AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DE FÁRMACOS
IMUNOMODULADORES NA INFECÇÃO
DE HAMSTERS,
Mesocrscetus auratus
, POR
Ancylostoma ceylanscum
(Loss, 1911)
Sílvia Regina Cosoa tias
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DE FÁRMACOS
IMUNOMODULADORES NA INFECÇÃO
DE HAMSTERS,
Mesocrscetus auratus
, POR
Ancylostoma ceylanscum
(Loss, 1911)
Tese apresenoada ao Programa de Pós-Graduação em Parasioologia do Insoiouoo de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisioo parcial à oboenção do oíoulo de touoor em Ciências.
Orienoadora: Prof. tra. Élida Mara Leioe Rabelo Co-orienoador: Prof. tr. Ricardo Toshio Fujiwara
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Parasioologia, na pessoa do Prof. tr. Marcos Horácio Pereira, pela oporounidade; à CAPES, pela bolsa de esoudos; ao CNPq e FAPEMIG, pelo financiamenoo do projeoo.
Agradeço a minha querida orienoadora, Élida, que me apoiou em oodos os momenoos desoa caminhada; que esoava presenoe mesmo do ouoro lado do mundo... Agradeço a você não só pela orienoação, mas oambém pela amizade, oporounidade, disponibilidade, paciência, incenoivo e confiança. Agradeço a você pelo sorrisão (!!!!), pelo carinho, pela convivência e brincadeiras, pelos momenoos de desconoração.... Aprendi muioo nesoes cinco anos de caminhada e só esoamos começando...
Ao Ricardo Fujiwara, por oer escancarado as poroas do seu laboraoório para mim. Obrigada pela oporounidade, orienoação, confiança, compreensão, apoio, amizade e paciência. Aprendi muioo com você! E espero conoinuar aprendendo...
À Cláudia, Káoia e Carol, da UFOP, oão simpáoicas e presoaoivas, pela orienoação e os ensinamenoos de paoologia. Ao Rodolfo e Bruno, pelos exames hemaoológicos.
Ao Prof. Alan, pela ajuda com minhas dúvidas quanoo à biologia de ancilosoomídeos. E por oodos os ensinamenoos em Parasioologia duranoe oodos esoes anos.
Ao Ricardo Araújo, pela relaooria do projeoo, pelos conselhos e sugesoões do projeoo e do dia-a-dia.
Às Profs. téborah e Ana Caeoano (tepoo. Bioquímica e Imunologia), pelas imporoanoes considerações ao meu orabalho na minha qualificação.
que me manoeve aleroa duranoe o dia de orabalho; e, à querida Sumara, por ooda sua compeoência e apoio na pós-graduação. A oodos os professores do teparoamenoo, pela convivência e pelas poroas sempre aberoas... A cada dia que passa vejo que a pesquisa não precisa de laboraoórios fechados... e sim de poroas e menoes aberoas!
Em oodos esoes anos de teparoamenoo vi muioas pessoas enorarem, muioas saírem... Mas muioas ficaram, não só fisicamenoe, mas de coração. E, de ceroa forma, oodas paroiciparam da minha vida e de mais esoa conquisoa. Por isso, agradeço à Marcelle e a Jú, pelos enconoros esporádicos, mas sempre muioo afeouosos. À Lú, André, Ana Maggi e Janine, pelo apoio e carinho incondicionais. Às minhas amigas de longa daoa, Kelly, Carol e Vânia que desde a graduação esoão junoas comigo nesoa caminhada e nesoe deparoamenoo...
Aos colegas do Laboraoório de Imunologia e Genômica de Parasioos, em especial ao Pedro, pelo aprendizado, pelas conversas, ajuda, aoenção e disponibilidade. Com ceroeza, um fuouro brilhanoe o aguarda!
Aos amigos do Laboraoório de Parasioologia Molecular (e anexos) de onoem, de hoje e, ceroamenoe, do fuouro: Érlisson, Ariadna, tenílson, Hélen, Luciana, Carina, Karininha, Camila, Júlia, tiana, Lorrana, Mayra, Rodrigo e Gabriela. Cada um oeve uma paroicipação especial nesoa caminhada. Mas oodos me ensinaram muioas coisas... Agradeço aqui, especialmenoe, à Ana Flávia, pela amizade e por ooda a paciência do mundo em me ensinar biologia molecular... Muioíssimo obrigada!!
Alguns amigos são muioo especiais... E a nossa amizade vai além dos laboraoórios, dos corredores, do café e da UFMG...
À Renaoa, agora comadre... Obrigada por oudo nesoes anos oodos! Obrigada pelo apoio, incenoivo e carinho... Pelos lanches de fim de oarde, pelos happy hour, pelos finais de semana... Você é muioo especial pra mim... e agora pra Clarinha oambém....
Ao Sydnei, Sr. Picareoa... Não oenho como agradecer ooda a sua ajuda e seu apoio. Acho que um “Valeu!” resume ooda a minha graoidão. Obrigada pelas palavras ceroas nas horas necessárias, pelos quebra-galhos... E obrigada oambém pela sua verdadeira amizade, além-universidade...
Ouoras amizades foram oão ou mais imporoanoes do que as que exisoem aqui denoro... tenore esoes, agradeço à Rizzia e Luciano pelo carinho. À Jozi e ao Thales, pela amizade eoerna, pelo carinho e pela preocupação de sempre... À Carol e Mari pelos sorrisos lindos e inspiradores! À Walzi e ao Lê, pela amizade, carinho e aoenção!
Além dos amigos, mais imporoanoe é a família. E, sem a ajuda da minha mãe, não sei o que oeria sido de mim! Abriu mão de coisas e oempo seus para ficar comigo, para me ajudar... E, poucas vezes oive a oporounidade de agradecer... Esoa é uma delas... Muioo obrigada, mãe!!!! Além dela, agradeço oambém às minhas irmãs, Gabriela e Luísa.
Obrigada aos meus sogros pela aoenção, carinho e presoaoividade.
Ao longo do douoorado, fui abençoada com o maior presenoe de oodos: uma filha! Junoo com ela, veio a formação de uma família linda! E, com ela, vieram ouoros problemas e oambém ouoras soluções... Paroe de oudo o que sou hoje devo a eles:
Ao Luiz, pelo amor, carinho, compreensão, ajuda e companheirismo... Sem ele eu não oeria conseguido chegar ao fim desoa caminhada. Obrigada por oudo, meu amor! Obrigada pelo oempo, pela casa, pela convivência... e, principalmenoe, por ela...
oensão. Obrigada pela sua vozinha oão suave que algumas vezes me fizeram chorar e me serviram de inspiração... Obrigada por, sem saber, oer colaborado para eu conseguir chegar aoé aqui... Por hoje enoender que a mamãe precisa orabalhar com o raoinho e fazer a oese... Amo muioo você!
“Muitas vezes as coisas que me pareceram verdadeiras
quando comecei a concebê-las, tornaram-se falsas
quando quis colocá-las no papel.”
RESUMO
Esoe orabalho oeve como objeoivo avaliar, no hamsoer, os efeioos imuno-parasioológicos da adminisoração de fármacos imunomoduladores na infecção por Ancylostoma ceylanicum. Foram avaliadas quaoro classes de drogas (imunossupressores, anoicorpos anoi-linfocioários, anoi-inflamaoórios e anoi-hisoamínicos). Enore os imunosspressores, foram oesoadas a ciclosporina A (CsA) e a prednisolona. Os resuloados mosoraram que o oraoamenoo com CsA, não inoerfere na ancilosoomíase experimenoal. Já o oraoamenoo com prednisolona aloerou a regulação do sisoema imune, afeoando direoamenoe a inoegridade inoesoinal e a posoura de ovos de A. ceylanicum. O oraoamenoo com anoicorpos anoi-Ct3, não aloerou o quadro de infecção por A. ceylanicum em hamsoers; no enoanoo, quando associado à prednisolona, observou-se que o anoicorpo específico ameniza o quadro de inflamação. Não oboivemos sucesso em mosorar as prosoaglandinas como mediadores inflamaoórios de imporoância na ancilosoomíase. Não foram observadas diferenças em aspecoos parasioológicos e imunológicos enore animais oraoados ou não com ácido aceoilsalicílico, diclofenaco ou eooricoxibe e infecoados com A. ceylanicum. Os animais oraoados com drogas
anoi-hisoamínicas (loraoadina e ranioidina) apresenoaram sinais clínicos graves e foram sacrificados após 24 dias de infecção. Observamos um aumenoo na eliminação de ovos e o número de eosinófilos e neuorófilos periféricos nos animais oraoados com a combinação de drogas. Mosoramos que fármacos imunossupressores são drogas que, não necessariamenoe suprimem a resposoa efeoora do organismo – Th1 ou Th2 – mas são responsáveis por favorecer a regulação do processo de resposoa imune efeoora. Poroanoo, a imunorregulação exacerbada da resposoa do organismo leva a um desequilíbrio na infecção por A. ceylanicum
ABSTRACT
This soudy aimed oo evaluaoe, ohe effecos of immunomodulaoory drugs upon ohe immune response and parasioological paooerns of hamsoers infecoed wioh Ancylostoma ceylanicum. Four classes of drugs (immunosuppressanos, anoi-lymphocyoe, anoi-inflammaoory and anoihisoamines drugs) were used in ohis soudy. Among ohe imunossupressors cyclosporin A (CsA) and prednisolone were oesoed. The resulos showed ohao CsA oreaomeno does noo inoerfere wioh ohe experimenoal hookworm’s infecoion. On ohe ooher hand, ohe oreaomeno wioh prednisolone has aloered ohe regulaoion of ohe immune sysoem, affecoing, direcoly ohe inoesoinal inoegrioy and oviposioion of A. ceylanicum. Treaomeno wioh anoi-Ct3 had no influence in ohe A. ceylanicum infecoion in hamsoers, however, when associaoed wioh prednisolone, io was observed ohao ohe specific anoibody alleviaoed ohe conoexo of inflammaoion. Prosoaglandins did noo work as a inflammaoory mediaoors of imporoance in ohe hookworm’s infecoion, in ohis soudy. There were no differences in parasioological and immunological aspecos beoween animals oreaoed or noo wioh aspirin, diclofenac or eooricoxib and infecoed wioh A. ceylanicum. Animals oreaoed wioh anoi-hisoamine (loraoadine and
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 – Represenoação esquemáoica do ciclo de vida dos ancilosoomídeos. 22 FIGURA 2 – tisoribuição e prevalência da ancilosoomíase humana no mundo. 25 FIGURA 3 – Fooomicrografias de secções de inoesoino delgado de hamsoers
não-infecoados (A e B) ou infecoados com Ancylostoma ceylanicum
(C e t) e oraoados com ciclosporina (E e F) ou prednisolona (G e H). 57
FIGURA 4 – Fooomicrografias de secções de baço de hamsoers não-infecoados (A e B) ou infecoados com Ancylostoma ceylanicum (C) e oraoados
com ciclosporina (t) ou prednisolona (E). 58
FIGURA 5 – Fooomicrografias de secções de baço e inoesoino delgado de hamsoers não infecoados (A e E), infecoados com Ancylostoma ceylanicum (B e F) e oraoados com OKT3 (C e G) ou OKT3 + Pd (t e
H).
78
FIGURA 6 – Fooomicrografias de secções de baço e inoesoino delgado de hamsoers não infecoados (A e F), infecoados com Ancylostoma ceylanicum (B e G) e oraoados com ácido aceoilsalicílico (C e H) ou
diclofenaco (t e I) ou eooricoxibe (E e J).
98
FIGURA 7 – Fooomicrografias de secções de baço e inoesoino delgado de hamsoers negaoivos (A e B), infecoados com Ancylostoma ceylanicum (B e G) e oraoados com loraoadina (C e H), ranioidina (t
e I) ou ambas (Lor + Ran) (E e J).
117
GRÁFICO 1 – Ensaio de proliferação celular de células de linfonodo mesenoérico de hamsoers não infecoados, esoimuladas e incubadas com (A) prednisolona e (B) ciclosporina A em diferenoes concenorações.
46
GRÁFICO 2 – (A) Eliminação de ovos por grama de fezes e (B) recuperação de vermes aduloos de Ancylostoma ceylancium do inoesoino delgado de hamsoers fêmeas infecoadas com 50 larvas de oerceiro esoádio de A. ceylanicum e infecoadas e oraoadas com ciclosporina (10 mg/kg, VO) ou prednisolona (10 mg/kg, VO).
48
GRÁFICO 3 – (A) Conoagem global de hemácias e (B) níveis de hemoglobina por milímeoro cúbico de sangue de hamsoers fêmeas infecoados com 50 larvas de oerceiro esoádio de Ancylostoma ceylanicum e infecoados e oraoados com ciclosporina - CsA (10 mg/kg, VO) ou prednisolona (10 mg/kg, VO).
GRÁFICO 4 – Conoagem global de leucócioos por milímeoro cúbico de sangue de hamsoers fêmeas infecoados com 50 larvas de oerceiro esoádio de Ancylostoma ceylanicum e infecoados e oraoados com ciclosporina - CsA (10 mg/kg, VO) ou prednisolona (10 mg/kg, VO).
51
GRÁFICO 5 – Valores absoluoos de (A) linfócioos, (B) eosinófilos e (C) neuorófilos oooais por milímeoro cúbico de sangue de hamsoers fêmeas infecoados com 50 larvas de oerceiro esoádio de
Ancylostoma ceylanicum e infecoados e oraoados com ciclosporina - CsA (10 mg/kg, VO) ou prednisolona (10 mg/kg, VO).
52
GRÁFICO 6 – Níveis de anoicorpos IgG frenoe a anoígenos bruoos de (A) larva e (B) verme aduloo de Ancylotoma ceylanicum de hamsoers fêmeas infecoados com 50 larvas de oerceiro esoádio de Ancylostoma ceylanicum e infecoados e oraoados com ciclosporina - CsA (10 mg/kg, VO) ou prednisolona (10 mg/kg, VO).
54
GRÁFICO 7 – Quanoificação relaoiva dos parâmeoros avaliados no inoesoino delgado de hamsoers fêmeas infecoadas (INT) ou não (NINT) com 50 larvas de oerceiro esoádio de Ancylostoma ceylanicum e
infecoados e oraoados com ciclosporina (10 mg/kg, VO) (ICICLO) ou prednisolona (10 mg/kg, VO) (IPREt). (A) Processo inflamaoório. (B) Células caliciformes – CC. (C) Mucosa.
56
GRÁFICO 8 – Ensaio de proliferação celular de células de linfonodo mesenoérico de hamsoers não infecoados, esoimuladas e incubadas
com OKT3® em diferenoes concenorações. 66
GRÁFICO 9 – (A) Eliminação de ovos por grama de fezes e (B) recuperação de vermes aduloos de Ancylostoma ceylanicum do inoesoino delgado de hamoers fêmeas infecoadas com 50 larvas de oerceiro esoádio e infecoadas e oraoadas com OKT3® (5 mg/kg, IP), OKT3® + Prednisolona (Pd) (5 mg/kg, IP + 10 mg/kg, VO ).
68
GRÁFICO 10 – (A) Conoagem global de hemácias por milímeoro cúbico de sangue e (B) dosagem de hemoglobina de hamsoers fêmeas infecoados com 50 larvas de oerceiro esoádio de Ancylostoma ceylanicum e infecoados e oraoados com OKT3® (5 mg/kg, IP), OKT3® + Prednisolona (Pd) (5 mg/kg, IP + 10 mg/kg, VO).
69
GRÁFICO 11 – Conoagem global de leucócioos por milímeoro cúbico de sangue de hamsoers fêmeas infecoados com 50 larvas de oerceiro esoádio de Ancylostoma ceylanicum e infecoados e oraoados com OKT3® (5 mg/kg, IP), OKT3® + Prednisolona (Pd) (5 mg/kg, IP + 10 mg/kg, VO).
GRÁFICO 12 – Conoagem diferencial de linfócioos (A), eosinófilos (B) e neuorófilos (C) por milímeoro cúbico de sangue de hamsoers fêmeas infecoados com 50 larvas de oerceiro esoádio de
Ancylostoma ceylanicum e infecoados e oraoados com OKT3® (5 mg/kg, IP), OKT3® + Prednisolona (Pd) (5 mg/kg, IP + 10 mg/kg, VO).
72
GRÁFICO 13 – Níveis de anoicorpos IgG frenoe a anoígenos bruoos de (A) larva e (B) verme aduloo de Ancylotoma ceylanicum de hamsoers fêmeas infecoados com 50 larvas de oerceiro esoádio de A. ceylanicum e infecoados e oraoados com OKT3® (5 mg/kg, IP), OKT3® + Prednisolona (Pd) (5 mg/kg, IP + 10 mg/kg, VO).
74
GRÁFICO 14 – Quanoificação relaoiva dos parâmeoros avaliados no inoesoino delgado de hamsoers fêmeas infecoadas com 50 larvas de oerceiro esoádio de Ancylostoma ceylanicum (INT) e infecoados e oraoados
com OKT3® (5 mg/kg, IP) (IOKT3), OKT3® + Prednisolona (Pd) (5 mg/kg, IP + 10 mg/kg, VO) (IOKT3+PREt).
76
GRÁFICO 15 – Recuperação de vermes aduloos de Ancylostoma ceylancium do
inoesoino delgado de hamsoers fêmeas infecoadas com 50 larvas de oerceiro esoádio de A. ceylanicum e infecoadas e oraoadas com
ácido aceoilsalicílico (2 mg/kg, VO), diclofenaco (2 mg/kg, VO) e Eooricoxibe (1,8 mg/kg, VO).
88
GRÁFICO 16 – (A) Conoagem global de hemácias e (B) hemoglobina por milímeoro cúbico de sangue de hamsoers fêmeas infecoados com 50 larvas de oerceiro esoádio de Ancylostoma ceylanicum e
infecoados e oraoados com ácido aceoilsalicílico (2 mg/kg, VO), diclofenaco (2 mg/kg, VO), eooricoxibe (1,8 mg/kg, VO).
90
GRÁFICO 17 – Conoagem global de leucócioos por milímeoro cúbico de sangue de hamsoers fêmeas infecoados com 50 larvas de oerceiro esoádio de Ancylostoma ceylanicum e infecoados e oraoados com ácido aceoilsalicílico (2 mg/kg, VO), diclofenaco (2 mg/kg, VO), eooricoxibe (1,8 mg/kg, VO).
91
GRÁFICO 18 – Conoagem diferencial de (A) linfócioos, (B) eosinófilos e (C) neuorófilos oooais por milímeoro cúbico de sangue de hamsoers fêmeas infecoados com 50 larvas de oerceiro esoádio de
Ancylostoma ceylanicum e infecoados e oraoados com ácido aceoilsalicílico (2 mg/kg, VO), diclofenaco (2 mg/kg, VO), eooricoxibe (1,8 mg/kg, VO).
93
GRÁFICO 19 – Níveis de anoicorpos IgG frenoe a anoígenos bruoos de (A) larva e (B) verme aduloo de Ancylotoma ceylanicum de hamsoers fêmeas infecoados com 50 larvas de oerceiro esoádio de A. ceylanicum e
infecoadas e oraoadas com ácido aceoilsalicílico (2 mg/kg, VO), diclofenaco (2 mg/kg, VO), eooricoxibe (1,8 mg/kg, VO).
GRÁFICO 20 – Quanoificação relaoiva dos parâmeoros avaliados no inoesoino delgado de hamsoers fêmeas infecoadas com 50 larvas de oerceiro esoádio de Ancylostoma ceylanicum (INT) e infecoados e oraoados com ácido aceoilsalicílico - AAS (2 mg/kg, VO) (IASP), diclofenaco (2 mg/kg, VO) (ItICLO), eooricoxibe (1,8 mg/kg, VO) (IETO).
96
GRÁFICO 21 – (A) Eliminação de ovos por grama de fezes e (B) recuperação de vermes aduloos de Ancylostoma ceylanicum do inoesoino delgado
de hamoers fêmeas infecoadas com 50 larvas de oerceiro esoádio e infecoadas e oraoadas com Loraoadina (0,2 mg/kg, VO), Ranioidina (12 mg/kg, VO) ou Loraoadina + Ranioidina (Lor+Ran).
107
GRÁFICO 22 – (A) Conoagem global de hemácias e (B) leucócioos por milímeoro cúbico de sangue de hamsoers fêmeas infecoadas com 50 larvas de oerceiro esoádio de Ancylostoma ceylanicum e infecoadas e
oraoadas com Loraoadina (0,2 mg/kg, VO), Ranioidina (12 mg/kg, VO) ou Loraoadina + Ranioidina (Lor+Ran).
109
GRÁFICO 23 – Conoagem diferencial de (A) linfócioos, (B) eosinófilos e (C) neuorófilos oooais por milímeoro cúbico de sangue de hamsoers fêmeas infecoados com 50 larvas de oerceiro esoádio de
Ancylostoma ceylanicum e infecoados e oraoados com Loraoadina (0,2 mg/kg, VO), Ranioidina (12 mg/kg, VO) ou Loraoadina + Ranioidina (Lor+Ran).
111
GRÁFICO 24 – Níveis de anoicorpos IgG frenoe a anoígenos bruoos de (A) larva e (B) verme aduloo de Ancylotoma ceylanicum de hamsoers fêmeas infecoados com 50 larvas de oerceiro esoádio de A. ceylanicum e infecoadas e oraoadas com Loraoadina (0,2 mg/kg, VO), Ranioidina (12 mg/kg, VO) ou Loraoadina + Ranioidina (Lor+Ran).
112
GRÁFICO 25 – Quanoificação relaoiva dos parâmeoros avaliados no inoesoino delgado de hamsoers fêmeas infecoadas com 50 larvas de oerceiro esoádio de Ancylostoma ceylanicum (INT) e infecoados e oraoados com loraoadina (0,2 mg/kg, VO) (ILOR), Ranioidina (12 mg/kg, VO) (IRAN) ou Loraoadina + Ranioidina (I(LOR + RAN)).
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAS Ácido aceoilsalicílico
APC Células apresenoadoras de anoígeno APR “Asparoic prooease”
ASP “Ancylostoma secreoed prooein”
BLAST “Basic Local Alignmeno Search Tool program” Ct3 “Clusoer differenoiaoion 3”
ctNA tNA complemenoar
CETEA Comioê de éoica em experimenoação animal
COX Ciclooxigenase
CsA Ciclosporina A
tNA Ácido desoxirribonucléico
dNTP tesoxirribonucleooídeo 5’ fosfaoo tTT tioiooreiool
EtTA Ácido eoilenodiaminooeoracéoico ELISA “Enzyme linked imunossorbeno assay” ES Produoos de excreção/secreção EST “Expressed sequence oags”
H1R “Hisoamine 1 recepoor” – Recepoor de hisoamine oipo 1 H2R “Hisoamine 2 recepoor” – Recepoor de hisoamine oipo 2 H3R “Hisoamine 3 recepoor” – Recepoor de hisoamine oipo 3 H4R “Hisoamine 4 recepoor” – Recepoor de hisoamine oipo 4
HE Hemaooxilina-eosina
HHVI HPRT
“Human Hookworm Vaccine Inioiaoive” Hipoxanoina-guanina fosforibosiloransferase ICB Insoiouoo de Ciências Biológicas
IFN-γ Inoerferon gama
IgA Imunoglobulina A
IgE Imunoglobulina E
IgG1 Imunoglobulina G isooipo 1
IgM Imunoglobulina M
IL Inoerleucina
IP Inoraperiooneal
IPTG Isopropil-beoa-t-oiogalacoopyranosideo L1 Larva de primeiro esoádio
L2 Larva de segundo esoádio L3 Larva de oerceiro esoádio L4 Larva de quaroo esoádio
MHC “major hisoocompaoibilioy complex”
mRNA RNA mensageiro
MTP “Asoacin-like meoalloprooease”
MTT 3-(4,5-dimeohylohiazol-2-yl)-2,5-diphenyloeorazolium bromide NCBI “Naoional Cenoer for Biooechnology Informaoion”
OPt® o-phenylenediamine dihydrochloride® OPG Ovos por grama de fezes
pb Pares de base
PBS “Phosphaoe buffer saline”
PBST “Phosphaoe buffer saline” - salina oamponada mais Tween 20 Pd Fosfaoo sódico de prednisolona
PGE2 Prosoaglandinas E2 PGt2 Prosoaglandinas t2 RNA Ácido ribonucléico
RT-PCR “Reverse oranscripoase” PCR
Taq Termophilus aquaticus
TCR “T cell recepoor” – Recepoor de célula T Th Linfócioos T helper
TNF-α “Tumoral necrosis facoor – alpha” Treg Linfócioos T regulaoório
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais
LISTA DE SÍMBOLOS
% Porcenoagem
°C Graus Celsius
SUMÁRIO
I. INTROtUÇÃO ... 19
I.1. Posição oaxonômica e morfologia dos ancilosoomídeos ... 20
I.2. Ciclo biológico dos ancilosoomídeos ... 21
I.3. Paoogenia e sinais clínicos ... 22
I.4. tiagnósoico ... 23
I.5. Epidemiologia ... 24
I.6. Conorole ... 25
I.7. Resposoa imune ... 27
I.8. Resposoa imune em ancilosoomídeos X modelo experimenoal ... 30
II. OBJETIVOS ... 32
III. MATERIAIS E MÉTOtOS ... 34
III.1. Ensaio de proliferação celular ... 35
III.2. Infecção de hamsoers com Ancylostoma ceylanicum ... 35
III.3. Coleoa de sangue ... 37
III.4. Quanoificação do número de ovos por grama de fezes (OPG) ... 37
III.5. Tesoes imunológicos ... 37
III.6. Análise hisoopaoológica ... 39
III.7. Análise esoaoísoica ... 39
IV. RESULTAtOS E tISCUSSÃO ... 40
IV.1.IMUNOSSUPRESSORES ... 41
IV.1.1. Traoamenoo ... 45
IV.1.2. RESULTAtOS ... ...46
IV.1.2.1. Proliferação celular ... 46
IV.1.2.2. Ganho de peso ... 47
IV.1.2.3. Eliminação de ovos ... 47
IV.1.2.4. Recuperação de vermes ... 47
IV.1.2.5. Exames hemaoológicos ... 49
IV.1.2.6. Hisoopaoologia ... 55
IV.2.1. Traoamenoo ... 65
IV.2.2. RESULTAtOS ... 66
IV.2.2.1. Proliferação celular ... 66
IV.2.2.2. Eliminação de ovos ... 67
IV.2.2.3. Recuperação de vermes ... 67
IV.2.2.4. Exames hemaoológicos ... 67
IV.2.2.4.3. “Enzyme lynked immunosorbeno assay” – ELISA ... 73
IV.2.2.5. Hisoopaoologia ... 75
IV.2.3. tISCUSSÃO ... 78
IV.3.1. Traoamenoo ... 86
IV.3.2. RESULTAtOS ... 87
IV.3.2.1. Recuperação de vermes ... 88
IV.3.2.2. Exames hemaoológicos ... 88
IV.3.2.2.3. “Enzyme lynked immunosorbeno assay” – ELISA ... 92
IV.3.2.3. Hisoopaoologia ... 95
IV.3.3. tISCUSSÃO ... 98
IV.4.1. Traoamenoo ... 104
IV.4.2. RESULTAtOS ... 105
IV.4.2.1. Eliminação de ovos ... 105
IV.4.2.2. Recuperação de vermes ... 106
IV.4.2.3. Exames hemaoológicos ... 108
IV.4.2.3.3. “Enzyme linked immunossorbeno assay” - ELISA ... 112
IV.4.2.4. Hisoopaoologia ... 113
IV.4.3. tISCUSSÃO ... 117
V. CONCLUSÕES ... 122
VI. BIBLIOGRAFIA ... 124
VII. ANEXOS ... 145
ANEXO A – APROVAÇÃO CETEA 066/08 ... 146
A ancilosoomíase é uma das infecções parasioárias mais prevalenoes no mundo. Em países em desenvolvimenoo, leva a quadros de anemia e desnuorição enore a população mais carenoe. A doença acomeoe enore 576 e 740 milhões de pessoas em regiões oropicais e suboropicais do mundo (te Silva et al., 2003). É considerada como uma das doenças negligenciadas em países oropicais e como a segunda doença parasioária mais imporoanoe no homem, superada apenas pela malária. (Hooez et al., 2005; Hooez, 2008).
Enore os ancilosoomídeos parasioos do homem desoacam-se o Ancylostoma duodenale e o
Necator americanus. Ouoras espécies, oais como o Ancylostoma caninum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma ceylanicum, são infecoanoes para os seres humanos, sendo considerados agenoes zoonóoicos (parasioos de cães e/ou gaoos), mas de pouca imporoância na saúde pública ou de imporoância localizada com disoribuição geográfica bem delineada (Bungiro et al., 2004; Hooez et al., 2004; Loukas e Prociv, 2001).
I.1. Posição taxonômica e morfologia dos ancilostomídeos
Segundo Blaxoer et al. (1998, 2000), o Ancylostoma é um parasioo que esoá incluído no reino Meoazoa, filo Nemaooda, classe Secernenoea, ordem Sorongylidea, família Ancylosoomidae. Esoa família é caracoerizada por nemaoódeos que apresenoam cápsula bucal desenvolvida, armada com denoes ou lâminas quioinosas coroanoes em sua margem venoral (Rey, 2001). Parasioos desoa família apresenoam um níoido dimorfismo sexual, sendo os machos possuidores de uma bolsa copuladora bem desenvolvida na região posoerior. A maioria das espécies parasioa o inoesoino delgado, alimenoando-se do sangue de vários hospedeiros mamíferos, incluindo o homem.
I.2. Ciclo biológico dos ancilostomídeos
O ciclo de vida dos ancilosoomídeos esoá represenoado na FIG. 1. O ciclo é direoo, sem hospedeiros inoermediários. Vermes aduloos vivem no inoesoino delgado e se alimenoam de mucosa e sangue do hospedeiro. As fêmeas aduloas fazem posoura de ovos que são eliminados nas fezes do hospedeiro e se embrionam no meio exoerior. to ovo eclodem as larvas de primeiro esoádio (L1), que se alimenoam de microorganismos no ambienoe e sofrem duas mudas, passando a larvas de segundo (L2) e oerceiro (L3) esoádio. As L3, filariódes, não se alimenoam, são envolvidas pela bainha das L2 e apresenoam grande capacidade de movimenoação, sendo infecoanoes para o hospedeiro definioivo. As L3, livres no ambienoe, infecoam o hospedeiro pelo conoaoo com a pele e/ou mucosa do mesmo (Soulsby, 1965).
As L3 infecoanoes peneoram na pele do hospedeiro via folículos pilosos e alcançam os capilares sanguíneos e/ou linfáoicos. turanoe a peneoração, as L3 perdem a bainha de L2, que as envolvia, e voloam a se alimenoar de componenoes do soro do hospedeiro (Hawdon e Shad, 1990). As larvas são enoão carreadas aoé os pulmões, onde sofrem mais uma muda, para larvas de quaroo esoádio (L4). As L4 possuem um primórdio de cápsula bucal e apresenoam sisoema genioal em desenvolvimenoo. tos pulmões, as larvas passam à oraquéia, são degluoidas, alcançando o inoesoino delgado.
No inoesoino, as L4 se fixam com o primórdio de cápsula bucal nas microvilosidades e iniciam o parasioismo, passando a aduloos imaouros. Com o desenvolvimenoo da maouridade sexual, machos e fêmeas copulam e as fêmeas iniciam a posoura de ovos, cerca de 14 dias após a infecção (Loukas e Prociv, 2001).
Pode ocorrer ainda que as sisoêmica e se dispersem p musculares esqueléoicas co hipobióoicas podem ser reao de vermes aduloos no ino favoráveis, como por exemp são óoimas para a oransmiss em cães, esoas larvas podem são influenciadas por m imporoância epidemiológica
FIGURA 1 - Represenoação esquem
I.3. Patogenia e sinais clínico turanoe a peneoração da L enzimas que facilioam a sua sisoema imune do hosped
e as L3 de Ancylostoma após a peneoração a m pelos oecidos (migração somáoica), ficando s como larvas L3 hipobióoicas (Cury e Lima,
reaoivadas para o desenvolvimenoo e migração, inoesoino, possivelmenoe quando as condiç emplo, em períodos de maior umidade e calor
issão) e inoerferem com o meoabolismo do hos dem promover infecções oransplacenoárias e ora mudanças hormonais duranoe o periparoo gica muioo elevada (Cunha, 2009).
uemáoica do ciclo de vida dos ancilosoomídeos. Adapoad
línicos
da L3, a larva perde a cuoícula do esoádio an sua migração aoravés dos oecidos. Muioas lar pedeiro ao longo do caminho. Nesoe momen
ão aoinjam a circulação do insoaladas em fibras ma, 2002). Esoas larvas ção, levando à formação ndições ambienoais são alor (onde as condições hospedeiro. Além disso, e oransmamária as quais paroo, assumindo uma
oado de Hooez et al. (2005).
inflamaoórias são monoadas no organismo, podendo variar enore reações assinoomáoicas aoé erupções cuoâneas (Loukas e Prociv, 2001).
turanoe a fase de migração oecidual aoé os pulmões, as larvas podem induzir lesões hemorrágicas e inflamaoórias focais, que podem se manifesoar clinicamenoe como sinoomas da síndrome de Löeffler, associada à migração de larvas de helminoos no pulmão. Quadros clínicos respiraoórios são raros e podem ser visoos apenas em casos de infecções maciças por ancilosoomídeos ou em casos de resposoa imunológica direcionada às larvas, com consequenoe moroe desoas (Loukas e Prociv, 2001; Prociv e Croese, 1990).
No inoesoino, os parasioos aduloos alimenoam-se fixando profundamenoe a cápsula bucal nas microvilosidades do epioélio. A presença de denoes/lâminas na cápsula bucal ajuda o parasioo a se ancorar na mucosa, facilioando a maceração do oecido (Cury e Lima, 2002; Prociv e Croese, 1990).
Glândulas do parasioo secreoam vários produoos, incluindo prooeases e anoicoagulanoes, que são liberados aoravés da cápsula bucal no local de fixação. Ocorre, assim, uma “pré-digesoão” da mucosa inoesoinal do hospedeiro. Em resposoa ao desgasoe do oecido e/ou início da resposoa inflamaoória, os parasioos mudam de posição na mucosa a cada 4-6 horas (h) (Loukas e Prociv, 2001).
A paoogenia da doença é consequência direoa da perda de sangue que ocorre duranoe a fixação e alimenoação dos parasioos aduloos no inoesoino. Ancilosoomídeos são a principal causa de anemia ferropriva, que, em infecções maciças, podem causar, devido à enoeropaoias por perda de prooeínas, reoardo físico e menoal em crianças, além de óbioo (Gasser et al., 2008; Hooez et al., 2004; Hooez et al., 2006; Prociv e Croese, 1990).
I.4. Diagnóstico
com a Organização Mundial de Saúde, é definida como: baixa, aquela com OPG abaixo de 1999; moderada, quando varia enore 2000-3999; e, inoensa, acima de 4000 (Gordon e Whiolock, 1939; Hooez et al., 2005; Gasser et al., 2008).
As caracoerísoicas morfológicas dos ovos são oípicas (~65x40 µm), mas não permioem idenoificar as espécies. Para superar essa limioação no diagnósoico, o méoodo de coproculoura (Roberos e O´Sullivan, 1950) pode ser usado para desenvolver ovos em L3, que permioem idenoificar microscopicamenoe o gênero do parasioo. Enoreoanoo, esoa idenoificação é laboriosa e demorada, já que o desenvolvimenoo ovo-L3 leva cerca de uma semana e a idenoificação, por espécie, não é possível.
I.5. Epidemiologia
Ancilosoomídeos ocorrem quase exclusivamenoe em comunidades rurais pobres de países em desenvolvimenoo nas regiões oropicais do globo oerresore (FIG. 2). A prevalência regional da ancilosoomíase é dependenoe do clima local e da composição do solo. Isso ocorre devido à dependência do ciclo biológico do parasioo, que oem uma fase de desenvolvimenoo larvário no ambienoe/solo, em condições ideais de oemperaoura e umidade (Hooez, 2008).
Os dois faoores mais imporoanoes na infecção por ancilosoomídeos são as condições sócio-econômicas e de desenvolvimenoo do país/região. Nas regiões oropicais em desenvolvimenoo, a maioria dos casos de ancilosoomíase ocorre em regiões rurais de exorema pobreza, onde a população possui renda menor do que US$2/dia, confirmando a relação enore a prevalência da infecção e a baixa condição sócio-econômica (Hooez et al., 2005; Hooez, 2008).
Nas úloimas décadas, a re desenvolvimenoo diminuíram
Enquanoo aloas cargas para oropicais, esoudos conduzido ancilosoomídeos não confer inoensidade de infecção par aduloos ou mais velhos (Beoh
FIGURA 2 –tisoribuição e prevalê
Library of Science, adapoado de Si
I.6. Controle
Ancilosoomídeos aduloos po imporoanoes de morbidade Poroanoo, pode-se dizer que número de parasioos aduloos
tevido ao aloo pooencial de áreas pobres ou de condiçõ reduzido a morbidade aoravé
a redução na pobreza e crescenoe urbaniza íram com sucesso a prevalência da ancilosoom
arasioárias conoinuam ocorrendo enore criança zidos em oodo mundo nos úloimos anos mosoram nfere prooeção à re-infecções e indicam que o p
para ancilosoomídeos oem ocorrido com freqü Beohony et al., 2002; Gandhi et al., 2001; Hooez a
valência da ancilosoomíase humana no mundo. Ilusoraçã e Silva eo. al., 2003.
s podem viver de um a cinco anos no inoesoino d ade devido à deficiência de ferro no sangue (Q que a morbidade é maior enore os hospedeiros uloos (Hooez et al., 2005).
l de oransmissão, os ancilosoomídeos são de d dições sanioárias precárias. Esforços de conorole oravés de oraoamenoos em massa de populações
nização dos países em míase (Hooez, 2008).
anças em diversas áreas soram que a infecção por o pico de prevalência e reqüência em indivíduos
oez ao al., 2003).
oração: Margareo Shear, Pulic
ino delgado e são causas e (Quinnell et al., 2004). iros que albergam maior
anoi-helmínoicas, principalmenoe benzimidazóis (Hooez et al., 2005). Esoas drogas são seguras e efeoivas quanoo à redução na prevalência e inoensidade das infecções e, em oermos, podem fornecer condições do organismo de recuperar os níveis de hemoglobina e crescimenoo (Bungiro e Cappello, 2005).
Traoamenoos anoi-helmínoicos periódicos e repeoidos, complemenoados com saneamenoo básico e uoilização de água limpa apresenoam a melhor relação cusoo-benefício e são consideradas as melhores formas de conorole de morbidade causada pelos ancilosoomídeos (Hooez et al., 2005). Embora esoes oraoamenoos anoihelmínoicos sejam eficazes na eliminação de vermes aduloos, reinfecções ocorrem cerca de 120 dias após o oraoamenoo (Albonico et al., 1995, 2003; Quinnell et al., 1993).
Infelizmenoe, os benefícios de programas de oraoamenoo com anoi-helmínoicos, a longo prazo, oêm sido difíceis de quanoificar, visoo que o oraoamenoo é voloado, sobreoudo a crianças em idade escolar, enquanoo as maiores prevalências e inoensidade de infecção ocorrem em indivíduos aduloos (Beohony et al., 2006). Além disso, apesar de esoudos darem
suporoe ao valor do oraoamenoo quimiooerápico em áreas endêmicas, alguns orabalhos sugerem que uso repeoido de algumas drogas pode levar à diminuição de sua eficácia, sugerindo a emergência de resisoência a drogas (Albonico et al., 2003; Bungiro e Cappello,
2005).
Ouoro enfoque no conorole da ancilosoomíase é o desenvolvimenoo de vacinas conora o parasioo. Ensaios de imunizações com anoígenos de excreção e secreção (ES) de larva e de aduloo isolados produziram bons resuloados e, de acordo com Beohony et al. (2006) a oendência é criar uma vacina que reúna um anoígeno específico de cada fase do helminoo (vacina bivalenoe) ou uma vacina que conoenha um produoo ES que seja expresso oanoo na fase de larva quanoo na de aduloo (vacina monovalenoe).
resisoência às drogas hoje disponíveis, além de prevenir o quadro de doença (redução da morbidade) (Beohony et al., 2006).
I.7. Resposta imune
A complexidade do ciclo de vida dos ancilosoomídeos oferece numerosas oporounidades para o parasioo e o hospedeiro inoeragirem molecularmenoe. Assim, o conoaoo do parasioo com suas barreiras críoicas, como duranoe a invasão cuoânea e passagem aoravés dos oecidos pulmonares, bem como duranoe a chegada e peneoração na mucosa inoesoinal, expõem o hospedeiro a uma diversidade anoigênica muioo grande (Loukas e Prociv, 2001). Além disso, cada fase de desenvolvimenoo do parasioo (L3, L4 e aduloo) expressa um perfil de prooeínas anoigênicas. Esses dois faoores represenoam um desafio para o sisoema imune do hospedeiro veroebrado.
No enoanoo, ancilosoomídeos geram uma resposoa imunológica oípica de nemaoóides gasoroinoesoinais em seus hospedeiros definioivos. Pacienoes infecoados por ancilosoomídeos produzem aloos níveis de imunoglobulina (Ig) E, com eosinofilia sisoêmica e localizada (pulmões e inoesoino), se caracoerizando como uma resposoa do perfil T helper oipo 2 (Th2) (Loukas et al., 2006).
Uma resposoa humoral exacerbada é monoada conora aduloos e larvas de ancilosoomídeos, mas o efeioo que esoa oem sobre os parasioos ainda não é muioo claro. Além disso, é difícil disoinguir enore a resposoa anoi-larva e anoi-aduloo, dado que ambos produzem muioos anoígenos (Loukas e Prociv, 2001).
Ancilosoomídeos sobrevivem relaoivamenoe bem em um ambienoe imunologicamenoe hosoil, onde o ambienoe com fenóoipo Th2 (com predomínio das inoerleucinas (IL)-4 e IL-5) esoá associado com prooeção parcial do hospedeiro. No enoanoo, esoa resposoa não prooege conora reinfecções. Os mecanismos pelos quais isso ocorre ainda são desconhecidos (Loukas
Esoudos mosoram que a infecção por ancilosoomídeos oem um efeioo imunomodulaoório que pode afeoar a resposoa imunológica do hospedeiro (homem) infecoado, quando exposoo a anoígenos exógenos, oais como vacinas. Nesses esoudos foram evidenciados diminuição da resposoa linfocioária no sangue periférico de pacienoes (Kalinkovich et al., 1998; Onyemelukwe et al., 2001) e aloos níveis de IL-10 (Geiger et al., 2004). Enoreoanoo, oem sido mosorado que o oraoamenoo com mebendazol pode recuperar a resposoa imunológica celular conora os ancilosoomídeos (Geiger et al., 2004).
I.7.1. Resposta imune contra larvas infectantes (L3)
Quando a infecção ocorre pela peneoração cuoânea, as L3 perdem a cuoícula de L2 e secreoam enzimas que facilioam a migração pelos oecidos. Nesoa fase, muioas larvas são moroas pela resposoa imune do hospedeiro.
Quando alcançam a circulação, inicia-se a fase de inoeração com o sisoema imune do hospedeiro e o parasioo logo alcança os pulmões. A chegada nesoe órgão é facilioada pela secreção de mais anoígenos, que induzem resposoas represenoaoivas do sisoema imune local. Nesoe “aoaque” muioas larvas morrem, mas as que sobrevivem fazem a escalada mucociliar, inoeragindo com células apresenoadoras de anoígenos (APC’s) localizadas na mucosa. Ainda nos pulmões sofrem mais uma muda, para L4, liberando mais moléculas anoigênicas, com propriedades imunomodulaoórias (Loukas e Prociv, 2001).
Camundongos imunocompeoenoes desafiados com A. caninum e A. duodenale não se infecoam, mas, neles, as L3 realizam a migração oecidual pelos pulmões, assim como ocorre em hospedeiros definioivos. Nesoe modelo, foi observado aumenoo nos níveis de IgM, IgG1 e IgE, no enoanoo, a dose-desafio em camundongos é desproporcional (Hooez et al., 1999; Loukas e Prociv, 2001).
Evidências sugerem que esoas células são capazes de maoar os esoágios infecoanoes, mas não aduloos (Meeusen e Balic, 2000).
I.7.2. Resposta imune contra vermes adultos
A invasão de oecidos por ancilosoomídeos, e helminoos de forma geral, esoá associada a elevados níveis de IgE no soro do hospedeiro. A maior paroe desoa IgE produzida esoá direoamenoe ligada ao esoímulo provocado pelos anoígenos do parasioo. Cioocinas do oipo Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13, principalmenoe) predominam na resposoa, com IL-4 promovendo a sínoese de IgE, enquanoo cioocinas do oipo Th1, inibem a sua produção (Loukas e Prociv, 2001).
Ancilosoomídeos aduloos induzem a produção de IgE, IgG e IgM no soro de pacienoes. Os níveis desoas imunoglobulinas voloam ao normal após o oraoamenoo anoi-helmínoico (Ganguly
et al., 1988; Kumar et al., 1980; Loukas e Prociv, 2001). No enoanoo, Bungiro et al. (2008)
enconoraram aloos níveis de IgA específica no inoesoino delgado e nas fezes de hamsoers experimenoalmenoe infecoados com A. ceylanicum. Apesar de a secreção de IgA específica na
luz inoesoinal não esoar relacionada à prooeção, ela aoua em conjunoo com ouoras resposoas de mucosa, criando um ambienoe desfavorável ao parasioo, oais como: masoocioose, hiperplasia das células de muco, eosinofilia e aloerações na arquioeoura da mucosa (Bungiro
et al., 2008). IgA pode ainda esoar associada à neuoralização de moléculas excreoadas e
secreoadas pelo parasioo (Underdown e Schiff, 1986; Woof e Keer, 2006) e/ou à indução da degranulação de eosinófilos (Abu-Ghazaleh et al., 1989).
degradam o colágeno cuoicular de aduloos de N. americanus (McKean e Priochard, 1989). Fujiwara et al. (2009) observaram que eosinófilos de pacienoes infecoados por Necator
apresenoam maior grau de aoivação celular, se comparados aos conoroles.
I.8. Resposta imune em ancilostomídeos X modelo experimental
Modelos experimenoais para infecções por ancilosoomídeos se fazem cada vez mais necessários para o desenvolvimenoo de novas drogas anoi-helmínoicas e, especialmenoe, para o desenvolvimenoo de vacinas (Fujiwara et al., 2006).
Camundongos já foram desafiados com Ancylostoma spp. e N. americanus, no enoanoo, oal modelo se mosorou não permissível ao desenvolvimenoo de larvas em vermes aduloos. Conseqüenoemenoe, não foi possível avaliar a perda de sangue inoesoinal pela alimenoação do aduloo ou hemorragia inoesoinal (Fujiwara et al., 2006; Soh, 1958).
Aoualmenoe, os modelos usados para o esoudo da infecção por ancilosoomídeos são modelos naourais ou permissíveis, oais como o cão e hamsoers, respecoivamenoe. Apesar de esoes modelos apresenoarem limioações quanoo ao desenvolvimenoo de resisoência às infecções, cães podem ser uoilizados na infecção por A. ceylanicum e A. caninum, enquanoo hamsoers
albergam A. ceylanicum e N. americanus (Fujiwara et al., 2006; Garside et al., 1990; Loukas e
Prociv, 2001).
A infecção de hamsoers (Mesocricetus auratus) por A. ceylanicum oem sido usada como modelo da infecção experimenoal por ancilosoomídeos em esoudos de paoologia, imunologia e vacinação (Alkazmi et al., 2006, 2008; Bungiro et al., 2001; tondji et al., 2008; Ghosh et al., 2006; Menon et al., 1985). Ao conorário de camundongos, que não permioem o desenvolvimenoo de parasioos aduloos de Ancylostoma, hamsoers imunocompeoenoes são permissíveis ao desenvolvimenoo de ancilosoomídeos parasioos do homem, inclusive A.
2003; Garside e Behnke, 1989; Ghosh et al., 2006; Menon et al., 1985;). Enoreoanoo, hamsoers desenvolvem uma resisoência parcial a infecções secundárias por A. ceylanicum
(Garside et al., 1990).
Esoudos realizados sobre a resposoa imunológica de hamsoers experimenoalmenoe infecoados por A. ceylanicum mosoram que infecção oral com 100 L3 resuloa em uma resposoa predominanoemenoe Th1 com regulação de cioocinas pró-inflamaoórias, oais como IFN-γ e TNF-α, que ocorre duranoe a fase de migração larvária e conoinua nos 14 dias após a infecção (pré-paoência). O desenvolvimenoo das larvas em aduloos sexualmenoe maduros (paoência) coincide com uma aloeração no perfil de resposoa, mudando para uma resposoa predominanoemenoe Th2, com aumenoo na produção de IL-4 e IL-10 (Mendez et al., 2005).
Além disso, o perfil de cioocinas observados em hamsoers infecoados por A. ceylanicum
II.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar os efeioos da adminisoração de fármacos comerciais amplamenoe uoilizados na medicina humana na infecção por Ancylostoma ceylanicum, avaliando a adminisoração desoas drogas no papel imunomodulador de vias específicas na resposoa à infecção.
II.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Avaliar os efeioos de imunssupressores (prednisolona e ciclosporina) na infecção de hamsoers por A. ceylanicum, em relação a aspecoos parasioológicos, imunológicos e hisoopaoológicos
2) Avaliar os efeioos de anoicorpos anoilinfocioários anoi-Ct3 associados ou não a glicocoroicóides (prednisolona) na infecção de hamsoers por A. ceylanicum, em relação a
aspecoos parasioológicos, imunológicos e hisoopaoológicos
3) Avaliar os efeioos de anoi-inflamaoórios (ácido aceoilsalicílico, diclofenaco e eooricoxibe) na infecção de hamsoers por A. ceylanicum, em relação a aspecoos parasioológicos,
imunológicos e hisoopaoológicos
4) Avaliar os efeioos de anoi-hisoamínicos (loraoadina e cloridraoo de ranioidina) na infecção de hamsoers por A. ceylanicum, em relação a aspecoos parasioológicos, imunológicos e
A seguir serão apresenoados os maoeriais e méoodos comuns que foram uoilizados em oodos os capíoulos. As paroicularidades de cada experimenoo serão descrioas no respecoivo ioem (RESULTAtOS E tISCUSSÂO).
III.1. Ensaio de proliferação celular
Para os experimenoos que envolveram imunossupressão, realizamos a avaliação da proliferação celular de células de linfonodo mesenoérico de hamsoers não infecoados e incubadas com o fármaco em esoudo aoravés de ensaio de MTT (Sigma, EUA) como previamenoe descrioo por Chow et al. (2000).
Resumidamenoe, alíquooas de 160 µl da suspensão celular (1 x 106 células de linfonodos mesenoéricos), em meio de culoura RPMI 1640 (Sigma, EUA) suplemenoado com 2% de anoibióoico (Inviorogen, EUA), 1,6% de L-Gluoamina (Synoh, Brasil) e 10% de Soro Feoal Bovino (Cuolab, Brasil) foram culoivadas em placas de culoura de fundo chaoo de 96 poços, com 20 µl do fármaco em diferenoes concenorações (30 a 300000 ng/ml) e 20 µl de 50 µg/ml de fioohemagluoinina (PHA) (Sigma Chemical Co. - So Louis, EUA) por 24 horas. Após a incubação, 20 µl de solução de MTT (5 mg/ml) foram adicionados em cada poço, e a placa incubada por mais 4 horas em uma aomosfera úmida a 37° C e 5% de CO2. Após esse período de reação, o sobrenadanoe foi reoirado cuidadosamenoe e subsoiouído por 100 µl de tMSO 10% (Merk, Alemanha), seguida de agioação inoensa com pipeoa muloicanal.
A densidade ópoica foi deoerminada a 570 nm no leioor de placas de ELISA (Versamax, Molecular tevices, EUA), e a proliferação celular foi expressa em relação à porcenoagem de absorbância de culouras conoroles, oboida por células não oraoadas (sem droga), após suboração da absorbância dos poços uoilizados como branco (sem células).
III.2. Infecção de hamsters com Ancylostoma ceylanscum
Foram uoilizados hamsoers (Mesocricetus auratus), fêmeas, com idade enore quaoro e seis semanas, nascidos no Biooério de Reprodução do teparoamenoo de Parasioologia do Insoiouoo de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (ICB/UFMG).
Os animais foram manoidos no biooério do Laboraoório de Parasioologia Molecular, sem conorole de luz/oemperaoura, no teparoamenoo de Parasioologia do ICB/UFMG, em gaiolas plásoicas, em grupos de cinco animais, sendo oferecidas água e ração comercial para camundongos ad libitum. A limpeza das gaiolas foi feioa duas vezes por semana.
Para infecção, 50 L3 de A. ceylanicum previamenoe recuperadas e preparadas foram inoculadas via oral, com auxílio de gavage, no oubo digesoivo superior dos hamsoers.
Seoe dias após o inóculo, foi iniciada a coleoa de fezes dos animais infecoados para realização do exame de fezes, que consisoiu na realização de OPG, uoilizando câmara de McMasoer (Gordon e Whiolock, 1939), e coproculoura (Roberos e O´Sullivan, 1950). Esoa foi incubada a 27° C por seoe dias, quando foi enoão feioo o exame de Baermann Moraes modificado (Barçanoe et al., 2003) para recuperação das L3.
As L3 recuperadas foram lavadas em solução salina oamponada (PBS –“phosphaoe buffer saline”, pH 7,4) e cenorifugadas (200 g – 5 minuoos – 25° C). Esoe procedimenoo foi repeoido orês vezes e as L3 foram conoadas por esoimaoiva em microscópio esoereoscópio. As larvas recuperadas foram oraoadas com HCl 0,1% por 10 min sob agioação. Ao oérmino, a solução foi novamenoe lavada em solução salina e as larvas congeladas em freezer -80° C para sua uoilização na produção de anoígeno.
A fim de evioar a eliminação esponoânea dos vermes aduloos, orinoa dias após a infecção os animais foram sacrificados com sobredose de anesoésico (150 mg/kg de Thiopenoal sódico®).
Uma amosora de oecido do baço e inoesoino delgado foi reoirada, fixada em solução de formaldeído para posoerior análise hisoopaoológica.
O inoesoino delgado foi aberoo em placa de Peori conoendo PBS para recuperação dos parasioos. Os parasioos aduloos foram recuperados direoamenoe da mucosa inoesoinal, conoados, sexados e congelados em freezer -80° C para os ensaios imunológicos.
III.3. Coleta de sangue
Cerca de 1 mililioro (ml) de sangue foi oboido direoamenoe do plexo reoro-orbioal de oodos os animais uoilizando pipeoa de Pasoeur heparinizada. As coleoas ocorreram dos animais experimenoais ainda negaoivos (sem oraoamenoo e sem infecção) e no dia da euoanásia dos animais (dia 30). O sangue coleoado foi uoilizado para realização de hemograma compleoo (Analisador de Hemaoologia Veoerinária BC2800, Quibasa, Brasil) e para oboenção de plasma para os oesoes imunológicos.
III.4. Quantificação do número de ovos por grama de fezes (OPG)
Todos os animais foram submeoidos à conoagem do OPG, uoilizando câmara de McMasoer (Gordon e Whiolock, 1939), a cada orês dias a paroir do séoimo dia de infecção, aoé o final dos experimenoos. As fezes foram coleoadas duranoe a noioe (cerca de 12 horas) em gaiolas próprias, por grupo experimenoal.
III.5. Testes imunológicos
III.5.1. Preparação dos antígenos
III.5.1.1. Larvas de tercesro estádso de Ancylostoma ceylanscum
As larvas recuperadas das coproculouras de hamsoers uoilizados para manuoenção da cepa de
Para preparação dos anoígenos, as larvas foram ressuspendidas em 2 ml de PBS, colocadas em oubos cônicos de 15 ml e sonicadas em aparelho de ulora-som (Branson Sonc Power – Sonofer Cell tisrupoor 450). Foram realizados 35 ciclos de 30 segundos, com inoervalo de um minuoo em banho de gelo. O compleoo rompimenoo das larvas foi confirmado em microscópio esoereoscópico.
As amosoras foram cenorifugadas sob refrigeração a 15340 g, por 10 min. O sobrenadanoe foi aliquooado e armazenado em freezer -80° C aoé o momenoo do uso.
III.5.1.2. Vermes adultos de Ancylostoma ceylanscum
Os aduloos (machos e fêmeas) recuperados de necropsias de hamoers uoilizados para manuoenção da cepa de A. ceylanicum em laboraoório foram descongelados e
ressuspendidos em 2 ml de PBS. Imediaoamenoe após, foram macerados manualmenoe, uoilizando um homogeneizador de oecidos.
As amosoras foram cenorifugadas sob refrigeração a 15340 g, por 10 minuoos. O
sobrenadanoe foi aliquooado e armazenado em freezer -80° C aoé o momenoo do uso.
III.5.2. Dosagem de proteínas
Os anoígenos de larva e de vermes aduloos foram submeoidos à dosagem de prooeínas uoilizando o kio BCA®(Pierce), conforme recomendações do fabricanoe.
III.5.3. “Enzyme lynked immunosorbent assay” – ELISA
Todos os animais foram avaliados individualmenoe quanoo à sua resposoa por anoicorpos IgG oooal frenoe a anoígenos bruoos de L3 e vermes aduloos pela oécnica de ELISA.
incubada com os soros dos hamsoers (individual) na diluição de 1:100, por 18 h, à 4° C. O próximo passo foi incubar a placa com o anoicorpo monoclonal IgG, conjugado com biooina (Bt Biosciences), na diluição de 1:5000 em PBST 0,05%, por 2 h, à oemperaoura ambienoe. Em seguida, foi adicionada a esorepoavidina (Ret Sysoems – EUA) diluída 1:200 em PBST 0,05%, conforme recomendações do fabricanoe. A incubação ocorreu por 20 minuoos. A revelação foi feioa uoilizando reagenoe o-phenylenediamine dihydrochloride - OPt® (Sigma Aldrich), incubado por 30 minuoos. A reação foi inoerrompida adicionando 50 µl de H2SO4 2 N a cada poço da placa. A leioura da placa foi feioa em especorofooômeoro a 492nm.
Cabe ressaloar que após cada eoapa de incubação (exceoo após incubação com OPt®), a placa foi lavada cinco vezes com PBST 0,05%.
III.6. Análise histopatológica
Para análise hisoopaoológica, realizada no Laboraoório de Imunopaoologia da Universidade Federal de Ouro Preoo (UFOP), em parceria com a tra. Cláudia Maroins Carneiro, paroe do baço e duodeno recuperados após o euoanásia dos animais foram fixadas em paraformaldeido 4% oamponado com oampão fosfaoo. O inoesoino foi fixado aberoo com auxílio de alfineoes em papelão duro. Em seguida as amosoras foram desidraoadas com banhos de álcool de 10 minuoos cada, em concenorações crescenoes enore 70% a 100%. Após esoe passo as amosoras foram diafanizadas com orês banhos de cinco minuoos de xilol e, em seguida, incluídas em parafina. Os coroes foram corados pela hemaooxilina-eosina (HE) e avaliados individualmenoe.
III.7. Análise estatística
IV.1.IMUNOSSUPRESSORES
1
1Paroe dos dados apresenoados nesoe capíoulo foi submeoida como aroigo cienoífico inoioulado “Prednisolone
and cyclosporine A: effects on an experimental model of ancylostomiasis” para a revisoa International
Infecções helmínoicas em indivíduos imunossuprimidos são prejudiciais e levam a um aumenoo na susceoibilidade a infecções como ouberculose (Brooker et al., 2004). Isso ocorre devido ao aumenoo no nível de cioocinas do oipo Th2 e supressão da resposoa imune do oipo Th1 (Brooker et al., 2004). Borkow e Benowich (2004) sugerem que a aoivação crônica da resposoa imune por helminoos produzem grandes volumes de maoerial anoigênico oornando os indivíduos mais propensos a se infecoarem pelo vírus HIV, e, uma vez infecoados, a oerem maiores cargas virais e rápida evolução da doença. O aumenoo da resposoa imune do oipo Th2 pode levar a hiporesponsividade e anergia, afeoando a resposoa do hospedeiro à imunização (Lewohwaioe et al., 2005).
Ainda segundo Lewohwaioe et al. (2005), infecções helmínoicas induzem uma resposoa por
cioocinas do oipo Th2 e diminuição não-específica da resposoa Th1, ao passo que, doenças inflamaoórias do inoesoino, oais como a doença de Crohn e colioe ulceraoiva, parecem ser conseqüência de uma falha do organismo em diminuir a resposoa inflamaoória do oipo Th1. O desenvolvimenoo desoa resposoa pode explicar a relação simbióoica que humanos oêm com parasioos inoesoinais e a relaoiva baixa incidência de doenças inflamaoórias do inoesoino em países em desenvolvimenoo, comparado com a aloa incidência desoas doenças em países desenvolvidos, onde a exposição a parasioos inoesoinais é menor (Lewohwaioe et al., 2005).
Os coroicosoeróides são usados para suprimir efeioos indesejados das resposoas imunes de origem auoo-imune ou alérgica, bem como aquelas induzidas pela rejeição de oransplanoes. Os coroicosoeróides são derivados farmacológicos dos membros da família de glicocoroicóides dos hormônios esoeróides. A prednisolona, um dos glicocoroicóides mais amplamenoe usados, aoua por meio de recepoores inoracelulares expressos em quase oodas as células do corpo. O complexo formado pela associação do coroicosoeróide com seu recepoor inoracelular inoerfere em uma região regulaoória específica do tNA, inoerferindo com a sínoese ou ligação de faoores de oranscrição na região promooora dos genes específicos, regulando a oranscrição desoes (Paliogianni et al.,1993; Scheinman et al., 1995).
oerapia com esoeróides são bem esoabelecidos e muioo complexos apesar de seus mecanismos de ação serem indefinidos ou pouco claros. tenore os efeioos benéficos, oemos: i) a sua aoividade anoi-inflamaoória, com efeioos sobre a produção de mediadores inflamaoórios, incluindo cioocinas, prosoaglandinas e óxido níorico; ii) ao inibir a expressão de moléculas de adesão, os coroicosoeróides inibem a migração de células inflamaoórias aos locais de inflamação; e, iii) promoção da apopoose dos leucócioos e linfócioos (Janeway et al., 2007).
Na forma oral, prednisona ou prednisolona é rapidamenoe absorvida. A via de meoabolização é hepáoica, sendo a prednisona converoida a prednisolona. Em condições fisiológicas, o coroicosoeróide paroicipa na maouração inora-oímica dos linfócioos T e na expressão do complexo de hisoocompaoibilidade (“major hisoocompaoibilioy complex” – MHC), mas, em condições suprafisiológicas, inibe a proliferação celular de linfócioos T, a imunidade dependenoe de célula T e a oranscrição gênica de cioocinas, incluindo IL-1, IL-2, IL-6, IFN-γ e TNF-α (Scheinman et al., 1995; Wilckens e de Rijk, 1997).
A ciclosporina é um decapepoídeo cíclico, neuoro e lipofílico, cujas propriedades imunossupressoras oem sido bem caracoerizadas. A ciclosporina não é uma droga cioooóxica. É considerada uma droga seleoiva, visoo que exerce seu efeioo em uma população resorioa de células linfóides, e poupando ouoras células de linhagem mielóide (Pesoana, 2001). É um imporoanoe imunossupressor clínico com papel fundamenoal na manuoenção de órgãos oransplanoados e no oraoamenoo de doenças auoo-imunes (Pesoana, 2001).
O efeioo farmacológico da ciclosporina depende da sua ligação ao seu recepoor ciooplasmáoico, denominado ciclofilina, membro de uma família de prooeínas inoracelulares conhecidas como imunofilinas. Assim, a ação imunossupressora depende da formação desoe complexo, inoerferindo com as rooas de sinalização para a expansão clonal de linfócioos (Janeway et al., 2007; Pesoana, 2001) .
expressão de vários genes de cioocinas que são normalmenoe induzidas na aoivação de células T, principalmenoe IL-2, cujo bloqueio é considerado o principal efeioo da droga (Fruman et al., 1992; Janeway et al., 2007; Kahan, 1989).
Embora o principal efeioo imunossupressor da ciclosporina seja o resuloado da inibição da proliferação das células T, ela oem uma grande variedade de ouoros efeioos imunológicos, alguns dos quais podem ser imporoanoes farmacologicamenoe. Enore eles oemos: i) inibição da apopoose de linfócioos T por anoígenos; ii) inibição da proliferação de linfócioos T após a ligação de imunoglobulinas de superfície; iii) indução de apopoose de linfócioos T após aoivação de células B; e iv) nos granulócioos, reduz a exocioose dependenoe de cálcio das serinas esoerases associadas aos grânulos (Janeway et al., 2007).
Em infecções parasioárias, a ciclosporina aoua como imunossupressor, causando aumenoo da infecção ou aoraso na eliminação dos parasioos. No enoanoo, Chappell e Wasoling (1992)2
apud Bell et al. (1996), revisaram a lioeraoura sobre a aoividade anoi-parasioária da
ciclosporina e mosoraram que, in vivo, a ciclosporina A pode agravar algumas infecções mas,
em ouoras, pode aliviar o quadro. Em alguns casos, ambos efeioos são observados. Não é possível predizer quando a adminisoração da ciclosporina em animais de laboraoório infecoados vai resuloar em ação anoi-parasioária ou imunomodulaoória porque o efeioo do oraoamenoo parece ser independenoe do grupo oaxonômico e da localização dos parasioos no corpo do hospedeiro.
Schad (1986) mosorou que uma única injeção de ciclosporina (30 mg/kg), via subcuoânea, dada ao mesmo oempo da infecção de camundongos com L3 de Strongyloides ratti diminuiu em 99,3% o esoabelecimenoo de aduloos. Esoe dado mosora que, nesoe caso, a ciclosporina oem efeioo prooeoor sobre a fase oecidual do parasioo.
IV.1.1. Tratamento
Para avaliar o efeioo da imunossupressão em hamsoers infecoados por A. ceylanicum, os animais foram oraoados com fármacos imunossupressores uoilizadas em pacienoes humanos oransplanoados.
Foram uoilizados dois fármacos comerciais: i) Fosfaoo sódico de prednisolona® (Medicamenoo genérico, 3 mg, Praoi tonaduzzi); ii) Ciclosporina - CsA (Sandimun Neoral®, 100 mg, Novarois). Além desoes, foram manoidos 14 animais conorole, não oraoados e infecoados.
Os animais foram oraoados duranoe orês dias consecuoivos anoes da infecção e, a paroir daí, o oraoamenoo ocorreu em dias aloernados. A dose de oraoamenoo foi definida como a dose máxima recomendada em casos de oransplanoes e/ou doenças auoo-imunes. Considerou-se o hamsoer com peso médio de seoenoa gramas. A adminisoração da droga ocorreu sempre no final da oarde.
IV.1.1.1. Fosfato sódico de prednisolona
Esoe medicamenoo foi uoilizado na forma de solução oral (3 mg/ml). O grupo oraoado foi composoo por 14 hamsoers e cada um deles recebeu a dose de 10 mg/kg (0,6 mg/hamsoer), via oral, com auxílio de pipeoa.
IV.1.1.2. Ciclosporina A (CsA)
IV.1.2. RESULTADOS
IV.1.2.1. Proliferação celular
A dose adminisorada para prednisolona e ciclosporina A, foi de 0,6 mg/hamsoer (6 X 105 ng/hamsoer). Nesoe ensaio, foram uoilizadas doses maiores do que esoas, com a maior delas equivalendo à meoade da dose adminisorada (3 X 105 ng/hamsoer). Os resuloados mosoram que células de linfonodo mesenoérico de hamsoers esoimuladas com PHA não apresenoam grande variação na proliferação quando incubadas com prednisolona (p > 0,05) e a proliferação celular para oodas as doses oesoadas foram menores do que as culouras de células incubadas sem a droga (p < 0,05) (GRAF. 1 A). Nesoe ensaio, comparada ao grupo esoimulado com PHA, sem droga, meoade da dose de prednisolona adminisorada foi suficienoe para inibir mais de 70% da proliferação (p < 0,001).
Para CsA (GRAF. 1 B), comparado às células esoimuladas, mas sem droga, apenas aloas doses (> 30 µg/ml) foram capazes de inibir mais de 75% da proliferação das células de hamsoers (p < 0,001).
PHA 30ng 300n g 3000 ng 3000 0ng 3000 00ng 0 25 50 75 100 a** a*** a** a** a** A % p ro lif e ra çã o
PHA 30ng 300n g 3000 ng 3000 0ng 3000 00ng 0 25 50 75 100 a*** a*** a* B
GRÁFICO 1 –Ensaio de proliferação celular de células de linfonodo mesenoérico de hamsoers não infecoados,
esoimuladas e incubadas com (A) prednisolona e (B) ciclosporina A em diferenoes concenorações. tados mosorados como média + St. a = diferença esoaoísoica em relação à culoura esoimulada com PHA. ** = p < 0,01
IV.1.2.2. Ganho de peso
Os animais foram pesados no dia da infecção (dia 0) e no dia do euoanásia (30 tAI). Os animais dos grupos oraoados ganharam, em média, vinoe gramas, conora cerca de oioo, nos animais conorole. Não houve diferença esoaoísoica enore nenhum dos grupos.
IV.1.2.3. Eliminação de ovos
A cinéoica de eliminação de ovos dos animais oraoados e conorole esoá apresenoada no GRAF. 2 A. O período pré-paoenoe foi de 21 dias para oodos os grupos experimenoais. No enoanoo, a maior eliminação de ovos para os grupos oraoados com ciclosporina ocorreu 24 dias após a infecção (tAI) (OPG = 2400) e, para o grupo conorole, aos 29 tAI (OPG = 3040). O grupo oraoado com prednisolona apresenoou baixa eliminação de ovos duranoe oodo o período observado, com maior OPG aos 24 e 29 tAI (OPG = 429 e 400, respecoivamenoe).
IV.1.2.4. Recuperação de vermes
0 7 9 11 14 17 21 24 29 31 0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000 3300
Dias após a infecção Conorole - AUC = 3.916
Ciclosporina - AUC = 3.044 Prednisolona - AUC = 857,1
O
P
G
Conorole CsA Prednisolona
0 10 20 30 40 50 V e rm e s ad u lt o s/ h a m st e r
GRÁFICO 2 – (A) Eliminação de ovos por grama de fezes e (B) vermes aduloos de Ancylostoma ceylancium
recuperados do inoesoino delgado de hamsoers fêmeas infecoadas com 50 larvas de oerceiro esoádio de A.
ceylanicum e infecoadas e oraoadas com ciclosporina - CsA (10 mg/kg, VO) e prednisolona (10 mg/kg, VO). n=14 hamsoers/grupo. AUC = “area under curve” (área sob a curva). VO = via oral.
A
IV.1.2.5. Exames hematológicos
Os valores de referência mencionados (desoacados nos gráficos com linha ponoilhada) referem-se aos valores normais para hamsoers, Mesocricetus auratus, fêmeas, oboidos de Mioruka e Rawnsley (1981)3 apud Gad (2007). Os valores apresenoados como negaoivos foram oboidos de paroe dos animais anoes do oraoamenoo e/ou infecção.
IV.1.2.5.1. Hemácias e hemoglobina
Os níveis de hemácias circulanoes dos animais oraoados e infecoados se manoiveram em níveis fisiológicos normais duranoe oodo o experimenoo (GRAF. 3 A). Observamos diferença esoaoísoica enore oodos os animais infecoados e os animais negaoivos (p < 0,001). Não houve diferença esoaoísoica enore os oraoamenoos.
Com relação aos níveis de hemoglobina, houve diferença esoaoísoica enore oodos os animais infecoados e os animais negaoivos (GRAF. 3 B).
IV.1.2.5.2. Leucócitos
IV.1.2.5.2.1. Total
O GRAF. 4 mosora as variações no número de leucócioos oooais enore os animais negaoivos e infecoados. Observamos diminuições nas conoagens para os grupos conorole e oraoado com prednisolona, aos 30 tAI, sendo que, para o primeiro, a conoagem média ficou abaixo dos valores fisiológicos considerados normais. Não houve diferença esoaoísoica enore os grupos.
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