Laila Toniol Cardin
Expressão Gênica Diferencial em resposta aos efeitos da proteína
anti-inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da
retina humana
_____________________________________________________
São José do Rio Preto
Expressão Gênica Diferencial em resposta aos efeitos da proteína
anti-inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da
retina humana
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, junto ao Programa de Pós-graduação em Genética, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.
Orientadora: Profa. Dra. Flávia Cristina Rodrigues Lisoni
Co-orientadora: Profa. Dra. Sonia Maria Oliani
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE Campus de São José do Rio Preto – UNESP Cardin, Laila Toniol.
Expressão diferencial em resposta aos efeitos da proteína anti-inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da retina humana / Laila Toniol Cardin. – São José do Rio Preto: [s.n.], 2013.
f.102 : il. , 30 cm.
Orientadora: Flávia Cristina Rodrigues Lisoni Co-orientador: Sonia Maria Oliani
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Inflamação ocular. 2. Anexina A1. 3. Expressão gênica. 4. Cultura de Células. I. Rodrigues-Lisoni, Flávia Cristina. II. Oliani, Sonia Maria. III. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. IV. Título.
Expressão Gênica Diferencial em resposta aos efeitos da proteína
anti-inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da
retina humana
Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, junto ao Programa de Pós-graduação em Genética, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de
São José do Rio Preto.
Banca Examinadora
Profa. Dra. Flávia Cristina Rodrigues Lisoni UNESP – Ilha Solteira
Orientadora
Profa. Dra. Érika Cristina Pavarino FAMERP – São José do Rio Preto
Profa. Dra. Claúdia Marcia Aparecida Carareto UNESP – São José do Rio Preto
Profa. Dra. Eny Maria Goloni Bertollo FAMERP – São José do Rio Preto
Profa. Dra. Cristiane Damas Gil UNIFESP – São Paulo
DEDICATÓRIA
AGRADECIMENTOS
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa concedida de Mestrado.
Ao Programa e Professores da Pós-graduação em Genética, por possibilitar a realização do meu Mestrado e pelo conhecimento adquirido.
Aos funcionários da Seção de Pós-graduação pela competência e colaboração na resolução de diversos problemas.
Ao Departamento de Biologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, pela atenção e colaboração quando precisei.
À Profa. Dra. Eloiza Tajara, coordenadora do Laboratório de Marcadores Moleculares e Bioinformática Médica, da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, pelos recursos oferecidos, dos equipamentos e materiais, para realização das técnicas.
À aluna de doutorado Bianca da Cunha Rodrigues, Dra. Fernanda Carregaro e ao técnico Tiago Henrique pelo auxiliou prestado no desenvolvimento de técnicas, e pela paciência e solicitude.
Ao Prof. Dr. Wilson Araújo da Silva Junior, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, por me receber em seu laboratório e pelos recursos, equipamentos e materiais oferecidos para realização da Técnica de Hibridização Subtrativa Rápida.
A Auxiliar de Pesquisa Científica e Tecnológica Anemari Ramos Dinarte dos Santos, da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto, pelo ensino da Técnica de Hibridização Subtrativa Rápida, pela acolhida e amizade. E a todos do Hemocentro de Ribeirão Preto que contribuíram com esse trabalho e me receberam tão amigavelmente.
À aluna de doutorado Marina Curado Valsechi, por me auxiliar com os géis de agarose e realização de PCR e ser sempre solícita.
À Profa. Dra. Andréia Machado Leopoldino, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, e sua aluna Laís Sobral, pelo auxílio prestado na realização da técnica de migração celular.
À Profa. Dra. Claudia Carareto, coordenadora do Laboratório de Evolução Molecular de insetos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, por disponibilizar seu laboratório e recurso para realização desse trabalho.
À Dra. Adriana Granzotto, pelo auxilio, técnico e científico, no laboratório, e especialmente pela convivência no dia-a-dia, companheira de apartamento, agradeço pela paciência, amizade, disponibilidade, apoio, conversas, conselhos, enfim, por tudo que me ajudou e melhorou os meus dias, nessa primeira experiência longe de minha família.
Aos valiosos companheiros do Laboratório de Imunomorfologia do IBILCE, Alexandre Dantas Gimenes, Aline Camargo Miranda, Ayla Blanco Poltronieri, Caroline de Freitas Zanon, Claudia de Mello Bosnich, Cristiane Damas Gil, Gabriela Franco Bueno, Janesly Prates, Jéssica Zani Lacerda, Kallyne Kioko Mimura, Marina de Paula Silva, Marystela Fávero Oliveira, Poatan da Silva Pinoti, Rafaela Molás, uma equipe a qual é exemplo de trabalho com alegria e entusiasmo, pelos momentos de alegria e companheirismo.
Às queridas amigas Ana Paula Girol, Carla Patrícia Carlos e Thaís Santana Gastardelo, exemplos de pessoas, por me ajudar durante o Mestrado, estando sempre prontas e dispostas.
À Analice Andreoli, pessoa atenciosa e convicta, pelo seu companheirismo e apoio nos momentos de angustia, pela sua amizade e carinho em todos os outros momentos de minha vida, por me entender, aceitar, pelas conversas e por todo crescimento que me proporcionou desde que conheci.
e pessoal, cada um com seu jeito, obrigada por essa amizade sincera, que ultrapassou os percalços do caminho e me proporcionou um crescimento pessoal inigualável nesses dois anos de convivência. E também por todo auxilio, generosidade, paciência, compreensão, aceitação e companheirismo concedidos nessa primeira aventura longe da minha família.
À todos os companheiros da Pós-graduação em Genética, e em especial a Bruna Victorasso Jardim, Gabriela Bottaro Gelaleti, Marcela Alcântara Proença, Maysa Succi.
Aos meus tios Iasmara e Valdir, e primas Ana Laura e Maria Claúdia, pela acolhida nos primeiros meses, e pela solicitude em qualquer momento. Obrigada por estarem comigo me ajudando sempre que eu precisei.
Ao pessoal da Equipe de jovens de Nossa Senhora, pela companhia nos eventos das equipes, em especial à Bianca Mendicino, Débora Cristina dos Santos, Geovane Prates Ferreira, Grazielle Gouveia e Laís Ramires Mendicino, pela companhia em vários momentos e pela amizade.
Às minhas amigas Letícia Rodrigues, Lorraine Stefanini, Pâmela Figueiredo, Talita Rossini e Valquiria Lima, pela amizade sincera, por se fazerem presentes mesmo a distância, pessoas importantes no conjunto que cerca minha vida, pelo apoio e incentivo constantes, amo demais.
“Todo mundo é um gênio. Mas, se você julgar um peixe pela sua capacidade de subir
em uma árvore, ele vai gastar toda uma vida acreditando que é estúpido.”
RESUMO
INTRODUÇÃO: A inflamação é caracterizada pelo acúmulo de leucócitos nos tecidos
oculares, podendo afetar qualquer parte do olho, sendo um processo doloroso,
associado à fotofobia e podendo resultar em complicações secundárias. Em geral, no
tratamento dessas inflamações intra-oculares, os glicocorticóides são os medicamentos
freqüentemente administrados. Porém, devido aos efeitos adversos, existe uma
demanda óbvia para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Entre elas, a
proteína anexina A1 (ANXA1) tem mostrado a sua participação ativa nos processos
inflamatórios. OBJETIVO: Em função desses dados, foi realizado o presente trabalho
que teve como objetivo geral avaliar a influência desse tratamento anti-inflamatório nas
células epiteliais pigmentadas da retina humana (ARPE-19), sobre a morfologia,
proliferação, migração e na expressão gênica e proteica. MATERIAL E MÉTODOS: As
células ARPE-19 foram cultivadas em meio completo e estimuladas pelo
Lipopolissacarideo bacteriano (LPS), e em outro experimento foi acrescentado o
tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26, para avaliar o possível efeito anti-inflamatório
dessa proteína, nos tempos de 1, 2, 4, 24, 48 e 72 horas sobre a morfologia,
proliferação e migração celular. Após análises estatísticas, que evidenciaram o tempo
de 72 horas, foi realizado um novo cultivo celular para a extração do RNA e conduzida
a técnica de Hibridização Subtrativa Rápida (RaSH). A validação de cinco genes
encontrados como diferencialmente expressos foi realizada por RT-qPCR. Além dessas
técnicas, também foi analisada a expressão das citocinas anti e pró-inflamatórias pelo
ensaio Multiplex. RESULTADOS: O ANXA1Ac2-26 não modificou a morfologia das
células ARPE-19, entretanto diminui a proliferação e aumenta a migração celular. Pela
tecnologia de RaSH foram encontrados 80 genes diferencialmente expressos após o
tratamento com ANXA1Ac2-26. Cinco desses genes (LRAT, CTGF, MAP1B, ALDH1A3 e
SETD7), devido às suas funções estarem relacionadas com doenças oculares e/ou
inflamatórias, foram validados por RT-qPCR, mas apenas dois deles (LRAT, CTGF)
confirmaram a baixa expressão. Também foram interligadas as vias de sinalização
celular, das quais a ANXA1 participa, importantes para o processo inflamatório, pelo
Ingenuity Sistems©. Em relação à análise da expressão das citocinas, observou-se que
concentração de 100 µg/ml. CONCLUSÃO: As nossas analises in vitro mostram que a
proteína ANXA1 pode interagir nas cascatas de sinalização de processos inflamatórios,
alterando a proliferação, migração e expressão gênica e proteica nas células. Desse
modo, os nossos resultados apontam que as Células do Epitélio Pigmentado da Retina
(EPR) são um alvo potencial da atividade da proteína ANXA1, tendo em vista sua
possível utilização em terapias inovadoras no tratamento de inflamações oculares.
Palavras-chave: Anexina A1, Inflamação ocular, Cultura de células, RaSH, Expressão
ABSTRACT
INTRODUCTION: The inflammation is characterized by the accumulation of leukocytes
in ocular tissues, and it can affect any part of the eye, been a painful process,
associated with photophobia and may result in secondary complications. In general, for
the treatment of these intraocular inflammations, the glucocorticoids are the drugs
frequently administered. However, due to its side effects, there is an obvious demand for
developing new therapeutic strategies. Among them, the protein annexin A1 (ANXA1)
has shown its active participation in inflammatory processes. AIM: In the present study
we investigated the influence of anti-inflammatory treatment in human retinal pigment
epithelial cells (ARPE-19), on the morphology, proliferation, migration and gene and
protein expression. MATERIALS AND METHODS: The ARPE-19 cells were cultured in
complete medium and stimulated by bacterial lipopolysaccharide (LPS), and in another
experiment was added treatment with ANXA1Ac2-26 peptide, to evaluate the possible
anti-inflammatory effects of this protein, in 1, 2, 4, 24, 48 and 72 hours on the morphology,
cell proliferation and migration. After statistical analyzes, which demonstrated that the
time 72 hours is the best, was performed a new culture bottles for RNA extraction
technique and conducted the Rapid Subtractive Hybridization (RaSH). The validation of
five genes founded differentially expressed was done by RT-qPCR. In addition to these
techniques was also analyzed the expression of anti and pro-inflammatory cytokines by
Multiplex assay. RESULTS: The ANXA1Ac2-26 did not alter the morphology of the
ARPE-19 cells, however decreased proliferation and increased cell migration. After statistical
analysis, it was evident that the time of 72 hours was the best to proceed with the
methodology. By RaSH technology, after treatment with the peptide, were found 80
differentially expressed genes. Five of those genes (LRAT, CTGF, MAP1B, ALDH1A3
and SETD7), due its functions are related to eye and/or inflammatory diseases, were
validated by RT-qPCR. Also were interconnected the signaling pathways, of which
ANXA1 participates, important to the inflammatory process by Ingenuity Sistems©.
Regarding the analysis of cytokine expression, we observed that the treatment with
ANXA1Ac2-26 diminish the expression of pro-inflammatory molecules at a concentration of
100 µg/ml. CONCLUSSION: Our in vitro analyzes show that the protein ANXA1 can
and gene and protein expression in the cells. Thus, our results suggest that the Retinal
Pigment Epithelial cells (RPE) are a potential target of the activity of protein ANXA1,
considering their potential use in innovative therapies for ocular inflammation’s
treatment.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Análise morfológica da linhagem celular ARPE-19 ___________________ 61
Figura 2. Efeitos dos tratamentos com o peptídeo ANXA1Ac2-26 na proliferação das
células ARPE-19. _____________________________________________________ 63
Figura 3. Ensaio de migração com linhagem celular ARPE-19. _________________ 65
Figura 4. Relação dos genes obtidos na subtração das células induzidas pelo LPS (Sub
A). _________________________________________________________________ 67
Figura 5. Relação dos genes obtidos na subtração das células tratadas com ANXA1
Ac2-26 (Sub B).___________________________________________________________ 69
Figura 6. Validação da integridade do mRNA e cDNA. ________________________ 71
Figura 7. Expressão gênica por PCR em tempo real. _________________________ 73
Figura 8. Expressão gênica por PCR em tempo real. _________________________ 75
Figura 9. Efeito do peptídeo ANXA1Ac2-26 nos níveis de expressão de citocinas pró e
anti-inflamatórias. _____________________________________________________ 77
Figura 10. Efeito do peptídeo ANXA1Ac2-26 nos níveis de expressão de citocinas pró e
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Genes, selecionados por RaSH, expressos na linhagem celular ARPE-19
com expressão aumentada após ativação pela endotoxina e, reduzida nas tratadas com
ANXA1Ac2-26. _________________________________________________________ 81
Tabela 2. Genes, selecionados por RaSH, com expressão aumentada na linhagem
celular ARPE-19 tratadas com ANXA1Ac2-26 e, reduzida nas ativadas pelo LPS. _____ 82
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Pl: microlitros
%: porcentagem
>: Maior
≤: Menor ou igual
°C: Graus célsius
µg: microgramas µM: Micromolar
ALDH1A3: Família Aldeído Desidrogenase 1, membro 3 AMP: Adenosina monofosfática cíclica
ANX: Anexinas
ANXA1: Gene da proteína Anexina A1, 28; Proteína Anexina A1 ANXA1Ac2-26: Peptédio da porção N-terminal da proteína ANXA1
ARPE-19: Linhagem celular de Células Epiteliais Pigmentadas da Retina Humana
Br: Brasil
Ca2+: Íon calcio
cDNA: DNA complementar cm2: centímetros quadrados cm3: centímetros cúbicos CO2: Gás carbônico
cPLA2: Fosfolipase citosólica A2
CREB: Proteína ligadora do elemento respondedor de AMP cíclico Ct: Cycle threshold
CTGF: Fator de Crescimento de Tecido Conjuntivo
DMEM: Meio de cultivo Dulbecco Eagle modificado DMRI: Degeneração Macular Relacionada com a Idade DNA: Ácido desoxirribonucleico
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético EGF: Fator de crescimento epidérmico EPR: Epitélio Pigmentado da Retina
FDEP: Fatores derivados do epitélio pigmentado Fpr-rs: Receptor murino para peptídeos formilados
GC: Glicocorticóides GO: Gene Ontology
Ham F-12: Mistura de nutrientes para cultura hs: horas
IBILCE: Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas IL: Interleucina
INF-γ: Interferon gama
K/BxN: Soro artritogênico kDa: Kilodalton
Log2: Escala logarítmica de base 2 LPS: Lipopolisacarídeo bacteriano
LRAT: Lectina Retinol Acetiltransferase (fosfatidilcolina-retinol O-aciltransferase)
MAP1B: Proteína associada ao microtúbulo 1B MAPK: Proteína quinase ativada por mitógeno MCP-1: Proteína quimiotática para monócitos mg: Miligrama
min: Minutos ml: Mililitro mM: Milimolar
NF-κB: Fator de crescimento nuclear kappa B ng: Nanograma
PCR: Reação em cadeia da polimerase PGE2: Prostaglandina E2
PKC: Proteína kinase C Pol: Polimerase
Rantes: Expressão e secreção de Células T reguladas e normais RaSH: Hibridização Subtrativa Rápida
RefSeq: Sequências de referência RNA: Ácido Ribonucleico
SETD7: Domínio SET (lisina metiltransferase) 7
Sub A: tester= ARPE-19 induzida por endotoxina vs driver= ARPE-19 induzida por endotoxina e tratadas com a proteína ANXA1Ac2-26
Sub B: tester= ARPE-19 induzida por endotoxina e tratadas com a proteína ANXA1Ac2-26 vs driver= ARPE-19 induzida por endotoxina
TGF-E: Fator de crescimento transformante beta TGF-α: Fator de crescimento transformante alfa TLR4: Receptor toll-like 4
TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa
U: Unidades UK: Reino Unido
UNESP: Universidade Estadual Paulista
VEGF: Fator de crescimento vascular endotelial
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ________________________________________________________ 23
1.1 Objetivos _________________________________________________________ 33
2. MATERIAL E MÉTODOS ________________________________________________ 34
2.1 Linhagem celular ARPE-19 __________________________________________ 35
2.2 Tratamentos farmacológicos _________________________________________ 35
2.3 Índice de Proliferação Celular ________________________________________ 37
2.4 Ensaio de Migração ________________________________________________ 38
2.5 Hibridização Subtrativa Rápida (RaSH) _________________________________ 39
2.6 PCR quantitativa (RT-qPCR) _________________________________________ 41
2.7 Ensaios Multiplex para análise de citocinas _____________________________ 43
2.8 Análises dos dados ________________________________________________ 44
3. RESULTADOS ________________________________________________________ 45
3.1 Morfologia Celular _________________________________________________ 46
3.2 Índice de Proliferação Celular ________________________________________ 46
3.3 Migração Celular ___________________________________________________ 46
3.4 Hibridização Subtrativa Rápida (RaSH) _________________________________ 46
3.5 Ingenuity Systems© ________________________________________________ 47
3.6 PCR Quantitativa – RT-qPCR _________________________________________ 48
3.7 Ensaios Multiplex para análise de citocinas _____________________________ 49
4. DISCUSSÃO __________________________________________________________ 50
5. CONCLUSÕES ________________________________________________________ 57
6. FIGURAS ____________________________________________________________ 59
7. TABELAS ____________________________________________________________ 80
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ________________________________________ 89
O olho é um órgão altamente especializado, que traduz estímulos luminosos em sinais elétricos e retransmite esses sinais para o córtex visual (Figura 1). A percepção da luz e formação da imagem é mediada pela ativação dos fotorreceptores, localizados na camada mais externa da retina, e é nessa camada que a luz ativa uma cascata de sinalização e propaga o impulso elétrico. Essa foto-ativação é iniciada após isomerização do 11-cis-retinal nos segmentos externos dos fotorreceptores, assim a continuação do ciclo visual é dependente da reposição constante de 11-cis-retinal, uma função desempenhada pelo epitélio pigmentado da retina (EPR) (LIPINSKI; THAKE; MACLAREN, 2013).
Figura 1. Esquema do olho humano com destaque para a retina. Fonte: GOWDAK; GOWDAK,
1989.
EPR é o principal componente da barreira hemato-retiniana (LEUNG; BARNSTABLE; TOMBRAN-TINKA, 2009), com importante papel na manutenção da nutrição e tolerância imune do olho (STREILEIN, 2003). Esse epitélio (Figura 2) é constituído por uma monocamada de células de origem ectodérmica, aderidas à superfície interna da membrana de Bruch, diretamente posicionada sobre os segmentos externos dos fotorreceptores, e interconectadas por complexos juncionais que consistem em junções gap, oclusão e desmossomos (KOEVARY, 2000).
Figura 2. Esquema das camadas da retina humana, destacando o epitélio pigmentado e a
barreira hemato retiniana. Fonte: http://www.infoescola.com/visao/retina/ e http://www.eyeconnectamd.ca/dryamd.aspx.
concentração da luz dentro do olho, melhorando a resolução da imagem e manutenção da adesão da retina neurosensorial. Ainda, o EPR fornece uma barreira de permeabilidade seletiva entre a coreóide e a retina neurosensorial, fagocitose dos cones e bastonetes, síntese de matriz interfotoreceptora, transporte e armazenamento de metabólitos e vitaminas (FORRESTER et al., 1999).
Essas células EPR possuem um papel fundamental no ciclo visual, pois a sua conexão com os fotorreceptores, fagocitando e transformando o sinal luminoso em impulso elétrico, proporciona a base para uma boa visão (LIPINSKI; THAKE; MACLAREN, 2013). Nesse processo de interação entre as células EPR e os fotorreceptores, encontramos várias enzimas atuando na transformação dos compostos para completar o ciclo visual, uma dessas é a Lectina Retinol Acetiltransferase (fosfatidilcolina-retinol O-aciltransferase) (LRAT), que age nessas células em um momento específico formando os pigmentos que gerarão a imagem (TANG et al., 2012).
As células EPR suportam um alto nível de estresse oxidativo devido seus elevados níveis de consumo de oxigênio e alto teor lipídico poli-insaturados e, ainda, ampla exposição à luz (PAIMELA et al., 2007). O estresse oxidativo pode evocar um progressivo dano às células EPR que, secundariamente, causa efeitos adversos nos fotorreceptores (ZARBIN, 2004). Além do estresse oxidativo crônico, os processos inflamatórios também têm sido ligados à degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) (ZARBIN, 2004).
A inflamação ocular aguda pode induzir o processo de uveíte, com vários graus de degeneração na retina e perda da visão (SHEN et al., 2000; AGRAWAL et al., 2010). Essa inflamação, que é caracterizada pelo acúmulo de leucócitos nos tecidos oculares, pode afetar qualquer parte do olho, sendo um processo doloroso e associado à fotofobia (BANSAL; GUPTA; GUPTA, 2010). A natureza recorrente desse processo inflamatório pode resultar em complicações secundárias como catarata, glaucoma, descolamento de retina e, por fim, destruição dos tecidos oculares e cegueira (JANCEVSKI; FOSTER, 2010; SRIVASTAVA; RAJAPPA; KAUR, 2010).
Há vários tipos de processos patológicos que podem acometer a retina, todos promovem perda significante da visão. Acredita-se que as células EPR têm um papel na vitreoretinopatia proliferativa, na transição de células epiteliais para células mesenquimais mediando a fibrose e, relacionado com essa função, o Fator de Crescimento de Tecido Conjuntivo (CTGF), possui correlação com os níveis de fibrose em doenças vitreoretinais (CHEN et al., 2012).
Outras patologias na retina, como hemorragia retiniana (CELIK et al., 2006), podem ser induzidas pelo lipopolissacarídeo (LPS) de bactérias gram-positivas incluindo Saccharomyces aureus e Escherichia coli, enquanto de Chlamydia pneumoniae (cLPS) pode apresentar correlação com a progressão da degeneração macular relacionada com a idade (ROBMAN et al., 2005).
Na retina, o LPS aumenta a concentração de citocinas pró-inflamatórias, sendo também um potente desencadeador da ativação da micróglia (WANG et al., 2005; YANG; ZHI; TSO, 2007) e astrócitos no tecido nervoso (JANG et al., 2007). Essa endotoxina pode estimular diretamente as células EPR nas concentrações entre 100 ng/ml e 1mg/ml, produzindo respostas inflamatórias e sinais apoptóticos (NAGINENI; DETRICK; HOOKS, 1994; GARCIA-CABANES et al., 2001; ELNER et al., 2003; KOGA et al., 2003). As células EPR expressam vários receptores de LPS, incluindo CD14 e o toll-like 4 (TLR4) que têm importante papel na defesa contra uma variedade de patologias oculares (KINDZELSKII et al., 2004; ELNER et al., 2005; PAIMELA et al., 2007).
Alguns fatores secretados pelas células EPR podem inibir diretamente a imunidade adaptativa e inata (NISHIDA; TAYLOR, 1999; TAYLOR; YEE, 2003; KAESTEL et al., 2005). O
fator de crescimento transformante α (TGF-α) e a trombospondina, ambos secretados pelas células EPR, podem bloquear a ativação da célula Th1 e promover tolerância sistêmica de antígenos no microambiente ocular (ZAMIRI et al., 2005; UNO et al., 2006). Essas células podem ainda regular a imunidade inata pela supressão da inflamação induzida por macrófagos, por meio da secreção de fatores derivados do epitélio pigmentado (FDEP) (ZAMIRI et al., 2006). Esses estudos indicam que as células EPR exercem um papel fundamental nos processos inflamatórios da retina (LEUNG; BARNSTABLE; TOMBRAN-TINKA, 2009).
inflamatórios, imunológicos e de cicatrização, provavelmente envolvidos na proliferação vítreo-retiniana.
A inflamação é o principal fator contribuinte para inúmeros distúrbios oculares (LEUNG; BARNSTABLE; TOMBRAN-TINKA, 2009) e no tratamento desses processos intra-oculares, os glicocorticóides são os medicamentos freqüentemente administrados (YEUNG et al., 2003). No entanto, há o risco de efeitos adversos, como elevação da pressão intraocular (JONAS; KREISSIG; DEGENRING, 2003), cataractogênese (YOSHIKAWA et al., 1995) e citotoxidade às estruturas oculares, como as células EPR (MCGHEE; DEAN; DANESH-MEYER, 2002). Além disso, os glicocorticóides não devem ser administrados em pacientes infectados com HIV, com transplantes ou com outras terapias imunossupressoras (HEGAB; AL-MUTAWA, 2003). Um dos mediadores anti-inflamatórios endógenos, induzido pelos glicocorticóides e responsável pela inibição da síntese de eicosanóides e de fosfolipase A2 é a proteína anexina A1 (ANXA1) (BLACKWELL et al., 1980; FLOWER, 1988). Esta proteína tem sido investigada como um agente terapêutico anti-inflamatório.
As anexinas (ANX) compreendem uma superfamília bem conservada de proteínas, com pelo menos 13 membros descritos, relacionadas estruturalmente e caracterizadas por um domínio C-terminal homólogo com 4 a 8 repetições de 70-75 aminoácidos, responsável pelas suas propriedades ligadoras de cálcio e fosfolipídeos (Figura 3). A região variável N-terminal, que é única em comprimento e sequência para cada membro da família, inclui sítios potenciais de fosforilação, glicosilação e ação de peptidase (GERKE; MOSS, 2002). Essa família de proteínas são encontradas em muitos organismos, desde leveduras a plantas e mamíferos, preferencialmente no citosol, associadas à membrana plasmática ou ao citoesqueleto. Sua função não está completamente esclarecida, mas existem evidências de sua participação em transdução de sinais (MOSS; MORGAN, 2004), transporte de vesículas (DIAKONOVA et al., 1997), inibição da inflamação (GETTING; FLOWER; PERRETTI, 1997; OLIANI et al., 2001), duplicação de DNA (SMITH; MOSS, 1994), transformação celular (SOLITO et al., 1998), formação de canais de íons, inibição de coagulação, interação célula-matriz (CROXTALL; FLOWER; PERRETTI, 1993), proliferação e apoptose (PERRETI; FLOWER, 2004;
Figura 3. Esquema da proteína anexina, mostrando os aminoácidos da região N terminal e as 4
repetições de 70-75 aminoácidos na região C terminal. RODRIGUES-LISONI; HENRIQUE; TAJARA, 2011.
A ANXA1, originalmente conhecida como lipocortina 1, foi o primeiro membro dessa família que teve seu gene clonado e é considerada o seu protótipo (WALLNER et al., 1986). O gene ANXA1 está localizado no cromossomo 9, em 9q12-21.2, apresenta 13 exons e codifica uma proteína de 37kDa.
Modificações pós-traducionais foram descritas, e pode ser considerada importante consequência intracelular alterando as propriedades da ANXA1. Uma das modificações é a clivagem do domínio N-terminal da proteína, formando uma molécula truncada com alteração da sua sensibilidade ao Ca2+ e da localização intracelular, essa clivagem pode ser considerada um evento regulatório para sua ação (GERKE; MOSS, 2002). A ação inflamatória e anti-proliferativa tem sido mostrada em estudos in vivo e in vitro, após administração da ANXA1 exógena ou seu peptídeo mimético da porção N-terminal (Ac2-26 e Ac- AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK) (DA CUNHA; OLIANI; DAMAZO, 2012).
Além da função de inibidor da fosfolipase citosólica A2 (cPLA2), foi inicialmente verificado que os resíduos de tirosina da ANXA1 compreendem um substrato para fosforilação pelo receptor do fator de crescimento epidérmico (HUANG et al., 1986). Essas observações levaram à conclusão de que essa proteína representava um mediador da resposta anti-inflamatória, uma hipótese posteriormente apoiada por estudos mostrando sua expressão elevada após administração de esteroides durante a inflamação (SOLITO et al., 1991).
Alldridge e colaboradores (1999) observaram que a anexina regula os componentes proximais das cascatas de sinalização MAPK (proteína quinase ativada por mitógeno), o que pode explicar sua ação anti-proliferativa, talvez pela inibição da ciclina D1 ou pela indução da desorganização do citoesqueleto. Os elementos centrais da via de sinalização MAPK são proteínas quinases serina/treonina, que respondem a uma variedade de fatores de crescimento (como o fator de crescimento epidérmico) e seus receptores, citocinas e hormônios. Uma das cascatas MAPK melhor caracterizada compreende a das famílias Quinase regulada por sinais extracelulares (ERK 1 e 2), cuja ativação é importante para proliferação, desenvolvimento e diferenciação. Essa via é iniciada por receptores de fatores de crescimento ou receptores acoplados à proteína G, que desencadeiam uma série de fosforilações em mensageiros secundários, culminando na translocação de um deles para o núcleo e consequente indução da fosforilação de fatores de transcrição e de outras proteínas associadas a genes de resposta imediata (HAZZALIN; MAHADEVAN, 2002). As famílias ERK 1 e 2 participam de vias de sinalização que incluem famílias bem conhecidas em mamíferos, as quinases c-jun e MAPKs p38, que são importantes para desenvolvimento, inflamação e apoptose (PIERCE; PREMONT; LEFKOWITZ, 2002).
Silva e colaboradores (2011) observaram que a ANXA1 é um mediador importante na homeostase dos processos inflamatórios, sugerindo que a proteína possui uma ação no controle da ativação dos neutrófilos e na sua migração, contribuindo para a resolução da resposta inflamatória. Modelos de toxoplasmose ocular mostraram, por meio de análises himuno-histoquímicas, aumento na expressão de ANXA1 em neutrófilos e fagocitose de células mononucleares, durante a fase tardia da inflamação, indicando que essa proteína pode contribuir na resolução dos processos inflamatórios (MIMURA et al., 2012).
O mecanismo preciso pelo qual a ANXA1 inibe a proliferação celular não é bem conhecido, mas a maioria dos estudos indica seu papel na regulação do crescimento mediado pelos glicocorticóides (GC) (ALLDRIDGE; BRYANT, 2003). Esses compostos induzem a expressão da ANXA1 em vários tipos celulares, inclusive em neutrófilos (OLIANI et al., 2001), eosinófilos (OLIANI; DAMAZO; PERRETTI, 2002) e mastócitos (OLIANI et al., 2008) e, parecem levar à sua fosforilação e translocação para a superfície da célula (SOLITO et al., 2003a). Além disso, a ANXA1 também pode ser encontrada em células endoteliais, epiteliais de pulmão e sinoviócitos (PERRETTI et al., 1996; OLIANI et al., 2001; DAMAZO et al., 2005).
esse processo inclui etapas de adesão ao endotélio e diapedese. O acúmulo e a subseqüente ativação de leucócitos podem ser perpetuados e resultar em doenças que envolvem lesão e inflamação crônicas. Para regulação desse processo, é ativada uma série de sistemas de feed-back que interrompem a migração leucocitária (VON ANDRIAN et al., 1992; MANCUSO; FLOWER; PERRETTI, 1995; PANÉS; PERRY; GRANGER, 1999). Entre esses estão os hormônios glicocorticóides, as citocinas IL10 e IL4, a adenosina, o óxido nítrico, a prostaciclina, a catepsina G e a ANXA1 (PERRETTI, 1997).
Durante o processo de inflamação, a liberação do ácido aracdônico a partir de fosfolipídeos celulares, e sua quebra em metabólitos, resulta em vários efeitos biológicos, entre eles a vasodilatação. Essa liberação é decorrente da ação das fosfolipases A2 que, por sua vez, são ativadas por diferentes estímulos. Um deles envolve a cascata de sinalização desencadeada por recrutamento de Grb2 e p21ras, iniciada pelo receptor do fator de crescimento epidérmico, com consequente fosforilação da fosfolipase e sua ligação ao cálcio. O processo é inibido pelos GCs, que promovem a redução dos níveis de moléculas de adesão e fosforilação da ANXA1 (NEWMAN et al., 1997; SOLITO et al., 1998; CROXTALL; CHOUDHURY; FLOWER, 2000).
O efeito inicial dos GCs sobre a ANXA1 é a translocação dessa proteína do citoplasma para a superfície externa da célula, onde é retida por um mecanismo dependente de Ca2+ (TAYLOR et al., 1993). Solito e colaboradores (1998) sugerem que a forma citosólica bloqueia a cPLA2 e a forma extracelular também atua como regulador negativo do processo inflamatório. Oliani e colaboradores (2001) observaram que a isoforma citosólica (com 37kDa) está presente em neutrófilos circulantes. A adesão dessas células ao endotélio aparentemente causa externalização da proteína na membrana plasmática do leucócito. A segunda isoforma (com 33kDa) foi observada principalmente em neutrófilos extravasados e teve localização intracelular. A presença da ANXA1 na membrana plasmática (DIAKANOVA et al., 1997) e sua habilidade para associação com a bicamada lipídica pode estar relacionada com o recrutamento de proteínas de sinalização para a membrana.
na tirosina 21 está relacionada com promoção tumoral e proliferação excessiva e a torna inativa como inibidor de cPLA2 (DE COUPADE et al., 2000).
A exportação de ANXA1 é um mecanismo importante que permite à proteína acessar receptores na superfície de outras células e assim exercer ações regulatórias parácrinas. Realmente, sítios com alta afinidade de ligação da ANXA1 já foram identificados em uma variedade de células tais como as da adenohipófise (CHRISTIAN et al., 1997), neutrófilos (PERRETTI et al., 2002) e em diferentes linhagens celulares, como células de linfoma histiocítico difuso e células foliculares estreladas extraídas de tumor da pituitária (SOLITO et al., 2001; TIERNEY et al., 2003).
Análises realizadas recentemente no nosso laboratório, demonstraram imunocitoquimicamente, a ligação da ANXA1 com o receptor Fpr-rs2 em neutrófilos de camundongos induzidos à peritonite aguda, sugerindo que a ação anti-inflamatória da ANXA1 pode ser mediada pelo receptor (GASTARDELO et al. 2009). Em outro estudo foi observado que a administração do Boc2, antagonista do FPR, anula os efeitos anti-inflamatórios da injeção sistêmica do peptídeo (GIROL, 2012).
Abordando o olho, Girol (2012), após verificar a ação anti-inflamatória da ANXA1 exógena, analisou a expressão endógena da proteína, demonstrando, pela primeira vez na literatura, a presença da ANXA1 nos tecidos oculares nas condições inflamatórias. Em outro modelo de inflamação, artrite induzida por soro K/BxN em camundongos, também foi demonstrado a ação dos glicocorticóides, via ANXA1(PATEL et al., 2012).
Solito e colaboradores (2003b) propuseram outro mecanismo pelo qual a ANXA1 inibe a inflamação. Esses autores levantaram a hipótese de que a elevação dos níveis de ANXA1 e sua translocação para a membrana, durante a adesão dos leucócitos ao endotélio, provoca não apenas a redução dessa adesão, mas também o encaminhamento da célula para a apoptose. Da mesma maneira, a ANXA1 promoveria a apoptose de leucócitos no sítio da inflamação, quando sua síntese está aumentada. Realmente, a expressão elevada de ANXA1 já foi associada com o aumento da atividade da caspase 3, uma enzima chave no desencadeamento da apoptose (SOLITO et al., 2001). Como a cPLA2 é um substrato da caspase-3 (ATSUMI et al., 1998), este mecanismo indireto anti-PLA da ANXA1 deve levar a uma diminuição da produção de prostaglandina E2 (PGE2), um metabólito pró-apoptose da cPLA2, o que reforça o potencial pró-apoptótico da ANXA1.
Uma nova descoberta relacionada com a sinalização da ANXA1 é que essa proteína pode ser associada diretamente com a subunidade p65 do fator de transcrição de ubiquitina
(ZHANG et al., 2010). Esse fato destaca caminhos alternativos pelos quais a ANXA1 pode modular localmente os processos inflamatórios (HUTCHINSON et al., 2011).
Desse modo, os trabalhos relacionados com a ANXA1 têm contribuído para um maior entendimento do papel dessa proteína no processo inflamatório. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais a ANXA1 modula as respostas celulares nos processos inflamatórios ainda não estão completamente determinados. Além disso, são raros os relatos sobre o papel anti-inflamatório da ANXA1 nas doenças oculares. Os dados disponíveis sugerem que essa família de proteínas pode ter, além do seu importante papel no processo inflamatório, um envolvimento significativo em outras doenças, inclusive no câncer, por meio de cascatas de sinalização que incluem genes relacionados com o ciclo celular, diferenciação e apoptose.
Diante dessas considerações, e da necessidade de novas terapias para o tratamento das inflamações oculares em substituição às atuais, como por exemplo, os corticosteróides que apresentam efeitos adversos (DUNN, 2004), investigamos, in vitro, o efeito da administração da ANXA1, nas células ARPE-19 após ativação pelo inflamógeno LPS, em busca de uma via nas cascatas gênicas de sinalização, para a possível descoberta de futuros marcadores moleculares e alternativa terapêutica ocular inovadora.
1.1 Objetivos
Objetivo geral
Em função da importância do possível efeito anti-inflamatório do peptídeo ANXA1Ac2-26 nas células epiteliais pigmentadas da retina humana (ARPE-19), após ativação pelo inflamógeno lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), foi avaliado como a proteína modula a expressão gênica e como essas alterações podem participar do processo inflamatório.
Os objetivos específicos compreenderam os seguintes aspectos:
i. o efeito do peptídeo ANXA1Ac2-26 in vitro nas células ARPE-19 controles e estimuladas pelo LPS na morfologia, no índice de proliferação celular e migração celular e na expressão gênica.
ii. as dosagens das citocinas pró e anti-inflamatórias.
iii. a expressão dos genes diferencialmente expressos como possíveis marcadores moleculares potencialmente relacionados com os tratamentos anti-inflamatórios.
Os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as normas da Comissão de Ética em Pesquisa do IBILCE/UNESP, protocolo 0012.0.229.000-11 e parecer 043/11 (Anexo).
2.1 Linhagem celular ARPE-19
A linhagem celular ARPE-19 foi cultivada em uma mistura (1:1) de meio Dulbecco Eagle modificado e Ham F-12 (DMEM:F-12) (Cultilab, Br) de acordo com Dunn et al. (1996), e semeadas em garrafas de cultura de 25 cm2, na concentração de 104 células, suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab, Br), 200 mM L-glutamina, 0,1 mg/mL de estreptomicina e 100 U/mL de penicilina (Invitrogen, UK) e mantidas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 por 24 horas, até serem fixadas no substrato. Após esse período, o meio foi trocado a cada dois ou três dias, ou até se tornar confluente. O crescimento e a morfologia celular foram avaliados diariamente em microscópio invertido e, quando a densidade celular se mostrou alta (80-90%), o material foi submetido à desagregação celular por meio de tripsina e subdividido em duas réplicas.
2.2 Tratamentos farmacológicos
2.3 Índice de Proliferação Celular
As amostras controle não foram induzidas por LPS e nem tratadas com o ANXA1Ac2-26. Para análise do índice de proliferação celular, foi realizada uma curva de crescimento, com contagem de células cultivadas em placas de cultura de 6 poços, semeadas na concentração de 5x104 células por poço. O experimento foi realizado em triplicatas. Após esse período, o meio de cultura completo foi substituído por meio sem soro (DMEM:F-12 0%), a fim de deixar todas as células na mesma etapa celular. Após 24 horas, o meio sem soro foi substituído pelo meio completo e adicionado LPS [10 µg/mL] em um conjunto de poços correspondentes aos grupos LPS e LPS + ANXA1Ac2-26. As células que receberam o LPS ficaram com esse meio por 24 horas para indução do processo inflamatório (MIMURA, 2012). Após, as células foram tratadas com o ANXA1Ac2-26, na concentração final de 5 µg/mL, nos períodos de 1, 2, 4, 24, 48 e 72 horas.
Figura 1. Modelo de três placas com 6 poços contendo apenas um tipo celular (ARPE-19) com
diferentes tratamentos (controle, LPS e LPS/ ANXA1Ac2-26) e coletados nos seis diferentes tempos do experimento (1, 2, 4, 24, 48 e 72 horas).
2.4 Ensaio de Migração
2.5 Hibridização Subtrativa Rápida (RaSH)
Esta técnica de RaSH (JIANG et al., 2000), foi desenvolvida para separar os mRNA que mostram diferenças de expressão entre culturas submetidas a condições distintas. As etapas descritas podem ser observadas no esquema encontrado no final desse item.
Dos seis tempos analisados anteriormente, foi escolhido o tempo de 72 horas para o cultivo celular em garrafas grandes (75 cm3) nas três diferentes condições (controle, tratada com LPS e LPS + ANXA1Ac2-26) para a extração de RNA com trizol (SAMBROOK; RUSSEL, 2001). Após a extração foi realizada a hibridização subtrativa rápida (RaSH), com duas
subtrações, uma denominada de “Sub A”, onde temos as células da linhagem ARPE-19 ativadas pela endotoxina LPS sendo o tester e as células da linhagem ARPE-19 ativadas pela endotoxina LPS e tratadas com ANXA1Ac2-26 sendo o driver; e a outra denominada “Sub B”, onde tínhamos o contrário da primeira.
A primeira fita de DNA complementar (cDNA) foi obtida por transcriptase reversa com 2µL de oligo (dT) (50 µM), 2µL de dNTPs 10 mM, à 65°C, por 5 min, e imediatamente no gelo por 1 min, acrescentando-se 2 µL de DTT 0.1 mM, 1 µL de RNAout, 10 µL de tampão 5X Superscript III e 3 µL de transcriptase reversa (RT) Superscript III (200 U/µL). O material foi incubado a 50ºC por 60 minutos e, em seguida, a 70ºC por 15 minutos. Após esse procedimento foi adicionado 2 µL de RNase H (2 U/µL) e, deixado à 37°C por 20 min. O cDNA foi utilizado em reações de amplificação para segmentos da E-actina, para verificar sua qualidade.
Para a síntese da segunda fita, o cDNA foi utilizado em reações contendo 30 µL de tampão 5X Second-Strand Buffer, 3 µL de dNTPs 10 mM, 1 µL de DNA ligase (10 U/µL), 4 µL de DNA Pol I (10 U/µL), incubado por 2 horas a 16ºC e, após 2 µL de T4 DNA Pol (5 U/µL), continuando a incubação por mais 5 minutos. A ação desta enzima foi inibida pela adição de 10 µL de EDTA 0,5 M. Em seguida, foi realizada a purificação do cDNA com fenol: clorofórmio e a ressuspensão do pellet obtido em 45 µL de água. O cDNA foi utilizado em reações de amplificação para segmentos da E-actina, posteriormente digerido com 2µL da enzima MboI (10 U/µL) e incubado por uma hora a 37ºC. A seguir, recebeu mais 1 µL dessa enzima e foi incubado over-night a 37ºC.
(9 U) de T4 DNA ligase (3 U/µL) e permaneceu over-night a 14ºC. Em seguida, foram realizadas vinte PCRs com o primer XDPN-18 para obtenção de massa adequada. A concentração do produto total obtido foi verificada em espectrofotômetro e o material procedente das células estimuladas por LPS (tester) foi digerido com a enzima Xho I (10 U/µL) por 6 horas a 37ºC.
Para a subtração, foram utilizados 100 ng de cDNA das células de driver, 5 µg de tester e 16,60 µL de tampão de hibridização. O material foi fervido a 100ºC por 5 minutos e incubado durante 48 horas a 42ºC. Em seguida, foi promovida a ligação, por 3 horas a 16ºC, desse cDNA com o plasmídeo Pzero (também digerido com a enzima Xho I por 20 minutos a 37ºC).
A transformação foi realizada com 1 µL do produto de ligação e 50 µL de bactérias competentes (DH5D). O material foi submetido a choque elétrico a 2,5 volts, 25 µFD e 200 OHMS e esperou-se o aparelho marcar de 4 à 5 seg., quando a eletroporação é mais eficiente. Após isso, recebeu 500 µL de meio LB e foi agitada a 200 rpm por uma hora, a 37ºC. O material foi plaqueado em placas de Petri com Agar e Zeocin (100 mg/mL) e mantido a 37ºC por 16 horas. No dia seguinte, as colônias foram transferidas e colocadas para crescer em 150 µL de meio LB com zeocin. Após 16 horas, foi realizada uma PCR com o primer universal M13 e o seqüenciamento do produto no Sequênciador Automático de DNA, modelo ABI 3700 PrismABI Analyser (Applied Biosystems).
Na análise do RaSH, após obtermos as sequências nucleotídicas, foram submetidas ao programa de alinhamento blast (http://www.ncbi.nih.nlm.gov/blast). A partir dos resultados do blast, apenas com o banco obtido de RefSeq (Sequências de Referencia) foram selecionadas as sequências que no alinhamento apresentaram no mínimo 90% de similaridade com o comprimento da sequência alvo. Devido ao critério de seleção adotado, os genes selecionados do blast podem ser considerados homólogos às sequências encontradas nas bibliotecas. Assim, foram escolhidos cinco genes encontrados como diferencialmente expressos (pela técnica de RaSH) e com funções interessantes, em relação ao projeto de pesquisa, para avaliação pela técnica de PCR quantitativa – Transcriptase Reversa.
A seleção dos genes que foram validados por PCR em tempo real, foi feita a partir de estudos das funções e processos que o gene está envolvido de acordo com os termos do Gene Ontology (GO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), e tendo como embasamento o tema do projeto de pesquisa.
2.6 PCR quantitativa (RT-qPCR)
As reações foram realizadas em termociclador 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems) com o sistema SYBR Green. Nossas amostras foram compostas do controle, (sem tratamento); submetidas à indução da inflamação pelo LPS, na concentração de 10 µg/mL (PAIMELA et al., 2007) por 24 horas (MIMURA, 2012) e submetidas à indução e tratadas com o peptídeo ANXA1Ac2-26 na concentração de 5 µg/mL e 100 µg/mL. Os iniciadores específicos para cada trancrito foram desenhados com a ferramenta Primer3 (http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi), conforme a seguir na tabela 1.
Tabela 1. Iniciadores para os genes de interesse
Oligonucleotídeo Sequência
LRAT right 5’ AGATGCCATAGTGGGTCAGG 3’
LRAT left 5’ CGAAGACAAAGGGAGGAACA 3’
CTGF right 5’ TGGAGATTTTGGGAGTACGG 3’
MAP1B right 5’ CAGGATGGGTGGTGCTTAGT 3’
MAP1B left 5’ AGTCCGGCTCTTTCTCCTTC 3’
ALDH1A3 right 5’ GTCCGATGTTTGAGGAAGGA 3’
ALDH1A3 left 5’ GAATACGCTTTGGCCGAATA 3’
SETD7 right 5’ ACATACGTGCCCTGGAGAAC 3’
SETD7 left 5’ GCACCCTGGAGGGGTATTAT 3’
As reações foram preparadas em triplicata, incluindo o controle endógeno, gliceraldeído 3 fosfato dehidrogenase (GAPDH), beta actina (ACTB) e beta tubulina (TUBB) e processadas em volume final de 20 PL contendo 100 a 500 ng de cDNA, SYBR® Green PCR Master Mix e 100 nM de cada primer, segundo protocolo da Applied Biosystems. Como controle de qualidade, as reações para amostras com valores de desvio significativos (> 2%) foram repetidas utilizando sempre o mesmo cDNA estoque.
As condições de termociclagem compreenderam uma incubação de 2 min a 50°C, seguida por desnaturação inicial de 10 min a 95°C. Em seguida, o programa continuou com 40 ciclos de 15 seg a 95°C, 1 min a 60°C para anelamento de primers e extensão das cadeias, seguidos de 35 seg a 65°C para coleta do sinal. A curva de dissociação foi gerada após amplificação e compreendeu um passo de 15 seg a 95°C seguido de 1 min a 60°C.
A quantificação da expressão foi realizada comparando-se os valores obtidos com curvas padrões, desenhadas pela diluição seriada, a partir de um pool de amostras de cDNA. O fator de normalização utilizado foi a média geométrica dos genes contitutivos, utilizado como controle interno (controle endógeno). Finalmente, os valores de expressão gênica, obtidos nas análises, foram novamente normalizados pelo resultado da quantificação da amostra controle, escolhida como calibrador de todas as amostras.
Dessa forma, a partir dos valores do Ct (Cycle threshold)* de cada amostra, foram
calculadas as médias das triplicatas. Posteriormente, foi calculado o ΔCt a partir da subtração da média obtida para a sequência de interesse por aquela do controle interno. Para o cálculo do
Δ-ΔCt, foi escolhida a amostra estimulada por LPS como calibrador, sendo atribuído ao mesmo
o valor de zero como resultado da subtração com seu próprio ΔCt. Nas demais amostras
(tratadas com ANXA1Ac2-26), o resultado do Δ-ΔCt foi calculado a partir das diferenças dos
valores de ΔCt de cada um deles em relação ao calibrador. Em seguida, foi calculado o 2-Δ
-ΔCt, ou seja, o 2-(Δ-ΔCt)
Foi considerado aumento ou redução significativa de expressão quando o valor de expressão foi duas vezes maior ou menor, respectivamente, em relação à amostra controle ou quando esteve acima ou abaixo de 1 quando apresentado na forma de Log2.
* Cycle threshold ou Ct é o ciclo no qual as amostras atingem o ponto de detecção da fluorescência pelo equipamento.
2.7 Ensaios Multiplex para análise de citocinas
A fim de quantificar as citocinas dos sobrenadantes das células ARPE-19, submetidas às diferentes condições experimentais descritas acima, utilizamos o kit MILLIPLEX MAP HCYTOMAG 60K e o equipamento LUMINEX xMAP MAGPIX (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) para a detecção multiplex quantitativa de múltiplos analitos, com rapidez e especificidade, por meio de beads magnéticas.
As células ARPE-19 foram semeadas com meio completo DMEM:F-12 na concentração de 5x104 células por poço (placa de 6 poços). Após esse período, o meio de cultura completo foi substituído por meio sem soro (DMEM:F-12 0%), a fim de deixar todas as células na mesma etapa celular. Após 24 horas, o meio sem soro foi substituído pelo meio completo e adicionado LPS [10 µg/ml] em um conjunto de poços correspondentes aos grupos LPS e em outro conjunto de poços, após a indução por LPS, houve o tratamento com o ANXA1Ac2-26 nas concentrações de 5 µg/ml e 100 µg/ml.
O sobrenadante das células foi cuidadosamente retirado, centrifugado, aliquotado e mantido a -20ºC até o momento do uso. As beads magnéticas, soluções controles, tampão de lavagem, soro matriz e padrões foram preparados e homogeneizados conforme as intruções decritas no kit (HCYTOMAG-60K, Milliplex MAP Kit, Millipore). Inicialmente, foram adicionados
25 μL dos padrões, soluções controles e amostras na placa magnética de 96 poços, lavada
previamente com o tampão de lavagem. Em seguida, 25 μL de assay buffer foi adicionado às
amostras, 25 μL do soro matriz aos padrões e, 25 μL de beads magnéticas revestidas com anticorpos específicos (HCYTOMAG-60K, Milliplex MAP Kit, Millipore) à todos os poços (controles, padrões e amostras). A placa foi selada com selante próprio, revestida com papel alumínio e incubada overnight a 4˚C, sob agitação no shaker. No dia seguinte, a placa foi
lavada duas vezes com 200 μL de tampão de lavagem e, incubada com 25 μL de anticorpo de detecção ligado a biotina à temperatura ambiente, por uma hora, no shaker. Para completar a
vezes e incubada com 150 μL do fluido (Drive Fluid) por cinco minutos à temperatura ambiente, no shaker. Em seguida, a leitura da placa foi realizada pelo LUMINEX xMAP MAGPIX.
A concentração dos analitos foi determinada pelo software MAGPIX xPONENT (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA). Os ensaios foram realizados em quintriplicatas para confirmar os resultados. Os analitos estudados foram: Interleucina 6 (IL-6), Interleucina 8 (IL-8), Interleucina 1 beta (IL-1β), expressão e secreção de Células T reguladas e normais (Rantes), proteína quimiotática para monócitos (MCP-1), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interferon gama (INF-γ), interleucina 10 (IL-10), fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e fator de crescimento epidérmico (EGF).
2.8 Análises dos dados
A morfologia celular foi avaliada no microscópio invertido OLYMPUS, CKX41. No teste de proliferação celular foi observado em qual tempo o tratamento mostrou uma diferença estatística mais significante em relação ao crescimento celular. O programa GrapghPad Prism 5 (GraphPad Software) foi utilizado para análises estatísticas iniciais, primeiramente foi realizado o Teste de normalidade, após foi realizado, comparando todos os grupos, o teste de variância não-paramétrico Kruskal-Wallis e o Teste de comparação múltipla de Dunn’s. O teste de análise
da variância one-way foi utilizado para comparar os grupos em cada tempo experimental. A diferença significante foi assumida quando o valor de P ≤ 0,05.
No teste de migração celular as imagens foram fotografadas nos tempos 0, 8, 24, 32 e 48hs e a análise quantitativa da área de fechamento da ranhura foram analisadas utilizando o programa Axiovision Rel. 4.7 (Carl Zeiss, Thornwood, NY). Após observação dos resultados da morfologia, índice de proliferação e ensaio de migração celular nos tempos propostos, foi escolhido aquele que deu a maior diferença estatística para realizar as técnicas de RaSH, MagPix e RT-qPCR.
3.1 Morfologia Celular
A morfologia celular (Figura 1) é caracterizada por uma monocamada de células cuboides dispostas em forma hexagonal no grupo controle e sem alterações após indução da inflamação com LPS ou tratamento com o peptídeo anti-inflamatório ANXA1Ac2-26.
3.2 Índice de Proliferação Celular
As células ARPE-19 apresentaram um crescimento progressivo entre os períodos de 1 a 72 horas. Na Figura 2, é possível observar que os três grupos do estudo (controle, indução de inflamação (LPS) e tratamento com peptídeo anti-inflamatório ANXA1Ac2-26) não mostraram uma diferença muito intensa de crescimento. No entanto, no tempo de 72 horas do experimento o
teste estatístico “Análise de Variância a um critério”, combinando tratamento com dia de
experimento, sendo considerado o efeito de tempo, mostrou uma diferença estatística significante, diminuindo a proliferação nas células tratadas com o peptídeo em relação ao controle. Podemos concluir, a partir do ensaio de proliferação celular e do teste estatístico aplicado, usando o programa GraphPad Prism 5 (GraphPad Software), que o tempo de 72horas foi o mais significante estatisticamente, considerando valor P ≤ 0,05.
3.3 Migração Celular
Os resultados mostraram que o peptídeo, após estímulos de inflamação, altera a migração celular nos ensaios realizados. Quando há indução de inflamação pelo LPS observamos diminuição da migração celular e, após tratamento com ANXA1Ac2-26 aumento da migração (Figura 3). A indução de endotoxemia, após um período de tempo maior (24 a 48 horas), afeta a migração dessas células, enquanto o tratamento com ANXA1Ac2-26 reestabelece a migração quando comparamos com o controle.
3.4 Hibridização Subtrativa Rápida (RaSH)
Pela metodologia de RaSH foram obtidas 142 sequências de qualidade (pelo banco de dados Blast), que após rigorosas seleções e classificações (pelo banco de dados Gene) resultaram em 80 genes indicados como diferencialmente expressos. Essa tecnologia compara dois experimentos, com o intuito de encontrar diferenças de expressão gênica.
No nosso trabalho obtivemos duas bibliotecas subtrativas (Sub A e Sub B), os 21 genes
aumentada após tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26. Assim, o esperado é que a expressão dos genes de uma biblioteca esteja diminuída em relação a outra.
Nas bibliotecas obtidas encontramos 80 genes com diferentes atividades, descritas nos bancos de dados do Gene Ontology (GO), como por exemplo: metiltransferase (1), apoptose (9), bioquímica de moléculas pequenas (1), câncer (4), desenvolvimento celular (2), doenças cardiovasculares (1), doenças imunes (4), doenças inflamatórias (6), doenças neurológicas (7), doenças oftalmológicas (2), função e desenvolvimento do sistema nervoso (2), função e desenvolvimento do sistema visual (4), função molecular (1), manutenção e função celular (1), organização e montagem celular (9), proliferação e crescimento celular (1), respostas inflamatórias (1), síntese de proteínas (3), trafego de moléculas imunes (1), transporte molecular (1), ligante de actina (2), ligante de ATP (1), ligante de carboidratos (1), ligante de DNA (1), ligante de íons de zinco (1), ligantes de proteínas (4), ligante de proteínas idênticas (1), ligante de RNA (1) e função desconhecida (7). Entre todos esses genes, escolhemos cinco (CTGF, LRAT, MAP1B, ALDH1A3 e SETD7) para a validação por PCR em tempo real, pois esses estão relacionados com metabolismo associados com o ciclo visual, o desenvolvimento e as funções do sistema nervoso e visual, e as doenças inflamatórias e oftálmicas.
3.5 Ingenuity Systems©
A lista contendo os genes selecionados pela técnica de RaSH foi analisada com a utilização do software Ingenuity Systems©. Essa análise mostrou que poucos desses genes se destacavam quando relacionados as funções que cada um controla no metabolismo. Percentualmente observamos os genes mais listados, indicando assim, a relação de cada um desses genes com todas as funções metabólicas descritas pelo software, onde obtivemos na
“Sub A” cinco genes, CTGF (46,95%), BMPR2 (24,15%), HDAC2 (11,96%), LRAT (11,51%) e
TMSB4X (7,67%), e na “Sub B” nove genes, FN1 (45,92%), ITGB1 (45,55%), HIF1A (23,33%),
SERPINE1 (20,55%), PTPN11 (16,02%), TIMP2 (11,40%), SPARC (10,83%), TUBB4 (7,96%) e HSPA4 (7,87%).
A análise pelo software permitiu observar a interação dos genes encontrados em nossa biblioteca com diferentes redes funcionais. Os dados mostram como eles interagem uns com os outros, e, ainda, com genes importantes nos processos inflamatórios e nas vias oculares. Em relação à biblioteca subtrativa A (Sub A), os diferentes genes encontrados estão relacionados com organização celular, ciclo celular, reparo e replicação do DNA, formando uma rede de interação importante (Figura 4). Em relação à biblioteca subtrativa B (Sub B), os genes diferencialmente expressos encontrados formam redes funcionais associadas com doenças imunológicas, doenças inflamatórias, ciclo celular e desenvolvimento celular (Figura 5).
3.6 PCR Quantitativa – RT-qPCR
Previamente ao PCR em tempo real, validamos a integridade dos RNAs (Figura 6A) e cDNAs (Figura 6B) obtidos nas três amostras estudadas.
Os genes selecionados para validação (CTGF, LRAT, MAP1B, ALDH1A3 e SETD7) estão envolvidos em cascatas relacionadas com doenças inflamatórias e oculares, assim como, com função e desenvolvimento do sistema nervoso e do órgão sensorial (Tabela 3).
Pelas análises do RaSH, dois genes (CTGF e LRAT) deveriam mostram expressão reduzida e três genes (MAP1B, ALDH1A3 e SETD7) expressão aumentada nas células ARPE-19 submetidas ao tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26. No entanto, no primeiro experimento de PCR quantitativo, com a concentração testada (5 µg/mL) igual a do experimetno de RaSH, apenas o gene CTGF apresentou redução significante da expressão nessas células após tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26, em relação as células estimuladas pelo LPS (Figura 7). Os demais genes apresentaram oscilação na expressão gênica, porém não significantes estatisticamente. Para a expressão desses genes ser considerada significante os valores
devem ser ≥ a 1 ou ≤ a -1, na base de log 2.
3.7 Ensaios Multiplex para análise de citocinas
O padrão de expressão das citocinas evidenciou que, após a indução por endotoxina nas células, ocorre aumento significante dos mediadores, IL-6, IL-8, IL-1β, Rantes, MCP-1, TNF-α e INF-γ e ainda ocorrreu um pequeno aumento, porém não significante dos mediadores
IL-10, VEGF e EGF. O tratamento com ANXA1Ac2-26 na concentração de 5 µg/mL por 72 horas, não alterou o padrão inflamatório do processo de endotoxemia (Figura 9), mantendo, assim, a expressão das moléculas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. No entanto, o tratamento com ANXA1Ac2-26, na concentração de 100 µg/mL, diminuiu significativamente a expressão dos mediadores pró-inflamatórias, IL-6, IL-8, IL-1β, Rantes, MCP-1, TNF-α, mostrando a eficiência
da ação anti-inflamatória da ANXA1 quando em uma concentração elevada. A expressão dos mediadores anti-inflamatórios INF-γ e VEGF também tiveram uma redução significante,
A inflamação é o principal fator contribuinte para o comprometimento funcional do epitélio pigmentado da retina (EPR) (LEUNG; BARNSTABLE; TOMBRAN-TINKA, 2009), levando ao surgimento de inúmeras doenças oftalmológicas, uma vez que esse epitélio desempenha várias funções metabólicas e de apoio na retina sensorial (STEINBERG, 1985; STRAUSS, 2005; HAMILTON E LEACH, 2011). Os tratamentos com ANXA1 possuem como finalidade manter as propriedades anti-inflamatórias e evitar os efeitos colaterais dos glicocorticoides (PERRETTI; GAVINS, 2003). A identificação do mecanismo de ação da ANXA1, paralelamente com o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos baseados em mimetizar vias endógenas especificas, tem aumentado o desenvolvimento de programas de descoberta de fármacos (GAVINS; HICKEY, 2012).
Embora exista uma ampla literatura sobre os efeitos farmacológicos da ANXA1 e dos seus peptídeos miméticos nos processos inflamatórios in vitro (D'ACQUISTO; PERRETTI; FLOWER, 2008) e in vivo (GASTARDELO et al., 2009; FACIO et al., 2011), poucos estudos têm monitorado suas ações nas inflamações oculares. Dessa maneira, para verificar a ação anti-inflamatória da ANXA1 nas células EPR, testamos, após indução do processo de endotoxemia, o tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26 nessas células.
No presente trabalho, analisando as células cultivadas da linhagem celular ARPE-19, observamos que a morfologia, após tratamento com o ANXA1Ac2-26, não foi modificada, no entanto a proliferação celular diminuiu após indução pelo LPS e tratamento com o ANXA1Ac2-26, e a migração celular aumentou após tratamento com o ANXA1Ac2-26. O teste de migração celular também foi realizado por Kang e colaboradores (2012), em diferentes linhagens celulares de câncer de mama humano, e foi visto que cada tipo celular expressa a ANXA1 em diferentes concentrações, promovendo a migração celular. Esses pesquisadores, ainda relataram que após a administração do micro RNA de interferência da ANXA1 ocorre diminuição da migração e proliferação celular, sugerindo assim que a presença da proteína modula a invasividade celular.
Investigação realizada no nosso laboratório, também com a linhagem celular ARPE-19 (MIMURA, 2012), mostrou que a ANXA1 está envolvida na fisiologia do EPR nas condições normais e após o estímulo inflamatório com LPS e tratamento, possuindo ação anti-inflamatória nessas células. Outros trabalhos mostraram que a expressão da ANXA1, bem como as atividades anti-inflamatórias e protetoras dessa proteína e dos seus peptídeos miméticos, têm
sido exploradas (GAVINS et al., 2007; D’ACQUISTO, 2009) em vários modelos experimentais,
(OUYANG et al., 2012), efeito protetor após lesão do nervo cavernoso (FACIO JUNIOR; BURNETT, 2012), entre outros.
Além dos estudos celulares, analisamos nos sobrenadantes dos cultivos os mediadores pró e anti-inflamatórios por análises multiplex. A liberação dos mediadores pró-inflamatórios IL-6, IL-8, IL-1β, Rantes, MCP-1 e TNF-α e anti-inflamatórios IL-10, EGF, VEGF e INF-γ, foi
avaliada nas células ARPE-19 após ativação pelo LPS, com e sem tratamento nas diferentes concentrações do ANXA1Ac2-26 (5 µg/mL e 100 µg/mL). O estímulo pela endotoxina nessas células induziu a liberação dos mediadores envolvidos na resposta inflamatória, como TNF-α,
IL-10, IL-8, IL-6 e MCP-1, mostrando aumento significante em relação ao controle, e mantendo altos níveis após 72 horas. Várias investigações indicam que, na inflamação ocular, as citocinas pró-inflamatórias são produzidas principalmente pelas células inflamatórias, endoteliais e, pelo epitélio pigmentado da retina (OOI et al., 2006; VAN LAAR; VAN HAGEN, 2006; ZENKEL et al., 2010). Outros estudos também mostram a liberação de alguns mediadores inflamatórios, como a IL-6 e IL-8, em células EPR ativadas pelo LPS (PAIMELA et al., 2007; LEUNG; BARNSTABLE; TOMBRAN-TINKA, 2009; MIMURA, 2012). Pacientes com doenças do segmento anterior do olho também apresentaram alta expressão de IL-6 e IL-8 em fluido lacrimal (FODOR et al., 2006). Há evidências de que essas citocinas podem induzir a degenaração celular e tecidual, pois, camundongos nocautes para IL-6 apresentam maior sobrevida de células ganglionares da retina em relação aos selvagens após lesão do nervo óptico (FISHER et al., 2001).
O efeito anti-inflamatório do ANXA1Ac2-26 ocorreu somente na concentração de 100 µg/ml, diminuindo significantemente a liberação das citocinas pró-inflamatórias estudadas no período de 72 horas. Anteriormente, já foi demonstrado que a ANXA1 está relacionada com a modificação da expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias em estudos do nosso grupo (DAMAZO et al., 2011; GIROL, 2012, MIMURA, 2012) e, também, de Yang e colaboradores (2006) usando linhagens celulares de fibroblasto de pulmão (com e sem o gene da ANXA1), observaram que essa proteína regula negativamente a expressão da citocina IL-6, via efeitos na cascata p38mapk. A sinalização da IL-6 leva ao aumento da produção de citocinas inflamatórias, quimiocinas, proteases e fatores de crescimento (IL-6, IL-1β, IL-23, CCL5, CXCL8, MCP-1, MMP9, MMP2, VEGF e HIF) (AGGARWAL; GEHLOT, 2009; SANSONE; BROMBERG, 2011). Os nossos dados mostram que o ANXA1Ac2-26 reduz a liberação de mediadores inflamatórios pelas células epiteliais, consequentemente impedindo o desenvolvimento inflamatório.
