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AMANDA DA COSTA GOMES
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE E ANTIGLICANTE DE
FITOTERÁPICOS UTILIZADOS PARA OS SINTOMAS DE
CLIMATÉRIO.
AMANDA DA COSTA GOMES
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE E ANTIGLICANTE DE
FITOTERÁPICOS UTILIZADOS PARA OS SINTOMAS DE
CLIMATÉRIO.
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências e Letras de Assis – UNESP –
Universidade Estadual Paulista para a obtenção do título de Mestre em Biociências (Área de Conhecimento: Caracterização e Aplicação da Diversidade Biológica).
Orientador: Prof. Dr. Regildo Márcio Gonçalves da Silva
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca da F.C.L. – Assis – Unesp
G633a
Gomes, Amanda da Costa
Avaliação do potencial antioxidante e antiglicante de fito-terápicos utilizados para os sintomas de climatério / Amanda da Costa Gomes.- Assis, 2016.
79 f. : il.
Dissertação de Mestrado – Faculdade de Ciências e Letras de Assis – Universidade Estadual Paulista.
Orientador: Dr Regildo Márcio Gonçalves da Silva
1. Menopausa. 2. Climatério. 3. Stress oxidativo. 4. Plantas medicinais. 5. Mulheres - envelhecimento. I. Título.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar a Deus, por todas as bênçãos e oportunidades.
Aos meus pais que tanto amo, Rosa e Uraci que sempre me apoiaram em tudo e não pouparam esforços para que meu sonho se realizasse.
À minha querida irmã Aline, meu cunhado Júlio Cesar e meu sobrinho Ítalo, que
mesmo de longe sempre me apoiaram.
Ao meu orientador, o professor Dr. Regildo Márcio Gonçalves da Silva, por seu seus
ensinamentos, por toda a atenção, compreensão, disponibilidade e prontidão em ajudar.
À minha tia Maria Alves da Costa, por me acolher em sua casa, sempre de portas
abertas quando precisei.
À minha avó Isabel e minhas tias Silvia e Elisa, pelo carinho e atenção.
Aos colegas do mestrado, em especial à Célia, Janine e Anderson, pela amizade e
ajuda em todos os momentos.
Aos colegas de laboratório, pela troca de experiências e ensinamentos.
À funcionária do laboratório, Maria Amábile, pela amizade, ajuda e companhia. As minhas amigas, Naiara e Jéssica Lucchetta pela amizade e orações, sempre presentes mesmo de longe.
À minha madrinha Ida, sempre presente.
Ao Dr. Wilson, que me ajudou a entender que a vida acadêmica era o meu lugar.
“Qualquer coisa que você possa fazer, ou sonha que
possa fazer, comece a fazê-la. A ousadia
tem em si genialidade, força e magia.”
GOMES, Amanda da Costa. Avaliação do potencial antioxidante e antiglicante de fitoterápicos utilizados para os sintomas do climatério. 2016. 79 f. Dissertação (Mestrado em Biociências). – Faculdade de Ciências e Letras, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Assis, 2016.
RESUMO
O climatério é uma fase biológica na vida da mulher em que ocorre a transição do período reprodutivo e o não reprodutivo, caracterizado pela diminuição da produção hormonal e consequentemente a cessação permanente dos ciclos menstruais associados ao decréscimo da função ovariana. Sendo assim, a necessidade de investigação clínica em mulheres no período do climatério torna-se necessária à medida que aumenta a expectativa média de vida da população. Terapias alternativas são estudadas e avaliadas, dentre elas destacam-se as preparações à base de plantas, denominadas de fitoterápicos. Este trabalho avaliou o potencial antioxidante nos fitoterápicos a base de Cimicifuga racemosa, Trifolium pratense, Humulus lupulus e Morus nigra utilizados para sintomas do climatério, por meio dos
testes in vitro de sequestro de radical livre estável DPPH, potencial redutor de ferro
(FRAP), atividade sequestradora do radical óxido nítrico (NO), inibição da peroxidação lipídica (TBARS) e pelo método de inibição da hemólise oxidativa em eritrócitos humanos. Também foram avaliadas in vitro a capacidade antiglicante e
antioxidante, pelos sistemas albumina sérica bovina (BSA) /ribose e do sistema BSA/Metilglioxal, na presença ou ausência do agente oxidante Cu+2, por meio do ensaio da mobilidade relativa em eletroforese. Foram quantificados os polifenóis e flavonoides totais presentes nos extratos secos. Entre os fitoterápicos, a maior atividade antioxidante tanto para o sequestro de DPPH quanto para o teste FRAP foi detectada no extrato seco de Humulus lupulus (83,56% e 46,95 µM ET/ g de extrato
seco, respectivamente). Na inibição da peroxidação lipídica as menores porcentagens de TBARS foram encontradas para M. nigra (4,82%) e H. lupulus
(18,26%). C. racemosa apresentou a menor formação de nitrito (34,57 µM/mL) no
sequestro do radical NO. T. pratense apresentou o maior conteúdo de polifenóis
(24,61 mg EAG/g de extrato seco) e flavonoides (22,79 mg ER/g de extrato seco). No ensaio de hemólise oxidativa, os extratos mostraram capacidade inibitória concentração-dependentes, enquanto para atividade antiglicante, todos os extratos demostraram potencial antiglicante.
GOMES, Amanda da Costa. Evaluation of antioxidant and anti-glycation potential of herbal medicines used for climacteric symptoms. 2016. 79 f. Dissertação (Mestrado em Biociências). – Faculdade de Ciências e Letras, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Assis, 2016.
ABSTRACT
Climacteric is a biological phase in life of woman in which occurs the transition from reproductive period and non-reproductive, characterized by decreased hormone production and consequently the permanent cessation of menstrual cycles associated with decreased ovarian function. Thus, the need for clinical investigation on women in climacteric period becomes necessary with increasing the average life expectancy of the population. Alternate therapies are being studied and assessed, among them stand out the herbal preparations, called herbal medicines. This work evaluated the antioxidant potential in Cimicifuga racemosa, Trifolium pratense, Humulus lupulus and Morus nigra, used for menopausal symptoms, through in vitro
tests DPPH radical scavenging, ferric reducing antioxidant power (FRAP), scavenging of nitric oxide (NO), inhibition of lipid peroxidation (TBARS) and inhibition oxidative hemolysis human erythrocyte. Were also evaluated in vitro anti-glycation
and antioxidant potential by Relative Electrophoresis Mobility (REM), using bovine serum albumin BSA with ribose and methylglyoxal, in presence or absence oxidant agent Cu2+. Total polyphenols and flavonoids present in the dry extracts were
quantified. Among the herbal medicines, the highest antioxidant activity both for the DPPH radical scavenging as to the FRAP test was detected at dry extract of
Humulus lupulus (83.56% and 46.95 µM ET / g of dry extract, respectively). For
inhibition of lipid peroxidation the lowest percentages of TBARS were found to M. nigra (4.82%) and H. lupulus (18.26%). C. racemosa showed the lowest formation of
nitrite (34.57 µM / mL) in scavenging of nitric oxide (NO). T. pratense showed the
highest polyphenol content (24.61 mg GAE / g dry extract) and flavonoids (22.79 mg RE/ g of dry extract). In the oxidative haemolysis assay, extracts showed inhibitory ability concentration-dependent, while for anti-glycation activity, all extracts demonstrated inhibitory potential of glycation.
Keywords: Menopause. Climacteric. Oxidative stress. Medicinal plants. Women –
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ... 9
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 11
OBJETIVO ... 33
REFERÊNCIAS ... 33
CAPÍTULO ÚNICO ... 46
1 - Introdução ... 47
2 - Material e métodos... ... 48
2.1 - Reagentes ... 48
2.1.1 - Extratos secos dos fitoterápicos ... 48
2.1.1.1 – Diluição dos extratos...48
2.2 - Avaliação da capacidade antioxidante ... 48
2.2.1 - Atividade sequestradora do radical livre DPPH ... 48
2.2.2 - Potencial redutor de ferro (Ferric Reducing Antioxidant Power FRAP) ... 49
2.2.3 - Atividade sequestradora de óxido nítrico (NO) ... 50
2.2.4 - Inibição da peroxidação lipídica (TBARS) ... 50
2.2.5 - Avaliação da atividade antioxidante pela inibição de hemólise oxidativa em eritrócitos humanos ... 51
2.2.5.1 - Obtenção dos eritrócitos ... 51
2.2.5.2 - Ensaio de hemólise oxidativa ... 51
2.3 - Avaliação da atividade antiglicante e antioxidante por Mobilidade Relativa em Eletroforese (MRE) ... 52
2.4 - Determinação do conteúdo de polifenóis totais ... 52
2.5 - Determinação do conteúdo de flavonoides totais ... 53
3 - Análises estatísticas ... 53
4 - Resultados ... 54
4.1 - Avaliação da atividade antioxidante pelos métodos de sequestro do radical DPPH e NO, FRAP, TBARS e determinação do conteúdo de polifenóis e flavonoides totais ... 54
4.2 - Avaliação da atividade antioxidante pela inibição da hemólise oxidativa em eritrócitos humanos ... 57
4.3 - Avaliação da atividade antiglicante e antioxidante por mobilidade relativa em eletroforese (MRE) ... 58
5 - Discussão ... 59
6 - Conclusão ... 63
7-Referências ... 63
CONCLUSÕES GERAIS ... 69
ANEXO A – Normas para publicação Phytotherapy Research ... 70
INTRODUÇÃO GERAL
A investigação clínica em mulheres no período do climatério vem se tornando necessária à medida que aumenta a expectativa média de vida da população
brasileira (BRASIL, 2008). Nesta fase, tratamentos complementares utilizando fitoterápicos podem controlar os sintomas e diminuir os danos à saúde devido ao longo prazo da deficiência de estrogênio ou para quando ocorrem contraindicações
da terapia hormonal convencional (BORRELLI e ERNST, 2008; MAHMUD, 2010; JUNGBAUER e MEDJAKOVIC, 2014). De acordo com a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária – ANVISA, na RDC nº 26/2014, fitoterápico é definido como produto obtido de matéria-prima ativa vegetal, exceto substâncias isoladas, com finalidade profilática, curativa ou paliativa, incluindo medicamento fitoterápico e
produto tradicional fitoterápico, podendo ser simples, quando o ativo é proveniente de uma única espécie vegetal medicinal, ou composto, quando o ativo é proveniente de mais de uma espécie vegetal.
Os fitoterápicos utilizados durante o climatério são obtidos de espécies vegetais ricas em fitoestrógenos, um grupo de compostos fitoquímicos que incluem
isoflavonas, lignanas, cumestanos e estilbenos, nos quais a atividade farmacológica deriva de sua semelhança estrutural aos estrógenos, isto é, possui um anel fenólico, pré-requisito para a ligação aos receptores estrogênicos (MAHMUD, 2010;
PATISAUL e JEFFERSON, 2010; MOREIRA et al., 2014). Estudos epidemiológicos sugerem que a utilização de fitoestrógenos diminui o risco do câncer de mama, a
incidência de osteoporose e sintomas associados à menopausa. Vários fitoestrógenos apresentam propriedades antioxidantes por meio do sequestro de radicais livres, inibindo o desenvolvimento de doenças cardíacas e alguns tipos de
como a superóxido dismutase e catalase (MITCHELL et al., 1998; DIXON, 2004;
COXAM, 2008; YEHUDA et al., 2011; MOREIRA et al., 2014).
Sabe-se que a passagem pelo período de climatério até o estabelecimento da
menopausa é um processo natural e inevitável de todas as mulheres. É notório também, que as pesquisas podem descobrir novos compostos ativos capazes de minimizar este processo natural, principalmente quando o mesmo é acelerado e/ou
agravado por fatores extrínsecos. As investigações de compostos naturais, principalmente de origem vegetal, já consagrados na literatura científica pelo seu
potencial terapêutico, podem auxiliar significativamente nesse processo, fornecendo meios de evitar o envelhecimento precoce e/ou minimizar os danos provocados pela idade, além da possível descoberta de novos compostos antioxidantes, antiglicantes
e fotoprotetores.
Diante deste contexto, este trabalho permitiu o aumento do conhecimento sobre os fitoterápicos à base de Cimicifuga racemosa (cimicífuga), Trifolium pratense
(trevo-vermelho), Humulus lupulus (lúpulo) e Morus nigra (amoreira-preta) utilizados
no controle e tratamento dos sintomas do climatério, por meio de um screening de
testes antioxidantes, avaliação do potencial fotoprotetor e atividade antiglicante destas espécies. Desta forma, o mesmo favoreceu o aumento do conhecimento sobre a utilização destes fitoterápicos e enriqueceu o conhecimento científico
contribuindo assim para seu emprego na medicina preventiva e curativa, uma vez que, existiam poucas informações científicas sobre a atividade antienvelhecimento
CONCLUSÕES GERAIS
Considerando os resultados obtidos no presente estudo, pode-se concluir que:
Os extratos secos padronizados de Humulus lupulus e Cimicifuga racemosa
destacaram-se por apresentar atividade antioxidante superior aos demais
extratos nos testes DPPH, FRAP e NO. No teste TBARS, Morus nigra
apresentou o melhor potencial inibitório da peroxidação lipídica.
Todos os extratos mostraram potencial no teste ex vivo que avaliou atividade
inibitória de hemólise oxidativa induzida por AAPH em eritrócitos humanos, com destaque para H. lupulus.
Os extratos apresentaram conteúdo polifenólico e flavonoídico em
conformidade com os certificados de qualidade de matéria-prima farmacêutica, onde as atividades biológicas, antioxidante e antiglicante estão relacionadas com a presença destes compostos vegetais.
No teste de mobilidade relativa em eletroforese todos os extratos
apresentaram potencial atividade antiglicante perante os agentes glicantes
ribose e metilglioxal, na presença ou ausência do agente oxidante Cu+2, com destaque para T. pratense e M. nigra.
Em suma, todos os extratos secos padronizados dos fitoterápicos
apresentaram atividade antioxidante e antiglicante, dentro das concentrações
avaliadas, sugerindo que os mesmos são fontes de compostos que previnem e combatem o estresse oxidativo e a glicação proteica, dois processo intimamente atrelados ao envelhecimento precoce, principalmente durante o
