RESSALVA
Atendendo solicitação da autora, o texto
completo desta dissertação será
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Instituto de Biociências de Botucatu
FABIANA MASAGO
Desenvolvimento de nano e micropartículas de quitosana
encapsulando 4-metilesculetina e avaliação no tratamento da
doença inflamatória intestinal
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Instituto de Biociências de Botucatu
Desenvolvimento de nano e micropartículas de quitosana
encapsulando 4-metilesculetina e avaliação no tratamento da
doença inflamatória intestinal
FABIANA MASAGO
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre
em Ciências Biológicas
(Farmacologia).
Orientador: Prof. Dr. Luiz Claudio Di Stasi Co-orientadora: Profa. Dra. Patrícia Severino
Auxílio Financeiro
Proc. 130554/2013-8
Dedicatória
Aos meus pais, Luiza e Mitsuru, e irmão, Fábio, por me apoiarem ao longo
desse percurso e ao longo da vida.
Ao meu amigo e namorado Hebert pela paciência e por estar sempre ao meu
lado nos melhores e piores momentos.
As minhas amigas biólogas Juliana, Natalia K. e Natalia M. pelas risadas e
por aguentarem minhas reclamações.
“Somos moldados e guiados pelo que amamos.”
Agradecimentos
Este trabalho não teria sido possível sem a ajuda de...
Meus amigos de trabalho do Laboratório de Fitomedicamentos, Farmacologia e Biotecnologia
(FITOFARMATEC) do Instituto de Biociências de Botucatu-UNESP Ana, Alexandre S, Celso,
Lesvi, Luiz e Tainan pelo constante apoio e auxílio durante o experimento;
Aline, Ellen e Alexandre T do Laboratório de Fitomedicamentos, Farmacologia e Biotecnologia
(FITOFARMATEC) do Instituto de Biociências de Botucatu-UNESP agradeço imensamente a ajuda
e aos seus ensinamentos.
Gilson, Andrea e Carolina do departamento de Engenharia de Materiais e de Bioprocessos da
Faculdade de Engenharia Química-UNICAMP por me ajudarem no processo de desenvolvimento
das partículas;
Profa. Dra. Maria Helena por ter cedido seu laboratório no departamento de Engenharia de
Materiais e de Bioprocessos da Faculdade de Engenharia Química-UNICAMP e por ter-me
co-orientado no início do trabalho;
Prof. Dr. João Pessoa de Araújo Junior do Departamento de Microbiologia e Imunologia do
Instituto de Biociências de Botucatu-UNESP por ter disponibilizado a ultracentrífuga;
Funcionários do Departamento de Farmacologia UNESP-Botucatu;
Funcionários da Seção de Pós-graduação da UNESP-Botucatu;
Não posso deixar de agradecer...
Ao meu Orientador Prof. Dr. Luiz Claudio Di Stasi do Laboratório de Fitomedicamentos,
Farmacologia e Biotecnologia (FITOFARMATEC) do Instituto de Biociências de Botucatu-UNESP
por ter me orientado desde a iniciação científica, pelas oportunidades e conhecimentos adquiridos
durante todos esses anos de orientação.
A minha co-orientadora Profa. Dra. Patrícia Severino do departamento de Engenharia de
Materiais e de Bioprocessos da Faculdade de Engenharia Química-UNICAMP pela extrema
paciência em me ensinar nano e microbiotecnologia e por toda a dedicação e ajuda no percurso do
mestrado;
PRÓLOGO
Durante o período referente ao mestrado no Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Farmacologia) pude desenvolver diversas atividades junto ao Laboratório FITOFARMATEC e ao Departamento de Engenharia de Materiais e de Bioprocessos que enriqueceram minha formação como aluna de mestrado. Dentre elas, listo:
1. Disciplinas cursadas
Farmacocinética
Farmacodinâmica: Receptores e Interação Droga-Receptor Laboratório de Didática em Farmacologia
Tópicos Especiais em Farmacologia - Tópicos de Atualização em Mediadores da Resposta Inflamatória
Tópicos Especiais em Zoologia - Planejamento de Experimentos em Ciências
2. Resumos publicados em congressos
XXIII Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil Data: 16-19 de setembro de 2014
Local: Goiânia-GO
Título do resumo: “Desenvolvimento de nanopartículas de quitosana encapsulando 4-metil-esculetina para o tratamento da doença inflamatória intestinal.” Masago, F.1, Santana, M.H. 2,
Severino, P.³, Di Stasi, L.C4.
3. Bolsa
Bolsa CNPq (Proc. 130554/2013-8)
4. Participação em eventos
XII Workshop da Pós-Graduação XI CAEB
Curso de extensão universitária estatística univariada usando o Programa R IV Simpósio de Farmacologia da UNESP;
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RESUMO
A retocolite ulcerativa e a Doença de Crohn, as principais formas de Doença Inflamatória Intestinal (DII), são doenças crônicas do intestino que causam dores abdominais, diarreia intensa e hemorragias. Até o momento, os tratamentos farmacológicos disponíveis, que incluem aminosalicilatos, glicocorticóides, imunossupressores e a terapia biológica com anticorpos monoclonais, não promovem a cura definitiva da doença e estão associados ao desenvolvimento de diversos efeitos colaterais. Recentes estudos mostraram que o derivado cumarínico 4-metilesculetina (4-ME) possui efeitos protetores no processo inflamatório colônico induzido por ácido 2,4,6-trinitrobenzenosulfônico (TNBS), os quais foram associados às suas atividades anti-inflamatória e antioxidante. Considerando-se que a encapsulação de fármacos e produtos ativos em nano e micropartículas poderiam aumentar seu tempo de retenção no cólon com consequente aumento da resposta farmacológica, os objetivos do presente trabalho foram elaborar nano e micropartículas de quitosana contendo 4-ME e avaliar se estas formulações melhoram a resposta anti-inflamatória intestinal da 4-ME em comparação à sua administração na forma livre. Para tal, foi realizada a padronização de micro e nanopartículas de quitosana contendo 4-ME, as quais foram administradas, por via oral em ratos, na dose de 5 mg/Kg e seus efeitos comparados com a administração da mesma dose de 4-ME na forma livre, usando o modelo de inflamação colônica induzida por TNBS em ratos. Neste contexto, foram avaliados parâmetros macroscópicos (escore da lesão, extensão da lesão, relação peso/comprimento do cólon e aderência) e bioquímicos (atividade da mieloperoxidase e da fosfatase alcalina e níveis colônicos de glutationa total). Os tratamentos com micro e nanopartículasnão foram capazes de diminuir a inflamação induzidas pelo TNBS; contudo a administração de 4-ME em sua forma livre demonstrou atividade anti-inflamatória pela diminuição significativa da atividade da fosfatase alcalina e por evitar a depleção da glutationa. Em conclusão, a 4-ME associada às nano e micropartículas de quitosana não se mostraram como uma estratégia farmacêutica apropriada para a liberação controlada de 4-ME como agente anti-inflamatório intestinal.
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ABSTRACT
Ulcerative colitis and Crohn's disease, the main forms of Inflammatory Bowel Disease (IBD), are chronic diseases which cause abdominal pain, diarrhea and bleeding. Nowadays, the available treatments, such as aminosalicylates, glucocorticoids, immunosuppressants and biological therapy with monoclonal antibodies do not promote a definitive cure; furthermore, they are associated with several side effects. Recent studies showed protective effects of coumarin derivative 4-methylesculetin (4-ME) against colonic inflammation induced by 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid (TNBS), which was associated to the anti -inflammatory and antioxidant properties of 4-ME. Since encapsulation of drugs and active products into nano and microparticles are able to increase the retention time in the colon and improve pharmacology activity; the present study aims to develop chitosan nano and microparticles containing 4-ME, and to evaluate if these pharmaceutical formulations improve intestinal anti-inflammatory activity 4-ME when compared to its free form. For this, nano and microparticles of chitosan with 4-ME encapsulated were standardized, which were administered, by oral route, at the dose of 5 mg/Kg, and its effects compared with same dose of free form of 4-ME, using the TNBS model of colonic inflammation in rats. In this context, macroscopic (score, lesion extension, weight/length ratio and adherence) and biochemical (myeloperoxidase and alkaline phosphatase activities and total glutathione content) parameters were analyzed. Treatments with nano and microparticles were not able to minimize TNBS-induced inflammation; however, free form 4-ME demonstrated anti-inflammatory activity evidenced by the significant inhibition of alkaline phosphatase activity and counteraction of glutathione depletion. In conclusion, 4-ME associated with nano and microparticles of chitosan did not represent an appropriated pharmacologic strategy for the controlled delivery of 4-ME as anti-inflammatory intestinal agent.
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1 INTRODUÇÃO
1.1 Doença Inflamatória Intestinal
A Doença Inflamatória Intestinal (DII) abrange duas formas graves de inflamações crônicas, idiopáticas e recidivantes do trato gastrointestinal, a retocolite ulcerativa e a Doença de Crohn (FUSUNYAN; SANDERSON, 1998; SANCHEZ-MUÑOS et al., 2008).
Entretanto, as duas doenças se diferem quanto a algumas características. Na retocolite ulcerativa (RCU), a inflamação se limita ao cólon onde acomete as camadas mucosa e submucosa e não há ocorrência de fístulas e nem de granulomas. Em contraste, a inflamação na Doença de Crohn (DC) pode ocorrer em qualquer órgão do trato gastrointestinal, comprometer todas as camadas do mesmo e ocorrer à formação de fístulas e granulomas (BUDARF et al., 2009; KHOR et al., 2011).
Um dos principais problemas relacionados com a DII são as recidivas e a exacerbação dos sintomas que incluem dores abdominais, diarreia, alterações das funções intestinais, hemorragia retal (MOUM et al., 1997; CAPRILLI et al, 2012), náusea, perda de peso, perda
de apetite e taquicardia (KAWADKAR; RAM, 2007). Considerando-se que estes sintomas afetam aproximadamente metade dos doentes de forma intermitente, a DII apresenta-se como uma doença incapacitante que afeta a qualidade de vida do indivíduo (BAUMGART; SANDBORN, 2007).
2 habitantes para as duas doenças na região do Piauí (PARENTE, 2015). Os gastos terapêuticos mundiais relacionados com a DII não refletem esta baixa incidência, visto que em 2012 alcançou valores de 5.1 bilhões de dólares e estima-se que chegarão a 6.2 bilhões de dólares em 2017 de acordo com dados da BCC RESEARCH (BUSINESS COMMUNICATIONS COMPANY RESEARCH, 2013).
Ainda que a etiologia da DII esteja sendo amplamente estudada nas últimas décadas, as suas causas não estão totalmente elucidadas (MOLODECKY et al., 2012). Estudos
sugerem que o processo inflamatório na DII seja resultante da combinação de predisposições genéticas associadas a alterações do sistema imune e a fatores ambientais, como tabagismo, estresse, uso de anticoncepcional, má alimentação e a alteração da microbiota promovem uma disfunção da barreira, o que podem resultar no desenvolvimento do processo inflamatório intestinal (BLUMBERG; STROBER, 2001; KHOR et al., 2011).
O processo inflamatório é caracterizado por três etapas principais que incluem o aumento substancial do fluxo sanguíneo para o local afetado, o aumento da permeabilidade vascular e a migração de neutrófilos e macrófagos para o local inflamado (SHARMA; BUCHANAN, 1994; LEVY, 1996). Segundo KHOR et al. (2011), essas três etapas só
ocorrem devido ao desequilíbrio da barreira intestinal resultante principalmente de defeitos na autofagia, na regulação da imunidade e no aumento da liberação de espécies reativas de oxigênio (EROs).
Indivíduos com DC ou com RCU que apresentam defeitos na autofagia bacteriana, que é um processo catabólico que envolve a degradação e a reciclagem de componentes celulares, a resistência contra infecções e a remoção da microbiota do lúmen intestinal (RIOUX et al.,
2007; HAMPE et al., 2007; KUBALLA et al., 2008), demonstram um aumento da
3 microbiota, além da falha na regulação do sistema imune e da liberação excessiva de EROs, podem modificar a homeostase intestinal alterando a permeabilidade vascular (KHOR et al.,
2011), e consequentemente, aumentando o influxo de macrófagos e neutrófilos para o local inflamado que aumentam a produção de citocinas pró e anti-inflamatórias, sendo as principais citocinas pró-inflamatória na DII o fator de necrose tumoral α (TNFα), o interferon-γ (IFN-γ) e as interleucinas (IL) 1, 6 e 12, e as principais citocinas anti-inflamatórias as IL-4, 10 e 11 (ARDIZZONE; BIANCHI, 2005). Pesquisas demonstram que na RCU há um aumento da secreção de IL-5, IL-14, IL-10 e IL-13, ao passo que na DC há o aumento de TNF-α, IFN-γ, IL-1 e IL-12, com um maior desequilíbrio da permeabilidade da barreira intestinal no sistema imune em indivíduos com a DC do que nos indivíduos com RCU (SVENTORAITYTE et al.,
2008).
A ativação excessiva de leucócitos (neutrófilos, eosinófilos e monócitos) nos tecidos elevam a produção de EROs (ASAKURA; KITAHORA, 2013) e/ou espécies reativas de nitrogênio (ERNs) (PAVLICK et al., 2002). Enzimas antioxidantes como a superóxido
dismutase, catalase, glutationa peroxidase e antioxidantes não enzimáticos como os tiols, ascorbato e α-tocoferol são essenciais na neutralização dos agentes oxidantes citados (ASAKURA; KITAHORA, 2013). No entanto, na inflamação intestinal há uma redução dos níveis de enzimas protetoras e dos agentes antioxidantes endógenos (KAWAKAMI et al.,
2007) em contraste aos elevados níveis das EROs e ERNs que resultam em um estresse oxidativo no intestino (PAVLICK et al., 2002). Considerando-se isto, a presença dos radicais
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1.2 Fármacos convencionais e perspectivas na sua incorporação em nano e micropartículas
A incompreensão das causas da DII dificulta sua terapêutica; os objetivos dos medicamentos convencionais são diversos: tratamento dos sintomas, prevenção de recidivas (tratamento de manutenção), cicatrização de fístulas e evitar cirurgias de urgência. Nenhum fármaco isolado é eficaz para tratar todos esses objetivos e até o presente momento os pacientes dependem da aplicação de múltiplos medicamentos ao longo da vida (COLLNOT et al., 2012).
A terapêutica atualmente utilizada para o tratamento da DII inclui um grande número de produtos, dentre os quais estão os aminosalicilatos (sulfassalzina, olsalazina), glicocorticóides (prednisolona, prednisona), imunossupressores (azatioprina, 6-mercaptopurina) (YAMAMOTO-FURUSHO, 2007) e a terapia biológica que inclui anticorpos monoclonais anti-TNFα como o infliximab (MORRISON et al., 2009; PLEVY;
TARGAN, 2011). Infelizmente, a terapêutica disponível não representa a cura para a DII, sendo que os fármacos disponíveis possuem sérios efeitos colaterais (BAUMGART; SANDBORN, 2007), além de apresentarem um custo elevado, como é o caso da terapia biológica.
Neste contexto fica clara a necessidade da busca de novas estratégias terapêuticas ou ainda de novos compostos que possam potencializar o efeito dos fármacos, diminuir a dose administrada e consequentemente o risco da ocorrência de efeitos colaterais (VISCIDO et al.,
5 (VANDENBROUCKE et al., 2010) encapsuladas em nano ou micropartículas apresentaram
interessantes resultados no processo inflamatório intestinal.
Os aminosalicilatos, como o ácido 5-amino salicílico (5-ASA) são rapidamente absorvidos no intestino delgado o que diminui sua disponibilidade no local de ação. Além disso, podem provocar náusea, diarreia, cólicas, dores de cabeça, febre, flatulência, erupções cutâneas, nefrite, pancreatite, perda de cabelo e pancitopenia (JONES, 2006). Camundongos com inflamação colônica induzida por TNBS tratados com nanopartículas de poli-caprolactona e 5-ASA na dose de 0.5 mg/Kg reduziram a atividade de mieloperoxidase (MPO) demostrando ser 60 vezes mais potentes que a dose de 30 mg/Kg administrada na forma de solução (PERTUIT et al., 2007).
Glicocorticóides, como a prednisolona e budesonida, atenuam os sintomas reduzindo a inflamação e diminuindo a resposta imune (KUHBACHER; FÖLSCH, 2007), todavia se forem utilizados por longos períodos promovem reações adversas, tais como síndrome de Cushing, infecção, supressão da adrenal, distúrbios do sono, osteoporose, apresentar falso-positivo para hepatite e diminuição da função renal quando usado por longo período (JONES, 2006).
A prednisolona quando administrada por via oral apresenta rápida absorção no trato gastrointestinal superior podendo causar osteoporose e hipertensão. A liberação específica pode ser considerada uma alternativa para diminuir essa rápida absorção e os seus efeitos adversos como foi demonstrada através das Nanopartículas revestidas com Eudragit® S100
6 O imunossupressor tacrolimus apresenta atividade farmacológica devido à inibição da calcineurina, uma enzima relacionada à transcrição das IL-2 pelos linfócitos T auxiliares que determina a extensão da resposta imune. Porém, a sua utilização para o tratamento da DII ocasiona reações adversas aos pacientes como: leucopenia, hepatotoxicidade e pancreatite. Pesquisas com micropartículas incorporando tacrolimus em ratos com DII induzida por TNBS demonstraram maior seletividade pelo local inflamado o que aumentou a eficiência do tacrolimus no tratamento, isso foi observado pela diminuição significativa do escore de atividade clínica e da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) e menor nefrotoxicidade em ratos (LAMPRECHT et al., 2005a).
A terapia biológica com anticorpos monoclonais com um domínio anti-TNF é administrado por via intravenosa e tem implicações sistêmicas, como a pancitopenia e podem causar lúpus medicamentoso. Em testes com os anticorpos monoclonais em nanopartículas administrados por via oral em camundongos com inflamação intestinal induzida por dextran sulfato de sódio foi observado a maior ação específica do anticorpo no local inflamado e, adicionalmente, ausência de efeito sistêmico, redução do escore histológico e redução da atividade de MPO (VANDENBROUCKE et al., 2010).
Esse potencial terapêutico das nano e micropartículas está associado principalmente ao tipo de liberação do princípio ativo no local desejado. Nas formulações convencionais a liberação da dose total administrada é rápida e mesmo com a dose e a frequência de administração corretas, a biodisponibilidade do fármaco pode oscilar entre as concentrações tóxicas, terapêuticas ou subterapêuticas (Figura 1) (DELUCIA et al., 2007).
7 diversos ambientes e direcionar de maneira específica o fármaco para os locais de ação desejados, aumentando a eficiência de ação de substâncias ativas. Isso minimiza os custos gastos com profissionais de saúde para administrar o fármaco e aumenta a conveniência em relação à administração diurna e noturna do medicamento para os pacientes (SILVA, 2006; ALLEN et al., 2007).
Figura 1 - Comparação ilustrativa entre os níveis de concentração plasmática do fármaco convencional com os fármacos de liberação controlada, o eixo x representa o tempo e o eixo y a concentração plasmática dos compostos. As doses estão esquematizadas por setas (adaptação de EVANGELISTA et al.,1998).
Por outro lado, as formas farmacêuticas de liberação controlada podem oferecer desvantagens tais como maior custo de processamento, um risco de toxicidade por liberação total do fármaco ou acúmulo do mesmo devido à liberação lenta em relação à terapêutica convencional e dificuldade na regulação da quantidade de fármaco efetiva no plasma (DUMITRIU; DUMITRIU, 1993).
8 camada espessa de muco que é uma característica da área inflamada (KRISHNAIAH et al.,
2003).
SCHIMIDT et al. (2013) demonstraram em humanos que as nanopartículas tem uma
deposição maior entre os espaços celulares e as micropartículas se depositam mais na superfície celular intestinal. Por esta diferença de tamanhos VISCIDO et al.(2014)
propuseram que micropartículas teriam maior utilidade na cura da DII devido à passagem entre os espaços celulares dos enterócitos que se situam nas microvilosidades e as nanopartículas teriam maior utilidade no tratamento da remissão ou menor inflamação onde a mucosa tem menor permeabilidade e predomina a absorção por células epiteliais. Dessa forma, nano e micropartículas poderiam ser promissoras estratégias para o tratamento da DII.
1.2.1 Propriedades da quitosana para sua utilização em nano e micropartículas no tratamento da DII
A composição das partículas pode ser de origem biológica (fosfolipídios, lipídios, ácido láctico, dextrana, quitosana e albumina) ou química (polímeros, carbono, sílica e metais). Essa propriedade da partícula é de extrema importância, pois determina tanto seu nível de toxicidade, como as cargas da superfície da partícula que entrarão em contato com o tecido alvo e a disponibilidade no intestino. Dos mais variados tipos de partículas, a quitosana tem sido amplamente utilizada como carreador de inúmeras substâncias ativas na DII (FRIEND, 2005; DE JONG; BORM, 2008; LAROUI et al., 2011).
9 Outras propriedades positivas são: ação antimicrobiana, absorção de metais tóxicos (mercúrio, cádmio e chumbo) e a capacidade de estimular o sistema imune (AGNIHOTRI et al., 2004).
Além disso, a quitosana é degradada por enzimas produzidas por bactérias anaeróbias, do gênero Bacteroides e Bifidobacterium da microbiota colônica que são responsáveis pela
hidrólise glicosídica desse polissacarídeo (HOVGAARD; BRONDSTED, 1996; TOZAKI et al.,1997; SINHA; KUMRIA, 2003). GARCÍA-LAFUENTE et al. (1997) observaram o perfil
dessas bactérias antes e após a indução da inflamação por TNBS e constataram que as bactérias do gênero Bacteroides estavam presentes após a indução possibilitando, assim, a
utilização da quitosana no desenvolvimento das nano e micropartículas por proporcionar uma liberação específica e controlada no cólon.
1.3 Pesquisas de novos produtos ativos na DII
Nos últimos anos, diversos compostos de origem natural têm demonstrado atividade anti-inflamatória em modelos experimentais que mimetizam a DII. Entre estes compostos podem ser citados a curcumina (BENGMARK, 2007), a vitamina E (GONZALEZ et al.,
2001), o tempol (CUZZOCREA et al., 2000) e os flavonoides, como a quercetrina
(SÁNCHEZ DE MEDINA et al., 2002), a silimarina (CRUZ et al., 2001), a morina (OCETE et al., 1998) e a rutina (GÁLVEZ et al., 1997).
Outra classe fitoquímica que possui atividades farmacológicas com potencial para ser utilizada no tratamento da DII são as cumarinas. As cumarinas englobam uma classe de compostos fenólicos encontradas em plantas, bactérias e fungos (MURRAY et al., 1982). O
10 apresentam, inclusive, outras importantes atividades, tais como, imunossupressora, antitumoral, anticoagulante, antiviral e anti-inflamatória (RIVIEIRO et al., 2010).
Em estudos realizados por nosso grupo de pesquisa foi avaliada a atividade antioxidante de 14 cumarinas no modelo de peroxidação lipídica induzida por ferro e ácido ascórbico em membranas de cérebro de ratos. Dentre estas, esculetina e 4-metilesculetina (4-ME) apresentaram os menores valores de concentração inibitória de 50% da peroxidação lipídica, assim como demonstrado por outros estudos (SEKIYA et al., 1982; PAYÁ et al.,
1992; KUSTER; ROCHA, 2000; SHARMA et al., 2005).
Com base nisto, iniciou-se um estudo para avaliar a atividade anti-inflamatória intestinal de 4-ME no modelo de inflamação intestinal induzida por TNBS em ratos e observou-se que este composto apresentou atividade na dose de 5 mg/Kg, e essa atividade foi associada às propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias desta substância (WITAICENIS
et al., 2010).
Devido a estes interessantes resultados, novos estudos foram realizados e demonstraram que a atividade anti-inflamatória intestinal de 4-ME está relacionada com a redução dos níveis de IL-1β, inibição da atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO), fosfatase alcalina e metaloproteinase-9 (MMP-9) e pela atividade antioxidante do composto, observada pela diminuição nos níveis de malonilaldeído (MDA) e por evitar a depleção do conteúdo de glutationa total (GSH) colônico (WITAICENIS et al., 2012). Além disso, estudos in vitro demonstraram que a 4-metilesculetina promove a inibição de IL-1β, IL-8, IL-2 e
IFN-γ em culturas de células RAW 264.7, Caco-2 e esplenócitos, respectivamente (WITAICENIS
et al., 2012).
11
al.,1983;1985). Recentemente, HEMSHEKHAR et al. (2013) observaram que 4-ME
apresenta atividade antiarrítmica e anti-inflamatória no modelo experimental de artrite. Na década de 1950, foi constatado que algumas cumarinas poderiam causar hepatotoxicidade; contudo pesquisas recentes demonstram que cumarinas não representam risco à saúde humana (LAKE, 1999) e, adicionalmente demonstraram que este derivado cumarínico não apresenta atividade genotóxica (FEDATO et al., 2012; HEMSHEKHAR et al., 2013). Entretanto, estudos realizados in vitro por GALKIN et al. (2009) verificaram que
a 4-ME apresenta baixo tempo de retenção no lúmen intestinal.
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5 CONCLUSÃO
Com base nos resultados observados e na discussão apresentada, é possível concluir que o desenvolvimento e a encapsulação da 4-ME em nano e micropartículas de quitosana pela técnica de gelificação ionotrópica foram realizados com sucesso.
