerada no trigésimo dia de tratamento.
46
Figura 18: Hematoxilina-Eosina (400X) evidenciando infiltrado inflamatório linfoplasmocitário perivascular e intersticial, angiogênese e edema na profundidade da úlcera no trigésimo dia de tratamento.
47
Figura 19: Hematoxilina-Eosina (400X) evidenciando angiogênese, deposição de colágeno entre os vasos e diminuição da resposta inflamatória na profundidade da úlcera no trigésimo dia de tratamento.
47
Figura 20: Tricrômio de Masson (100X) evidenciando colágeno jovem em trama delicada associado a edema na derme papilar e colágeno senescente na profundidade da úlcera no trigésimo dia de tratamento.
48
Figura 21: Picrosirius red (100X) evidenciando a deposição de colágeno jovem e intensa angiogênese na porção papilar e colágeno senescente na profundidade da úlcera no trigésimo dia de tratamento.
48
Figura 22: Hematoxilina-Eosina (400x) evidenciando fibroblastos jovens e senescentes em área de deposição de colágeno na profundidade da úlcera no trigésimo dia de tratamento.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Deslocamentos químicos dos átomos de carbono e hidrogênio verificados nos espectros de 13C RMN e 1H RMN da amostra de glucana obtida a partir do
Saccharomyces cerevisiae.
38
Tabela 2. Distribuição dos parâmetros histopatológicos evidenciados em úlceras venosas na fase de pré-tratamento (dia 0) e no trigésimo dia de tratamento (dia 30) com β-(1→3) glucana por via tópica.
50
Tabela 3. Eritrograma, contagem de plaquetas e VSH dos pacientes portadores de úlceras venosas nas fases de pré-tratamento (dia 0) e de trigésimo dia de tratamento (dia 30) com β-(1→3) glucana por via tópica.
52
Tabela 4. Leucograma dos pacientes portadores de úlceras venosas nas fases de pré-tratamento (dia 0) e de trigésimo dia de tratamento (dia 30) com β-(1→3) glucana por via tópica.
53
Tabela 5. Dosagens bioquímicas dos pacientes portadores de úlceras venosas nas fases de pré-tratamento (dia 0) e de trigésimo dia de tratamento (dia 30) com β -(1→3) glucana por via tópica.
54
Tabela 6. Área e o percentual de redução das úlceras venosas por período de segmento terapêutico.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 16
2 REVISÃO DE LITERATURA... 18
2.1 ÚLCERA VENOSA... 18
2.2 FISIOLOGIA DO EROCESSO DE CICATRIZAÇÃO... 21
2.3 TRATAMENTO DA ÚLCERA VENOSA... 23
2.4 IMUNOTERAEIA COM β-GLUCANAS... 24
3 OBJETIVOS... 27
3.1 OBJETIVO GERAL... 27
3.1 OBJETIVOS ESEECÍFICOS... 27
4 CASUÍSTICA E METODOLOGIA... 28
4.1 DELINEAMENTO DA EESQUISA... 28
4.2 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA GLUCANA... 28
4.3 FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA... 29
4.4 AELICAÇÃO DA GLUCANA... 29
4.5 REGISTRO FOTOGRÁFICO E MENSURAÇÃO DA ÁREA DA ÚLCERA... 30
4.6 BIÓESIA CUTÂNEA... 30
4.7 EROCESSAMENTO E COLORAÇÕES HISTOLÓGICAS... 30
4.8 AVALIAÇÃO HISTOEATOLÓGICA... 31
4.8.1 Análise qualitativa... 31
4.8.2 Análise semiquantitativa... 31
4.8.3 Análise quantitativa... 33
4.9 AVALIAÇÕES HEMATOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS... 33
4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 34
5 RESULTADOS... 35
5.1 CASUÍSTICA... 35
5.2 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA GLUCANA... 35
5.3 REGISTRO FOTOGRÁFICO E MENSURAÇÃO DA ÁREA DA ÚLCERA ... 38
5.4.1 Análise qualitativa... 39
5.4.2 Análise semiquantitativa... 50
5.4.3 Análise quantitativa... 51
5.5 AVALIAÇÕES HEMATOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS... 51
6 DISCUSSÃO... 55
7 CONCLUSÃO... 58
REFERÊNCIAS... 59
APÊNDICES... 65
1 INTRODUÇÃO_______________________________________________________
As úlceras venosas são lesões cutâneas de difícil cicatrização que surgem nos membros inferiores como conseqüência da insuficiência venosa crônica (IVC). Configuram um sério problema de saúde pública em função de sua alta prevalência e do impacto socioeconômico (SIMON; DIX; MCCOLLUM 2004). Embora a mortalidade associada a este tipo de ferida seja praticamente nula, a morbidade é bastante significativa, levando a um comprometimento da qualidade de vida do paciente e da sua produtividade no trabalho, além de restrições das suas atividades da vida cotidiana (NUNES, 2006).
O processo de cicatrização de feridas é sistêmico, complexo e resulta de uma série de fenômenos desencadeados em resposta à injúria tecidual (GURTNER, et al., 2008). Mesmo com o arsenal terapêutico disponível, novas propostas têm surgido com o intuito de acelerar a cicatrização, minimizar os riscos e as complicações, melhorar a qualidade de vida do paciente e reduzir os custos despendidos com o tratamento.
Neste contexto, a literatura destaca a β-glucana insolúvel, obtida a partir do fungo Saccharomyces cerevisiae, um polissacarídeo capaz de estimular o processo de cicatrização, através da ativação de células imunes, principalmente macrófagos e linfócitos, com conseqüente liberação de citocinas, como a interleucina 1 β (IL-1 β), interleucina 6 (IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), fatores de crescimento e outros mediadores importantes para a angiogênese, proliferação de fibroblastos e síntese de colágeno, além do aumento da atividade fagocítica (BROWN; GORDON, 2003; CHEN; SEVIOUR, 2007).
intravenosa, melhora no estado geral, ausência de eventos adversos e ação adjuvante à quimioterapia, proporcionando um aumento na sobrevida dos pacientes.
2 REVISÃO DE LITERATURA___________________________________________
2.1 ÚLCERA VENOSA
O sistema venoso dos membros inferiores é constituído por veias superficiais e profundas que se comunicam através de veias perfurantes. Em condições normais, o fluxo sangüíneo tem um único sentido, do sistema superficial para o profundo, guiado por válvulas existentes no interior das veias e impulsionado pelo músculo gastrocnêmio. Em posição ortostática, a pressão venosa nos membros inferiores está compreendida entre 80 mmHg e 90 mmHg e, durante a deambulação, essa pressão é reduzida para aproximadamente 30 mmHg, permitindo um fluxo sangüíneo livre(DEODATO, 2007).
Entretanto, esse sistema pode apresentar anormalidades no seu funcionamento, sendo tais alterações causadas por incompetência valvular, associada ou não à obstrução do fluxo venoso, refluxo ou combinação de ambos, bem como pela falência do músculo gastrocnêmio. Isso configura um quadro de insuficiência venosa crônica, a qual está relacionada com o surgimento da hipertensão venosa. A pressão elevada no interior dos vasos provoca alterações na microcirculação, acarretando aumento da permeabilidade capilar com liberação de macromoléculas para o espaço extravascular, como o fibrinogênio e a hemoglobina, que se transformam em fibrina e hemossiderina, respectivamente. Como conseqüência desse processo, é possível observar alterações cutâneas sob a forma de edema, eczema, hiperpigmentação, lipodermatoesclerose e ulceração do tecido (ABBADE; LASTÓRIA, 2005).
As úlceras venosas são lesões cutâneas que correspondem a 80-85% das úlceras que acometem os membros inferiores (SIMON; DIX; MCCOLLUM 2004). Surgem geralmente de forma espontânea e podem ocorrer também em função de traumatismos e infecções. Na maioria das vezes, localizam-se na região maleolar, entretanto, acometem outras regiões do membro inferior. São caracterizadas pela perda circunscrita ou irregular da epiderme ou derme, e podem atingir o tecido subcutâneo e subjacente. Possuem bordas irregulares, leito vermelho vivo e em alguns casos apresentam necrose do tipo esfacelo. São bastante exsudativas, recidivantes e em geral compreendem uma área extensa. A dor é variada, melhorando com a elevação do membro, e é mais intensa na presença de edema e infecção (SILVA et al., 2005).
praticamente inexistente, as úlceras venosas cursam com elevada morbidade, comprometendo significativamente a qualidade de vida do paciente em função da dor crônica, perda de auto-estima, isolamento social, inabilidade para o trabalho, gerando aposentadorias por invalidez, além do grande número de atendimentos ambulatoriais e hospitalizações (NUNES, 2006).
Na Europa, a prevalência de insuficiência venosa crônica na faixa etária de 30 a 70 anos varia entre 5% e 15%, sendo que 1% da população apresenta a úlcera venosa. Nos Estados Unidos da América, em torno de 7 milhões de pessoas têm a IVC e mais de 600 mil possuam esse tipo de lesão. (FRANÇA; TAVARES, 2003). Maffei et al (1986), em estudo epidemiológico das alterações venosas de membros inferiores realizado na cidade de Botucatu (SP), estimaram uma prevalência de varizes em 35,5% da população e de formas graves de IVC com úlcera aberta ou cicatrizada em 1,5%.
O diagnóstico de úlcera venosa é predominantemente clínico, sendo necessária a obtenção de informações, tais como: ano de ocorrência da primeira úlcera, localização de úlceras anteriores, número de recorrências, tempo livre de úlcera e tratamentos anteriores, uma vez que esses dados são importantes para o direcionamento da terapia. Podem ser realizados ainda exames complementares, como Doppler de ondas contínuas, ultra-sonografia (eco-Doppler), plestimografia venosa e flebografia, com o propósito de diagnosticar precisamente as alterações anatômicas e funcionais do sistema venoso (AGUIAR et al., 2005; FRANÇA; TAVARES, 2003).
Figura 1. Classificação CEAP da doença venosa de acordo com o Fórum Venoso Americano (EKLÖF, et al., 2004).
Classificação Clínica (C):
• Classe 0: Sem sinais visíveis ou palpáveis de doença venosa.
• Classe 1: Telangiectasias e/ou veias reticulares.
• Classe 2: Veias varicosas.
• Classe 3: Edema.
• Classe 4: Alterações cutâneas
* Classe 4a: Hiperpigmentação ou eczema
* Classe 4b: Lipodermatosclerose ou atrofia branca
• Classe 5: Classe 4 com úlcera cicatrizada.
• Classe 6: Classe 4 com úlcera ativa. Classificação Etiológica (E):
• EC: Congênita
• EP: Primária
• ES: Secundária (pós-trombótica)
• EN: Sem causa venosa definida Classificação Anatômica (A):
• AS: Veias Superficiais
• AD: Veias Profundas
• AP: Veias Perfurantes
• AN: Sem localização venosa definida Classificação Fisiopatológica (P):
• PR: Refluxo
• PO: Obstrução
• PR,O: Refluxo e Obstrução
2.2 FISIOLOGIA DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO
A cicatrização de feridas consiste em um processo sistêmico e bastante complexo, que envolve a ativação, produção e inibição de uma série de constituintes celulares e moleculares para que ocorra o reparo tecidual. Não havendo qualquer obstáculo, esse processo pode ser compreendido em três grandes fases conforme descrito a seguir (MANDELBAUM, S; DI SANTIS; MANDELBAUM, M, 2003a).
- Fase Inflamatória ou Exsudativa
Após a injúria tecidual, os vasos sanguíneos sofrem vasoconstricção reflexa, por cerca de 5 a 10 minutos, sendo este efeito promovido pela norepinefrina e serotonina. Ocorre a ativação da cascata de coagulação e agregação plaquetária, resultando na conversão do fibrinogênio solúvel em fibrina insolúvel, cujas moléculas se polimerizam e formam uma rede que, juntamente com as plaquetas e as hemácias, originam o coágulo. Este, uma vez formado, além de limitar a perda de constituintes circulatórios, fornece uma matriz provisória para a migração celular (GURTNER, et al., 2008).
Com a ativação plaquetária, há a liberação de mediadores vasoativos, de fatores de crescimento, como o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o fator de crescimento epidérmico (EGF), o fator de crescimento e transformação alfa (TGF-α), o fator de crescimento e transformação beta (TGF-β) e de outras proteínas como a fibronectina e a tromboplastina. Essas moléculas se difundem pela matriz provisória e criam um gradiente quimiotático para as células inflamatórias (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).
Os macrófagos são responsáveis pela degradação e remoção dos componentes do tecido conjuntivo danificado, como colágeno, elastina e proteoglicanas, participando ainda da fagocitose de neutrófilos senis e bactérias. Quando ativados, os macrófagos liberam substâncias vasoativas, intermediários reativos do oxigênio e nitrogênio, como o peróxido de hidrogênio, ânion superóxido e óxido nítrico, além de citocinas como IL-1 β, IL-6, interleucina 8 (IL-8), TNF-α, TGF-α e TGF-β, e fatores de crescimento como o PDFG, EGF, fator de crescimento fibroblástico (FGF) e o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF). Estes mediadores propiciam o aumento da atividade fagocítica dos macrófagos e estimulam células imunes e outras células não imunes essenciais para a formação do novo tecido. (PARK; BARBUL, 2004; SINGER; CLARK, 1999).
Os linfócitos T e B além de produzirem citocinas e fatores de crescimento, o que contribui para a ativação de diversos tipos celulares, atuam como células reguladoras (linfócitos T), células apresentadoras de antígenos e produtoras de anticorpos (linfócitos B) (BOYCE et al., 2000; IWATA et al., 2009).
- Fase Proliferativa ou Fibroblástica
Na fase proliferativa ocorre a reepitelização, com a migração de células epiteliais para a área ulcerada em resposta aos processos de angiogênese e de fibroplasia. Dessa maneira, há a formação de um tecido brilhante, vermelho vivo, com ondulações granulosas, denominado tecido de granulação. A produção deste novo tecido é dependente do acúmulo de macrófagos. Estas células imunes quando ativadas, estimulam o recrutamento, proliferação e diferenciação dos fibroblastos, os quais sintetizam colágeno, elastina, fibronectina, glicosaminoglicana e proteases (componentes da matriz extracelular), contribuindo para a formação do tecido conjuntivo frouxo (fibroplasia), além de estimular a angiogênese (SINGER; CLARK, 1999).
- Fase de Maturação ou Remodelação
A fase de maturação é caracterizada pelo aumento da força de tensão, pela diminuição do tamanho da cicatriz e do eritema. Nesta fase, ocorre a reorganização da matriz extracelular e a maturação dos componentes nela presentes. A neovasculatura diminui e tardiamente a cicatriz é considerada avascular. Uma cicatrização normal tem aproximadamente 70% da força de tensão original, é plana e não é volumosa (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).
Inúmeros fatores podem retardar o processo de cicatrização, sejam eles locais ou sistêmicos, tais como: infecção, edema, tecido necrótico, hipertensão arterial sistêmica, diabetes mellitus, nefropatia, hepatopatia, neoplasias malignas. Além disso, a idade do paciente, o tipo de nutrição, os cuidados pessoais e a utilização de alguns medicamentos, principalmente imunossupressores e antiinflamatórios podem dificultar este processo (DEALEY, 2009).
2.3 TRATAMENTO DA ÚLCERA VENOSA
O tratamento da úlcera venosa deve contemplar a cicatrização da lesão e evitar a recorrência da mesma. Neste contexto, destacam-se a terapia compressiva, a terapia tópica, os medicamentos sistêmicos e o tratamento cirúrgico da anormalidade venosa (ABBADE; LASTÓRIA, 2005). A compressão atua na macrocirculação aumentando o retorno venoso profundo, diminuindo o refluxo no momento da deambulação, aumentando o volume de ejeção quando da ativação do músculo gastrocnêmio e promovendo a reabsorção do edema. Além disso, age na microcirculação diminuindo a saída de líquidos e macromoléculas dos capilares e vênulas para o interstício, podendo estimular também a atividade fibrinolítica. Para o tratamento compressivo dispõe-se de bandagens ou ataduras elásticas e inelásticas, bem como meias elásticas. Dentre as ataduras inelásticas a mais comumente utilizada é a bota de Unna, que é capaz de formar um molde semi-sólido para a realização da compressão externa (O’MEARA; CULLUM; NELSON, 2009).
debridamento, pois esse tipo de tecido, além de favorecer a ocorrência de infecção, não permite a formação do tecido de granulação. O debridamento pode ser realizado de três formas: autolítico, químico ou mecânico. O primeiro é alcançado com a utilização de curativos oclusivos, pela ação das enzimas presentes no próprio exsudato que permanece em contato com a úlcera. São exemplos desses curativos os hidrogéis e os hidrocolóides. O debridamento químico se faz mediante a aplicação tópica de enzimas, como a colagenase e a papaína. Para o debridamento mecânico são utilizados instrumentos cirúrgicos (ABBADE, LASTÓRIA, 2005; IRION, 2005).
A quantidade de exsudato também deve ser controlada, pois o seu excesso, além de favorecer infecções e maceração da pele perilesional, traz desconforto para o paciente. Por outro lado, a desidratação do leito da úlcera deve ser evitada, pois favorece a formação de tecido desvitalizado. Nas úlceras com excesso de exsudato são indicados curativos compostos por alginatos e hidropolímeros (MANDELBAUM, S; DI SANTIS; MANDELBAUM, M, 2003b).
Para estimular a granulação tecidual da úlcera podem ser utilizados ácidos graxos essenciais (AGE), fatores de crescimento, dentre outros (MANDELBAUM, S; DI SANTIS; MANDELBAUM, M, 2003b). Os medicamentos sistêmicos, pertencentes à classe farmacológica dos flebotônicos, são importantes como terapia adjuvante (MARTINEZ, et al., 2008), enquanto o tratamento cirúrgico tem por finalidade eliminar ou diminuir a hipertensão venosa (ZAMBONI, et al., 2003).
A terapia compressiva pode ser realizada em associação com os produtos anteriormente citados, devendo-se destacar que a escolha do tratamento adequado depende de uma série de fatores como: grau de contaminação da ferida, presença e tipo de exsudato, ocorrência de necrose, recursos financeiros, materiais e humanos disponíveis para o cuidado desse tipo de ferida (COLERIDGE-SMITH, 2009).
Devido à complexidade, os custos inerentes ao tratamento das úlceras venosas são relativamente elevados, estando distante da realidade socioeconômica da maioria da população. Em função dessas variáveis é notória a necessidade de mais estudos com agentes terapêuticos capazes de acelerar o processo de cicatrização.
2.4 IMUNOTERAPIA COM β-GLUCANAS
de ramificações laterais. Estão amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas em uma variedade de organismos como fungos, bactérias, algas e plantas, porém não detectadas em mamíferos (CHEN; SEVIOUR, 2007).
Nos fungos, as β-glucanas são os principais componentes estruturais da parede celular. Estão normalmente ligadas às proteínas, aos lipídios e a outros sacarídeos, como a manana. O papel da glucana no fungo não está completamente elucidado, entretanto, acredita-se que sua principal função é manter a rigidez e integridade da parede celular (SILVA, et al., 2006).
Nos mamíferos, estes biopolímeros podem ser reconhecidos pelo sistema imune como padrões moleculares associados aos patógenos (PAMPs). Receptores para β -glucanas foram primeiramente descritos em monócitos humanos (CZOP; AUSTEN, 1985) e estudos desenvolvidos posteriormente evidenciaram a presença de receptores em uma variedade de leucócitos, incluindo macrófagos, neutrófilos, linfócitos, eosinófilos e células natural killer (células NK), além de células não imunes, como células endoteliais (LOWE, et al., 2002) células do epitélio alveolar e fibroblastos (WEI, et al., 2002). Até o momento, é sugerida a participação dos seguintes receptores no processo de reconhecimento das β-glucanas: dectin-1, receptor de complemento tipo 3 (CR3), lactosilceramida, receptor scavenger e receptores toll-like 2 e 4 (GOODRIDGE; WOLF; UNDERHILL, 2009).
As β-glucanas fazem parte dos agentes modificadores da resposta biológica e atuam no sistema imune do hospedeiro participando intensamente da ativação leucocitária, estimulando a fagocitose, a citotoxicidade e a atividade antimicrobiana, incluindo a produção de intermediários reativos do oxigênio e nitrogênio. Além disso, estimulam a produção de mediadores inflamatórios, citocinas e quimiocinas, como IL-1β, IL-6, IL-8, interleucina 12 (IL-12) e TNF-α (BROWN; GORDON, 2003).
Estudos em animais e no homem têm demonstrado que a terapia com a β -glucana é capaz de alterar a progressão de neoplasias malignas (DI LUZIO, et al., 1979; SALES, 1989; LIU, et al., 2009; WEITBERG, 2009;), de infecções causadas por diversos patógenos, como bactérias (HETLAND, 2000; FREITAS, 2004) e fungos (SATO, et al., 2006), e também do processo de cicatrização de diversos tipos de feridas.
proteína ativadora 1 (AP-1), envolvida na regulação de genes de citocinas imunorregulatórias e a proteína específica 1 (SP-1), que interage com o fator nuclear 1 (NF-1), o qual atua como regulador transcricional do procolágeno humano α1 e α2 (WEI; WILLIAMS; BROWDER, 2002).
A cicatrização de feridas em animais de laboratório tratados com glucana por via tópica demonstrou aumento da proliferação fibroblástica, o que contribuiu para a reepitelização (WOLK; DANON, 1985). A β-(1→3) glucana fosfatada foi administrada por via intravenosa em animais submetidos a anastomose do cólon e incisão total da pele. Neste estudo foi observado que nos grupos tratados com a glucana, houve aumento da força de tensão das feridas, indicando uma correlação positiva entre tratamento com glucana, força tênsil e biossíntese de colágeno (PORTERA; LOVE; MEMORE, 1997).
A β-(1→3) glucana aminada foi capaz de estimular a cicatrização de feridas cutâneas induzidas em camundongos diabéticos quando aplicada por via tópica (BERDAL et al., 2007). Em modelo de anastomose colônica em ratos, verificou-se que os animais tratados com β-(1→3) glucana por via oral apresentaram aumento significativo no número de macrófagos e fibroblastos (DINC, et al., 2006). Na pesquisa desenvolvida por Lee et al. (2003), pele artificial obtida a partir de cultura de fibroblastos e queratinócitos em meio contendo β-(1→3), (1→6) glucana e gelatina foi utilizada em feridas induzidas experimentalmente em camundongos atímicos, verificando-se que a glucana foi capaz de promover o aumento da reepitelização.
3 OBJETIVOS_________________________________________________________
3.1 OBJETIVO GERAL
Verificar se a glucana insolúvel, por via tópica, atua no processo de cicatrização de úlceras venosas em humanos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
* Caracterizar quimicamente a glucana insolúvel obtida a partir do
Saccharomyces cerevisiae;
* Avaliar a resposta inflamatória nas úlceras tratadas com a glucana por via tópica;
* Investigar angiogênese, proliferação fibroblástica e produção de colágeno nas referidas úlceras;
* Averiguar alterações hematológicas, hepáticas e renais em função da aplicação da glucana por via tópica.
4 CASUÍSTICA E METODOLOGIA______________________________________
4.1 DELINEAMENTO DA PESQUISA
A pesquisa seguiu o modelo de um ensaio clínico não-randomizado intragrupo, no qual para a avaliação do efeito do tratamento cada participante serviu como seu próprio controle (HULLEY, S. B et al, 2003). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL/UFRN) sob nº de protocolo 147/07 (ANEXO 1), respeitando-se o Capítulo III da Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde (CNS) sobre as Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisa Envolvendo Seres Humanos.
O grupo de estudo foi constituído por pacientes atendidos no Ambulatório de Angiologia e Cirurgia Vascular do HUOL/UFRN. Antes das intervenções, os mesmos receberam orientações acerca do objetivo da pesquisa e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (APÊNDICE 1).
Para ser incluído no estudo, o paciente deveria ter idade compreendida entre 18 e 75 anos, não havendo restrição quanto ao sexo, e apresentar pelo menos uma úlcera venosa por no mínimo dois meses. Foram excluídos os pacientes com transtornos psiquiátricos, sinais clínicos de comprometimento arterial no membro inferior, neoplasia, doença auto-imune, insuficiência renal, cardíaca ou hepática.
Os pacientes incluídos na pesquisa foram submetidos à avaliação clínica pelo cirurgião vascular pertencente à equipe. Para tanto, foi elaborado um instrumento de avaliação do portador de úlcera venosa (APÊNDICE 2), de acordo com as Diretrizes da Sociedade Brasileira de Angiologia e Cirurgia Vascular – SBAVC (AGUIAR et al., 2005).
4.2 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA GLUCANA
A concentração de açúcares totais foi determinada pelo método de Dubois et al (1956), tendo como padrão a D-glicose. A concentração total de proteínas foi mensurada pelo método de Bradford (SPECTOR, 1978) utilizando-se a albumina sérica bovina (BSA) como padrão e a concentração de compostos fenólicos foi obtida pelo método colorimétrico Folin-Ciocalteu adotando-se como padrão o ácido gálico (COSTA et al., 2010). Os polímeros foram hidrolisados (5 M TCA, 100ºC, 2 h) e a composição de açúcar foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (Merck Hitachi Elite LaChrom®) em coluna LichroCART®250-4. Arabinose, galactose, glicose, fucose, manose, ramnose e xilose foram utilizadas como referência. Os ensaios acima descritos foram realizados no Laboratório de Biopolímeros, Departamento de Bioquímica do Centro de Biociências/UFRN.
Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de 13C e 1H (1D e 2D) foram obtidos em espectrômetro Bruker Avance DRX 400 MHz no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Paraná. Glucana (50 mg) foi dissolvida em 800 µ L de ácido dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6) e as amostras foram analisadas à temperatura de 70 °C.
4.3 FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA
A glucana foi dispersa na concentração de 3% em um creme contendo crodabase CR-2 (Croda®, Campinas), de acordo com a formulação abaixo descrita:
Crodabase CR-2--- 25% Nipazol--- 0,05% Nipagin--- 0,15% Glicerina--- 5,175% Água destilada---qsp--- 100g
4.4 APLICAÇÃO DA GLUCANA
de crepom (ABBADE; LASTÓRIA, 2005). Este procedimento foi realizado diariamente por um período de no mínimo dois meses (FRADE, 2003).
4.5 REGISTRO FOTOGRÁFICO E MENSURAÇÃO DA ÁREA DA ÚLCERA A evolução do processo de cicatrização foi acompanhada pelo registro fotográfico e pela mensuração da área da úlcera. Este procedimento foi realizado semanalmente no Ambulatório de Angiologia e Cirurgia Vascular do HUOL/UFRN, dispondo-se, para o primeiro, de câmera digital Sony DSC- W35 e, para o segundo, do contorno do perímetro da úlcera sobre uma folha plástica estéril, sendo a figura obtida analisada pelo software AutoCAD 2008®.
4.6 BIÓPSIA CUTÂNEA
Para a avaliação histopatológica das úlceras em estudo, foram realizadas, em cada paciente, duas biópsias cutâneas. A primeira foi efetuada no pré-tratamento (dia 0) e a segunda no trigésimo dia de tratamento (dia 30). Para executar este procedimento, limpou-se a úlcera com solução de cloreto de sódio 0,9%, em seguida foi aplicada anestesia local (xilocaína 2% com epinefrina) e realizada biópsia incisional em elipse com auxílio de lâmina de bisturi nº 15, contemplando a área ulcerada e a borda da lesão (a média dos fragmentos excisados foi de 1,0 x 0,5 x 0,5 cm). Imediatamente após a biópsia, a glucana foi administrada. O procedimento acima descrito ocorreu no Centro Cirúrgico do HUOL por cirurgião pertencente à equipe. O fragmento excisado, embora elíptico, não causou dano significativo ao paciente e permitiu analisar e comparar a área ulcerada e a borda da lesão. O material obtido foi fixado em formaldeído a 10%, por 24 horas, e encaminhado ao Laboratório de Anatomia Patológica, Departamento de Patologia/UFRN.
4.7 PROCESSAMENTO E COLORAÇÕES HISTOLÓGICAS
foi corado pela hematoxilina-eosina (HE) para evidenciação da estrutura cutânea e seus componentes celulares e teciduais; o segundo pelo tricrômico de Masson e o terceiro pelo picrosirius red, ambos com a finalidade de identificação das fibras de colágeno. Tanto a coloração por HE quanto as histoquímicas obedeceram a padrões estabelecidos no Laboratório de Anatomia Patológica, Departamento de Patologia/UFRN (APÊNDICE 3).
4.8 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA
A avaliação histopatológica foi realizada por médico patologista pertencente à equipe, com auxílio de microscópio óptico binocular Olympus CX31 acoplado a câmera digital Olympus C-5060, de acordo com o descrito abaixo (FRADE, 2003):
4.8.1 Análise Qualitativa
Foram avaliados os seguintes parâmetros:
a) Padrão da Epiderme: Identificação da presença de hiperplasia epitelial ou de atrofia.
b) Necrose: Presença ou ausência de necrose tecidual.
c) Processo Inflamatório: Presença ou ausência de processo inflamatório. d) Angiogênese: Presença ou ausência de neoformação vascular.
e) Fibrose Colagênica: Verificação ou não do aumento das fibras de colágeno. f) Proliferação Fibroblástica: Verificação ou não do aumento do número de fibroblastos.
4.8.2 Análise Semiquantitaiva
O estudo semiquantitativo avaliou, pelo sistema de cruzes, os parâmetros determinados na observação qualitativa, com exceção do padrão da epiderme.
NECROSE
+ Necrose no 1/3 superior da derme ++ Necrose em toda a derme
+++ Necrose até o tecido subcutâneo
O processo inflamatório e a angiogênese foram analisados em função da coloração por HE, enquanto que, para o estudo da fibrose colagênica e da proliferação fibroblástica, foram consideradas as três colorações.
O processo inflamatório foi avaliado com relação ao grau de comprometimento do espécime, adotando-se:
PROCESSO INFLAMATÓRIO + Inflamação no 1/3 superior da derme ++ Inflamação em 2/3 do espécime +++ Inflamação em todo o espécime
A angiogênese foi determinada levando-se em consideração o calibre dos vasos e a disposição dos mesmos no espécime. Isso possibilitou a seguinte identificação:
ANGIOGÊNESE
+ Presença de vasos capilares de paredes finas, com uma ou duas células endoteliais, localizados na derme superficial da área ulcerada e nas margens da úlcera
++ Presença de vasos capilares com uma espessura duas vezes maior que o anterior; endotélio tumefeito e neovascularização estendendo-se até 2/3 do espécime
+++ Vasos de paredes espessas, bem constituídos, endotélio tumefeito, presente em todo o espécime
Na fibrose colagênica, considerou-se a presença, espessura e distribuição das fibras de colágeno no espécime, atribuindo-se:
FIBROSE COLAGÊNICA + Fibras colágenas delicadas e ocasionais
A proliferação fibroblástica foi avaliada obedecendo-se os seguintes aspectos:
PROLIFERAÇÃO FIBROBLÁSTICA
+ Ocasionais fibroblastos. Predomínio das alterações inflamatórias celulares agudas
++ Fibroblastos e células inflamatórias em igual proporção +++ Predomínio fibroblástico em todo o espécime
4.8.3 Análise Quantitativa
A análise histomorfométrica das células inflamatórias: neutrófilos, linfócitos e plasmócitos foi realizada a partir da contagem de sete campos de grande aumento por espécime (aumento 400X). O número de células em cada campo foi contado e a média dos campos foi calculada.
4.9 AVALIAÇÕES HEMATOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS
Para averiguar possíveis alterações hematológicas, hepáticas e renais em função da aplicação da glucana por via tópica, os pacientes foram submetidos a coletas de 15 mL de sangue por punção venosa. Foram realizadas duas coletas: a primeira antes de iniciada a terapia com glucana e a segunda no trigésimo dia de tratamento. A avaliação laboratorial consistiu dos seguintes exames: hemograma, velocidade de sedimentação das hemácias (VSH), glicemia de jejum, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), gamaglutamiltransferase (GGT), proteínas totais, albumina, uréia e creatinina. Os exames foram realizados no Laboratório Integrado de Análises Clínicas (LIAC) da Faculdade de Farmácia/UFRN.
4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA
7 CONCLUSÃO________________________________________________________
- Uma homoglucana linear insolúvel com ligações glicosídicas do tipo β-(1→3) foi isolada partir do Saccharomyces cerevisiae;
- Foi observado ativação da resposta inflamatória cicatricial com aumento do número de neutrófilos, linfócitos e plasmócitos, sendo estatisticamente significativo o aumento do número de plasmócitos;
- As modificações histológicas evidenciadas na angiogênese e na fibrose colagênica estavam relacionadas com as distintas fases do processo de cicatrização;
- Foi verificado aumento da proliferação de fibroblastos após tratamento com a β-(1→3) glucana;
- Não foram observadas, por intermédio da avaliação laboratorial realizada, alterações hematológicas, hepáticas e renais decorrentes da aplicação da β-(1→3) glucana insolúvel por via tópica;
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VALENCIA, I. C. et al. Chronic venous insufficiency and venous leg ulceration. Journal of The American Academy of Dermatology, v. 44, n. 3, p. 401-421, 2001. WEI, D.; WILLIAMS, D.; BROWDER, W. Activation of AP-1 and SP-1 correlates with wound growth factor gene expression in glucan-treated human fibroblasts. International Immunopharmacology, v. 2, n. 8, p. 1163-1172, 2002.
WEITBERG, A. B. A phase I/II trial of beta-(1,3)/(1,6) D-glucan in the treatment of patients with advanced malignancies receiving chemotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, v. 27, n. 40, p. 1-4, 2009.
WERNER, S.; GROSE, R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiological Reviews, v. 83, n. 3, p. 835-870, 2003.
WOLK, M.; DANON, D. Promotion of wound healing by yeast glucan evaluated on single animals. Medical Biology, v. 63, n. 2, p. 73-80, 1985.
APÊNDICE 1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Este é um convite para você participar da pesquisa intitulada “Imunoterapia de Feridas Complexas com ββββ-1,3 Glucana”, coordenada pela Profa. Dra. Valéria Soraya de Farias Sales tendo a participação da farmacêutica-bioquímica e mestranda Sarah Dantas Viana Medeiros.
Sua participação na pesquisa é voluntária, o que significa que você poderá desistir a qualquer momento, retirando seu consentimento, sem que isso lhe traga nenhum prejuízo ou penalidade.
Essa pesquisa tem por objetivo estudar a ação de uma substância denominada glucana por via tópica (local) nas feridas de sua pele, visto que ela poderá auxiliar no processo de cicatrização do seu ferimento. Caso decida aceitar o convite, você será submetido (a) aos seguintes procedimentos:
1) Coleta de sangue em veia periférica no braço ou antebraço por profissionais experientes, com auxílio de seringa e agulha descartáveis. Antes da coleta será realizada anti-sepsia (limpeza) no local da punção com álcool a 70% e algodão. O sangue será coletado rapidamente até o volume de 10 mL e o desconforto da coleta será mínimo. Eventualmente uma pequena mancha roxa pode se formar no local da punção. O sangue coletado será utilizado para realização de exames hematológicos (hemograma e VSH), bioquímicos (dosagem de glicose, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase, gamaglutamiltransferase, uréia, creatinina, proteínas totais e albumina) e que lhe serão entregues depois de realizados. Essas coletas serão necessárias antes de iniciar a terapia proposta e no trigésimo dia do seguimento terapêutico.
3) Semanalmente a (s) feridas (s) serão fotografadas e com auxílio de uma folha plástica estéril e lápis para retroprojetor, serão contornadas.
Os riscos envolvidos com sua participação são: mancha roxa (hematoma) no local da coleta de sangue (punção), pequeno sangramento quando da realização da retirada do fragmento da ferida (biópsia) e prurido (coceira). Tais riscos serão minimizados através das seguintes providências: compressão e curativo no local de retirada do fragmento e, se necessário, uso de anti-histamínico para a coceira.
Você terá os seguintes benefícios ao participar da pesquisa: possibilidade de utilização de uma nova terapia para auxiliar no processo de cicatrização da sua ferida. Todas as informações obtidas serão sigilosas e seu nome não será identificado em nenhum momento. Os dados serão guardados em local seguro e a divulgação dos resultados será feita de forma a não identificar os voluntários.
Não há despesas pessoais para o participante em qualquer fase do estudo. Também não há compensação financeira relacionada com a sua participação. Em caso de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos propostos neste estudo (nexo causal comprovado), você tem direito a tratamento médico na instituição, bem como às indenizações legalmente estabelecidas.
Você ficará com uma cópia deste Termo e toda a dúvida que você tiver a respeito desta pesquisa, poderá perguntar diretamente para o responsável Profa. Dra. Valéria Soraya de Farias Sales ou à mestranda Sarah Dantas Viana Medeiros, no endereço: Rua Gal. Gustavo Cordeiro de Farias S/N Petrópolis – Natal/RN (2º andar da Faculadade de Farmácia – Laboratório de Imunologia Clínica) ou pelo telefone: 3215-4230.
Dúvidas a respeito da ética dessa pesquisa poderão ser questionadas ao Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (CEP/HUOL) no endereço: Av. Nilo Peçanha, 620 – Petrópolis – Natal /RN ou pelo telefone: 3202-3719. E-mail: cep_huol@yahoo.com.br
Consentimento Livre e Esclarecido
Participante da Pesquisa:
Nome: _____________________________________________________________
Assinatura: _________________________________________________________
Pesquisador Responsável: Valéria Soraya de Farias Sales
Assinatura: __________________________________________
Endereço Profissional: Rua Gal. Gustavo Cordeiro de Farias S/N Petrópolis – Natal/RN (2º andar da Faculadade de Farmácia – Laboratório de Imunologia Clínica).
Telefone: 3215-4230
Mestranda: Sarah Dantas Viana Medeiros
Assinatura: _____________________________________________
Comitê de Ética em Pesquisa – CEP/HUOL
Endereço: Av. Nilo Peçanha, 620 – Petrópolis – Natal /RN Telefone: 3202-3719 ramal: 242
APÊNDICE 2
INSTRUMENTO DE AVALIAÇÃO DO PORTADOR DE ÚLCERA VENOSA
DATA _____/_____/_____
IDENTIFICAÇÃO E PERFIL SÓCIO-ECONÔMICO
Nome: ... Nº Registro: ...
Sexo: ... Data de Nascimento: .../.../... Estado Civil: ... Nº de Filhos: ... Religião: ... Naturalidade: ... Escolaridade: ... Profissão: ... Vínculo Empregatício: ... Ocupação Atual: ... Renda Familiar: ...
HÁBITOS PESSOAIS
Etilismo: ( ) Nunca Bebeu ( ) Parou de Beber Há quanto tempo? ( ) Sim, Tempo?
Tabagismo: ( ) Não ( ) Sim Nº de cigarros/dia: _______ Tempo de tabagismo:
EXAME GERAL
Antecedentes Pessoais Patológicos
Diabetes Mellitus:_______ anos Hipertensão Arterial: ________ anos Outras Doenças: ... Medicamentos em Uso (Indicação/Duração do Tratamento/Posologia):
______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
Exames Laboratoriais Anteriores (Tipo/Resultado):
EXAME DA FERIDA
Tipo da Ferida: _____________________ Tempo de Existência: ______________ Trauma Prévio: _________________ Número de Lesões: _______________ Recidiva: ( ) Não ( ) Sim, Quantas Vezes: __________
Tempo Aproximado de Cicatrização: __________________ Localização: ____________________________________
Leito da Ferida: ( ) Necrose ( ) Granulação ( ) Epitelização Pele Circunvizinha: ( ) Saudável ( ) Bolhoso ( ) Ressecado ( ) Macerado ( ) Necrose ( ) Calor e rubor
Presença de Exsudato: ( ) Não ( ) Sim Tipo de Exsudato: ( ) Seroso ( ) Sero-sanguinolento ( ) Sanguinolento ( ) Purulento Odor: ( ) Ausente ( ) Discreto ( ) Acentuado
Dor: ( ) Ausente ( ) Leve ( ) Moderada ( ) Intensa Sinais de Infecção: ( ) Calor ( ) Eritema ( ) Edema ( ) Dor
( ) Pus ( ) Linfadenopatia ( ) Linfagite Sinais e Sintomas Locais
( ) Hiperpigmentação ( ) Claudicação
( ) Lipodermatosclerose ( ) Ausência de Pelos ( ) Edema ( ) Cianose ( ) Varizes ( ) Anidrose ( ) Rachaduras ( ) Sinais de Eczema ( ) Diminuição da Sensibilidade
( ) Deformidades ( ) Prurido ( ) Rubor à elevação
( ) Tegumento atrófico ( ) Palidez à elevação ( ) Dor ao descanço ( ) Ausência de pulso Outros: ...
APÊNDICE 3
COLORAÇÕES HISTOLÓGICAS
HEMATOXILINA/EOSINA 1- Desparafinizar – Xilol – 03 cubas - 05 minutos cada
2- Alcoolizar – Álcool Etílico absoluto – 04 cubas - 02 minutos cada 3- Hidratar – Água Corrente – 03 minutos
4- Hematoxilina – 05 a 10 minutos 5- Água Corrente - 02 minutos
6- Diferenciar com Álcool Ácido e Lavar em Água Corrente 7- Solução Saturada de Carbonato de Lítio - 03 mergulhos 8- Lavar em Água Corrente
9- Eosina – 05 minutos
10- Desidratar – Álcool Etílico Absoluto – 4 cubas – 10 mergulhos 11- Xilol, Clarificar – 03 Cubas - 10 mergulhos
12- Montar – Lamínula e Bálsamo do Canadá.
RESULTADOS:
Núcleo: Coloração Azul
Citoplasma, Fibras Colágenas, Elásticas e Neurofibrilas : Coloração Rosa a Vermelho Hemácias: Coloração Vermelho
Fundo: Coloração Rosa Pálido
MÉTODO TRICRÔMICO DE MASSON TECIDO CONJUNTIVO
FIXADOR: FORMALINA NEUTRA 10% CORTES: PARAFINA
PROCEDIMENTO TÉCNICO 1-Desparafinizar e hidratar, 2-Lavar com água destilada,
4-Lavar em água corrente por 10 minutos e lavar em água destilada, 5-Solução de fuccina ácida – Escarlate Briebrich - 10 minutos, 6-Lavar em água destilada,
7-Solução de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico - 10 minutos 8-Lavar em água destilada,
9-Solução de azul de anilina - 5 minutos, 10- Lavar em água destilada,
11-Solução de ácido acético 1% - 3 minutos, 12- Lavar em água corrente,
13-Desidratar, clarear e montar.
RESULTADOS:
NÚCLEO... negro
MÚSCULO, CITOPLASMA E QUERATINA...vermelho COLÁGENO...azul
MÉTODO PICROSIRUIS RED
PROCEDIMENTO TÉCNICO 1-Desparafinizar e hidratar, 2-Solução picrosirius – 1 hora,
3- Lavar em água corrente por 5 minutos, 4-Hematoxilina – 1 minuto,
5- Lavar em água corrente por 10 minutos, 6-Desidratar, clarear e montar.
RESULTADOS:
