PCR Quantitativa – RT-qPCR

Previamente ao PCR em tempo real, validamos a integridade dos RNAs (Figura 6A) e cDNAs (Figura 6B) obtidos nas três amostras estudadas.

Os genes selecionados para validação (CTGF, LRAT, MAP1B, ALDH1A3 e SETD7) estão envolvidos em cascatas relacionadas com doenças inflamatórias e oculares, assim como, com função e desenvolvimento do sistema nervoso e do órgão sensorial (Tabela 3).

Pelas análises do RaSH, dois genes (CTGF e LRAT) deveriam mostram expressão reduzida e três genes (MAP1B, ALDH1A3 e SETD7) expressão aumentada nas células ARPE- 19 submetidas ao tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26. No entanto, no primeiro experimento

de PCR quantitativo, com a concentração testada (5 µg/mL) igual a do experimetno de RaSH, apenas o gene CTGF apresentou redução significante da expressão nessas células após tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26, em relação as células estimuladas pelo LPS (Figura 7).

Os demais genes apresentaram oscilação na expressão gênica, porém não significantes estatisticamente. Para a expressão desses genes ser considerada significante os valores

devem ser ≥ a 1 ou ≤ a -1, na base de log 2.

No segundo experimento, a concentração utilizada (100 µg/mL) de ANXA1Ac2-26 foi maior

em relação ao primeiro experimento pois outros trabalhos na literatura demonstraram que essa concentração indicou um efeito anti-inflamatório mais preciso (Mimura, 2012). Nesse segundo experimento, os genes CTGF e LRAT apresentaram uma redução sigificante da expressão nas células ARPE-19 após tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26, em relação as células

estimuladas pelo LPS (Figura 8). Os demais genes (MAP1B, ALDH1A3 e SETD7) apresentaram também uma drástica redução na expressão gênica, porém era esperado que estes genes estivessem com a expressão elevada nas células ARPE-19 após tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26, em relação as células estimuladas pelo LPS.

3.7 Ensaios Multiplex para análise de citocinas

O padrão de expressão das citocinas evidenciou que, após a indução por endotoxina nas células, ocorre aumento significante dos mediadores, IL-6, IL-8, IL-1β, Rantes, MCP-1, TNF-α e INF-γ e ainda ocorrreu um pequeno aumento, porém não significante dos mediadores

IL-10, VEGF e EGF. O tratamento com ANXA1Ac2-26 na concentração de 5 µg/mL por 72 horas,

não alterou o padrão inflamatório do processo de endotoxemia (Figura 9), mantendo, assim, a expressão das moléculas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. No entanto, o tratamento com ANXA1Ac2-26, na concentração de 100 µg/mL, diminuiu significativamente a expressão dos

mediadores pró-inflamatórias, IL-6, IL-8, IL-1β, Rantes, MCP-1, TNF-α, mostrando a eficiência

da ação anti-inflamatória da ANXA1 quando em uma concentração elevada. A expressão dos mediadores anti-inflamatórios INF-γ e VEGF também tiveram uma redução significante,

enquanto, IL-10 e EGF não se alteraram significantemente após o tratamento com ANXA1Ac2-26,

A inflamação é o principal fator contribuinte para o comprometimento funcional do epitélio pigmentado da retina (EPR) (LEUNG; BARNSTABLE; TOMBRAN-TINKA, 2009), levando ao surgimento de inúmeras doenças oftalmológicas, uma vez que esse epitélio desempenha várias funções metabólicas e de apoio na retina sensorial (STEINBERG, 1985; STRAUSS, 2005; HAMILTON E LEACH, 2011). Os tratamentos com ANXA1 possuem como finalidade manter as propriedades anti-inflamatórias e evitar os efeitos colaterais dos glicocorticoides (PERRETTI; GAVINS, 2003). A identificação do mecanismo de ação da ANXA1, paralelamente com o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos baseados em mimetizar vias endógenas especificas, tem aumentado o desenvolvimento de programas de descoberta de fármacos (GAVINS; HICKEY, 2012).

Embora exista uma ampla literatura sobre os efeitos farmacológicos da ANXA1 e dos seus peptídeos miméticos nos processos inflamatórios in vitro (D'ACQUISTO; PERRETTI; FLOWER, 2008) e in vivo (GASTARDELO et al., 2009; FACIO et al., 2011), poucos estudos têm monitorado suas ações nas inflamações oculares. Dessa maneira, para verificar a ação anti- inflamatória da ANXA1 nas células EPR, testamos, após indução do processo de endotoxemia, o tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26 nessas células.

No presente trabalho, analisando as células cultivadas da linhagem celular ARPE-19, observamos que a morfologia, após tratamento com o ANXA1Ac2-26, não foi modificada, no

entanto a proliferação celular diminuiu após indução pelo LPS e tratamento com o ANXA1Ac2-26,

e a migração celular aumentou após tratamento com o ANXA1Ac2-26. O teste de migração celular

também foi realizado por Kang e colaboradores (2012), em diferentes linhagens celulares de câncer de mama humano, e foi visto que cada tipo celular expressa a ANXA1 em diferentes concentrações, promovendo a migração celular. Esses pesquisadores, ainda relataram que após a administração do micro RNA de interferência da ANXA1 ocorre diminuição da migração e proliferação celular, sugerindo assim que a presença da proteína modula a invasividade celular.

Investigação realizada no nosso laboratório, também com a linhagem celular ARPE-19 (MIMURA, 2012), mostrou que a ANXA1 está envolvida na fisiologia do EPR nas condições normais e após o estímulo inflamatório com LPS e tratamento, possuindo ação anti-inflamatória nessas células. Outros trabalhos mostraram que a expressão da ANXA1, bem como as atividades anti-inflamatórias e protetoras dessa proteína e dos seus peptídeos miméticos, têm

sido exploradas (GAVINS et al., 2007; D’ACQUISTO, 2009) em vários modelos experimentais,

como inflamações pulmonares (DA CUNHA; OLIANI; DAMAZO, 2012), regulação da atividade da COX-2 em células da macula densa renal (SEIDEL et al., 2012), tratamento de colite

(OUYANG et al., 2012), efeito protetor após lesão do nervo cavernoso (FACIO JUNIOR; BURNETT, 2012), entre outros.

Além dos estudos celulares, analisamos nos sobrenadantes dos cultivos os mediadores pró e anti-inflamatórios por análises multiplex. A liberação dos mediadores pró-inflamatórios IL- 6, IL-8, IL-1β, Rantes, MCP-1 e TNF-α e anti-inflamatórios IL-10, EGF, VEGF e INF-γ, foi

avaliada nas células ARPE-19 após ativação pelo LPS, com e sem tratamento nas diferentes concentrações do ANXA1Ac2-26 (5 µg/mL e 100 µg/mL). O estímulo pela endotoxina nessas

células induziu a liberação dos mediadores envolvidos na resposta inflamatória, como TNF-α,

IL-10, IL-8, IL-6 e MCP-1, mostrando aumento significante em relação ao controle, e mantendo altos níveis após 72 horas. Várias investigações indicam que, na inflamação ocular, as citocinas pró-inflamatórias são produzidas principalmente pelas células inflamatórias, endoteliais e, pelo epitélio pigmentado da retina (OOI et al., 2006; VAN LAAR; VAN HAGEN, 2006; ZENKEL et al., 2010). Outros estudos também mostram a liberação de alguns mediadores inflamatórios, como a IL-6 e IL-8, em células EPR ativadas pelo LPS (PAIMELA et al., 2007; LEUNG; BARNSTABLE; TOMBRAN-TINKA, 2009; MIMURA, 2012). Pacientes com doenças do segmento anterior do olho também apresentaram alta expressão de IL-6 e IL-8 em fluido lacrimal (FODOR et al., 2006). Há evidências de que essas citocinas podem induzir a degenaração celular e tecidual, pois, camundongos nocautes para IL-6 apresentam maior sobrevida de células ganglionares da retina em relação aos selvagens após lesão do nervo óptico (FISHER et al., 2001).

O efeito anti-inflamatório do ANXA1Ac2-26 ocorreu somente na concentração de 100

µg/ml, diminuindo significantemente a liberação das citocinas pró-inflamatórias estudadas no período de 72 horas. Anteriormente, já foi demonstrado que a ANXA1 está relacionada com a modificação da expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias em estudos do nosso grupo (DAMAZO et al., 2011; GIROL, 2012, MIMURA, 2012) e, também, de Yang e colaboradores (2006) usando linhagens celulares de fibroblasto de pulmão (com e sem o gene da ANXA1), observaram que essa proteína regula negativamente a expressão da citocina IL-6, via efeitos na cascata p38mapk. A sinalização da IL-6 leva ao aumento da produção de citocinas inflamatórias, quimiocinas, proteases e fatores de crescimento (IL-6, IL-1β, IL-23, CCL5, CXCL8, MCP-1, MMP9, MMP2, VEGF e HIF) (AGGARWAL; GEHLOT, 2009; SANSONE; BROMBERG, 2011). Os nossos dados mostram que o ANXA1Ac2-26 reduz a liberação de mediadores inflamatórios

pelas células epiteliais, consequentemente impedindo o desenvolvimento inflamatório.

Em função da importância no entendimento do efeito do ANXA1Ac2-26 na expressão

diferencialmente expressos, incluindo novos genes e transcritos raros. Além disso, apresenta vantagem em relação às demais técnicas de hibridização subtrativa, pois simplifica os passos de hibridação e subtração. Ainda, é eficiente na diminuição dos falso-positivos, podendo ser realizada de forma menos onerosa (JIANG et al., 2000). As subtrações foram realizadas em amostras de células EPR após indução por endotoxina versus a mesma condição, tratadas com ANXA1Ac2-26. Os resultados obtidos mostraram, pela primeira vez na literatura, que nas células

EPR a expressão gênica é alterada após o tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26.

A técnica RaSH, que permitiu usar as duas bibliotecas: SubA (tester= ARPE-19 induzida por endotoxina X driver= ARPE-19 induzida por endotoxina e tratadas com a proteína ANXA1Ac2-26) e SubB (tester= ARPE-19 induzida por endotoxina e tratadas com a proteína

ANXA1Ac2-26 X driver= ARPE-19 induzida por endotoxina), gerou 80 genes diferencialmente

expressos nas duas subtrações. Na modificação da expressão gênica, tumores de ratos knockout para ANXA1 mostram expressão alterada de vários genes, em relação aos ratos selvagens (YI, 2012). Esse fato revela que a ANXA1 pode ter um efeito regulador no estoma tumoral e sugere que essa proteína pode afetar o desenvolvimento tumoral e formar metástases por meio de interações com vários componentes no microambiente tumoral.

Os genes escolhidos para validação por PCR em tempo real foram LRAT, CTGF, MAP1B, ALDH1A3 e SETD7, por terem funções importantes relacionadas, respectivamente, com doenças oculares, síndrome da fibrose retiniana, funções e desenvolvimento do sistema nervoso, funções e desenvolvimento do sistema visual e doenças inflamatórias. Entre esses cinco genes, obtidos pela técnica utilizada, dois deles (CTGF e LRAT da biblioteca “Sub A”) deveriam mostrar expressão reduzida nas células ARPE-19 submetidas ao tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26, e três genes (MAP1B, ALDH1A3 e SETD7 da biblioteca “Sub B”)

expressão aumentada. Porém, todos os cinco genes apresentaram redução significante da expressão nas células ARPE-19 tratadas com ANXA1Ac2-26, na concentração de 100ug/mL,

comparadas com as células estimuladas somente com LPS.

Quando realizamos o PCR quantitativo com as células ARPE-19 tratadas com ANXA1Ac2-26 na concentração de 5ug/mL, ou seja na mesma concentração realizada a

metodologia de RaSH, apenas um dos genes confirmou a validação (CTGF). Isso provavelmente ocorre porque os efeitos miméticos do peptídeo nessas células são mais efetivos na resposta gênica em concentrações mais elevadas (100ug/ml). Nos experimentos realizados com RaSH observarmos que os genes CTGF e LRAT seriam considerados bons marcadores moleculares de processos inflamatórios oculares, enquanto os genes MAP1B, ALDH1A3 e SETD7 ainda exigem novos ensaios.

A seleção dos genes validados contribui de forma significativa para o entendimento dos processos inflamatórios oculares, pois na literatura os níveis de expressão do gene CTGF estão relacionados com os diferentes graus da síndrome da fibrose retiniana (CHEN et al., 2012) e, ainda, com a expressão elevada na Doença Macular relacionada com a idade, pois induz a produção de proteínas da matriz pelas vias de sinalização ERK (p42/p44mapk) e p38mapk (NAGAI et al., 2009). Chintala e colaboradores (2012) estudaram a retinopatia induzida por oxigênio em ratos neonatais, e injetaram vetores virais recombinantes do gene CTGF. Esses pesquisadores observaram que o desenvolvimento da vascularização da retina foi concomitante com o aumento, progressivo e dependente do tempo, nos níveis de CTGF, e a supressão da expressão ou atividade do CTGF atrasou a expansão do plexo capilar da retina. O CTGF possui efeito direto no desenvolvimento e remodelação dos vasos da retina, sendo importante no reparo e adaptabilidade vascular após lesões. Além da relação com o metabolismo ocular, esse gene possui função na diferenciação e proliferação dos condrócitos, adesão celular e está relacionado com o fator de crescimento derivado de plaquetas.

No gene LRAT estudado, ressaltamos a importância relacionada por codificar uma proteína que catalisa a estratificação do All-trans-Retinol para All-trans-Retinil Ester, uma reação essencial para o ciclo dos retinoides no sistema visual. Essa proteína é expressa em diversos tecidos em adultos e fetos, incluindo o EPR (RUIZ; BOK, 1999). Mutações nesse gene estão relacionadas com o inicio adiantado de severas distrofias na retina (TREVINO et al., 2005; TANG et al., 2012). Estudos recentes de Borman e colaboradores (2012) mostraram que mutações no gene LRAT causam atrofia progressiva de retina. Eles avaliaram, pela tecnologia de microarray,149 pacientes com Amaurose Congênita de Leber ou distrofia precoce de retina (caracterizada pela perda da visão desde o nascimento) Nesse estudo identificaram um paciente com a mutação homozigota nesse gene e outros três pacientes com novas mutações no exon 2, sugerindo que alterações no gene LRAT podem mostrar uma boa resposta à novas terapias.

O gene MAP1B, que codifica a proteína associada com o microtúbulo 1B e está envolvido na montagem de microtúbulos, é essencial na neurogênese, pois a retina sensorial possui células nervosas, que formam a camada interna da retina e transmitem o sinal elétrico para o nervo óptico (POZO-RODRÍGUEZ et al., 2012). Esse gene foi encontrado superexpresso na região da macula em comparação com as regiões periféricas da retina em pacientes idosos, sugerindo que pode estar relacionado com a Doença Macular relacionada com a idade (KOCIOK; JOUSSEN, 2007). Pangratz-Fuehrer e colaboradores (2005) estudando ratos deficientes em MAP1B observaram um fenótipo comportamental distinto e funções da retina

alterada, fornecendo para esse gene também uma importante função na neurotransmissão sináptica.

O quarto gene estudado, ALDH1A3, codifica a isoenzima aldeído desidrogenase, que utiliza o retinal na forma livre ou conjugada com retinol, como substrato. Essa substância deve ser constante e eficientemente regenerada para que a retina permaneça sensível à luz e mantenha a visão (VON LINTING et al., 2010). A revisão de literatura de Palczewski (2012) mostra que o retinal, juntamente com os pigmentos visuais opsina e rodopsina, são essenciais para o ciclo do ácido retinóico. Ainda, durante o período gestacional, a deficiência de vitamina A afeta principalmente o olho, causando malformações, demonstrando que a vitamina A é importante no desenvolvimento do olho Estudos com ratos Raldh3-/- mostraram que os embriões exibem defeitos nasais e no olho, apresentando falha na formação do cálice óptico (DUESTER, 2009). Esse gene também possui importante função na desintoxicação de aldeídos gerados pelo metabolismo do álcool e peroxidação de lipídeos.

O último dos genes escolhidos, SETD7, contém o Dominio SET (lisina metiltransferase) 7, possui como principal função a modulação da atividade gênica pela metilação de histonas e alteração da estrutura da cromatina (PRADHAN et al., 2009). A ação do SETD7 em doenças inflamatórias foi relacionada com os genes dependentes do Fator Nuclear κ-B (NFκ-B) e sua cascata, mostrando que SETD7 regula a expressão de genes inflamatórios por meio de sua interação com o NFκ-B e modulação da remodelação da cromatina em seus promotores (LI et al., 2008).

Os genes estudados mostraram expressão diferencial nas células EPR de uma maneira dependente do tratamento com ANXA1Ac2-26. Kociok e colaboradores (2002) analisaram a

expressão gênica em cultura de células EPR, essas células foram tratadas com humor vítreo e desenvolveram retinopatia proliferativa. Nesse experimento, observaram diminuição da expressão de nove dos dez genes analisados, esses estão relacionados com transcrição, mediação de sinais de tradução, inflamação, glicosilação e interação proteina-proteina. Esse fato se deve, provavelmente, porque na transdiferenciação das células EPR há uma complexa rede de ação gênica envolvida, onde essas células passam de um estado quiescente para proliferativo levando ao desenvolvimento da doença.

Em resumo, o presente trabalho evidencia a importância da técnica de RaSH como um método eficiente e rápido para identificar genes modulados pela ANXA1 em células de origem epitelial. Outros experimentos serão necessários para determinar se os demais genes obtidos na subtração e regulados pela ANXA1 estão casualmente relacionados ou associados com mudanças induzidas pelo tratamento com essa proteína. Pelas funções dos genes encontrados

podemos observar que são importantes nas cascatas dos processos inflamatórios, podendo ter sua expressão modificada pela possível interação no metabolismo das células epiteliais oculares. O olho possui características que o torna um órgão alvo para terapia gênica, por ser imuno privilegiado, ter tamanho pequeno, e ser facilmente visualizado e examinado. Os fotorreceptores e o EPR são os principais alvos para terapia gênica no tratamento de doenças da retina, devido seu importante papel no ciclo visual (LIPINSKI; THAKE; MACLAREN, 2013).

Finalmente, o peptídeo ANXA1Ac2-26 altera a proliferação, migração e expressão gênica e

proteica na linhagem celular ARPE-19 e, essas alterações provavelmente estão relacionadas com os processos inflamatórios, devido a indução realizada por endotoxina. Assim, sugerimos que ANXA1Ac2-26 tem ação moduladora no metabolismo dessas células. Poucas investigações

têm avaliado o efeito do ANXA1Ac2-26 na expressão nesses genes que foram selecionados em

nosso trabalho e, futuros estudos moleculares serão necessários para mostrar os mecanismos de ação dessa proteína anti-inflamatória.

As analises in vitro mostraram que o ANXA1Ac2-26 pode ter um importante papel nas

cascatas gênicas e um papel regulatório na inflamação ocular. Dessa maneira, os nossos dados apontam a importância das células ARPE-19 como um alvo potencial de atividades gênicas envolvendo a ação da ANXA1, tendo em vista as aplicações dessa proteína como uma possível alternativa terapêutica nas doenças inflamatórias oculares.

Os resultados obtidos com as células ARPE-19, nas condições experimentais propostas, permitem concluir:

x o peptídeo ANXA1Ac2-26 não modifica a morfologia celular, no entanto pode ter um

potencial efetivo na proliferação e na migração celular, em decorrência de sua atuação diminuindo e aumentando, respectivamente esses processos, quando comparados as células controle.

x a expressão de citocinas pró-inflamatórias é reduzida após o tratamento com ANXA1Ac2-26, porém a ação anti-inflamatória ocorre apenas em concentrações elevadas.

x a hibridização subtrativa rápida resulta em 80 genes diferencialmente expressos, comparando indução por LPS e tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26 e, o RT-qPCR validou

os genes CTGF e LRAT como possíveis marcadores para doenças oculares.

x as vias de sinalização celular, das quais a ANXA1 participa, formam uma rede de interação com outros genes associados com doenças imunológicas, doenças inflamatórias, ciclo celular e desenvolvimento celular.

Essas conclusões associadas mostram que a ANXA1 está envolvida nas cascatas de sinalização de processos inflamatórios, alterando a proliferação, a migração e as expressões gênica e proteica nas células. Desse modo, os nossos resultados apontam as células EPR como um alvo potencial da atividade gênica da proteína, tendo em vista sua possível utilização em terapias inovadoras no tratamento de inflamações oculares.

Figura 1. Análise morfológica da linhagem celular ARPE-19. A morfologia celular observada

no grupo controle (A), caracterizada por uma monocamada de células cuboides dispostas em forma hexagonal, não foi alterada nos grupos ativadas pelo LPS [10 µg/mL] (B) e ativadas pelo LPS e tratadas com ANXA1Ac2-26 [5 µg/mL] (C). As células ARPE-19 foram semeadas com meio

completo DMEM:F-12 na concentração de 5x104 por poço (placa de 6 poços). Os ensaios foram realizados em triplicatas para confirmar os resultados. Barra: 100 µm.

Figura 2. Efeitos dos tratamentos com o peptídeo ANXA1Ac2-26 na proliferação das células

ARPE-19. O crescimento das células foi progressivo entre os períodos estudados, e não

apresentou diferenças entre os grupos experimentais. As células ARPE-19 foram semeadas com meio completo DMEM:F-12 na concentração de 5x104 por poço (placa de 6 poços) e, após induzidas por LPS [10 µg/mL] e tratadas com ANXA1Ac2-26 [5 µg/mL]. Os ensaios foram

realizados em triplicatas para confirmar os resultados. Gráfico com x= tempo (h) e y= número de células x 104. Valores P < 0,05 foram significantes.

Figura 3. Ensaio de migração com linhagem celular ARPE-19. A migração celular diminuiu

após indução por LPS e aumentou após administração do peptídeo ANXA1Ac2-26. As células

foram semeadas com meio completo DMEM:F-12 na concentração de 5x104 por poço (placa de 6 poços), e realizada indução de endotoxemia [10 µg/mL] e tratamento com ANXA1Ac2-26 [5

µg/mL]. Os ensaios foram realizados em triplicatas para confirmar os resultados. Gráfico com x= tempo (hs) e y= área de migração (mm2). Valores P < 0,05 foram significantes; * LPS vs Controle; + LPS+ ANXA1Ac2-26 vs LPS.

Figura 4. Relação dos genes obtidos na subtração das células induzidas pelo LPS (Sub A). O software Ingenuity Systems revela uma rede de interações gênicas relacionados com

Figura 5. Relação dos genes obtidos na subtração das células tratadas com ANXA1Ac2-26

(Sub B). O software Ingenuity Systems revela uma rede de interações gênicas relacionados

Figura 6. Validação da integridade do mRNA e cDNA. A integridade do mRNA (A) foi

avaliada pela observação das bandas ribossomais 18S e 28S corridas em gel de agarose 1%. Integidade do cDNA (B) observada pela reação de PCR do gene constitutivo GAPDH em gel de agarose 1%. As células ARPE-19 foram semeadas com meio completo DMEM:F-12 na concentração de 1x106 por garrafa de 75 cm2, e realizada indução por LPS [10 µg/mL] e tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26 [5 µg/mL].

Figura 7. Expressão gênica por PCR em tempo real. Redução da expressão do gene CTGF

nas células tratadas com o peptídeo ANXA1Ac2-26 comparadas com as células estimuladas pelo

LPS. As células ARPE-19 foram semeadas com meio completo DMEM:F-12 na concentração de 5x104 por poço (placa de 6 poços), e realizada indução por LPS [10 µg/mL] e tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26 [5 µg/mL]. Os ensaios foram realizados em triplicatas para