UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA CÂMPUS DE ARAÇATUBA
ESTRESSE OXIDATIVO NA LEISHMANIOSE
VISCERAL CANINA
Breno Fernando Martins de Almeida
Médico Veterinário
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA CÂMPUS DE ARAÇATUBA
ESTRESSE OXIDATIVO NA LEISHMANIOSE
VISCERAL CANINA
Breno Fernando Martins de Almeida
Orientador: Prof. Dr. Paulo César Ciarlini
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária – Unesp, Campus de Araçatuba, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal (Fisiopatologia Médica e Cirúrgica).
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da FMVA / UNESP
Almeida, Breno Fernando Martins de.
A447e Estresse oxidativo na leishmaniose visceral canina / Breno Fernando Martins de Almeida. Araçatuba : [s.n.], 2013.
76 f. : il.; tab. + 1 CD-ROM
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba.
Orientador: Prof. Dr. Paulo César Ciarlini.
1. Estresse oxidativo. 2. Neutrófilos. 3. Superóxido. 4. Leishmaniose.
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
BRENO FERNANDO MARTINS DE ALMEIDA – Natural de Ituiutaba, Minas Gerais, nascido em 13 de julho de 1985, filho de Dania Martins Ferreira de Almeida e Wilson Fernando de Almeida. Em 2003, ingressou no curso de Medicina Veterinária da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia (EMVZ) da Universidade Federal do Tocantins (UFT), onde se graduou como Médico Veterinário em setembro de 2008 com Trabalho de Conclusão de Curso
intitulado “Laboratório Clínico Veterinário” sob orientação do Prof. Dr. Marlos
“Imagination is more important than knowledge.
Knowledge is limited.
Imagination encircles the world.”
Aos meus pais, Dania e Wilson, por todo o apoio e incentivo dedicados aos meus estudos e por sempre acreditarem na minha capacidade.
AGRADECIMENTOS
A Deus por todas as oportunidades conseguidas, sempre iluminando e guiando meus passos.
À minha família por todo carinho, empenho, apoio e compreensão dedicados. Sem vocês nada disso seria possível, agradeço profundamente à minha mãe Dania Martins, ao meu pai Wilson Fernando, ao meu irmão Bruno Fernando e à minha avó Dirce Dias.
Ao meu orientador Prof. Adjunto Paulo César Ciarlini por todo o conhecimento transmitido, desde o estágio no Laboratório Clínico, passando pela residência e chegando ao mestrado. Espero que também possa se perpetuar no doutorado.
À Maria Fernanda Cereijido Bersani Fink por todo amor e carinho compartilhados, tanto nos momentos fáceis quanto difíceis. A você minha eterna gratidão.
Aos meus amigos de Minas Gerais, em especial meus primos Ricardo e Henrique pelos momentos de alegria que compartilhamos juntos.
Aos meus amigos do Tocantins, em especial Ronaldo Júnior, Eduardo Assis, Eduardo Queiroz, Thiago José, Bruno Santos, Ricardo Cabús, Mônica Priscila, Montserrat Rodrigues, Ronaldo Queiroz e Edna Cabús (Juju). Sem a amizade de vocês eu nada seria e não conseguiria força para alcançar todos os meus objetivos.
Aos residentes do Hospital Veterinário Luiz Quintiliano de Oliveira da área de Clínica Médica, em especial Flávia Volpato e Karina Yukie, e do Laboratório Clínico Veterinário, em especial Acácio Lustosa, Aline Leal, Daniele Gonçalves e Thaísa Tosta. Muito obrigado por contribuírem significativamente na seleção dos animais renais do estudo.
Aos grandes amigos do Laboratório Clínico Veterinário do Departamento de Clínica, Cirurgia e Reprodução Animal, em especial Laine Gabas, Priscila Preve, Luis Gustavo, Anelise Bosco, Kelly Vendrame e Jucilene Souza. Sem vocês a realização desse trabalho não seria possível, muito obrigado por contribuírem tão significativamente.
Às professoras Valéria Marçal Félix de Lima e Suely Regina Mogami Bomfim por todo o auxílio na execução desse projeto de pesquisa, bem como pelo fundamental apoio na avaliação do Exame Geral de Qualificação. Ainda pela tão estimada disposição a ajudar no que fosse preciso.
Aos funcionários do Centro de Controle de Zoonoses de Araçatuba, em especial o Médico Veterinário Saulo Avanço e aos funcionários Ocilane, Valério e Moisés por todo empenho e auxílio dedicados durante a seleção dos animais.
À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pela concessão da bolsa de mestrado durante o primeiro ano do curso.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa auxílio de mestrado concedida (Proc. 2011/14083-0).
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Faculdade de Medicina
Veterinária de Araçatuba da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, pela oportunidade oferecida para a realização do curso de Mestrado.
Aos proprietários dos cães saudáveis do grupo controle e dos cães portadores de doença renal crônica por autorizarem a colheita de sangue e inclusão dos animais no experimento.
Aos cães, objeto de estudo do presente trabalho.
Enfim, a todos que direta ou indiretamente contribuíram na execução dessa pesquisa, sem vocês nada disso seria possível!
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS...13
1 Contextualização do problema...13
2 Objetivos...13
3 Pesquisa bibliográfica...13
4 Neutrófilos: função na imunidade inata e relação com o estresse oxidativo...15
5 A relação da leishmaniose visceral com a função neutrofílica e o estresse oxidativo...18
6 Relação entre a uremia, o estresse oxidativo e o metabolismo oxidativo e apoptose de neutrófilos...21
REFERÊNCIAS...24
CAPÍTULO 2 - A LEISHMANIOSE CAUSA ESTRESSE OXIDATIVO, ALTERAÇÃO DO METABOLISMO OXIDATIVO E VIABILIDADE DE NEUTRÓFILOS DE CÃES...35
1 Introdução...36
2 Material e Métodos...38
2.1 Seleção dos animais...38
2.2 Colheita das amostras e análises laboratoriais...40
2.3 Isolamento dos neutrófilos...41
2.4 Avaliação do metabolismo oxidativo neutrofílico...42
2.5 Avaliação da viabilidade e taxa de apoptose neutrofílica...42
3 Resultados e Discussão...43
3.1 A produção de superóxido dos neutrófilos ativados de cães com leishmaniose visceral aumenta independentemente da condição urêmica...43
3.2 Cães com leishmaniose sofrem estresse oxidativo independente do estágio da doença...46
3.3 A uremia causa estresse oxidativo e maior peroxidação lipídica...47
3.4 A leishmaniose predispõe os neutrófilos à apoptose...48
3.5 A uremia diminui a viabilidade e aumenta a apoptose espontânea de neutrófilos caninos...48
4 Conclusão...49
REFERÊNCIAS...49
CAPÍTULO 3 - A DISFUNÇÃO NEUTROFÍLICA VARIA COM O ESTÁGIO DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA...58
1 Introdução...59
2 Material e Métodos...61
3 Resultados e Discussão...64
4 Conclusão...70
5 Agradecimentos...70
ESTRESSE OXIDATIVO NA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA
RESUMO – O estresse oxidativo ocorre quando há desequilíbrio entre as defesas antioxidantes e os agentes oxidantes no organismo. Considerando que cães com leishmaniose visceral podem desenvolver uremia, o que afeta o metabolismo oxidativo e a apoptose dos neutrófilos, propusemos investigar a hipótese de que o estresse oxidativo, a alteração do metabolismo oxidativo e da apoptose dos neutrófilos de cães variam com o estágio da doença e que a instalação do quadro de uremia contribui para esta variação. Para tal, foram avaliados marcadores plasmáticos de estresse oxidativo (capacidade antioxidante total, peroxidação lipídica, glutationa, ácido úrico, bilirrubina e albumina), a produção de superóxido (método de redução do tetrazólio nitroazul e citometria de fluxo com a sonda hidroetidina), viabilidade e taxa de apoptose (método morfológico e citometria de fluxo utilizando o sistema anexina V-PE) de neutrófilos de cães com leishmaniose classificados de acordo com o LeishVet Consensus em estágio moderado da doença, estágio muito severo quando a uremia está instalada e de cães com uremia sem leishmaniose, comparando-os a cães saudáveis. A leishmaniose, independentemente do estágio, e a uremia causam estresse oxidativo levando à redução da capacidade antioxidante total, que pode estar relacionado à maior produção de superóxido e maior apoptose induzida observada nesses grupos. Espontaneamente, neutrófilos de cães com leishmaniose muito severa e com uremia possuem menor viabilidade, maior apoptose e maior peroxidação lipídica, sugerindo que a uremia seja a causa de tais alterações. Conclui-se que ocorre estresse oxidativo independente do estágio da leishmaniose, entretanto a condição urêmica contribui para diminuição da viabilidade dos neutrófilos em cães no estágio final da doença. As alterações do metabolismo oxidativo dos neutrófilos ocorrem concomitante ao estresse oxidativo e maior apoptose neutrofílica tanto na leishmaniose quanto na uremia isoladamente.
OXIDATIVE STRESS IN CANINE VISCERAL LEISHMANIASIS
SUMMARY – Oxidative stress occurs due to an imbalance between oxidants and antioxidant defenses. Considering that dogs with leishmaniasis may develop uremia, which affects the oxidative metabolism and apoptosis of neutrophils, we proposed to investigate the hypothesis that oxidative stress, alteration of oxidative metabolism and apoptosis of neutrophils in dogs varies according to stage of leishmaniasis and that uremia, commonly occurs in late stages of disease, would contribute to such variations. To this, we evaluated plasma markers of oxidative stress (total antioxidant capacity, lipid peroxidation, glutathione, uric acid, bilirubin and albumin), superoxide production (method of nitroblue tetrazolium reduction and flow cytometry with the probe hydroethidine), and viability and apoptosis rate (morphological method and flow cytometry using annexin V-PE system) on neutrophils from dogs with leishmaniasis classified according to the LeishVet Consensus in moderate stage of the disease, very severe stage when uremia is installed and dogs with uremia negative for leishmaniasis, comparing them to healthy dogs. Leishmaniasis regardless of stage and uremia cause oxidative stress with reduced total antioxidant capacity, which may be related to greater induced production of superoxide and stimulated apoptosis observed in these groups. While spontaneously, neutrophils of dogs in very severe stage and with uremia had lower viability, increased apoptosis and higher lipid peroxidation, suggesting that uremia is the cause of such changes. Can be concluded that the intensity of oxidative stress does not vary with the stage of leishmaniasis, however uremic condition contributes to reduce the viability of neutrophils in late-stage dogs. Changes of neutrophil oxidative metabolism occur concomitant with oxidative stress and increased neutrophil apoptosis in both leishmaniasis and in uremia alone.
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
1 Contextualização do problema
É conhecida a disfunção que a leishmaniose visceral causa em neutrófilos, tanto no estabelecimento quando em estágios mais avançados da infecção, alterando de forma significativa o metabolismo oxidativo dessas células. Os neutrófilos são “fagócitos profissionais” com grande capacidade de produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e que quando estimulados em excesso, como o que pode ocorrer em alguns estágios da leishmaniose, podem contribuir para o estresse oxidativo. O estresse oxidativo, por sua vez, pode causar apoptose prematura dos neutrófilos, o que pode levar os animais à imunodeficiência, tendo em vista que neutrófilos em apoptose têm sua função diminuída. Entretanto, a uremia, condição que ocorre nos estágios mais avançados da leishmaniose devido à doença renal crônica (DRC), também causa estresse oxidativo e altera a função neutrofílica, alterando o metabolismo oxidativo e aumentando a apoptose de neutrófilos, conforme já demonstrado em estudos humanos.
2 Objetivos
Testar a hipótese de que a leishmaniose causa estresse oxidativo de forma dependente do estágio da doença.
Testar a hipótese de que a leishmaniose causa alteração da produção de superóxido e das taxas de viabilidade e apoptose de neutrófilos de cães infectados de forma dependente do estágio da doença.
3 Pesquisa bibliográfica
dados eletrônicos: Portal da Pesquisa, Web Science, Scielo e Science Direct, Bireme e Athena.
As perguntas para a realização da revisão foram estruturadas com três elementos conceituados na Medicina Baseada em Evidências, conforme preconizado por Castro (2001):
Pergunta 1: Situação: status antioxidante; Intervenção: leishmaniose; Desfecho: estresse oxidativo. Tal pergunta gerou a seguinte estratégia para busca na base de dados da Pubmed: “((((leishmaniasis) AND antioxidant status) AND oxidative stress) AND dog)”. A busca resultou em três trabalhos, sendo dois deles selecionados por atenderem aos objetivos propostos (BILDIK et al., 2004; HEIDARPOUR et al., 2012).
Pergunta 2: Situação: neutrófilo; Intervenção: leishmaniose; Desfecho: metabolismo oxidativo. Tal pergunta gerou a seguinte estratégia para busca na base de dados da Pubmed: “((((((((oxidative burst) OR nbt) OR chemiluminescence) OR reactive oxygen species) OR superoxide)) AND (((((phagocyte) OR neutrophil) OR pmn) OR polymorphonuclear)) AND leishmaniasis) AND dog)”. A busca resultou em dez trabalhos, sendo quatro deles selecionados por atenderem aos objetivos propostos (BRANDONISIO et al., 1996; GÓMEZ-OCHOA et al., 2010; PALTRINIERI et al., 2010; VUOTTO et al., 2000). Outro trabalho do banco de dados do Grupo de Pesquisa relacionado ao tema foi acrescentado (CIARLINI et al., 2010).
Pergunta 3: Situação: neutrófilo; Intervenção: leishmaniose; Desfecho: apoptose. Tal pergunta gerou a seguinte estratégia para busca na base de
dados da Pubmed: “((((leishmaniasis) AND dog) AND neutrophil) AND apoptosis)”. A busca resultou em um trabalho que não foi selecionado por não atender ao objetivo proposto, ressaltando a ausência de pesquisas relacionadas ao tema.
e sem limite de tempo para a espécie canina. Não foi utilizado limite de busca quanto ao idioma. O período da pesquisa bibliográfica se estendeu até o dia 05/12/2012.
4 Neutrófilos: função na imunidade inata e relação com o estresse oxidativo
Os neutrófilos são células polimorfonucleares (PMN) componentes chave da imunidade inata. As primeiras evidências da função dos fagócitos na imunidade datam do século 19, quando Metchinikoff (1883) observou a presença de células ao redor de espinhos que ele havia utilizado para perfurar larvas de estrelas do mar. Ele sugeriu que tais células de alguma maneira estavam envolvidas na defesa da larva contra os danos causados pelo espinho.
Posteriormente, Sbarra e Karnovsky (1959) começaram a entender melhor a relação entre os fagócitos e o estresse oxidativo, explicando a relação entre o maior consumo de oxigênio da célula e o metabolismo oxidativo. Muitas outras pesquisas surgiram buscando entender a função dos neutrófilos na imunidade, foi quando Babior et al. (1973) estabeleceram a relação entre a produção de superóxido pela célula e sua importância na destruição de micro-organismos invasores.
Atualmente já se sabe que os neutrófilos são as primeiras células efetoras na imunidade inata de mamíferos (HOSTETTER, 2012). São células com grande mobilidade rapidamente atraídas ao sítio de inflamação, lesão ou infecção por meio de mediadores químicos como quimiocinas, citocinas e outros mediadores inflamatórios (BORREGAARD et al., 2007).
Além da função fundamental de destruição do agente infeccioso, tem sido evidenciado que os neutrófilos serviriam como uma ligação entre as imunidades inata e adquirida, além da efetividade na resolução da inflamação (HAGER et al., 2010; NATHAN, 2006).
Uma vez recrutados por mediadores químicos, os neutrófilos podem ser ativados para maior produção de ERO e destruição do agente infeccioso (HOSTETTER, 2012). Entretanto, o primeiro passo do processo envolve o
priming dessas células. Sabe-se que os neutrófilos quiescentes circulantes atingem o estado primed quando sensibilizados por um mediador químico e que, na presença de um segundo estímulo, essas células se tornam ativadas, processo necessário para completa funcionalidade celular (SWAIN et al., 2002).
Depois de devida ativação e chegada ao sítio de infecção, os neutrófilos estão aptos à destruição do agente invasor após fagocitose ou geração de NETs (neutrophil extracellular traps) (HOSTETTER, 2012). A fagocitose é um processo ativo no qual o agente invasor é englobado pela célula, que pode requerer ou não prévia opsonização para facilitar o processo (HOSTETTER, 2012). Durante a fagocitose ocorre a fusão dos grânulos celulares com o fagossomo, garantindo então a ativação da NADPH oxidase, enzima fundamental ao metabolismo oxidativo (NORDENFELT; TAPPER, 2011). A função primordial da NADPH oxidase é formar superóxido e liberá-lo no fagolisossomo. Então o superóxido se combina com outras moléculas, como o peróxido de hidrogênio, para produzir mais ERO, que na presença de proteases tem forte ação microbicida (SEGAL, 2005).
A formação de NETs pelos neutrófilos é um mecanismo microbicida só descoberto recentemente, em que as células ativadas criam estruturas extracelulares compostas por proteínas granulares e histonas num esqueleto de DNA que aprisiona e mata o micro-organismo (BRINKMANN et al., 2004).
tecidos vizinhos (SCHWARTZMAN; CIDLOWSKI, 1993). As caspases são enzimas chave no processo de apoptose celular, quando ativadas, funcionam como proteases inibindo proteínas essenciais a sobrevida da célula, causando assim sua morte e desenvolvimento de alterações morfológicas típicas do processo (SALVESEN; DIXIT, 1999). Diversas condições podem alterar o processo de apoptose dos neutrófilos, tais como condições observadas na reperfusão tecidual, na hiperglicemia e na presença de agentes oxidantes (KANNAN; JAIN, 2000).
O estresse oxidativo pode ser desencadeado após ativação exagerada dos neutrófilos, assim também é ativada a apoptose da célula por meio da alteração do estado redox, em que um meio intracelular mais oxidante leva à ativação das caspases (ZAMZAMI et al., 1996). Nesse mecanismo, todas as defesas antioxidantes celulares são esgotadas para eliminar as ERO, assim quando os agentes pro-oxidantes superam as defesas antioxidantes do organismo, instala-se o estresse oxidativo propriamente dito (BURTKE; SANDSTROM, 1994).
Dessa forma, o estresse oxidativo pode ser definido como um aumento da produção de radicais livres resultantes de danos teciduais (PEAKE; SUZUKI, 2004). Uma maneira eficaz de se avaliar o estresse oxidativo é a determinação da peroxidação lipídica, uma vez que um alvo comum para os radicais livres são os ácidos graxos insaturados presentes nas membranas celulares (PRYOR et al., 1976). Outra maneira eficaz de se determinar o estresse oxidativo é a determinação da capacidade antioxidante total (CAT) do plasma. A CAT fornece, de forma geral, o conjunto das substâncias com capacidade antioxidante no plasma, uma vez que a dosagem isolada de cada substância é inviável, até mesmo porque elas têm efeito complementar (EREL, 2004).
componentes plasmáticos atuam na defesa antioxidante intracelular eliminando superóxido, hidroperóxidos e, consequentemente, prevenindo as reações em cadeia dessas ERO que oxidam os substratos celulares (JI, 1995).
Dentre as substâncias plasmáticas antioxidantes, a glutationa é a defesa antioxidante não enzimática mais importante, existindo em grandes quantidades no organismo. Esse antioxidante age na eliminação de peróxidos
e na regeneração de importantes antioxidantes como o α-tocoferol e o ácido ascórbico (JONES, 2002). O ácido úrico é outro antioxidante não enzimático que pode proteger o organismo contra o estresse oxidativo, atuando na eliminação de ERO e radicais hidroxila (BECKER et al., 1993). A bilirrubina atua como um potente antioxidante em situações de estresse oxidativo devido à capacidade de eliminar ERO, prevenir a peroxidação lipídica, desativar o radical hidroxil e proteger as células da alta concentração do peróxido de hidrogênio (MACLEAN et al., 2007). Sua função antioxidante se deve também à ampliação do ciclo em que a bilirrubina é oxidada de volta a biliverdina e, então, é reciclada novamente à bilirrubina via biliverdina redutase (AGUIAR et al., 2006).
5 A relação da leishmaniose visceral com a função neutrofílica e o estresse oxidativo
A leishmaniose visceral é uma doença endêmica em regiões tropicais e subtropicais causada por protozoários do gênero Leishmania (WHO, 1984). O cão é o principal reservatório da forma visceral da doença em áreas urbanas e só na região de Araçatuba, 41.774 cães foram submetidos à eutanásia pelo Centro de Controle de Zoonoses entre os anos de 1999 a 2004, de forma que a prevalência da doença na cidade é de cerca de 9% (ANDRADE et al., 2007). No hospedeiro vertebrado, o protozoário parasita células do sistema monocítico-fagocitário, onde se multiplica e atinge outros sistemas orgânicos causando os mais variados sinais clínicos (PEARSON; STEIGBIGEL, 1981).
avançadas da doença na tentativa de entender a susceptibilidade dos animais à doença, já que essas células são a primeira linha de defesa do organismo (BRANDONISIO et al., 1996; CIARLINI et al., 2010; GÓMEZ-OCHOA et al., 2010; JAIN et al., 1996; PEARSON; STEIGBIGEL, 1981; VUOTTO et al., 2000).
Conforme já demonstrado, os neutrófilos constituem a primeira linha de defesa do organismo, realizando fagocitose do agente invasor e destruindo-o por meio da produção de ERO, entrando posteriormente em apoptose. Entretanto, alguns micro-organismos desenvolveram a capacidade de modificar o metabolismo oxidativo e a apoptose neutrofílica como tática para perpetuar a infecção, evadindo de forma eficaz o sistema imune (ANWAR; WHYTE, 2007). Dentre esses micro-organismos, protozoários do gênero Leishmania vêm sendo foco de estudos em modelos humanos in vitro devido à sua habilidade em inibir o metabolismo oxidativo (LAUFS et al., 2002) e a apoptose de neutrófilos parasitados (AGA et al., 2002).
Durante o estabelecimento da infecção, o papel dos neutrófilos tem sido investigado e revisado. Existe um modelo de infecção demonstrando que os
neutrófilos funcionariam como “Cavalos de Tróia” no estabelecimento da
infecção (LASKAY et al., 2003). Nesse modelo, quando a Leishmania major é inoculada, formas viáveis do parasito são fagocitadas juntamente com formas em apoptose, causando inibição do metabolismo oxidativo neutrofílico. Uma vez dentro da célula, a Leishmania sp. prolonga a sobrevida do neutrófilo inibindo a apoptose celular para que os macrófagos cheguem ao sítio de infecção. Dessa forma, os macrófagos realizam a fagocitose dos neutrófilos em apoptose com formas viáveis do parasito dentro dos corpos apoptóticos, perpetuando a infecção após adentrarem em suas células alvo sem ativar o metabolismo oxidativo dos macrófagos (LASKAY et al., 2003).
2010; GÓMEZ-OCHOA et al., 2010), outros observaram uma inibição do metabolismo oxidativo de neutrófilos de cães com leishmaniose frente a estímulos (BRANDONISIO et al., 1996; VUOTTO et al., 2000).
Gómez-Ochoa et al. (2010) foram os primeiros a evidenciar que a alteração neutrofílica observada na leishmaniose canina é dependente do estágio da doença. No estudo realizado pelos autores, eles concluíram que ocorre um aumento significativo da produção de superóxido nos estágios iniciais da doença e um discreto decréscimo nos estágios finais da doença, quando o quadro de uremia decorrente da DRC está instalado.
Uma vez evidenciado que ocorre uma maior produção de superóxido por neutrófilos de cães infectados (CIARLINI et al., 2010; GÓMEZ-OCHOA et al., 2010) e que a apoptose é um processo dinâmico que pode ser desencadeado pelo estresse oxidativo causado por essa maior produção de ERO (KANNAN; JAIN, 2000), torna-se fundamental avaliar a viabilidade e apoptose de neutrófilos de cães infectados, ressaltando que até o momento não existem estudos publicados investigando a apoptose neutrofílica em tais situações.
O aumento da produção de superóxido observado em cães com leishmaniose também poderia favorecer de forma significativa o estresse oxidativo nesses animais, uma vez que já foi demonstrada a relação entre os fagócitos e o estresse oxidativo (BABIOR, 2000). Na leishmaniose visceral, o estresse oxidativo parece estar envolvido na patogênese de sinais clínicos como a anemia frequentemente observada na doença, em que ERO lesionam membranas celulares eritrocitárias causando peroxidação lipídica e predispondo as células à apoptose (NEUPANE et al., 2008; SAMANTA et al., 2012).
doença (BILDIK et al., 2004; HEIDARPOUR et al., 2012), entretanto, sem destacar o estágio da doença.
Estudos envolvendo o estresse oxidativo na leishmaniose visceral canina são fundamentais na tentativa de estabelecer a relevância dessa condição no tratamento e também para conhecer os mecanismos patológicos da doença (BILDIK et al., 2004).
Entretanto, conforme já demonstrado por Gómez-Ochoa et al. (2010), parece haver diferença quanto à função neutrofílica de acordo com o estágio da doença, logo existe a possibilidade que o mesmo ocorra com o estresse oxidativo e que haja diferença também quanto ao estágio da doença.
De acordo com o LeishVet Consensus, que preconiza o estadiamento da leishmaniose visceral, a doença pode ser dividida em quatro estágios: leve, moderada, severa e muito severa, de acordo com os sinais clínicos e achados laboratoriais (SOLANO-GALLEGO et al., 2009). Cães com a forma moderada da doença apresentam sinais clínicos típicos da leishmaniose como linfadenopatia, dermatite papular, dermatite ulcerativa, dermatite esfoliativa, onicogrifose, anorexia, perda de peso, febre, epistaxe, anemia leve não-regenerativa, hipoalbuminemia, hiperglobulinemia e perfil renal normal. Por outro lado, cães com a doença no estágio muito severo além de apresentam os sinais clínicos citados anteriormente, ainda podem apresentar vasculite, artrite, uveíte, glomerulonefrite, tromboembolismo pulmonar, síndrome nefrótica e DRC em estágio final com uremia e marcada proteinúria. Ainda no estágio muito severo, os animais apresentam valores de creatinina que os classificam nos estágios III (2-5 mg/dL) ou IV (>5 mg/dL) da DRC, segundo proposto pela IRIS (International Renal Interest Society).
6 Relação entre a uremia, o estresse oxidativo e o metabolismo oxidativo e apoptose de neutrófilos
incluem perda de apetite, vômito, diarreia, letargia e perda de peso e, à medida que a uremia progride, pode ocorrer gastrite urêmica, úlceras orais e disfunção plaquetária. Sinais menos comuns da uremia incluem pneumonia urêmica, osteodistrofia e encefalopatia. Outras consequências da piora do quadro renal incluem poliúria/polidipsia, desidratação, desordens eletrolíticas, acidose, anemia, hipertensão sistêmica e hiperparatireoidismo secundário renal (POLZIN, 2011).
Conforme demonstrado, a uremia decorrente da DRC é uma condição relativamente comum na leishmaniose (CORTADELLAS et al., 2008; KOUTINAS et al., 1999; NOLI, 1999) e tendo em vista que a uremia, isoladamente, é capaz de causar estresse oxidativo e alterar a função neutrofílica em humanos (CENDOROGLO et al., 1999; JOHNSON-DAVIS et al., 2011; KOTUR-STEVULJEVIĆ et al., 2012; LIBETTA et al., 2011), essa condição deve ser levada em consideração ao se avaliar cães nos diferentes estágios da leishmaniose. Existem evidências em trabalhos humanos de que o estresse oxidativo decorrente da própria uremia contribuiria para a anemia observada em pacientes com tais condições (TONON et al., 2012), de forma que o estresse oxidativo deve ser levado em consideração inclusive durante o tratamento da DRC em humanos (SMALL et al., 2012).
São escassos os estudos avaliando o estresse oxidativo em cães com uremia. Existem relatos de aumento dos teores de malondialdeído (MDA), marcador de peroxidação lipídica, com decréscimo de superóxido dismutase eritrocitária, glutationa peroxidase e catalase em cães urêmicos (KARGIN; FIDANCI, 2001). Em outro estudo avaliando a relação entre o estresse oxidativo e uremia, foi constatado que a anemia observada no quadro urêmico deve-se primariamente à deficiência de eritropoietina, e não à diminuição da vida eritrocitária devido ao estresse oxidativo, embora se tenha constatado estresse oxidativo em cães urêmicos (BURANAKARL et al., 2009).
Já se sabe que a condição urêmica isoladamente causa estresse oxidativo tanto em humanos (JOHNSON-DAVIS et al., 2011;
(BURANAKARL et al., 2009; KARGIN; FIDANCI, 2001). Na tentativa de determinar a origem das ERO, pode ser de grande ajuda avaliar o metabolismo oxidativo dos neutrófilos nessa condição. Devido ao delicado balanço entre metabolismo oxidativo e a apoptose, também é fundamental avaliar a apoptose dessas células, na tentativa de determinar uma possível imunodeficiência nessa condição.
Apesar de o metabolismo oxidativo e a apoptose de neutrófilos ter sido amplamente investigado em humanos nos últimos anos (COHEN et al., 2011; COHEN et al., 2008; COHEN et al., 2001; JABER et al., 2001; KOLLER et al., 2004; MAJEWSKA et al., 2003; MERA et al., 2005; SARDENBERG et al., 2006), em cães urêmicos o assunto tem sido pouco investigado. Em um estudo conduzido por Kralova et al. (2009) verificou-se que a condição urêmica em cães não afeta a função neutrofílica, no que diz respeito à fagocitose e produção de superóxido medida por quimiluminescência.
Parece haver um consenso entre os autores a respeito do efeito da uremia sobre a apoptose dos neutrófilos. Os resultados dos estudos evidenciam um aumento significativo da taxa de apoptose de neutrófilos de pacientes urêmicos (COHEN et al., 2001; JABER et al., 1998; JABER et al., 2001; KOLLER et al., 2004; MAJEWSKA et al., 2003; SARDENBERG et al., 2006). Essa maior taxa de apoptose de neutrófilos contribuiria de forma significativa para a maior susceptibilidade de pacientes urêmicos no estágio final da DRC à infecções bacterianas (CENDOROGLO et al., 1999).
neutrofílico ou devido à fase da DRC (CENDOROGLO et al., 1999). Ainda, de acordo com Cendoroglo et al. (1999), num estágio inicial da uremia ocorre um aumento do metabolismo oxidativo neutrofílico devido à presença das toxinas urêmicas que causam o estresse oxidativo da célula. Posteriormente, o processo de apoptose é desencadeado e, uma vez em apoptose, os neutrófilos produzem menos superóxido e ERO num estágio final.
REFERÊNCIAS
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CAPÍTULO 2 - A LEISHMANIOSE CAUSA ESTRESSE OXIDATIVO, ALTERAÇÃO DO METABOLISMO OXIDATIVO E DA VIABILIDADE DE NEUTRÓFILOS DE CÃES
ALMEIDA, B.F.M.; NARCISO, L.G.; MELO, L.M.; PREVE, P.P.; BOSCO, A.M.; LIMA, V.M.F.; CIARLINI, P.C.
Resumo - Com o objetivo de testar a hipótese de que o estresse oxidativo, alteração do metabolismo oxidativo e apoptose dos neutrófilos de cães varia com o estágio da leishmaniose e que a uremia contribui para tal variação, foram quantificados marcadores de estresse oxidativo, a produção de superóxido, viabilidade e taxa de apoptose em neutrófilos de cães com leishmaniose. Os cães foram classificados de acordo com o LeishVet Consensus em estágio moderado da doença (Leish II, n=20), estágio muito severo quando a uremia está instalada (Leish IV, n=20) e de cães com uremia sem leishmaniose (Urêmico, n=10), comparando-os a cães saudáveis (Controle n=30). Foi determinada a capacidade antioxidante total (CAT), a peroxidação lipídica, os teores de glutationa total e os antioxidantes plasmáticos albumina, ácido úrico e bilirrubina. A produção de superóxido foi determinada utilizando a sonda hidroetidina, a viabilidade e apoptose utilizando anexina V-PE, ambos em citometria de fluxo capilar. O estresse oxidativo ocorre na uremia e na leishmaniose com redução da CAT, associado à maior produção de superóxido e apoptose induzida. Espontaneamente, neutrófilos de cães urêmicos com e sem leishmaniose possuem menor viabilidade, maior taxa de apoptose e maior peroxidação lipídica. Conclui-se que a intensidade do estresse oxidativo não varia com o estágio da leishmaniose, entretanto a condição urêmica contribui para diminuição da viabilidade dos neutrófilos em cães no estágio final da doença.
1 Introdução
O estresse oxidativo ocorre quando há desequilíbrio entre a produção de substâncias oxidantes e as defesas antioxidantes do organismo (PEAKE; SUZUKI, 2004). Células especializadas em realizar fagocitose, como os neutrófilos, possuem grande capacidade de produção de substâncias oxidantes, as espécies reativas de oxigênio (ERO), que podem contribuir de forma significativa para o estresse oxidativo (ZAMZAMI et al., 1996). As ERO são produzidas espontaneamente e após a ativação do metabolismo oxidativo neutrofílico a partir do ânion superóxido, gerando compostos altamente reativos como o peróxido de hidrogênio, óxido nítrico, ácido hipocloroso e o ânion superóxido propriamente dito (NATHAN, 2006).
A produção exagerada e contínua dessas substâncias oxidantes leva ao consumo das defesas antioxidantes orgânicas. Assim, essas substâncias reagem com componentes celulares e teciduais causando a peroxidação lipídica e danos ao DNA celular, que levam à apoptose (ZAMZAMI et al., 1996). O estresse oxidativo está envolvido na patogênese de diversos processos patológicos, como anemia hemolítica (STOCKS; DORMANDY, 1971), aterosclerose (KATSURA et al., 1994), lesão de reperfusão tecidual (PARK; LUCCHESI, 1999) e até mesmo como potencial carcinogênico (SHACTER et al., 1988).
O papel dessas substâncias oxidantes vem sendo estudado com o objetivo de entender a função desses compostos na patogênese das doenças infecciosas (BILDIK et al., 2004; EREL et al., 1997; OLIVEIRA; CECHINI, 2000).
São escassos os estudos avaliando o metabolismo oxidativo neutrofílico em cães nos diversos estágios da leishmaniose visceral. Gómez-Ochoa et al. (2010) sugeriram que a produção de superóxido se altera de acordo com o estágio da doença, uma vez que observaram aumento da produção de superóxido neutrofílico no início da infecção e um discreto decréscimo nos estágios finais da leishmaniose visceral. Animais em estágios avançados da doença geralmente apresentam doença renal crônica que pode levar à uremia (SOLANO-GALLEGO et al., 2009). Portanto é razoável hipotetizar que a menor produção de superóxido observada nos estágios finais da leishmaniose visceral por Gómez-Ochoa et al. (2010), esteja associada à uremia, uma vez que há comprovação in vitro de que o soro urêmico é capaz de inibir o metabolismo oxidativo neutrofílico em cães (BARBOSA et al., 2010). Também já se sabe que a uremia decorrente da DRC é capaz de inibir o metabolismo oxidativo neutrofílico e que a menor produção de superóxido está associada ao aumento da taxa de apoptose em humanos (CENDOROGLO et al., 1999).
2 Material e Métodos
O experimento ocorreu de acordo com os princípios éticos em uso de animais do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Estadual Paulista (Protocolo FOA-9678/10).
2.1 Seleção dos animais
Foram selecionados 80 cães de variados padrões raciais e divididos em quatro grupos: Grupo Controle (n=30) constituído por número igual de machos e fêmeas com idade de 4±2 anos, todos clinicamente saudáveis, sem alterações nos exames físico e laboratoriais conforme demonstrado na Tabela 1 e parasitologicamente e sorologicamente negativos para leishmaniose visceral. Grupo Leish II (n=20), formado por 11 cães machos e nove fêmeas com leishmaniose visceral e em estágio moderado da doença. Grupo Leish IV (n=20), sendo 10 machos e 10 fêmeas com leishmaniose visceral em estágio muito severo. Grupo Urêmico (n=10), sendo oito machos e duas fêmeas com idade média de 6±2 anos sem leishmaniose visceral e com uremia decorrente de DRC nos estágios III e IV, com valores de creatinina acima de 2,1 mg/dL conforme Tabela 1.
O diagnóstico da leishmaniose visceral foi realizado por meio de sorologia por ELISA (LIMA, et al., 2003) e confirmado por exame parasitológico direto do aspirado de linfonodo poplíteo em microscopia óptica (100X). A exclusão da doença também baseou-se nos mesmos exames.
Os cães com leishmaniose foram classificados com doença moderada (estágio II) ou doença muito severa (estágio IV) de acordo com as diretrizes do
em estágio final e valores de creatinina acima de 2,1 mg/dL, síndrome nefrótica e intensa proteinúria (UPC >1,0).
Tabela 1 - Frequência de sinais clínicos e análises laboratoriais (média e desvio padrão) de cães do grupo controle e com leishmaniose visceral nos estágios moderado (Leish II) e muito severo (Leish IV) e animais urêmicos sem leishmaniose (Urêmico).
Parâmetro Controle Leish II Leish IV Urêmico Sinais clínicos
Linfadenopatia Ausente 95% 60% Ausente
Onicogrifose Ausente 90% 90% Ausente
Ulcerações de pele Ausente 75% 90% 15%
Alopecia periocular Ausente 90% 50% Ausente
Caquexia Ausente 40% 90% 80%
Halitose urêmica Ausente Ausente 85% 90%
Ulceração oral e na língua Ausente Ausente 90% 95%
Desidratação Ausente 15% 95% 60%
Exames laboratoriais Hemograma
Volume globular (%) 47,7 ± 3,3 34,6 ± 6,5 20,2 ± 9,8 28,0 ± 8,22 Hemácias (1012/L) 6,5 ± 0,5 4,80 ± 1,15 2,84 ± 1,34 3,88 ± 1,18 Hemoglobina (g/dL) 15,9 ± 1,0 11,5 ± 2,5 6,5 ± 2,8 9,08 ± 2,91 VCM (fL) 73,2 ± 2,9 73,4 ± 3,4 72,6 ± 2,6 72,6 ± 6,27 CHCM (%) 33,3 ± 0,2 33,2 ± 0,8 33,8 ± 1,42 32,32 ± 2,06 Leucócitos totais (109/L) 9,9 ± 2,6 14,1 ± 5,2 12,0 ± 6,12 14,1 ± 5,55 Bioquímica
Albumina (g/L) 31,8 ± 1,6 20 ± 5,8 22,3 ± 3,2 25,3 ± 3,3 ALT (UI/L) 44,29 ± 13,2 66,3 ± 10,1 42,5 ± 15,6 51,3 ± 22,4 AST (UI/L) 26,1 ± 8,1 47,6 ± 10,1 42,4 ± 17,0 39,6 ± 18,8 Colesterol (mg/dL) 178,3 ± 51,4 201,7 ± 43,2 279,7 ± 50,3 288 ± 82,4 Creatinina (mg/dL) 1,07 ± 0,16 0,89 ± 0,25 4,43 ± 2,1 9,48 ± 3,72 Glicose (mg/dL) 94,9 ± 10,7 84,5 ± 10,6 96,67 ± 10,1 78,56 ± 12,1 Globulina (g/L) 34,8 ± 6,0 59,1 ± 18,9 58,0 ± 18,0 36,4 ± 5,4 Proteína total (g/L) 65,8 ± 6,3 80,1 ± 18,0 80,9 ± 17,1 65,8 ± 23,3 Ureia (mg/dL) 32,6 ± 8,1 29,0 ± 10,8 263,0 ± 114,6 348,7 ± 90,1 Urinálise
Densidade urinária 1,043 ± 0,003 1,040 ± 0,009 1,016 ± 0,003 1,015 ± 0,004
UPC 0,2 ± 0,07 0,8 ± 0,6 3,6 ± 1,5 4,1 ± 2,0
Os animais do Grupo Urêmico foram estadiados segundo as diretrizes da
International Renal Interest Society (IRIS, 2006), de forma que só foram selecionados animais nos estágios III (creatinina 2,1-5,0 mg/dL) e IV (creatinina >5,0 mg/dL), que correspondem aos estágios dos animais com leishmaniose muito severa, conforme demonstrado na Tabela 1.
Animais tratados com medicamentos antioxidantes ou que alterassem a função neutrofílica não foram incluídos no estudo.
2.2 Colheita das amostras e análises laboratoriais
Após jejum alimentar de oito a 12 horas, 10 mililitros de sangue total foram colhidos de cada animal por punção da veia jugular. Nove mililitros de sangue foram acondicionados em tubos heparinizados estéreis protegidos da luz e foram destinados ao isolamento dos neutrófilos e obtenção de plasma para análises bioquímicas. O restante do sangue foi acondicionado em tubo com EDTA para realização do hemograma. O isolamento dos neutrófilos foi realizado imediatamente após a colheita do sangue. O plasma foi armazenado protegido da luz à -20ºC para as análises bioquímicas e à -80ºC para determinação da capacidade antioxidante total (CAT), peroxidação lipídica e glutationa total, por no máximo 15 dias após a colheita.
O hemograma foi realizado em contador de células automatizado veterinário (BC-2800Vet, Shenzhen Mindray Bio-Medical Eletronics Co., Nanshan, China). A urina foi colhida por cistocentese para realização do exame de urina tipo I e determinação da relação proteína/creatinina urinária (UPC). A densidade urinária foi obtida por refratometria.
A capacidade antioxidante total plasmática foi determinada pelo método colorimétrico do cátion ABTS (2,2’-azino-bis 3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid) em que substâncias antioxidantes presentes no plasma inibem a oxidação dos substratos presentes nos reagentes, impedindo a mudança de cor do meio e, assim, determinando a capacidade antioxidante do plasma. Os resultados foram expressos em mmol de equivalente de Trolox/L após comparação das amostras com uma curva padrão com diversas concentrações de Trolox (EREL, 2004).
O teor plasmático de glutationa total (GSH) foi determinado utilizando conjunto de reagentes comerciais (Ransod and Ransel, Randox Laboratories, Oceanside, CA) em leitora automática de placas de 96 poços (Readwell Touch, Robonik PVT LTD, Thane, India) em 405 nm, segundo recomendações do fabricante.
A peroxidação lipídica plasmática foi determinada pelo método TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) utilizando reagente comercial (TBARS Assay Kit, ZeptoMetrix Corporation, USA) e leitora automática de placas de 96 poços (Readwell Touch, Robonik PVT LTD, Thane, India) em 545 nm segundo recomendações do fabricante. Os valores são expressos em µmol/L após comparação das amostras com uma curva de calibração com diversas concentrações de malondialdeído proposta pelo fabricante.
2.3 Isolamento dos neutrófilos
Hanks (HBSS) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA). Após contagem em hemocitômetro, as células foram diluídas em meio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) na concentração 106/mL. A viabilidade foi estimada pelo método de exclusão do azul de tripan e a pureza foi determinada por citologia. Apenas os isolamentos que obtiveram viabilidade e pureza acima de 95 e 93%, respectivamente, foram incluídos no estudo.
2.4 Avaliação do metabolismo oxidativo neutrofílico
Para determinação da produção de superóxido dos neutrófilos utilizou-se a sonda hidroetidina (HE) em citometria de fluxo capilar. Resumidamente, em 180
μL da suspensão de neutrófilos (106/mL) em RPMI 1640 foram acrescidos 20 μL
de solução tamponada de HE (0,1 mmol/L), na ausência e presença de acetato miristato de forbol 0,3 µM (PMA) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA), para a realização da prova estimulada. Após incubação a 37ºC por 15 minutos, a amostra foi mantida em banho de gelo e protegida da luz até o momento da leitura. A média de fluorescência do etídio foi quantificada em citômetro de fluxo capilar (Guava EasyCyte Mini®, Guava Technologies, Industrial Boulevard Hayward, USA) ajustado para o comprimento de onda máximo para emissão (593 nm) e excitação (473 nm) do etídio. Para eliminação dos debris celulares selecionou-se a população com maior tamanho compatível com a população de neutrófilos. Os resultados de 10.000 eventos foram analisados em programa computacional específico (Guava Express, CytoSoft Data Acquisition and Analysis Software. Personal Cell Analysis, v.4.1, 2006. Guava Technologies, Industrial Boulevard Hayward, USA) e considerada a unidade arbitrária de fluorescência média (ẋ-mean) vermelha do etídio, formado a partir da oxidação espontânea e estimulada de HE pelo superóxido.
2.5 Avaliação da viabilidade e taxa de apoptose neutrofílica
(106/mL) em RPMI 1640 foi incubada na ausência e presença de camptotecina 10 mM (CAM) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) para a realização da prova induzida. Após incubação por uma hora a 37ºC, com agitação por um minuto (600 rpm) a cada 15 minutos em termociclador microprocessado (Thermomixer, Eppendorf, Mod. Comfort, Hamburg, Germany), a suspensão de células foi
aliquotada em 100 μL e acrescida de 100 μL de Anexina V-PE, com posterior incubação por 20 minutos em temperatura ambiente sob proteção da luz. Utilizando-se citômetro de fluxo capilar, os resultados de 10.000 eventos foram analisados em programa computacional específico após a compensação do citômetro para o fluorocromo vermelho para reação positiva de 7-AAD e fluorocromo amarelo para reação positiva da Anexina V. Foi possível quantificar as seguintes populações celulares: células viáveis (anexina V– e 7-AAD–); apoptose inicial (anexina V+ e 7-AAD–) e apoptose final (anexina V+ e 7-AAD+). A taxa de apoptose total foi obtida após soma das populações de células em apoptose inicial e final.
2.6 Análise estatística
Após os estudos das distribuições das variáveis quanto à normalidade e homocedasticidade, foram utilizados os testes de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn e ANOVA com pós-teste de Tukey para comparar os grupos. As análises estatísticas foram realizadas em programa computacional estatístico (SAS Institute Inc. The SAS System, release 9.2., Cary:NC, 2008), sendo considerado significativo p<0,05.
3 Resultados e Discussão
3.1 A produção de superóxido dos neutrófilos ativados de cães com
leishmaniose visceral aumenta independentemente da condição urêmica
aumento do metabolismo oxidativo no estágio inicial da doença (CIARLINI et al., 2010; GÓMEZ-OCHOA et al., 2010). Porém, outros estudos utilizando quimiluminescência observaram uma inibição do metabolismo oxidativo neutrofílico de cães infectados frente a estímulos como o zymosan (BRANDONISIO et al., 1996; VUOTTO et al., 2000) e o PMA (VUOTTO et al., 2000). De forma semelhante a estudos que utilizaram o NBT (CIARLINI et al., 2010; GÓMEZ-OCHOA et al., 2010), no presente estudo observamos que na leishmaniose visceral a produção de superóxido dos neutrófilos na presença de estímulo com PMA está aumentada independentemente do estágio da doença (Tabela 2). Espontaneamente, embora houvesse aumento do metabolismo oxidativo em relação ao grupo controle, não foi observada diferença significativa (Tabela 2).
Existem evidências in vitro de que a uremia decorrente da DRC inibe o metabolismo oxidativo de neutrófilos de cães (BARBOSA et al., 2010), semelhante ao observado in vivo em humanos (COHEN et al., 2011; HIRAYAMA et al., 2001; SARDENBERG et al., 2006). No presente estudo observamos que a uremia (Grupo Urêmico) aumenta o metabolismo oxidativo frente a estímulo com o PMA (Tabela 2), conforme já descrito em felinos (KEEGAN; WEBB, 2010) e em humanos (KLEIN et al., 1999; MCLEISH et al., 1996; WARD; MCLEISH, 1995). Não foi observada diferença quanto à produção espontânea de superóxido do Grupo Urêmico e do Grupo Controle (Tabela 2), o que já foi demonstrado em cães (KRALOVA et al., 2009).
Tabela 2 - Produção de superóxido utilizando a sonda hidroetidina espontânea (NE) e estimulada com acetato miristato de forbol (PMA), viabilidade e apoptose total de neutrófilos utilizando o sistema anexina V-PE espontâneas (NE) e induzidas com camptotecina (CAM) (média ± desvio padrão) de cães do Grupo Controle, com leishmaniose moderada (Leish II) e muito severa (Leish IV) e de cães urêmicos sem leishmaniose (Grupo Urêmico).
Parâmetro Controle Leish II Leish IV Urêmico
Superóxido NE (fluorescência) 59,93 ± 12,0ab 62,55 ± 22,6a 81,26 ± 39,6a 41,09 ± 10,3b
Superóxido PMA (fluorescência) 149,4 ± 76,2b 412,36 ± 129,2a 409,27 ± 104,8a 449,86 ± 86,6a
Viabilidade NE (%) 98,94 ± 0,15a 98,79 ± 0,27a 98,15 ± 0,74b 98,38 ± 0,36b
Viabilidade CAM (%) 85,51 ± 2,95a 79,57 ± 4,0b 79,49 ± 3,75b 78,38 ± 5,14b
Apoptose total NE (%) 0,23 ± 0,07b 0,22 ± 0,10b 0,51 ± 0,29a 0,46 ± 0,12a
Apoptose total CAM (%) 7,29 ± 2,27b 15,81 ± 4,79a 16,91 ± 3,3a 18,46 ± 4,26a
* A presença de pelo menos uma letra coincidente na mesma linha indica que não há diferença estatística (p>0,05)
Tabela 3 - Marcadores de estresse oxidativo (média ± desvio padrão) de cães do Grupo Controle, com leishmaniose moderada (Leish II) e muito severa (Leish IV) e de cães urêmicos sem leishmaniose (Grupo Urêmico).
Marcador Controle Leish II Leish IV Urêmico CAT (mmol/L) 0,96 ± 0,03a 0,48 ± 0,07c 0,62 ± 0,25b 0,63 ± 0,05b TBARS (µmol/L) 17,8 ± 9,56b 19,76 ± 7,5ab 27,7 ± 12,2a 31,13 ± 15,5a
GSH (nmol/L) 9,73 ± 1,57b 13,34 ± 3,83a 11,6 ± 2,0ab 8,52 ± 1,38b Ácido úrico (mg/dL) 1,97 ± 0,16a 0,86 ± 0,5b 0,57 ± 0,15b 0,46 ± 0,15b Albumina (g/L) 31,8 ± 1,6a 20 ± 5,8b 22,3 ± 3,2b 25,3 ± 3,3ab Bilirrubina (mg/dL) 0,31 ± 0,11a 0,39 ± 0,20a 0,28 ± 0,25a 0,60 ± 0,46a * A presença de pelo menos uma letra coincidente na mesma linha indica que não há diferença estatística (p>0,05). CAT – Capacidade antioxidante total; TBARS – peroxidação lipídica pelas substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico; GSH – Glutationa total.
O fato de os neutrófilos dos grupos Leish II, Leish IV e Grupo Urêmico aumentarem significativamente a produção de superóxido frente ao estímulo com PMA (Tabela 2), um potente ativador neutrofílico (EL-BENNA et al., 2008), sugere uma prévia sensibilização dessas células. Os neutrófilos quiescentes se tornam
Em estudos humanos, já se sabe que os neutrófilos primed produzem discretamente, porém significativamente, mais superóxido ao longo do tempo que neutrófilos quiescentes (MAZOR et al., 2008). No presente estudo, a análise do metabolismo oxidativo foi pontual, impossibilitando a avaliação da produção de superóxido ao longo do tempo, entretanto foi possível evidenciar o estado primed
dos neutrófilos quando um potente ativador neutrofílico como o PMA foi adicionado às células. Uma contínua e maior produção de superóxido durante toda a sobrevida da célula primed pode predispor ao estresse oxidativo, conforme já demonstrado em humanos (MAZOR et al., 2008).
3.2. Cães com leishmaniose sofrem estresse oxidativo independente do
estágio da doença
O estresse oxidativo em cães com leishmaniose visceral foi muito pouco investigado. Sem considerar o estágio da doença, Bildik et al. (2004) e Heidarpour et al. (2012) constataram estresse oxidativo em cães com leishmaniose visceral devido à redução da CAT e albumina plasmática, promovendo aumento da peroxidação lipídica. De forma semelhante, no presente estudo foi observado que cães com leishmaniose visceral sofrem estresse oxidativo por redução da CAT em ambos os estágios da doença, porém de forma mais intensa na fase moderada da doença (Grupo Leish II) (Tabela 3). Em estágios mais avançados da doença, quando a DRC está presente, o aumento da peroxidação lipídica plasmática foi mais significativo (Tabela 3).
Os teores plasmáticos de albumina e ácido úrico, substratos plasmáticos com capacidade antioxidante, também diminuem em ambos os estágios da leishmaniose visceral canina. Não há diferença quanto aos teores de bilirrubina (Tabela 3).
dependem do estágio da doença, aumentando no estágio moderado e não se alterando no estágio muito severo (Tabela 3). Uma vez que cães do Grupo Leish II apresentaram os maiores teores de GSH e a menor CAT (Tabela 3), é plausível supor que devido ao estresse oxidativo mais evidenciado nesse grupo, houvesse uma maior demanda e maior produção de GSH na tentativa de impedir os danos da oxidação tecidual.
3.3 A uremia causa estresse oxidativo e maior peroxidação lipídica
Em humanos, o estresse oxidativo decorrente da uremia é a causa de diversos processos patológicos (KOTUR-STEVULJEVIĆ et al., 2012; JOHNSON -DAVIS et al., 2011; LIBETTA et al., 2011), inclusive contribui para o agravamento da anemia (TONON et al., 2012) e deve ser levado em consideração no tratamento da doença (SMALL et al., 2012). Em cães são escassos estudos avaliando o estresse oxidativo na condição urêmica. No presente estudo foi observado estresse oxidativo em cães urêmicos, sendo esta uma das primeiras evidências na espécie canina. Verificou-se diminuição da CAT e aumento da peroxidação lipídica em cães urêmicos com e sem leishmaniose visceral nos grupos Leish IV e Urêmico, respectivamente (Tabela 3). O estresse oxidativo evidenciado no presente estudo está de acordo com o que já foi observado em gatos (KEEGAN; WEBB, 2010) e humanos (CLERMONT et al., 2000; ERDOGAN et al., 2002) com uremia.
peroxidação lipídica observada nos animais dos Grupos Leish II, Leish IV e Urêmico (Tabela 3).
3.4 A leishmaniose predispõe os neutrófilos à apoptose
Não existem estudos avaliando a apoptose de neutrófilos sistêmicos de cães com leishmaniose visceral já estabelecida em seus diversos estágios. O que já se sabe é que no estabelecimento da infecção, neutrófilos parasitados têm a apoptose inibida para favorecer a sobrevida do parasita no hospedeiro (AGA et al., 2002). Na fase de estabelecimento da infecção, neutrófilos parasitados sofrem inibição do metabolismo oxidativo (LAUFS et al., 2002) e prolongamento da sobrevida (AGA et al., 2002) e funcionariam como “Cavalos de Tróia” para a
entrada do parasita nos macrófagos (LASKAY et al., 2003). Pela primeira vez foi observada diminuição da viabilidade espontânea dos neutrófilos de cães com leishmaniose e uremia. Além disso, neutrófilos de cães com leishmaniose estavam mais propensos à morte celular, sofrendo mais apoptose na presença de estímulo com CAM, de forma independente do estágio da doença (Tabela 2).
Neutrófilos no estado primed dos cães dos grupos Leish II, Leish IV e Urêmico podem estar mais propensos à apoptose, assim como já foi observada maior apoptose de neutrófilos humanos quando primed (MAZOR et al., 2008). As ERO produzidas no metabolismo oxidativo a partir do superóxido favorecem a apoptose neutrofílica, diminuindo a viabilidade celular (ZHANG et al., 2003).
3.5 A uremia diminui a viabilidade e aumenta a apoptose espontânea de
neutrófilos caninos
de cães urêmicos infectados (Leish IV) como no não infectados (Grupo Urêmico) (Tabela 2). Estes achados são similares a estudos realizados em humanos (COHEN et al., 2001; JABER et al., 2001; MAJEWSKA et al., 2003).
A diminuição da viabilidade e o aumento da apoptose espontânea observados em cães dos Grupos Leish IV e Urêmico podem ser explicados, pelo menos em parte, pela maior peroxidação lipídica observada nesses grupos (Tabelas 2 e 3). As ERO danificam estruturas celulares vitais, aumentando o estresse oxidativo ao causar depleção da CAT celular e causando peroxidação lipídica que, posteriormente, levaria ao aumento da taxa de apoptose espontânea nos neutrófilos de cães com condição urêmica.
Alguns estudos in vitro com substâncias antioxidantes têm demonstrado sua capacidade leishmanicida (ABDEL-MAGEED et al., 2012), o que poderia combater o estresse oxidativo e assim melhorar o quadro clínico desses animais. A patogenia pela qual a leishmaniose causa estresse oxidativo e quais as consequências desse estresse aos animais infectados ainda precisam ser mais bem entendidas a fim de orientar novas estratégias de tratamentos.
4 Conclusão
Pode-se concluir que o aumento do estresse oxidativo e do metabolismo oxidativo dos neutrófilos não varia com o estágio da leishmaniose canina, entretanto, a viabilidade neutrofílica é afetada devido à uremia que ocorre no estágio final da doença.
REFERÊNCIAS
ABDEL-MAGEED, W.M.; BACKHEET, E.Y.; KHALIFA, A.A.; IBRAHEIM, Z.Z.; ROSS, S.A. Antiparasitic antioxidant phenylpropanoids and iridoid glycosides from
