LEONARDO FRANCISCO DE SOUZA
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE NEMATICIDA DE DERIVADOS DO TIMOL E DA PIPERAZINA
Tese apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agroquímica, para obtenção do título de “Magister Scientiae”
VIÇOSA
LEONARDO FRANCISCO DE SOUZA
SÍNTESE E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE NEMATICIDA DE DERIVADOS DO TIMOL E DA PIPERAZINA
Tese apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agroquímica, para obtenção do título de “Magister Scientiae”
APROVADA:14 de julho de 1999.
________________________________ ____________________________ Profª Maria Amelia dos Santos Profª Célia Regina Alvares Maltha (Conselheira) (Conselheira)
________________________________ ____________________________ Profª Rosângela D’arc de Lima Barbosa Prof. Elson Santiago de alvarenga
______________________________ Prof. Antônio Jacinto Demuner
ii
À memória de
iii
AGRADECIMENTO
A Deus, por tudo.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão da bolsa de estudo.
Ao Professor Antônio Jacinto Demuner, que, com paciência, competência, humanidade e confiança, orientou meus trabalhos e estudos nas boas horas e nas adversidades.
À Professora Maria Amelia dos Santos (Universidade Federal de Uberlândia), que orientou e colaborou na realização dos ensaios biológicos.
À Professora Célia Regina A. Maltha, cuja revisão deste trabalho foi preciosa.
Aos estudantes de Iniciação Científica Leandro Coelho Dalvi e Luis Silvino, amigos cuja colaboração foi fundamental para a realização deste trabalho.
Ao técnico do Laboratório de Análise e Síntese de Agroquímicos (LASA), Sr. Antônio, que, com muita paciência, dedicação e amizade, ensinou-me a trabalhar corretaensinou-mente.
iv
Aos colegas da Comissão Nacional de Energia Nuclear - Distrito de Goiânia, em especial o gerente Dr. Paulo Ney, que muito ajudou na realização deste trabalho.
À Neusa Clara Teixeira, que sempre esteve ao meu lado e confiou em mim.
A toda a minha família, em especial minha mãe Leila, que sempre me deu forças durante esta jornada.
Aos amigos da Renovação Carismática Católica de Viçosa, que incessantemente intercederam por mim e por este trabalho, com muitas orações.
A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.
v
BIOGRAFIA
LEONARDO FRANCISCO DE SOUZA, filho de Agnaldo Luiz de Souza e Leila Maria Leão Cotta de Souza, nasceu em Sete Lagoas, no interior de Minas Gerais, em 28 de março de 1974.
Em 1989, ingressou na Escola Técnica de Sete Lagoas, onde, em 1992, recebeu o título de Técnico em Química. No ano seguinte ingressou na Universidade Federal de Viçosa (UFV), onde, em fevereiro de 1997, recebeu o título de Bacharel em Química.
vi
CONTEÚDO
Página
LISTA DE QUADROS... ix
LISTA DE FIGURAS... xi
LISTA DE ABREVIATURAS... xiv
EXTRATO... xvi
ABSTRACT... xviii
INTRODUÇÃO... 1
CAPÍTULO 1 - SÍNTESE DE DERIVADOS DO TIMOL E DA PIPERAZINA... 4
1. INTRODUÇÃO... 4
1.1. Nematóides: aspectos gerais e sua importância econômica... 5
1.2. O controle químico dos fitonematóides... 8
1.3. Outras formas de controle de nematóides... 9
1.4. O timol... 10
1.5. A piperazina... 14
2. MATERIAL E MÉTODOS... 17
vii
Página 2.2. Reação de formação do composto
2-benziloxi-1-isopropil-4-metil-benzeno [8]... 18
2.3. Reação de formação do composto 2-etoxi-1-isopropil-4-metil-benzeno[9]... 19
2.4. Reação de formação do composto 1-isopropil-4-metil-2-octiloxi-benzeno [10]... 21
2.5. Reação de formação do 1-isopropil-4-metil-2-octadeciloxibenzeno [11]... 22
2.6. Reação de formação do 2-(2’,3’,4’,5’,6’-pentafluorobenziloxi)-1-isopropil-4-metilbenzeno [12]... 24
2.7. Reação de formação do 1-isopropil-4-metil-2-metoxibenzeno [13]. 25 2.8. Tentativas de formação do composto 2-isopropil-5-metil-4- nitro-fenol [14]... 27
2.9. Tentativas de formação do 2-isopropil-5-metil-1-metoxi-4-nitro-benzeno [16]... 30
2.10. Reação de formação dos sais de piperazina: cloreto [17], citrato [18], fosfato [19], oxalato [20] e sulfato [21]... 32
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 33
3.1. Síntese de compostos derivados do timol... 33
3.2. Síntese de sais derivados da piperazina... 35
3.3. Preparo do 2-benziloxi-1-isopropil-4-metilbenzeno [8]... 35
3.4. Preparo do 1-isopropil-2-etoxi-4-metilbenzeno [9]... 41
3.5. Preparo do 1-isopropil-4-metil-2-octiloxibenzeno [10]... 45
3.6. Preparo dos compostos 1-isopropil-4-metil-2-octadeciloxibenzeno [11], 2-(2’,3’,4’,5’,6’-pentafluorobenziloxi)-1-isopropil-4-metil-benzeno [12] e 1-isopropil-4-metil-2-metoxi2-(2’,3’,4’,5’,6’-pentafluorobenziloxi)-1-isopropil-4-metil-benzeno [13]... 48
3.7. Tentativa de formação do composto 2-isopropil-5-metil-4-nitro-fenol [14]... 52
viii
Página
4. RESUMO E CONCLUSÕES... 58
CAPÍTULO 2 - AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE NEMATICIDA DOS DERIVADOS DO TIMOL... 59
1. INTRODUÇÃO... 59
2. MATERIAL E MÉTODOS... 62
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 66
4. RESUMO E CONCLUSÕES... 73
CAPÍTULO 3 - AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE NEMATICIDA DOS SAIS DE PIPERAZINA... 74
1. INTRODUÇÃO... 74
2. MATERIAL E MÉTODOS... 76
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 79
4. RESUMO E CONCLUSÕES... 86
RESUMO E CONCLUSÕES... 87
ix
LISTA DE QUADROS
Página CAPÍTULO 1
1 Perda de produção causada anualmente no mundo por nematóides fitoparasitas em diferentes culturas de expressão econômica (adaptado de SASSER e FREECKMAN, 1987)... 7 2 Dados de RMN de 13C dos éteres [11], [12] e [13]... 51 3 Dados de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) do composto [15]... 54
CAPÍTULO 2
1 Porcentagem de mortalidade de juvenis de segundo estádio de Meloidogyne incognita tratados com derivados do timol (5 µg mL-1).. 69 2 Porcentagem de mortalidade de juvenis de segundo estádio de
Meloidogyne incognita tratados com derivados do timol (50 µg mL-1) 69
3 Porcentagem de mortalidade de juvenis de Heterodera glycines tratados com derivados do timol (5 µg mL-1)... 70
x
Página CAPÍTULO 3
1 Porcentagem de mortalidade de juvenis de segundo estádio de Meloidogyne incognita tratados com sais de piperazina (5 µg mL-1)... 82
2 Porcentagem de mortalidade de juvenis de segundo estádio de Meloidogyne incognita tratados com sais de piperazina (50 µg mL-1).. 82 3 Porcentagem de mortalidade de juvenis de Heterodera glycines
tratados com sais de piperazina (5 µg mL-1)... 83
xi
LISTA DE FIGURAS
Página 1 Propostas de sínteses para os derivados do timol... 2 2 Propostas de síntese de sais de piperazina... 3
CAPÍTULO 1
1 Rota metabólica do timol no organismo de ratos... 15 2 Etapas para a formação dos éteres derivados do timol... 34 3 Síntese do 2-benziloxi-1-isopropil-4-metilbenzeno [8] a partir do
timol... 35 4 Espectro no IV (NaCl) do composto
2-benziloxi-1-isopropil-4-metilbenzeno [8]... 38 5 Espectro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) do composto
2-benziloxi-1-isopropil-4-metilbenzeno [8]... 39 6 Espectro de RMN de 13C (50 MHz, CDCl3) do composto
2-benziloxi-1-isopropil-4-metilbenzeno [8]... 40 7 Espectro de RMN de 13C (DEPT 135, 50 MHz, CDCl3) do
composto 2-benziloxi-1-isopropil-4-metilbenzeno [8]... 40 8 Síntese do 1-isopropil-2-etoxi-4-metilbenzeno [9] a partir do
xii
Página 9 Espectro no IV (NaCl) do composto
1-isopropil-2-etoxi-4-metilbenzeno [9]... 42 10 Espectro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) do
1-isopropil-2-etoxi-4-metilbenzeno [9]... 43 11 Parte do espectro de RMN de 1H (δ de 6,6 a 7,2; 200 MHz, CDCl
3
do composto 1-isopropil-2-etoxi-4-metilbenzeno [9]... 44 12 Síntese do 1-isopropil-4-metil-2-octiloxibenzeno [10] a partir do
timol... 45 13 Parte do espectro de RMN de 13C (δ de 14 a 32; DEPT 135,
50 MHz, CDCl3) do composto
1-isopropil-4-metil-2-octiloxibenzeno [10]... 47 14 Competição entre as reações de eliminação e substituição... 49 15 Procedimento utilizado nas tentativas de obtenção do composto
2-isopropil-5-metil-4-nitrofenol [14]... 52 16 Espectro de RMN de 13C (50 MHz, CDCl3) da timoquinona [15]... 55
17 Espectro de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) da timoquinona [15]... 56
CAPÍTULO 2
1 Estrutura dos compostos avaliados nesta etapa do trabalho... 65 2 Porcentagem de mortalidade de juvenis de segundo estádio de
Meloidogyne incognita tratados com derivados do timol (5 e 50 µg mL-1)... 71
3 Porcentagem de mortalidade de juvenis de Heterodera glycines tratados com derivados do timol (5 e 50 µg mL-1)... 72
CAPÍTULO 3
1 Estruturas dos compostos avaliados nesta etapa do trabalho... 78 2 Porcentagem de mortalidade de juvenis de segundo estádio de
xiii
Página 3 Porcentagem de mortalidade de juvenis de Heterodera glycines
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS
δ deslocamento químico
CCD cromatografia em camada delgada CD3OD metanol deuterado
CDCl3 deuteroclorofórmio
d dupleto
DCM diclorometano
DEPT Distortionless Enhanced Polarization Transfer
Hz Hertz
IV infravermelho
J constante de acoplamento escalar (em Hertz)
m multipleto
MHz megahertz
NCS nematóide do cisto da soja Rf fator de retenção
RMN de 13C ressonância magnética nuclear de carbono-13 RMN de 1H ressonância magnética nuclear de hidrogênio
s simpleto
t tripleto
xvi EXTRATO
SOUZA, Leonardo Francisco de, M.S., Universidade Federal de Viçosa, março de 2000. Síntese e avaliação da atividade nematicida de derivados do timol e da piperazina. Orientador: Antônio Jacinto Demuner. Conselheiros: Maria Amelia dos Santos e Célia Regina Álvares Maltha.
xvii
Heterodera glycines, utilizando-se doses de 5 e 50 µg mL-1 dos compostos
sintetizados. Nestes bioensaios, os índices de mortalidade para o Meloidogyne incognita variaram de 1,8 a 81,8% na concentração de 5 µg mL-1 e de 5,3 a 86,7% na concentração de 50 µg mL-1. Para Heterodera glycines estes índices variaram de 0 a 83% na concentração de 5 µg mL-1 e de 0 a 88% na concentração
de 50 µg mL-1. Estes resultados permitiram observar a influência dos diferentes
xviii
ABSTRACT
SOUZA, Leonardo Francisco de, M.S., Universidade Federal de Viçosa, March, 2000. Synthesis and evaluation of nematicidal activity of the derivatives of thimol and piperazine. Adviser: Antônio Jacinto Demuner. Committee members: Maria Amélia dos Santos and Célia Regina Álvares Maltha.
xix
1
INTRODUÇÃO
As perdas de produção causadas por nematóides fitoparasitas nas principais culturas agrárias são estimadas em cerca de 12% da produção ou em torno de 78 bilhões de dólares por ano, em todo o globo (SASANELLI, 1995). Estas perdas podem ser muito maiores do que esta estimativa, uma vez que os sintomas de ataque destes fitoparasitas não são específicos, podendo confundir-se com os de outras doenças, de tal maneira que o agricultor detecta anomalias e irregularidades nas culturas apenas quando o nível de infestação por nematóides já é bastante alto e de difícil controle (BAKER et al., 1994).
Para combater estes patógenos, faz-se necessário pesquisar e desenvolver novas formas de controle destes, bem como aperfeiçoar aquelas já existentes.
Uma das formas de controle de nematóides é o controle químico, ou seja, o uso de produtos químicos com atividade nematicida.
Com o intuito de obter compostos nematicidas mais eficazes e, concomitantemente, reduzir o impacto ambiental provocado pela introdução no meio ambiente de produtos tóxicos à fauna e à flora, este trabalho teve como objetivo a síntese de compostos derivados do timol e da piperazina.
2
(BENJILALI et al., 1986; MERCK INDEX, 1996), possibilitando a obtenção de derivados com alta especificidade e eficácia no controle de fitonematóides.
Apesar de a literatura reportar o uso do timol em diversas áreas, inclusive contra fitonematóides (SOLER et al., 1996), não há registros do seu uso e de seus derivados contra fitonematóides dos gêneros Meloidogyne incognita e Heterodera glycines. Este trabalho, portanto, teve como um de seus objetivos a síntese de derivados do timol, conforme o seguinte esquema (Figura 1).
OH O:
OH O2N
OR .. .. -base
RX NaNO3/H2SO4
R = metil etil octil octadecil benzil
2,3,4,5,6-pentafluorobenzil
Figura 1 - Propostas de sínteses para os derivados do timol.
A formação desses derivados buscava avaliar a influência da extensão e do tipo de grupo inserido, obtendo, assim, parâmetros de comparação para a avaliação da influência do grupo hidroxila no timol.
3
disso, seu custo é relativamente baixo (BHATT et al., 1990), tornando-a também potencialmente útil no controle de fitonematóides.
Assim, este trabalho também teve como objetivo a síntese de sais derivados da piperazina pela reação entre a piperazina e os ácidos, conforme o esquema a seguir (Figura 2).
N N H
H
N N H
H H
H + +
HX X
X
-X = citrato, cloreto, fosfato, oxalato e sulfato.
Figura 2 - Propostas de síntese de sais de piperazina.
As sínteses buscavam avaliar a influência do ânion ligado à piperazina sobre sua atividade contra os fitonematóides, permitindo dessa forma a obtenção de dados sobre o modo de ação desses compostos no organismo destes fitonematóides.
4
CAPÍTULO 1
SÍNTESE DE DERIVADOS DO TIMOL E DA PIPERAZINA
1. INTRODUÇÃO
Milhares de toneladas de alimentos são consumidas a cada dia pela população mundial, estimada atualmente em mais de 5 bilhões de habitantes. Considerando que a maioria desses alimentos são vegetais cultivados pelo homem, foi surgindo ao longo do tempo uma intensa necessidade de se melhorar cada vez mais o rendimento das colheitas, visando atender ao consumo mundial. Além disso, a produção de alimentos é uma fonte de divisas para muitos países de economia essencialmente agrícola, além daqueles em que os produtos agrícolas são a base de exportação, como é o caso do Brasil, cuja economia ficaria seriamente abalada se não fosse essa atividade.
5
imediatos e eficientes, sendo estes os maiores agentes de proteção de plantas contra insetos, plantas daninhas e patógenos de plantas (DUKE et al., 1992).
1.1. Nematóides: aspectos gerais e sua importância econômica
Um dos principais patógenos de plantas responsáveis por grandes perdas econômicas são os nematóides. Estes microrganismos, habitantes do solo e da água, que somam mais de 20.000 espécies conhecidas espalhadas por todo o planeta, são de dimensões reduzidas, mas podem deixar um rastro de prejuízo certamente descomunal, se medidas de controle não forem empregadas a tempo (MARTINS e CASTRO, 1997).
Medindo de 50 a 250 µm de largura por 500 a 4.000 µm de comprimento, milhões destes organismos podem viver em um metro quadrado de solo, porém somente cerca de 3% deles têm sido estudados e descritos (BAKER et al., 1994). Os fitonematóides dos gêneros Meloidogyne e Heterodera atacam quase todas as culturas, sendo considerados os grupos mais importantes devido à sua ampla distribuição, polifagia, diferenciação biológica ligada ao parasitismo entre populações de mesma espécie e alta capacidade de multiplicação durante a estação de crescimento da planta. A maioria deles ataca as raízes das plantas hospedeiras, interferindo na absorção de água e nutrientes do solo. Este ataque acentua-se a cada ano, até chegar a um ponto no qual as raízes ficam totalmente comprometidas. Como conseqüência, aparecem nas plantas infestadas sintomas como amarelecimento de folha, redução de tamanho e murcha.
As perdas de produção causadas por nematóides fitoparasitas são estimadas em torno de 12% (SASANELLI, 1995), ou cerca de 78 bilhões de dólares por ano (BAKER et al., 1994). Entretanto, as perdas são provavelmente muito maiores do que o estimado, uma vez que os sintomas na planta de danos causados por fitonematóides não são específicos, podendo ser confundidos com os de outras doenças, resultando em perdas não-notificadas.
6
desenvolvimento, a reprodução e a sobrevivência dos nematóides por vários anos (LUC et al., 1990).
O Quadro 1 mostra os prejuízos provocados anualmente pelo ataque de fitonematóides a diversos tipos de culturas em toda a extensão do globo terrestre.
Um exemplo substancial dos prejuízos causados por estes parasitas são as perdas causadas pelo nematóide do cisto da soja (NCS), Heterodera glycines Ichinohe, um dos mais importantes parasitas que atacam a soja. A infecção causa necrose da raiz, reduz a nodulação e provoca a supressão do crescimento de brotos, acompanhadas por severa clorose. De 1989 a 1991, as perdas de colheita devido ao NCS foram estimadas em aproximadamente 320 milhões de dólares por ano nos EUA (DOUONIK, 1993).
Na China estima-se que mais de 70% das plantações de soja estejam infectadas por este patógeno (LIU et al., 1996).
7
Quadro 1 - Perda de produção causada anualmente no mundo por nematóides fitoparasitas em diferentes culturas de expressão econômica (adaptado de SASSER e FREECKMAN, 1987)
Cultura Agrária Perda de produção (%)
Algodão 10,7
Arroz 10,0
Banana 19,7
Batata 12,2
Cacau 10,5
Café 15,0
Cana-de-açúcar 15,3
Fumo 14,7
Melancia 16,9
Melão 13,8
Milho 11,8
Soja 10,6
Sorgo 3,9
8 1.2. O controle químico dos fitonematóides
Muitas formas de controle de nematóides foram desenvolvidas, dentre elas a rotação de culturas, o controle biológico, o melhoramento genético das plantas, visando a criação de espécies vegetais resistentes aos nematóides, e o controle químico (BAKER et al., 1994).
O controle químico, ou seja, o uso de nematicidas, é utilizado desde 1943 como um meio eficiente e econômico no controle dos fitonematóides no campo. Os agricultores utilizam nematicidas principalmente porque através deles conseguem reduzir de forma rápida o prejuízo econômico causado pelos fitonematóides. Logo, a primeira vantagem do controle químico sobre os outros métodos é reduzir, a curto prazo, a densidade dos nematóides em níveis tão baixos que não produzam danos econômicos, ao mesmo tempo que permite ao agricultor plantar imediatamente após a aplicação do nematicida (FRANCO, 1992).
Muitos pesticidas utilizados para o controle de insetos e nematóides são organofosforados ou carbamatos, que inibem a acetilcolinesterase (Corbett et al., 1984, citados por NOEL e MAYASICH, 1991). A acetilcolinesterase e as estearases não-específicas, que atacam as ligações carboxilester, possuem sítios ativos similares e são inibidas da mesma maneira por estes pesticidas (Kirsch, 1971, citado por NOEL e MAYASICH, 1991).
9 CH3NHC O N CHC(CH3)2
SCH3
O
CH3NHC O
O
O
CH3 CH3
(1) (2)
(CH3)2CHNH P
O
CH3
SCH3 O
CH3CH2O
(3)
1.3. Outras formas de controle de nematóides
A pesquisa sobre métodos alternativos de controle de doenças e pragas tem aumentado nos últimos anos, em virtude da preocupação da sociedade quanto aos efeitos dos pesticidas sobre a saúde do homem e o ambiente. Existe também a preocupação quanto ao surgimento de novas raças, em conseqüência da seleção de organismos resistentes aos pesticidas (Jatala, 1986, citado por CASTRO, 1998). Em decorrência disso, diversas formas alternativas de controle de fitonematóides têm surgido, como controle físico, práticas culturais, controle biológico, desenvolvimento de cultivares resistentes e uso de produtos naturais.
Diversos fatores físicos, como o calor, a inundação, a solarização, entre outros, podem exercer algum controle sobre fitonematóides, apresentando a vantagem de não deixar resíduos tóxicos no solo. No entanto, a aplicação desses métodos é dispendiosa, sendo necessária a avaliação do retorno econômico da cultura a ser conduzida no local (MAAS, 1987).
10
sido as principais práticas culturais para reduzir a infestação por fitonematóides (STIRLING, 1991; WAQUIN, 1997).
Os fungos nematófagos têm merecido especial atenção, pois o solo contém milhares de espécies de parasitas, predadores, competidores e antagonistas de nematóides, tornando a manipulação de inimigos naturais de nematóides um método de controle biológico bastante promissor (BAKER et al., 1994). CASTRO (1998) avaliou a predação de M. javanica, M. incognita, M. arenaria, P. brachyurus e R. similis pelo fungo Arthrobotrys musiformis, espécie bastante distribuída em solos brasileiros (SANTOS et al., 1991). A porcentagem de juvenis de segundo estádio de M. javanica predados foi significativamente maior que as das demais espécies avaliadas, e fatores como temperaturas de crescimento e idades das culturas do fungo influenciaram a predação. Este estudo mostrou que a compreensão dos fatores que regulam a competição entre organismos é essencial para aumentar a efetividade da introdução desses antagonistas no controle biológico.
Os constituintes de plantas também podem ter vários efeitos sobre nematóides, alterando seu comportamento, desenvolvimento e outros processos controlados por enzimas (BAKER et al., 1994). BARCELOS (1997) demonstrou a inibição da eclosão de ovos de M. incognita raça 3 por extratos a quente e a frio da raiz e das partes aéreas de mucuna preta (Mucuna aterrima) e por outros compostos isolados desta planta. Entretanto, a pesquisa de produtos naturais com atividades nematicidas e, ou, nematostáticas é um campo que ainda precisa ser bem desenvolvido.
1.4. O timol
Também chamado de 4-isopropil-3-hidroxi-1-metilbenzeno, o timol apresenta-se sob a forma de cristais brancos (Tf = 51,5 °C; Te = 233 °C), de odor
11
OH
[4]
Foi isolado pela primeira vez por Neumann em 1719. Em 1846, Arppe o obteve a partir dos óleos essenciais de Thymus vulgaris L. e Monarda spicata L, família Labiatae (MERCK INDEX, 1996). Também ocorre em outros óleos essenciais de plantas como Thymus capitatus (KANDIL et al., 1994); Thymus serpylloides subesp. serpylloides (família Labiatae), conhecida como “timo da serra” (ARREBOLA et al., 1994); Origanum vulgare subesp. hirtum (Link) Ietswaart; Coridothymus capitatus (L.) Reichenb e Satureja thymbra, conhecidas popularmente como “orégano” (MULLER-RIEBAU et al., 1997; KOKKINI et al., 1997); Satureja hortensis L.; e Petroselinum sativum L. (família Umbelliferae) (REGNAULT-ROGER et al., 1993).
O timol é um monoterpenóide biossintetizado em plantas através de uma rota diferente do ácido mevalônico, ao contrário do que é esperado para a maioria dos monoterpenos derivados de plantas. Estes últimos são formados por condensação do isopentenil pirofosfato (IPP) com o dimetilalilpirofosfato (DMAPP), fornecendo o geranil pirofosfato, que, através da ação de monoterpeno ciclases, forma vários esqueletos tipo-C10 (Gershenzon e Croteau,
1991, citados por EINSENREICH et al., 1997).
12
A atividade biológica dos óleos essenciais de plantas que contêm timol muitas vezes é atribuída exclusivamente à sua presença ou ao sinergismo com outros constituintes desses óleos.
Os óleos essenciais são metabólitos secundários de plantas, constituídos principalmente de compostos terpenóides (KARPOUHTSIS et al., 1998), com ampla gama de aplicações farmacológicas e industriais. Os óleos essenciais do timo (Thymus vulgaris L.) possuem propriedades antioxidantes especificamente ligadas aos metabólitos fenólicos timol e carvacrol (Aeshbach et al., 1994, citados por SHETTY et al., 1996), sendo utilizados como flavorizantes e conservantes em alimentos (FENAROLI, 1975). Esses óleos também mostraram possuir propriedades bactericidas e antifúngicas (Deans et al., 1993, citados por REDDY et al., 1998).
A análise dos óleos essenciais de T. vulgaris L. que cresciam no norte da Itália apresentou 44 compostos, dentre os quais o timol foi o mais efetivo contra amplo espectro de micróbios (REDDY et al., 1998). KANDIL et al. (1994) mostraram que óleos essenciais do Thymus capitatus são efetivos agentes antimicrobianos, podendo ser usados em baixas concentrações com o mínimo de efeitos colaterais, no tratamento de infecções bacterianas nos sistemas respiratório, urinário e gastrointestinal e na pele, além de possuir atividade anticandidíase associada à presença do timol (BENJILALI et al., 1986)
Em estudos prévios, HITOKO et al. (1980) mostraram que o timol inibe o crescimento de Aspergillus versicolor, Aspergillus ochraceus e Aspergillus flavus. BUCHANAN e SHEPHERD (1981) constataram que concentrações maiores que 500 µg mL-1 inibem completamente o crescimento de
Aspergillus parasiticus, que produz aflatoxina, substância extremamente tóxica ao homem.
13
capsici. Esses compostos têm grande efeito inibitório em concentração acima de 100 µg mL-1 sobre todos os fungos examinados em ágar-batata-dextrose.
O efeito do sinergismo entre os componentes do óleo essencial de Thymus vulgaris na redução da porcentagem de contaminação em grãos de milho por Aspergillus flavus foi mostrado por MONTES-BELMONT e CARVAJAL (1998): em grãos tratados com o óleo essencial, a porcentagem de redução de contaminação foi de 100%, ao passo que em grãos tratados com o timol puro (solução a 2% em hexano) este percentual caiu para 52,3%. Com dosagens maiores, a proteção pode ser melhorada.
A atividade inseticida do timol foi testada por ELLIS e BAXENDALE (1997) em ácaros parasitas Acarapis woodi (Rennie), que vivem na traquéia de abelhas Apis mellifera, bem como em suas hospedeiras. O estudo mostrou que o timol, quando fumigado sobre ácaros adultos, larvas e seus ovos, controla significativamente a população de adultos (85,4% de mortalidade) e larvas (64,7% de mortalidade), mas também é tóxico para abelhas, sendo necessário controle da temperatura durante a fumigação do composto sobre estas.
KARPOUHTSIS et al. (1998) avaliaram as atividades inseticida e genotóxica do timol e carvacrol em moscas Drosophila melanogaster através da exposição de suas larvas a várias quantidades de timol e carvacrol. As larvas expostas estavam em tubos de ensaio contendo meio de cultura levedo-glicose. A porcentagem de moscas que emergia dos tubos após a exposição foi calculada, encontrando-se os valores de dose letal (DL50) iguais a 1,6 µL para o carvacrol e
2,6 µL para o timol. Este último mostrou ser um potente mutagênico, mas não um indutor recombinagênico.
14
reduzidas. Em amostras deixadas por 20 e 40 dias depois do tratamento, populações de bactérias foram maiores.
Muito pouco é conhecido sobre o metabolismo do timol em animais. Os primeiros estudos foram feitos por WILLIANS (1959), que notou que ele era excretado na urina de coelhos, cães e do homem sob a forma de conjugados de glucoronídeos e sulfatos e que pequenas quantidades do composto oxidavam, originando o timoquinol. ROBBINS (1934) notificou que cerca de um terço de uma dose de 1 g é excretada sem qualquer alteração na urina de cães, utilizando técnicas de cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas.
AUSTGULEN et al. (1987) realizaram estudos do metabolismo em ratos através da análise de amostras de urina em intervalos de 24 horas, propondo a rota metabólica ilustrada na Figura 1.
Pode-se observar que a metabolização do timol no organismo de ratos forneceu diversos produtos de oxidação ocorrida tanto no anel aromático como nos grupamentos alifáticos, havendo monoidroxilações, diidroxilações e formação de derivados monocarboxilados.
1.5. A piperazina
N N
H H
[5]
15
animais domésticos. Outras aplicações farmacêuticas envolvem o uso de seus derivados, como analgésicos, anti-hipertensivos, sedativos, contra doenças hemorrágicas, antiespasmódicos, anticonvulsivos, anestésicos, antiestamínicos, antimaláricos e, ainda, contra doenças neoplásicas (BHATT et al., 1990).
OH
OH HO
CH2OH
OH
CH2OH
OH
COOH
OH CH2OH
CH2OH
OH COOH
OH
Figura 1 - Rota metabólica do timol no organismo de ratos.
16
Embora o uso da piperazina e de seus derivados como anti-helmíntico em animais e no homem seja amplamente conhecido, existem poucos estudos sobre a atividade de alguns de seus derivados contra fitonematóides. LONGUE (1998) reportou que a 1-metilpiperazina [6], quando testada in vitro sobre o fitonematóide Meloidogyne incognita, provocou índice de 73% de mortalidade. A 1,4-dibenzoilpiperazina [7] causou 58% de mortalidade quando testada sobre o fitonematóide Heterodera glycines. Ambos os compostos foram testados a uma concentração de 20 µg mL-1 (LONGUE, 1998).
N N
CH3
H
N N O
O
17
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Generalidades metodológicas
Todas as reações foram realizadas com reagentes de grau P.A. O éter dietílico e o hexano foram purificados através de destilação. O THF foi seco sob refluxo por adição de sódio metálico, tendo a benzofenona como indicador. Após a secagem, o THF foi destilado e armazenado em frasco âmbar contendo peneira molecular e sob atmosfera inerte.
As análises em cromatografia em camada delgada foram realizadas com placas preparadas com sílica-gel Kieselgel 60 F254, com indicador de
fluorescência. A espessura da camada de sílica nas placas utilizadas foi de 0,25 mm. Todas as placas foram inicialmente visualizadas em luz ultravioleta (λ = 254 nm), sendo posteriormente reveladas com solução de ácido fosfomolíbdico em etanol, preparada de acordo com CASEY et al. (1990).
Os espectros no infravermelho foram obtidos nos espectrômetros MATSON INSTRUMENTS FTIR, no Departamento de Química da Universidade Federal de Minas Gerais, e PERKIN ELMER SPECTRUM 1000, no Departamento de Química da Universidade Federal de Viçosa.
18
no Departamento de Química da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Os solventes utilizados foram o CDCl3 e o D2O, sendo o tetrametilsilano utilizado
como padrão de referência (δ = 0).
2.2. Reação de formação do composto 2-benziloxi-1-isopropil-4-metilbenzeno [8] O 3 5 6 1 2 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 4 4" 1" 2" 2"
[8]
A uma solução de timol (600 mg; 4 mmol) em THF (15 mL), sob agitação magnética e em balão bitubulado (50 mL), foi adicionado hidreto de sódio (210 mg; 7 mmol), juntamente com imidazol (19,5 mg; 0,26 mmol). A mistura foi deixada sob refluxo a 70 °C, durante três horas. Após este tempo foi adicionado brometo de benzila (1.368 mg; 8 mmol) dissolvido em THF (10 mL).
A reação foi deixada sob refluxo por mais uma hora e, após este período, o aquecimento foi retirado, deixando-se a reação ocorrer por mais 12 horas. O THF foi então eliminado em evaporador rotatório. Ao concentrado foi adicionada água (30 mL). A mistura foi submetida à extração com éter dietílico (4 x 30 mL). A fase orgânica foi lavada com solução saturada de cloreto de sódio, seca com sulfato de magnésio e concentrada em evaporador rotatório, obtendo-se aproximadamente 1,2 g de material bruto.
19 CCD: Rf = 0,25 (hexano), UV (+).
IV (filme em placas de NaCl, ν/cm-1): 3.032, 2.960, 2.924, 2.868, 1.613, 1.597, 1.505, 1.346, 1.288, 945, 842 e 810.
RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) δ: 1,22 (d, 6H, J1”, 2” = 6,9 Hz, H2”); 2,31 (s, 3H,
CH3-); 3,41 (m, 1H, J1”, 2” = 6,9 Hz, H1”); 5,06 (s, 2H, -CH2-); 6,77 (d, 2H, J5,6=
7,6 Hz, H5 e H3); 7,13 (d, 1H, J6,5 = 7,6 Hz, H6); 7,23-7,48 (m, 5H, H3’, H4’, H5’
H6’ e H7’).
RMN de 13C (50 MHz, CDCl
3) δ: 21,3 (CH3); 22,8(-CH(CH3)2); 26,6
(CH(CH3)); 69,9 (C1’); 112,7 (C3); 121,5 (C5); 126,0 (C6);127,1 (C3’e C7’); 127,7
(C5’); 128,5 (C4’ e C6’);134,4 (C1); 136,3 (C5); 137,7 (C2’); 155,8 (C2).
2.3. Reação de formação do composto 2-etoxi-1-isopropil-4-metilbenzeno [9]
2' 1' O
2" 2" 1
" 4 2 1 6 5 3 4" [9]
20
à mistura reacional. A reação foi deixada à temperatura ambiente durante 12 horas. Decorrido esse tempo, a reação foi elaborada, eliminando-se o excesso de THF em evaporador rotatório, seguindo-se a adição lenta de água (20 mL) e extração com éter dietílico (4 x 20 mL). A fase orgânica foi lavada com solução saturada de NaCl, separada com funil de decantação, seca com MgSO4, filtrada e
concentrada em evaporador rotatório.
O material concentrado foi submetido ao fracionamento em coluna de sílica-gel, utilizando-se hexano como eluente, o que resultou na obtenção do éter [9], que é um líquido incolor (36 mg, 0,20 mmol; 18,8%).
CCD: Rf = 0,6 (hexano/éter dietílico, 300:1), UV (+).
IV (filme em placas de NaCl, ν/cm-1): 3.030, 2.960, 2.900, 2.860, 1.650, 1.600, 1.555 1.505, 1.325 1.280, 1.090 e 880.
RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) δ: 1,20 (d, 6H, J2”, 1” = 6,9 Hz, H2”); 1,41 (t, 3H,
J2’, 1’ = 7,0 Hz, H2’); 2,31 (s, 3H, H4” ); 3,29 (m, 1H, J1”, 2” = 6,9 Hz, H1”); 4,05 (q,
2H, J = 7,0, H1’); 6,65 (s, 1H, H3); 6,72 (d, 1H , J5,6= 7,8 Hz, H5); 7,08 (d, 1H, J6,5
= 7,8 Hz, H6).
RMN de 13C (50 MHz, CDCl3) δ: 15,0 (CH3CH2-O-); 21,3 (CH3-); 22,8
(-CH(CH3)2); 26,6 (-CH(CH3) ); 63,5 (CH3CH2-); 112,5 (C3); 121,0 (C5); 125,9
21
2.4. Reação de formação do composto 1-isopropil-4-metil-2-octiloxi-benzeno [10] 8' 7' 6' 5' 4' 3' 2' 1' O 2" 2" 1
" 2 1 6 5 3 4 4" [10]
A um balão bitubulado (50 mL) conectado a um condensador de refluxo sob atmosfera de nitrogênio e agitação magnética foram adicionados hidreto de sódio (120 mg; 4 mmol; 80% em óleo mineral) e imidazol (9,8 mg; 0,13 mmol). Com auxílio de seringa, foi adicionada a esta mistura uma solução de timol (300 mg; 2 mmol) em THF (10 mL). Observou-se imediata efervescência da mistura reacional, que foi mantida sob refluxo a 70 °C em banho de óleo por 3,5 horas.
Após este tempo foi adicionado 1-bromooctano (482,3 mg; 2,5 mmol) diluído em THF (15 mL). Manteve-se a reação sob refluxo por mais 7,5 horas. A seguir, adicionou-se lentamente água (1 mL) à mistura reacional, tomando-se o cuidado de não provocar projeção da mistura devido à reação violenta entre o excesso de hidreto de sódio e a água. Eliminado o excesso de hidreto, a mistura reacional foi concentrada em evaporador rotatório, para retirada do THF.
Ao material concentrado foram adicionados 20 mL de água, e a fase orgânica foi extraída com éter dietílico (4 x 20 mL). A fase orgânica foi lavada com solução saturada de NaCl, separada com funil de decantação, seca com MgSO4, filtrada e concentrada em evaporador rotatório.
22 CCD: Rf = 0,61 (hexano), UV (+).
IV (filme em placas de NaCl, ν/cm-1): 3.010, 2.950, 2.890, 1.600, 1.560, 1.500, 1.460, 1.275, 1.250, 1.160 e 825.
RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) δ: 0,89 (t, 3H, H8’);1,15 (d, 6H, J2”, 1” = 6,9 Hz,
H2”); 1,29 - 1,54 (m, 10H, H3’ a H7’);1,79 (m, 2H, J2’,1’ = 6,6 Hz, H2’); 2,31 (s,
3H, H4”); 3,19 (m, 1H, J1”,2” = 6,9 Hz, H1”); 3,94 (t, 2H, J1’,2’ = 6,6 Hz, H1’) 6,65
(s, 1H, H3); 6,72 (d, 1H , J5,6 = 7,7 Hz, H5); 7,08 (d, 1H, J6,5 = 7,7 Hz, H6).
RMN de 13C (50 MHz, CDCl
3) δ: 15,0 (CH3, C8’); 21,3 (CH3-); 22,7
(CH(CH3)2); 26,2 (-CH(CH3)2 ); 26,6(C7’, -CH2-); 29,3 - 31,8 (-CH2-, C3’,C4’, C5’
e C6’,); 67,8 (-CH2-, C1’); 112,5 (C3); 120,8 (C5); 125,8 (C6);134,2 (C1); 136,2
(C4); 156,1 (C2).
2.5. Reação de formação do 1-isopropil-4-metil-2-octadeciloxibenzeno [11]
OCH2CH2[CH2]14CH2CH3
2" 2" 1
" 2 1 6 5 3 4 4"
1' 2' 17' 18'
[11]
23
A mistura reacional foi concentrada em evaporador rotatório, seguindo-se adição de 20 mL de água. A faseguindo-se orgânica foi extraída com éter dietílico (4 x 20 mL), lavada com solução saturada de NaCl, seca com MgSO4, filtrada e
concentrada em evaporador rotatório.
O material concentrado foi submetido ao fracionamento em coluna de sílica-gel, utilizando-se hexano como eluente, resultando na obtenção de 142,6 mg de um óleo incolor, caracterizado como o éter 1-isopropil-4-metil-2-octadeciloxibenzeno [11] (0,36 mmol; 33,0%).
CCD: Rf = 0,56 (hexano), UV (+).
IV (filme em placas de NaCl, ν/cm-1): 3.030, 2.990, 2.910, 2.875, 1.650, 1.575, 1.530, 1.475, 1.275, 1.200, 875 e 830.
RMN de 1H (200 MHz, CDCl
3) δ: 0,88 (t, 3H, J18’,17’ = 6,5 Hz, H18’); 1,20 (d,
6H, J2”, 1” = 6,9 Hz, H2”); 1,26 - 1,55 (m, 15H, CH2[CH2]15CH2CH3); 1,79 (m,
2H, J17’,18’ = 6,5 Hz, H17’); 2,31 (s, 3H, H4”); 3,28 (m, 1H, J1”,2” = 6,9 Hz, H1”);
3,93 (t, 2H, H1’); 6,65 (s, 1H, H3); 6,71 (d, 1H , J5,6 = 7,8 Hz, H5); 7,08 (d, 1H,
J6,5 = 7,8 Hz, H6).
RMN de 13C (50 MHz, CDCl3) δ: 14,1 (CH3, C18’); 21,3 (CH3-); 22,7
(-CH(CH3)2); 22,7 - 32,0 (-CH2[CH2]16CH3,); 67,8 ( -CH2[CH2]15CH2CH3); 112,2
24
2.6. Reação de formação do 2-(2’,3’,4’,5’,6’-pentafluorobenziloxi)-1-isopropil-4-metilbenzeno [12] O F F F F F 3 2 1 6 5 4 4" 1" 2" 2"
1'
[12]
A um balão bitubulado (50 mL) conectado a um condensador de refluxo sob atmosfera de nitrogênio e agitação magnética foram adicionados hidreto de sódio (120 mg; 4 mmol) e imidazol (9,8 mg; 0,13 mmol). Com auxílio de seringa, foi adicionada a esta mistura uma solução de timol (300 mg; 2 mmol) em THF (10 mL). Esta mistura foi mantida sob refluxo a 70 °C em banho de óleo por 3,5 horas. Após este tempo, foi adicionado brometo de 2,3,4,5,6-pentafluorobenzila (521,98 mg; 2 mmol) diluído em THF (15 mL). Manteve-se a reação sob refluxo por mais duas horas. A seguir, adicionou-se lentamente água (1 mL) à mistura reacional, para eliminar o excesso de NaH.
A mistura reacional foi então concentrada em evaporador rotatório, adicionando-se em seguida 20 mL de água e extraindo-se a fase orgânica com éter dietílico (4 x 20 mL), que foi lavada com solução saturada de NaCl, seca com MgSO4, filtrada e concentrada em evaporador rotatório.
O material concentrado foi submetido ao fracionamento em coluna de sílica-gel, utilizando-se hexano como eluente, o que resultou na obtenção de 113,6 mg de um óleo incolor, caracterizado como o éter 2-(2’,3’,4’,5’,6’-pentafluorobenziloxi)-1-isopropil-4-metilbenzeno [12] (0,34 mmol; 32,0%).
25
IV (filme em placas de NaCl, ν/cm-1): 3.050, 2.990, 2.950, 2.890, 2.100-1.850, 1.660, 1.630, 1.580, 1.540, 1.530, 1.420, 1.380, 1.250, 1.175, 1.140, 1.060, 1.040, 990, 950, 825 e 800.
RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) δ: 1,14 (d, 6H, J2”,1” = 6,9 Hz, H2”); 2,39 (s, 3H,
H4”); 3,19 (m, 1H, J1”,2” = 6,9 Hz, H1”); 5,10 (s, H1’); 6,80 (s, 1H, H3); 6,83 (d,
1H, J5,6 = 7,7 Hz, H5); 7,12 (d, 1H, J6,5 = 7,7 Hz, H6).
RMN de 13C (50 MHz, CDCl3) δ: 21,3 (CH3-); 22,8 (-CH(CH3)2-); 26,6
(-CH(CH3)); 56,7 (-CH2-); 112,9 (C3); 122,5 (C5); 126,3 (C6);134,8 (C1); 136,5
(C4); 156,1 (C2).
2.7. Reação de formação do 1-isopropil-4-metil-2-metoxibenzeno [13]
OCH3
3 2 1 6 5
4 4"
1" 2" 2"
1'
[13]
Em um balão de fundo redondo bitubulado (100 mL), conectado a um condensador de refluxo, foram adicionados hidreto de sódio (1,2 mg; 40 mmol) e imidazol (97,5 mg; 1,3 mmol). O sistema foi mantido sob atmosfera de nitrogênio e agitação magnética. Em seguida, por meio de seringa, foi acrescentada uma solução de timol (3,0 g; 20 mmol) em THF anidro (30 mL). Houve imediata efervescência da solução, que foi colocada em banho de óleo sob refluxo a 70 °C por 3,5 horas.
26
foi deixada à temperatura ambiente durante 12 horas. Após este tempo, a reação foi elaborada, eliminando-se o excesso de THF em evaporador rotatório, seguindo-se da adição lenta de água (20 mL) e extração com éter dietílico (4 x 30 mL). A fase orgânica foi lavada com solução saturada de NaCl, separada com funil de decantação, seca com MgSO4, filtrada e concentrada em evaporador
rotatório.
O material concentrado foi submetido ao fracionamento em coluna de sílica-gel, utilizando-se hexano como eluente, o que resultou na obtenção de 2,4883 g de um líquido incolor, caracterizado como o éter 1-isopropil-4-metil-2-metoxibenzeno [13] (15,15 mmol; 75,8%).
CCD: Rf = 0,49 (hexano), UV (+).
IV (filme em placas de NaCl, ν/cm-1): 2.970, 2.950, 2.910, 1.640, 1.605, 1.500, 1.460, 1.400, 1.300, 1.260, 1.150, 1.050, 950, 850 e 810.
RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) δ: 1,19 (d, 6H, J2”,1” = 6,8 Hz, H2”); 2,32 (s, 3H,
H4”); 3,27 (m, 1H, J1”,2” = 6,8 Hz, H1”); 3,81 (s, 3H, CH3-); 6,67 (s, 1H, H3); 6,74
(d, 1H , J5,6 = 7,8 Hz ,H5); 7,09 (d, 1H, J6,5 = 7,8 Hz, H6).
RMN de 13C (50 MHz, CDCl3) δ: 21,3 (CH3); 22,8(-CH(CH3)2); 26,4
(-CH(CH3)2 ); 55,3 (CH3-); 111,4 (C3); 121,1 (C5); 125,8 (C6);134,0 (C1); 136,3
27
2.8. Tentativas de formação do composto 2-isopropil-5-metil-4-nitrofenol [14]
a) Primeira tentativa
O2N
OH
[14]
Em um balão de fundo redondo (25 mL) foi diluído cuidadosamente, sob agitação, H2SO4 concentrado (500 mg; 5,1 mmol) em água (1 mL). Adicionou-se
a esta solução NaNO3 (301 mg; 3,54 mmol), resfriando-a até 0 °C em banho de
gelo e água. O timol sólido (300 mg; 2 mmol) foi então adicionado à mistura sob agitação e a reação foi mantida a 0 °C por duas horas.
A reação foi acompanhada por CCD, não sendo verificada a formação de produto no intervalo de tempo duas horas. O banho de gelo foi retirado e a reação deixada à temperatura ambiente por 12 horas. Após este tempo, o meio reacional assumiu coloração avermelhada. A mistura foi submetida à extração com éter dietílico (3 x 30 mL). A fase orgânica foi neutralizada com solução saturada de bicarbonato de sódio, separada com funil de decantação, seca com MgSO4 e
concentrada em evaporador rotatório.
28
b) Segunda tentativa de formação do 2-isopropil-5-metil-4-nitrofenol [14]
O timol (3 g; 20 mmol), dissolvido em quantidade de THF mínima possível (1 mL), foi adicionado a uma solução contendo H2SO4 (5 g) e NaNO3
diluídos em água (10 mL), sob constante agitação e em banho de gelo. A reação foi mantida a 0 °C durante duas horas; após este tempo, o banho de gelo foi retirado e a reação deixada sob agitação magnética por mais 12 horas à temperatura ambiente.
A reação foi então elaborada e extraída com éter dietílico (4 x 30 mL). À fase orgânica foi adicionada lentamente solução saturada de NaHCO3, separada
da fase aquosa por meio de funil de decantação, seca com MgSO4, filtrada e
concentrada em evaporador rotatório. O material concentrado foi fracionado em coluna de sílica-gel, utilizando-se uma mistura de hexano/éter (20:1) como eluente.
Foram obtidas 74 frações de aproximadamente 9 mL cada, que foram reunidas de acordo com a análise cromatográfica (CCD) e agrupadas na ordem: 1 a 9, 10 a 25, 30 a 66, 67 a 73 e restante da coluna. As frações de 30 a 66, que se apresentaram como um único ponto na placa cromatográfica, foram concentradas, pesadas (1,2 g) e novamente fracionadas em coluna, utilizando-se mistura de hexano/éter dietílico (60:1) como eluente.
Obtiveram-se 148 frações de aproximadamente 3 mL cada, e novamente não se conseguiu obter o produto puro em nenhuma das frações. As frações foram então agrupadas de 1 a 15, 16 a 80, 81 a 90 e de 95 a 148. As frações de 95 a 148 foram reunidas, e o material obtido foi concentrado em evaporador rotatório, pesado (aproximadamente 900 mg) e fracionado em placas preparativas (quatro placas de 20 x 20 cm, sílica-gel com indicador de fluorescência, 0,8 mm de espessura cada). As placas foram eluídas utilizando-se mistura de hexano/éter dietílico (5:1) como eluente.
As frações da placa de Rf igual a 0,43 foram separadas e o composto
29
material apresentou coloração avermelhada. A análise dos espectros de RMN de
1H e RMN de 13C revelou que o composto obtido era a timoquinona [15] (90 mg;
2,7%).
2' 2'
1' 5"
4 5 6
1 2 3
O O
[15]
CCD: Rf = 0,43 (hexano/éter-etílico, 5:1).
RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) δ: 1,123 (d, 6H, J2”,1” = 6,9 Hz, H2”); 2,04 (s,
3H, H5”); 3,02 (m, 1H, J1”,2” = 6,8 Hz, H1”); 6,51 (s, 1H, H3); 6,55 (s, 1H, H6).
RMN de 13C (200 MHz, CDCl3) δ: 15,3 (CH3-); 21,4(-CH(CH3)2); 26,6
(CH(CH3)2); 130,4 (C2); 133,4 (C5); 145,2 (C3);155,0 (C6); 187,5 (C=O); 188,7
(C=O).
c) Terceira tentativa de formação do 2-isopropil-5-metil-4-nitrofenol [14]
Em um balão de fundo redondo (50 mL) imerso em banho de gelo foi adicionada uma solução de timol (300 mg; 2 mmol) em THF (10 mL). A esta solução adicionou-se lentamente, e sob agitação, uma mistura dos ácidos acético e nítrico (4:1 v/v; 2 mL de AcOH; 0,5 mL de HNO3). O banho de gelo foi
retirado e o sistema foi mantido a 50 °C durante quatro horas. A reação foi acompanhada por CCD, até se constatar o desaparecimento do timol. Decorridas quatro horas, o excesso de THF foi eliminado em evaporador rotatório, sendo a mistura neutralizada com solução saturada de NaHCO3. A mistura resultante foi
Obteve-30
se um óleo avermelhado que, ao ser submetido a CCD, revelou tratar-se do mesmo composto obtido na tentativa anterior de nitração do timol.
2.9.. Tentativas de formação do 2-isopropil-5-metil-1-metoxi-4-nitrobenzeno [16]
a) Primeira tentativa
O2N
OCH3
[16]
Em um balão de fundo redondo (25 mL) foi diluído cuidadosamente, sob agitação, H2SO4 concentrado (0,5 mL) em água (1 mL). Adicionou-se a esta
solução NaNO3 (301 mg; 3,54 mmol), resfriando-a até 0 °C em banho de gelo. O
1-isopropil-4-metil-2-metoxibenzeno [13] (200 mg; 1,22 mmol) diluído em THF (1 mL) foi então adicionado a esta mistura sob agitação e a reação mantida a 0 °C por duas horas. A reação foi acompanhada por CCD, não sendo observada a formação de produto nesse intervalo de tempo. O aquecimento foi então retirado e a reação deixada por mais 72 horas à temperatura ambiente. O monitoramento da reação através de CCD mostrou que ainda havia o ponto correspondente ao material de partida, não havendo formação de produto.
b) Segunda tentativa de formação do 2-isopropil-5-metil-1-metoxi-4-nitrobenzeno [16]
31
Pasteur, gotas de H2SO4 concentrado. Observou-se reação violenta, com
liberação de vapores de cor marrom (NO2), e a mistura reacional assumiu
imediatamente coloração verde-esmeralda, que foi evoluindo para vermelho intenso após 24 horas. A reação foi então elaborada e extraída com éter dietílico (4 x 30 mL). À fase orgânica foi adicionada lentamente solução saturada de bicarbonato de sódio, que foi separada da fase aquosa por meio de funil de decantação, seca com MgSO4, filtrada e concentrada em evaporador rotatório. O
material concentrado foi fracionado em coluna de sílica-gel, utilizando-se uma mistura de hexano/éter (20:1) como eluente. Foram obtidas 200 frações de aproximadamente 3 mL cada, porém nenhuma delas forneceu quantidade significativa de produto puro para análises espectroscópicas.
c) Terceira tentativa de formação do 2-isopropil-5-metil-1-metoxi-4-nitrobenzeno [16]
A um balão de fundo redondo (50 mL) contendo o composto 1-isopropil-4-metil-2-metoxibenzeno [13] (400 mg, 2,44 mmol) diluído em THF (10 mL) foi adicionada, sob agitação a 0°C, uma mistura de (2:1v/v; 1 mL de HNO3 conc.;
0,5 mL de CH3COOH glacial). O banho de gelo foi retirado, sendo adaptado um
condensador de refluxo ao balão, para evitar possíveis projeções de material. A reação foi então deixada à temperatura ambiente por uma hora. Decorrido este tempo, com auxílio de pipeta de Pasteur, foram adicionadas, de maneira lenta e cuidadosa, gotas da mistura HNO3/CH3COOH, até que se observasse a mudança
de coloração da reação de incolor para verde-esmeralda. Ao se observar a liberação de vapores marrons, adicionaram-se gotas de solução saturada de NaHCO3 para neutralizar os ácidos presentes. A reação foi elaborada e extraída
com éter dietílico (4 x 30 mL). À fase orgânica foi adicionada solução saturada de NaCl, seguida de separação em funil de decantação, secagem com MgSO4,
32
2.10. Reação de formação dos sais de piperazina: cloreto [17], citrato [18], fosfato [19], oxalato [20] e sulfato [21]
Todos os sais derivados da piperazina foram obtidos por meio de reação desta com um ácido contendo o ânion de interesse.
Os sais de piperazina contendo os ânions cloreto, sulfato e fosfato foram sintetizados por adição de solução 1:1 dos ácidos clorídrico, sulfúrico e fosfórico, respectivamente, a um béquer contendo piperazina (430 mg; 5 mmol) dissolvida em THF (10 mL), até que a formação de precipitado terminasse. A mistura foi então filtrada, e o precipitado obtido lavado com etanol, para eliminar o excesso de ácido. O cloreto, sulfato e fosfato de piperazina obtidos foram então recristalizados em etanol e colocados em dessecador.
O citrato e o oxalato de piperazina foram obtidos por meio de adição de solução saturada dos ácidos cítrico e oxálico a um béquer contendo piperazina (430 mg; 5 mmol) dissolvida em água destilada (10 mL), até que a formação de precipitado terminasse. A mistura foi filtrada e o precipitado obtido lavado com etanol. Os sais citrato e oxalato de piperazina obtidos foram então recristalizados em etanol e transferidos para dessecador.
33
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As sínteses desenvolvidas neste trabalho buscavam a produção de éteres derivados do timol contendo cadeias alquílicas e aromáticas, com o objetivo de avaliar a influência da extensão e do tipo de grupo inserido, obtendo-se, assim, parâmetros de comparação para a avaliação da influência do grupo hidroxila no timol.
No caso dos sais de piperazina, as sínteses realizadas buscavam a obtenção de dados sobre a influência do ânion ligado à piperazina sobre sua atividade contra os fitonematóides submetidos aos ensaios biológicos.
3.1. Síntese de compostos derivados do timol
Os fenóis podem ser convertidos em éteres através da síntese de Willianson (SOLOMONS, 1996), que consiste em uma reação de substituição nucleofílica do tipo ANDN entre um fenóxido de sódio (nucleófilo) e um haleto de
alquila ou benzila (nucleófugo: X-).
34 1a etapa: formação do ânion imidazol
+
N
N
Na+ + H2
_ .. .. + NaH .. N N H
2a etapa: desprotonação da hidroxila do timol pelo ânion imidazol
N N .. : O H O .. N N H .. .. : +
-3a etapa: formação do éter por substituição nucleofílica
O....:- + R X OR + X
35
Observa-se que na 2a etapa o imidazol é novamente formado, podendo ser utilizado para formação do ânion imidazol.
Foram feitas também diversas tentativas de nitração do timol, objetivando a redução do grupo nitro para grupo amino e posterior formação de aminas substituídas. As tentativas de nitração, no entanto, não levaram à produção dos derivados nitrados do timol.
Neste trabalho, foram produzidos seis éteres derivados do timol, além da timoquinona, obtida como produto das tentativas de nitração do timol.
3.2. Síntese de sais derivados da piperazina
Foram produzidos cinco sais derivados da piperazina, por meio de uma simples reação do tipo ácido-base entre o ácido que continha o ânion de interesse e a piperazina.
A reação de formação dos sais de piperazina foi praticamente instantânea, com formação imediata de precipitado. Todos os sais sintetizados apresentaram cor branca, e o rendimento das reações foi quantitativo.
3.3. Preparo do 2-benziloxi-1-isopropil-4-metilbenzeno [8]
[8] 35,8% O OH
i)NaH/Imidazol/T HF
refluxo 3 horas
ii)P hCH2Br/T HF
refluxo 1 hora/
12 horas temp.am b.
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O composto 2-benziloxi-1-isopropil-4-metilbenzeno [8] foi sintetizado, reagindo-se o timol com hidreto de sódio para retirada do hidrogênio do grupo hidroxila catalisada por imidazol, formando o ânion 2-isopropil-5-metilfenóxido, que posteriormente reagiu com o brometo de benzila, através de substituição nucleofílica do ânion brometo por este.
Após a mistura do timol com o hidreto de sódio/imidazol, observou-se pronta efervescência da mistura, decorrente da liberação de hidrogênio gasoso, formado quando da reação entre o ânion hidreto com próton H+ do imidazol e o do grupo hidroxila do timol, conforme descrito anteriormente.
Não se obteve êxito na recuperação do timol que não reagiu, talvez em virtude de reações colaterais deste, provocadas pelas condições de reação, e este fato contribuiu para a redução do rendimento da reação.
O espectro no infravermelho do composto obtido (Figura 4) mostra que as bandas de absorção na região de 3.650-3.584 cm-1, características da deformação axial do grupo hidroxila de fenóis (SILVERSTEIN et al., 1996), estão ausentes. Observa-se também uma intensa banda em 1.289 cm-1, relativa à deformação axial assimétrica C-O-C, com a deformação simétrica em 1.115-1.094 cm-1, característica de éteres. A presença de anel aromático é evidenciada pela presença de bandas na região próxima a 3.032 cm-1 de deformação axial de C-H em aromáticos, e as harmônicas, na região de 2.000-1.660 cm-1.
Quando comparado ao espectro de RMN de 1H do timol, o espectro do composto [8] (Figura 5) mostra a ausência do sinal do hidrogênio hidroxílico do timol, que aparece em δ 4,7. Observaram-se um dupleto integrado para 6H em δ 1,22 ((CH3)2CH-), um simpleto integrado para três hidrogênios em δ 2,31 (CH3-)
e um hepteto em δ 3,41 (CH3)2CH-). Estes dados são coerentes com os
deslocamentos químicos para seus hidrogênios (PREETSCH et al., 1996).
A presença do grupo OCH2 entre os anéis aromáticos é evidenciada pelo
37
hidrogênios, respectivamente. Os hidrogênios aromáticos do grupo benzila aparecem como um multipleto integrado para cinco hidrogênios em δ 7,23-7,48.
A confirmação da presença do grupo metileno é dada pela presença do sinal em δ 69,96 no espectro de RMN de 13C (Figura 6), confirmada pelo sinal
em δ correspondente no espectro de RMN de 13C DEPT 135 (Figura 7).
38
39
40
Figura 6 - Espectro de RMN de 13C (50 MHz, CDCl3) do composto 2-benziloxi
1-isopropil-4-metilbenzeno [8].
Figura 7 - Espectro de RMN de 13C (DEPT 135, 50 MHz, CDCl3) do composto
41
3.4. Preparo do 1-isopropil-2-etoxi-4-metilbenzeno [9]
i)NaH/Imidazol/T HF refluxo 3,5 horas
ii)CH3CH2Br/T HF
a 0ª C 1hora / 12 horas temp.amb.
OH
[9] 18,8% 18,8%
O
Figura 8 - Síntese do 1-isopropil-2-etoxi-4-metilbenzeno [9] a partir do timol.
Inicialmente procedeu-se à reação de formação do ânion 2-isopropil-5-metilfenóxido, por reação do timol com o NaH, catalisada por imidazol. A seguir, o brometo de etila foi adicionado, ocorrendo então a substituição nucleofílica do hidrogênio hidroxílico pelo grupo etila do brometo de etila. Obteve-se um líquido transparente, prontamente solúvel em CH2Cl2 e hexano.
O espectro no IV do composto [9] (Figura 9) apresentou uma banda intensa em 1.280 cm-1 de deformação axial assimétrica de C-O-C e outra de deformação axial simétrica em 1.030 cm-1, de intensidade bastante apreciável, característica de alquil-aril-éteres, além das bandas características de compostos aromáticos.
O espectro de RMN de 1H (Figura 10) apresentou, além dos sinais característicos dos grupos metila (δ 2,31) e isopropila (δ 1,20 e 3,27), um tripleto integrado para três hidrogênios em δ 1,41 (CH3CH2-O) e um quarteto integrado
para dois hidrogênios em δ 4,05 (CH3CH2-O). Observa-se ainda o acoplamento
spin-spin entre dois hidrogênios orto do anel aromático (Figura 11), evidenciado pela presença de dois dupletos em δ 6,72 e 7,08 (J5,6 = J6,5 = 7,8 Hz) e um
42
43
44
Figura 11 - Parte do espectro de RMN de 1H (δ de 6,6 a 7,2; 200 MHz, CDCl3) do composto 1-isopropil-2-etoxi-4-metilbenzeno
45
3.5. Preparo do 1-isopropil-4-metil-2-octiloxibenzeno [10]
O CH2[CH2]6CH3
[10 -]
] 23,6 % OH
i)NaH/Imidazol/T HF refluxo 3,5 horas
ii)CH3[CH2]6CH2Br/T HF
refluxo por 7,5 horas
Figura 12 - Síntese do 1-isopropil-4-metil-2-octiloxibenzeno [10] a partir do timol.
A primeira etapa desta reação, a produção do ânion 2-isopropil-5-metilfenóxido, foi realizada conforme descrito para reações anteriores. A única alteração ocorrida foi durante a substituição nucleofílica do haleto, na qual o tempo de refluxo necessário para que a reação ocorresse foi maior (7,5 horas), evidenciando a necessidade de maior tempo de reação para haletos lineares de maior cadeia.
O espectro no IV do composto [10] apresentou as bandas características de alquil-aril-éteres, sendo as principais em 3.100 cm-1 (deformação axial de CH aromático), 2.970 e 2.880 cm-1 (deformação axial de CH alifático) e em 1.250 cm-1 (deformação axial assimétrica de C-O-C).
O espectro de RMN de 1H apresentou, além dos sinais correspondentes ao grupo aromático e seus substituintes isopropila e metila, um tripleto integrado para três hidrogênios em δ 0,89 (CH3[CH2]6CH2-O-), um multipleto integrado
para 10 hidrogênios em δ 1,29-1,54 (CH3[CH2]5CH2CH2-O-), um quinteto
integrado para dois hidrogênios em δ 1,79 (CH3[CH2]5CH2CH2-O-) e um tripleto
integrado para dois hidrogênios em δ 3,94 (CH3[CH2]5CH2CH2-O-).
46
22,65; 26,20; 29,25; 29,31; 29,44; 31,82, correspondentes aos grupos metileno (-CH2-) mais bem visualizados na região expandida de δ 14,00 a 32,00 do
47
Figura 13 - Parte do espectro de RMN de 13C (δ de 14 a 32; DEPT 135, 50 MHz, CDCl3) do composto
48
3.6. Preparo dos compostos 1-isopropil-4-metil-2-octadeciloxibenzeno [11], 2-(2’,3’,4’,5’,6’-pentafluoroxibenzil)-1-isopropil-4-metilbenzeno [12] e 1-isopropil-4-metil-2-metoxibenzeno [13]
O[CH2]17CH3 O
F F
F F F
OCH3
[11] 33,0 % [12] 32,0 % [13] 75,8%
A metodologia utilizada nas sínteses dos compostos [11] e [12] foi realizada de acordo com o procedimento de obtenção do composto [10]. O composto [13] foi obtido utilizando metodologia semelhante à descrita para a obtenção do composto [9].
O composto [11] foi obtido após três tentativas, Na primeira e segunda tentativas, as reações foram mantidas sob refluxo durante três e oito horas, respectivamente, após a adição do haleto. Na terceira tentativa, o tempo de refluxo foi mantido em oito horas, obtendo-se o composto desejado com rendimento relativamente baixo. Na obtenção do composto [12], o tempo de refluxo após a adição de haleto foi de duas horas, e para obtenção do composto [13] não foi necessário refluxo, uma vez que o iodeto de metila é bastante volátil (Te = 43 °C). O aumento da temperatura iria volatilizar o haleto, impedindo o
contato entre os reagentes.
Nota-se que o rendimento da reação de formação do composto [13] é consideravelmente maior que o das demais reações. As prováveis explicações para este fato podem ser:
1a) O haleto de alquila utilizado para obtenção do composto [13] (CH3I)
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melhor grupo abandonador do que o bromo, átomo de halogênio presente nos demais haletos utilizados.
2a) A competição entre as reações de eliminação e substituição pode ter contribuído bastante para a redução do rendimento das reações realizadas com brometos de alquila (Figura 14).
C C H Br δ+ δ− B -Nu:
-C -C + BH +
C C H
Nu
+ :Br....-: .. : .. :Br -eliminação
substituição
Figura 14 - Competição entre as reações de eliminação e substituição.
Reações de eliminação provavelmente ocorreram em virtude do excesso de hidreto de sódio (base forte, B-) adicionado e que não reagiu com o timol, apesar do fato de que, para haletos primários, os rendimentos do produto de eliminação normalmente são menores que os do produto de substituição (BARBOSA, 1998).
Como não é possível que o iodeto de metila sofra reação de eliminação, é formado exclusivamente o produto de substituição, contribuindo, assim, para o maior rendimento da reação de formação do composto [13]. O mesmo ocorre com os brometos de benzila e 2’,3,’4’,5’,6’-pentafluorbenzila, porém, apesar de não ter havido reações de eliminação com estes haletos, os rendimentos dos produtos das reações de substituição (compostos [8] e [12]) foram menores que o da reação de obtenção do composto [13]
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entre 1.250 e 1.100 cm-1, devido aos diferentes modos de absorção axial C-F (SOLOMONS, 1996; PREETSCH et al., 1996).
O espectro de RMN de 1H do composto [11] apresentou, além dos sinais referentes ao anel aromático e aos grupos substituintes metila e isopropila, um tripleto integrado para três hidrogênios em δ 0,88 (CH3[CH2]17O-), um multipleto
integrado para 30H em δ 1,26-1,55 (CH3CH2 [CH2]15CH2O-), um multipleto
integrado para dois hidrogênios em δ 1,79 (CH3CH2[CH2]16O-) e um tripleto
integrado para dois hidrogênios em δ 3,93 (CH3[CH2]16CH2O-). O espectro do
composto [12] apresenta, além dos sinais citados, um simpleto integrado para dois hidrogênios em δ 5,11, correspondente ao grupo metileno entre os dois anéis aromáticos. O espectro do composto [13] apresenta um simpleto integrado para três hidrogênios em δ 3,81 (CH3-O-).
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Quadro 2 - Dados de RMN de 13C dos éteres [11], [12] e [13]
δC
composto [11] (δ)
composto [12] (δ)
composto [13]
(δ) δ calculado
1 67,86 57,67 55,31 72,20 [11]; 54,10[13]
1’ 156,24 155,02 156,65 156,70
2’ 134,09 134,78 134,03 134,20
3’ 125,78 126,29 125,81 127,40
4’ 120,82 122,46 121,08 121,10
5’ 136,20 136,46 136,30 136,20
6’ 112,21 112,86 111,41 114,40
1” 26,26 26,36 26,41 ----
2” 22,73 22,77 22,80 24,10
3” 21,36 21,27 22,80 24,10
4” 21,36 21,27 21,36 21,30
O CH2R
1 1' 2' 3' 4' 5
'
6'
1" 2" 3"
4" R = [CH
2]16CH3 [11]
C6F5 [12]
52
3.7. Tentativa de formação do composto 2-isopropil-5-metil-4-nitrofenol [14]
A nitração de fenóis usando técnicas-padrão de nitração normalmente gera produtos com rendimentos bastante baixos, principalmente devido à oxidação competitiva do anel, que leva à formação de grande quantidade de produtos coloridos, com rendimentos muito baixos ou nenhum rendimento do produto desejado (DWYER e HOLZAPFEL, 1998).
O mecanismo de nitração do timol envolve a formação do íon nitrônio por ação do ácido sulfúrico sobre o nitrato de sódio (VOGEL, 1971). Em seguida, o íon nitrônio age como eletrófilo sobre o anel aromático, e a adição deste íon leva à formação de um íon arênio que posteriormente transfere um próton para uma base, formando o nitroderivado (SOLOMONS, 1996; BARBOSA, 1998).
Nas tentativas realizadas foi seguido o procedimento ilustrado na Figura 15.
O2N
OH OH
i) NaNO3/H2SO4
ii) 0 oC, timol, temp. amb.
Figura 15 - Procedimento utilizado nas tentativas de obtenção do composto 2-isopropil-5-metil-4-nitrofenol [14].
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A análise do espectro RMN de 13C do composto obtido (Figura 16) mostrou que a síntese não foi bem sucedida. O espectro apresentou sinais em δ 15,36; 21,42; 26,00; e 56,00, correspondentes aos átomos de carbono dos grupos metil e isopropil ligados ao anel aromático e seis sinais com deslocamento químico 130,40; 133,45; 145,22; 155,00; 187,47; e 188,5. Estes dois últimos sinais apresentam-se muito distantes do TMS e não correspondem a sinais de átomos de carbono ligados ao grupo nitro (deslocamento químico calculado para C-NO2 = 141,4), sendo mais evidente a formação de uma quinona cujo
deslocamento químico tabelado para átomos de carbono ligados ao oxigênio é aproximadamente 187 (PREETSCH et al., 1996). Pela análise do espectro, não foi possível a distinção entre os deslocamentos químicos para os átomos de carbonos C1 e C4, entretanto sabe-se que os sinais em δ 187,5 e 188,7 são
relativos aos carbonos carbonílicos (C=O).
Os demais sinais também não correspondem aos valores calculados para o composto nitrado.
O espectro de RMN de 1H (Figura 17 e Quadro 3) mostrou, além dos sinais correspondentes aos grupos substituintes metil e isopropil, dois simpletos integrados para um hidrogênio cada em δ 6,52 e 6,55. Estes sinais reforçam a evidência de que o produto formado é uma quinona [15], uma vez que no nitrofenol estes sinais encontrariam-se mais distantes do TMS (δ calculado = 8,21 e 7,52).
Uma terceira tentativa foi realizada utilizando-se uma mistura de ácidos nítrico e acético (2:1 v/v) com o objetivo de aumentar a miscibilidade entre os reagentes e o timol dissolvido em THF. A reação, no entanto, não ocorreu, observando-se na placa de CCD os pontos com mesmo Rf que aqueles originados
54 O O
1 2 3
4 5 6
1'
2' 2'
4'
[15]
Quadro 3 - Dados de RMN de 1H (200 MHz, CDCl3) do composto [15]
δ mult. no de H atrib. J (Hz)
1,13 d 6 H2’ J2’,1’ = 6,9
2,04 s 3 H4’ ---
3,02 m 1 H1’ J1’,2’ = 6,9
6,52 s 1 H2 ---
55
56
