UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
DOUTORADO EM PSICOBIOLOGIA
ESTRATÉGIA DE VIDA DO PEIXE ANUAL Hypsolebias antenori
(Cyprinodontiformes: Rivulidae) DO SEMIÁRIDO BRASILEIRO
WALLACE SILVA DO NASCIMENTO
WALLACE SILVA DO NASCIMENTO
ESTRATÉGIA DE VIDA DO PEIXE ANUAL Hypsolebias antenori
(Cyprinodontiformes: Rivulidae) DO SEMIÁRIDO BRASILEIRO
ORIENTADORA: PROF. DRA. SATHYABAMA CHELLAPPA CO-ORIENTADORA: PROF. DRA. MARIA EMÍLIA YAMAMOTO
Tese apresentada a Universidade Federal do
Rio Grande do Norte como requisito para a
obtenção do Titulo de Doutor em
Psicobiologia.
FICHA CATALOGRÁFICA
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Nascimento, Wallace Silva do.
Estratégia de vida do peixe anual Hypsolebias antenori
(Cyprinodontiforme: Rivulidae) do semiárido brasileiro / Wallace Silva do Nascimento.–Natal, RN, 2014.
253 f.: il.
Orientadora: Profa. Dra. Sathyabama Chellappa. Coorientadora: Prof. Dra. Maria Emília Yamamoto.
Tese (Doutorado)–Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia. 1. Peixe anual, hypsolebias antenori. – Tese. 2. Reprodução do peixe.–Tese. 3. Estratégia de vida.–Tese. I. Chellappa, Sathyabama. II. Yamamoto, Maria Emília. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
2
Título: Estratégia de vida do peixe anual Hypsolebias antenori (Cyprinodontiformes: Rivulidae) do semiárido brasileiro
Doutorando: WALLACE SILVA DO NASCIMENTO
Data de defesa: 04 de junho 2014
Banca Examinadora:
____________________________________________ Dra. Sathyabama Chellappa
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN
____________________________________________ Dra. Maria Emília Yamamoto
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN
____________________________________________ Dr. Wagner Franco Molina
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, RN
____________________________________________ Dr. Júlio César Sá de Oliveira
Universidade Federal do Amapá, AP
____________________________________________ Dra. Odete Rocha
Universidade Federal de São Carlos, SP
3
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte e a Coordenação do Programa de
Pós-Graduação em Psicobiologia pela oportunidade da realização do doutorado.
Ao CNPq pelo apoio financeiro concedido para realização desta tese de doutorado.
À Professora Doutora Sathyabama Chellappa (UFRN), pela orientação, estímulo,
amizade, confiança, e de seu exemplo de dedicação a pesquisa, sempre primando pela
qualidade dos trabalhos.
Ao Dr. Naithirithi T. Chellappa (UFRN), pelo incentivo, amizade, inestimável
colaboração no provimento e pelo exemplo de superação em momentos de adversidades.
À Profa. Dra. Maria Emília Yamamoto pela co-orientação e Prof. Dr. Arrilton Araujo
de Souza pelo apoio.
Ao Professor Dr. Wagner F. Molina pelo grande apoio na realização do trabalho de
citogenética, tanto na geração dos dados como na escrita do artigo. A Paulo e Juliana pela
geração dos dados de citogenética.
À Professora Naissandra pela confecção e interpretação das lâminas histológicas.
À minha esposa Alessandra P. Xavier e minha filha Amanda, pela força, paciência,
conforto nos momentos difíceis, compreensão e incentivo, sempre presentes.
Ao meu pai, Denílson D. Nascimento, pelos ensinamentos, estimulo e apoio
incondicional nas coletas de peixe, proporcionando-me a determinação para o alcance de
meus objetivos.
À minha mãe Rita de Cássia, pelo amor, carinho, estimulo e determinação que me
conduziram até este momento de sucesso.
À meus irmãos John e Anderson pelas fotos e pelo apoio.
À meus amigos: Andrea S. Araujo, Liliane L. Gurgel, Elizete T. Cavalcante, Mônica
Rocha, Sérgio Ricardo, Nirlei Barros, Lucia Cavalcante, Ana Ligia Morais, Louise Thuane de
Lima, Marcelo Carvalho e Thiago Gurgel, pelo apoio, sugestões, a participação na execução
do trabalho e nossas constantes comemorações, que alegraram a todos durante esse
4
Ao amigo Agamenon e sua família que deram um grande apoio durante as coletas na
cidade Russas, assim como o pescador João, que com sua simplicidade ajudou muito nas
coletas dos peixes.
À todos os professores e funcionários do Departamento de Oceanografia e Limnologia
e do Departamento de Fisiologia, CB/UFRN.
A Deus por tudo que tenho.
5
SUMÁRIO
RESUMO 7
ABSTRACT 8
RELAÇÃO DE FIGURAS 9
1. INTRODUÇÃO GERAL 10
1.1 Peixes anuais do semiárido brasileiro 10
1.2 Estratégias reprodutivas dos peixes 14
1.3 Citogenética da família Rivulidae 19
2. OBJETIVOS 21
2.1 Objetivo geral 21
2.2 Objetivos específicos 21
3. MATERIAIS E MÉTODOS 23
3.1 Área de estudo 23
3.2 Pluviosidade e parâmetros limnológicos das poças 24
3.3 Captura dos peixes 25
3.4 Espécie em estudo 26
3.5 Caracterização morfométrica e merística do peixe 28
3.6 Proporção sexual 28
3.7 Relação peso e comprimento 28
3.8 Características macroscópicas e microscópicas das gônadas 29
3.9 Fecundidade e tipo de desova 31
3.10 Preparação de cromossomos mitóticos 32
3.11 Manutenção do estoque dos peixes no laboratório 35
3.12 Observações comportamentais 36
3.13 Testes estatísticos 36
3.14 Normalização do texto 36
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 37
Artigo 1.
Composição da ictiofauna das bacias hidrográficas do Rio Grande do Norte, Brasil (Artigo publicado na revista Biota Amazônia)
6
Artigo 2.
Proporção sexual e Relação peso-comprimento do peixe anual Hypsolebias antenori (Cyprinodontiformes: Rivulidae) de poças temporárias da região semiárida do Brasil.
(Artigo publicado na revista Biota Amazônia)
52
Artigo 3.
Anatomy and histology of the digestive tract of a rare annual fish Hypsolebias antenori (Rivulidae) from Brazil.
(Artigo publicado na revista Animal Biology Journal)
61
Artigo 4.
Gonad development and reproductive strategy of a rare annual fish Hypsolebias antenori from the semiarid region of Brazil.
(Artigo submetido na revista The Scientific World Journal) 74
Artigo 5.
Reproductive characteristics and strategies of freshwater fish species from the semiarid region of Brazil.
(Artigo aceito para publicação na revista Animal Biology Journal)
89
Artigo 6.
Karyotype patterns of Hypsolebias antenori (Cyprinodontiformes: Rivulidae): an endangered Killifish of the semiarid region of Brazil.
(Artigo publicado na revista The Scientific World Journal)
129
Artigo 7.
Conservation status of an endangered annual fish Hypsolebias antenori (Rivulidae) from Northeastern Brazil.
(Artigo aceito para ser publicado na revista Brazilian Journal of Biology)
136
Artigo 8.
Descrição das atividades do comportamento agressivo do macho de Hypsolebias antenori durante a reprodução
(Artigo em preparação para ser submetido na revista Acta Ethologica)
156
5. CONCLUSÃO 169
6. REFERÊNCIAS BILIOGRAFICAS 171
7
RESUMO
Este trabalho trata sobre a estratégia da vida de um peixe anual em perigo Hypsolebias antenori (Cyprinodontiformes: Rivulidae), do semiárido brasileiro. Os ovos dessa espécie nascem em poças temporárias, crescem rapidamente, reproduzem e no período de estiagem quando a poça seca, toda a população morre. Os ovos resistentes depositados no substrato da poça são capazes de passar por um estágio de diapausa, quando seu estágio de desenvolvimento embrionário é estacionado. Com a chegada do período de chuvas, os ovos eclodem e uma nova geração é formada. Os exemplares de H. antenori foram capturados durante 2011 e 2013, nas poças temporárias localizadas na bacia do rio Jaguaribe no Ceará, Brasil. Foram investigadas a proporção sexual, a relação peso-comprimento, o tipo de crescimento, a primeira maturação sexual, anatomia e histologia do trato digestório, desenvolvimento das gônadas, estratégia reprodutiva, dados cariotípicos da espécie, e o estado de conservação de H. antenori. Os resultados desse trabalho estão apresentados sob a forma de oito artigos. O primeiro artigo é sobre a composição da ictiofauna das bacias hidrográficas do Rio Grande do Norte, Brasil, incluindo o registro de H. antenori. O segundo artigo trata sobre a proporção sexual, características secundários sexuais dos machos, a relação peso-comprimento e o tipo de crescimento. Os machos apresentam um padrão de coloração intensa com nadadeiras mais desenvolvidas. A proporção sexual apresentou uma predominância significativa de fêmeas (1M: 1,7F). Os machos foram maiores em comprimento e em peso. A equação originada da relação peso total e comprimento total foi Wt = 0,0271Lt3,8937, apresentando um crescimento alométrico positivo, indicando maior incremento no peso do que em relação ao comprimento. O terceiro artigo trata sobre a anatomia e histologia do trato digestório de H. antenori. É considerado como um generalista com as características de onívoria, que aproveita fontes alimentares diferentes. O quarto artigo trata sobre os estádios e fases de desenvolvimento das gônadas e o tipo de desova de H. antenori. O quinto artigo trata sobre a estratégia reprodutiva r adotada pela H. antenori que auxilia na reprodução bem sucedida durante um curto período de vida. O sexto artigo trata sobre os dados cariotípicos da espécie, constituindo a primeira contribuição citogenética para o gênero. O sétimo artigo trata sobre o risco de extinção dessa espécie, que vêm sofrendo uma série de ameaças, tais como, a perda de habitats pela ocupação do solo, desmatamento, construção dos reservatórios, poluição devido aos efluentes domésticos, industriais, pesticidas e agrotóxicos. Além disso, a diminuição da pluviosidade e intensificação da aridez em decorrência das mudanças climáticas globais vem interferindo em seu ciclo reprodutivo. O oitavo trabalho trata sobre o comportamento agressivo adotado entre os machos e entre as fêmeas durante a reprodução. Todas as poças temporárias amostradas durante este trabalho estavam em um alto grau de degradação, principalmente devido à ação antrópica. Há uma grande necessidade de medidas de conservação para proteger as populações de peixes anuais, entre elas especialmente a criação de áreas de proteção nos ambientes aquáticos efêmeros do semiárido brasileiro.
8
ABSTRACT
This work deals with the life strategy of an endangered annual fish, Hypsolebias antenori (Cyprinodontiformes: Rivulidae), of the Brazilian semiarid region. The eggs of these fish hatch at the onset of the rainy season, grows rapidly and they reproduce during the rainy season. When the water puddles dry out, the entire population dies. The resistant eggs which are buried in the bottom of the dried pools go through diapause stages, during which time the embryonic development becomes temporarily arrested. With the onset of the next rainy season, the eggs hatch and a new generation is formed. Specimens of H. antenori were captured during 2011 and 2013, in temporary water pools located in the hydrographic basin of river Jaguaribe in Ceará, Brazil. Sex ratio, the length-weight relationship, the growth type, first sexual maturity, anatomy and histology of the digestive tract, development of gonads, reproductive strategy, karyotypic pattern of the species, and the conservation status of H. antenori were investigated. The results of this study are presented in the form of eight articles. The first article is about the fish faunal composition of the hydrographic basins of Rio Grande do Norte, Brazil, wherein the record of H. antenori is included. The second article deals with the sex ratio, secondary sexual characteristics of males, the length-weight relationship and the type of growth. Males show a pattern of intense coloration with well developed fins. The sex ratio showed a significant predominance of females (1M:1.7 F). Males were larger in length and weight. The equation of weight and total length relationship was Wt=0.0271Lt3,8937, showing a positively allometric growth, indicating greater increase in weight than in length. The third article discusses the anatomy and histology of the digestive tract of H. antenori. It is considered as a generalist feeder with characteristics of omnivore, which utilizes different food sources. The fourth article discusses the stages and phases of gonad development and type of spawning of H. antenori. The fifth article is about the r reproductive strategy adopted by H. antenori which helps in successful reproduction over a short period of life. The sixth article deals karyotypic pattern of the species, constituting the first cytogenetic contribution to the genus. The seventh article discusses about the risk of extinction of this species which suffers a series of threats, such as, habitat loss through land use, deforestation, construction of reservoirs, pollution due to domestic and industrial sewage, besides pesticides and agrochemicals. Furthermore, decreasing rainfall and intensification of aridity due to global climate changes, interferes with the reproductive cycle. The eighth article deals with aggressive behavior adopted between males and among females during reproduction. All temporary water pools sampled during this study were in high degree of degradation, mainly due to human action. There is a great need for conservation measures to protect the populations of annual fish, including the creation of protected areas in the semiarid ephemeral aquatic environments of Brazil.
9
RELAÇÃO DE FIGURAS GERAIS
Figura 1. Diversidade de espécies de peixes anuais (Rivulidae).
12
Figura 2. Ciclo reprodutivo esquemático dos peixes anuais. 13 Figura 3. Localização da área de estudo, Russas, CE, Brasil(04°57’39.8” S e
37°54’26.2” W).(A) Poça cheia no período chuvoso; (B) Poça seca no período de estiagem.
24
Figura 4. Captura de peixes e medições das poças temporárias do semiárido brasileiro. A) Diâmetro da poça; B) Profundidade da poça; C) Puçá utilizado para captura dos peixes; D) Peixe anual fêmea capturado.
26
Figura 5. Espécie em estudo: A) macho e B) fêmea de Hypsolebias antenori. 37 Figura 6. Procedimentos técnicos histológicos realizados para confecção das laminas
10
1. Peixes anuais do semiárido brasileiro
Zonas áridas constituem 40% do total da superfície terrestre e essas proporções
vêm aumentando devido o processo de desertificação, variação climática e destruição
das grandes florestas. Atualmente 20% da população humana vive nas regiões áridas e
semiáridas (Schessinger et al. 1990; Leal 2003).
No Brasil, aproximadamente 10% de seu território está classificado como região
semi-árida. O clima semi-árido brasileiro é considerado um dos mais complexos do
mundo, principalmente devido a seu sistema de circulação atmosférica. Pela sua
proximidade ao Equador, seu ritmo climático é diferente da maioria das regiões
semiáridas (Maltchik 1996). As bacias hidrográficas sob o domínio do semiárido
nordestino apresentam características peculiares, como regime intermitente e sazonal de
seus rios, reflexo direto das precipitações escassas e irregulares, associadas à alta taxa
de evaporação hídrica. Como conseqüência desse déficit climático, os processos de
descarga nestas regiões são praticamente nulos, produzindo-se fundamentalmente nos
leitos dos rios, quase sempre sistemas temporários ou efêmeros (Ab’Saber1995; Arruda
2001).
Os peixes anuais são definidos como um grupo de Cyprinodontiformes que
habitam ambientes aquáticos temporários na América do sul e na África, sendo
encontrados indivíduos adultos somente em breves períodos anuais (Berois et al. 2012).
Os peixes anuais encontrados na América do Sul pertencem à família Rivulidae, e
incluem os gêneros Austrolebias, Leptolebias, Cynolebias, Simpsonichthys, Pterolebias,
11
Os peixes anuais são, geralmente, pequenos com a coloração exuberante. Este
grupo de peixe apresenta muitas variações de cor, formas, tamanho, comportamento,
hábitos de reprodução e ecologia (Costa 2002). A Fig. 1 apresenta algumas espécies de
peixes anuais da América do sul.
Os peixes anuais vivem somente em “micro-habitats” dos corpos de água doce
sazonais, como poças, brejos ou pequenas lagoas que obrigatoriamente secam no
período de estiagem. Os peixes quando nascem, crescem rapidamente e reproduzem. No
período de estiagem, quando a poça seca, toda a população morre. Os ovos depositados
no substrato entram em diapausa, com seu estágio de desenvolvimento embrionário
temporariamente estacionado. Com a chegada de chuvas, os ovos eclodem e uma nova
geração é formada (Podrabsky & Hand, 1999).
As larvas crescem rapidamente, apresentando altas taxas de crescimento, os
individuos entram em maturidade sexual precocemente em cerca de 6 a 8 semanas. O
ciclo reprodutivo (Figura 2) é iniciado com vistosos padrões de coloração e formas
12
13
Figura 2. Ciclo reprodutivo esquemático dos peixes anuais (Fonte: Nascimento, 2014). A grande diversidade de cores e seu pequeno porte (geralmente de 3 a 7 cm de
comprimento) os tornaram populares entre os aquariófilistas. Existem clubes de
aquariofilia espalhados pelo mundo todo, dedicados exclusivamente à criação de peixes
anuais. Também despertam interessa na comunidade científica, atraídos por seu
intrigante ciclo de vida, entretanto, o grupo ainda é pouco conhecido. Entre as espécies
conhecidas no Brasil cerca de 75 % foram descritas taxonomicamente nos últimos 20
anos (Costa 2002).
As poucas pesquisas realizadas com espécies de rivulídeos têm demonstrado que
os peixes deste grupo apresentam peculiaridades que apontam sua importância como
excelentes modelos biológicos (Arenzon et al. 2003), bioindicadores (Arezo et al,
14
Os ecossistemas da região semiárida do nordeste brasileiro são inseridos no
bioma Caatinga. Todavia, estudos relacionados às espécies de peixes anuais dessa
região são praticamente inexistentes. A sobrevivência dos peixes anuais em ambientes
com estresse hídrico, baixos níveis de concentração do oxigênio dissolvido e ampla
flutuação de temperatura exigem alto grau de adaptações relacionadas ao seu ciclo de
vida. As mesmas peculiaridades que os tornam aptos a viverem nesses ambientes fazem
com que os peixes se tornem extremamente dependentes ao seu ambiente, tornando os
vulneráveis aos vários tipos de impactos. Os brejos e lagoas temporários têm sofrido
grandes impactos, principalmente, por meio de desmatamentos, drenagens e aterros para
multiplicação, alargamento e pavimentação de rodovias, crescimento populacional e
turismo. Com o resultado a grande maioria das espécies de peixes anuais é considerada
em risco de extinção (Costa 2002; Rosa et al. 2005; Nascimento et al. 2012b).
1.2 Estratégia reprodutiva dos peixes
Em razão da alta diversidade de espécies e da ocupação dos mais variados tipos
de ambientes, os peixes desenvolveram imensa variedade de estratégias reprodutivas
(Chase, 1999). A estratégia reprodutiva dos peixes pode ser definida como o conjunto
de características que uma espécie deverá manifestar para ter sucesso na reprodução, de
modo a garantir o equilíbrio populacional. Essas características, variáveis e adaptativas,
são denominadas táticas reprodutivas. Quanto à utilização dos termos estratégia, padrão
e táticas, a estratégia refere-se ao conjunto de táticas mais facilmente variáveis em
função do ambiente, sendo em parte conservativas, contudo o termo padrão seria
sinônimo de estratégia (Diana 1995; Ferreira & Mehanna 2006).
A reprodução dos peixes é cíclica, correspondendo a um período de repouso
15
novas proles (Chellappa et al. 2003; Cacho et al. 2007). O ciclo reprodutivo dos peixes
está vinculado com as variações do regime de chuvas (Chellappa et al. 2009).
O sucesso dos peixes teleósteos em distintos ambientes aquáticos é reflexo das
várias estratégias reprodutivas apresentadas pelo grupo. As estratégias reprodutivas dos
peixes englobam táticas extremas, que permitiram sua adaptação a ambientes nos quais
tanto as condições bióticas quanto às abióticas variam amplamente no espaço e no
tempo (Potts & Wootton 1984; Chellappa & Chellappa 2004).
Estudos sobre estratégias reprodutivas são de grande interesse, pois além da
melhor compreensão da história de vida de diferentes organismos podem conduzir a
implicações evolutivas permitindo discussões sobre os processos de evolução
reprodutiva ocorridos no passado, que provocaram, em última instância, a especiação
ictiológica. Entre as teorias evolutivas sobre histórias de vida, destaca-se a teoria de r
estrategistas e K estrategistas (Macarthur & Wilson 1967; Chase 1999; Pianka 2000).
Esta teoria conceituada como um contínuo entre dois pontos extremos onde as espécies
se disporiam de acordo com alguns parâmetros reprodutivos e comportamentais vem
sendo atualmente aprimorada, discutindo-se três pontos de contínuo triangular
(Winemiller & Rose 1992).
Winemiller, 1989 propôs três padrões reprodutivos para os peixes de água doce
sul-americanos: Estratégia de equilíbrio (K) adotada pelos peixes com pequenas
flutuações populacionais ao longo do ano, tamanho do corpo grande, classe de tamanho
corporal uniformemente distribuída ao longo do ano, período reprodutivo prolongado,
ovócitos grandes, desovas repetidas e cuidado parental bem desenvolvido. Temos como
exemplos o tucunaré comum, Cichla monoculus (Câmara et al. 2002), e o cascudo,
16
Estratégia Oportunista (r) adotada pelos peixes com flutuações populacionais
intermediárias, tamanhos do corpo pequeno, distribuição de tamanho corporal uniforme
durante a estação chuvosa, período de desova prolongada, repetidos surtos reprodutivos,
lotes com ovócitos pequenos, e pouco ou nenhum cuidado parental. Temos como
exemplos o Acestrorhynchus pantaneiro Menezes, 1992 (Characidae: Characiformes);
Pachyurus bonariensis Steidachner, 1879 (Scianidae: Perciformes) (Bailly 2006).
Estratégia sazonal adotada pelos peixes com grandes flutuações em populações
locais, tamanho do corpo intermediário a grande, período reprodutivo curto,
predominância de adultos na estação seca e de juvenis na chuvosa, longos tempo de
procriação, poucos surtos reprodutivos por ano, fecundidade intermediária alta, ovócitos
pequenos e pequeno ou nenhum cuidado parental. Exemplos: tamuatá, Hoplosternum
littorale (Oliveira & Chellappa 2002) e Leporinus piau (Nascimento 2012a).
A natureza exibe muitas alternativas que são adaptadas pelos peixes a fim de se
reproduzir. Durante a época reprodutiva, os peixes em geral apresentam dimorfismo
sexual e diversos comportamentos. Nessa fase, os machos de várias espécies constroem
ninhos ou selecionam um substrato para desova como meio de atrair as fêmeas para
acasalamento. Os aspectos do ninho e qualidade do substrato revelam o potencial
reprodutivo do macho para as prováveis parceiras (Barber et al. 2001).
Nos peixes aptos à reprodução os machos são em geral mais agressivos do que
as fêmeas e a posse de um território é o principal requisito para procriação deles
(Chellappa et al. 1999; Yamamoto et al. 1999). As fêmeas geralmente gastam muito
mais energia e tempo para reprodução do que os machos e, portanto, as fêmeas são mais
seletivas na escolha dos parceiros. As fêmeas preferem machos territoriais, acasalam-se
e depositam seus óvulos geralmente em territórios ocupados por machos de grande
17
habilidade durante a luta e a escolha do macho pela fêmea estão inter-relacionados. O
tamanho do corpo é de grande importância durante os confrontos e tem influenciado os
resultados de competições em muitas espécies de peixes (Chellappa et al. 1999).
Em peixes, em geral a ligação entre o par permanece apenas durante uma desova
e a monogamia se mantém somente em um pequeno número de espécies, uma vez que a
grande maioria é poligâmica (Takegaki & Nakazono 1999; Cacho et al. 2007).
Embora as espécies de peixes apresentem fecundação interna e externa, os
peixes também exemplificam várias estratégias exclusivas para o cuidado parental. A
maioria das espécies de peixes apresenta fertilização externa, que é um mecanismo de
liberar gametas na água sem fornecer o cuidado parental. Esses peixes tem alta
fecundidade para produzir a máxima quantidade de descendentes. Algumas espécies de
peixes com baixa fecundidade, no entanto, maximizam o cuidado parental, a fim de
entregar um menor número de descendentes com maior chance de sobrevivência (Cacho
et al. 1999; Cacho et al. 2006).
Dimorfismo sexual
O dimorfismo sexual ocorre quando há diferença entre os sexos de uma espécie,
que não seja as dos órgãos diretamente envolvidos no processo reprodutivo, tais como, a
gônadas e os órgãos copulatórios (Rappy & Fernandes 2005). Os peixes são organismos
informativos em estudos de dimorfismo sexual por causa dos muitos casos de
diversificação encontrados entres os sexos. Possivelmente, uma das categorias mais
comuns de dimorfismo sexual em peixes é a variação no tamanho do corpo, com
machos maiores do que fêmeas (Neat et al. 1998, Fletcher 1999; Roberts 1998).
Os peixes anuais geralmente apresentam dimorfismo sexual, onde os machos
geralmente apresentam uma coloração bastante chamativa em relação às fêmeas. O
18
exercendo um papel chave na diferenciação, especiação e evolução deste grupo diverso
de peixes (Belote & Costa 2004).
Tamanho da primeira maturação sexual
O conhecimento do tamanho no qual o peixe atinge a capacidade de reproduzir
pela primeira vez é muito importante. Há espécies que atingem a maturidade sexual
apenas após alcançarem um grande tamanho corporal. Por outro lado, há espécies que,
mantidas sob determinadas condições, aceleram o processo de maturidade e atingem a
fase reprodutiva ainda com tamanho reduzido (Okuzawa 2002).
Tipo de desova
O tipo de desova e como os ovócitos maduros são liberados durante o período
reprodutivo é determinado pela interação entre a dinâmica do desenvolvimento
ovocitário, a freqüência da desova dentro de um período reprodutivo e o número desses
períodos durante sua vida. Na época da reprodução, as fêmeas de peixes que liberam
seus ovócitos maduros de uma única vez são chamadas peixes de desova total (por
exemplo: piau, Leporinus piau, Nascimento et al. 2013), e que liberam seus ovócitos
maduros em várias parcelas ao longo de um período reprodutivo, são chamados peixes
de desova parcelada (por exemplo: jacundá, Crenicichla menezesi, Araujo et al. 2012).
Fecundidade
A fecundidade é definida como o número de ovócitos produzidos por uma fêmea
antes do próximo período de desova e varia muito nos indivíduos de uma espécie com o
mesmo peso, comprimento e idade, mas em geral aumenta proporcionalmente ao peso
do peixe, portanto com o cubo do comprimento (Murua & Saborido-Rey 2003).
A fecundidade é um parâmetro que mede o potencial de capacidade reprodutiva
do indivíduo, com variações inter e intra-específicas, entre períodos reprodutivos
(Fonteles-19
Filho 1989; Vazzoler 1996). Os peixes de migradores são altamente fecundos, enquanto
os sedentários desovam um número bem menor por desova o que é compensado pelas
desovas múltiplas realizadas ao longo do período reprodutivo (Godinho et al. 1997;
Andrade et al. 1988).
1.3 Citogenética de Rivulídeos Neotropicais
A variação genética é uma característica fundamental da maioria biota. Os
avanços nas tecnologias genéticas permitiram investigações profundas da variação
genética permitindo a exploração de várias questões relacionadas com a biodiversidade
e sua conservação, ou seja, a determinação da variabilidade genética, delimitação da
população, a caracterização do germoplasma , genotoxicidade , estudos comparativos do
genoma , análise forense , padrões filogeográficos, inferências evolutivas, contribuição
crescente a programas de criação de peixes e conservação biológica. Entre essas
abordagens, os estudos citogenéticos provaram ser uma ferramenta útil em várias
situações, identificando as características cromossômicas dos genomas das espécies
(Cioffi et al. 2012; Molina & Jacobina 2013).
Em peixes de agua doce, o confinamento aos sistemas hidrográficos, resulta em
um estreito relacionamento entre a história das bacias e a sua historia evolutiva
(Kavalco 2003). Análises citogenéticas em peixes dulcícolas Neotropicais vêm sendo
crescentemente empregadas na elucidação de questões taxonômicas, filogenéticas, na
identificação de espécies crípticas e delimitação de populações (Bertollo et al. 2004)
Alguns grupos de peixes no entanto são em grande parte desconhecidos quanto
aos seus aspectos cromossômicos. Neste aspecto, análises cromossômicas em espécies
Neotropicais da família Rivulidae são escassas (Arai 2011) e em grande parte limitadas
a espécies com distribuição mais ao norte, abrangendo Colômbia, Venezuela, Guiana
20
continente abrangendo áreas do sul do Brasil e Uruguai (Garcia et al. 1993; 1995). Além
da deficiência amostral das espécies analisadas, grande parte das informações
cromossômicas disponíveis são principalmente decorrentes de técnicas citogenéticas
clássicas, que limitam a compreensão de aspectos estruturais dos cromossomos das
espécies. Dados citogenéticos para espécies do grupo Simpsonichthys (da qual faz parte
o sub grupo Hypsolebias), que apresenta o maior número de espécies, e para regiões
21
2.1 Objetivo Geral
Este trabalho teve como objetivo descrever a estratégia de vida de Hypsolebias
antenori (Cyprinodontiformes:Rivulidae), uma espécie de peixe anual endêmico do semiárido brasileiro, a fim de gerar conhecimentos sobre aspectos de alimentação,
reprodução, citogenética e informações em relação ao estado de conservação desta
espécie.
2.2 Objetivos Específicos
Verificar a riqueza de espécies de peixes do Estado do Rio Grande do
Norte.
Artigo 1. Composição da ictiofauna das bacias hidrográficas do Rio Grande do Norte, Brasil (Publicado na revista Biota Amazônia).
Descrever o dimorfismo entre os sexos do peixe anual Hypsolebias
antenori do semiárido brasileiro.
Avaliar o tipo de relação peso/comprimento e a proporção sexual nesta
espécie.
Artigo 2. Proporção sexual e Relação peso-comprimento do peixe anual H. antenori (Cyprinodontiformes: Rivulidae) de poças temporárias da região semiárida do
Brasil. (Publicado na revista Biota Amazônia).
Descrever os tipos de adaptações morfo-histológicas do trato digestório e
verificar seu relacionamento com o tipo de alimentação de H. antenori.
Artigo 3. Anatomy and histology of the digestive tract of a rare annual fish Hypsolebias antenori (rivulidae) from Brazil. (Publicado na revista Animal Biology
22
Verificar os estágios de desenvolvimento das gônadas, o tipo de desova e a
estratégia reprodutiva de H. antenori.
Artigo 4. Gonad development and Reproductive strategy of a rare annual fish Hypsolebias antenori from the semiarid region of Brazil. (Submetido na revista Brazilian Journal of Biology)
Artigo 5. Reproductive characteristics and strategies of freshwater fish species from the semiarid region of Brazil. (Aceito para publicação na revista Animal
Biology Journal)
Verificar o padrão cariótipico do peixe anual H. antenori.
Artigo 6. Karyotype Patterns of Hypsolebias antenori (Cyprinodontiformes: Rivulidae): An Endangered Killifish of the Semiarid Region of Brazil. (Publicado na
revista The Scientific World Journal)
Verificar o estado de conservação do peixe anual H. antenori no semiárido
brasileiro.
Artigo 7. Conservation status of an endangered annual fish Hypsolebias antenori (Rivulidae) from Northeastern Brazil. (Aceito para publicação na revista Brazilian Journal of Biology).
Descrever os encontros agonisticos entre os machos de H. antenori.
23
3.1 Área de estudo
O presente estudo foi realizado em poças temporárias no município de Russas
estado do Ceará / CE (nas coordenadas geográficas 04°57’39.8” S e 37°54’26.2” W),
localizadas na Bacia do Rio Jaguaribe no semiárido nordestino brasileiro (Figura 3).
Esta região caracteriza-se por apresentar solos de várzea e não possuir grandes
elevações, favorecendo a formação de ambientes aquáticos temporários. A sazonalidade
dos ecossistemas de água doce ocorre devido à recorrência de seca prolongada, as
chuvas irregulares, temperaturas elevadas e uma elevada taxa de evaporação da água.
Esta região recebe quase 750 mm de precipitação anual e tem uma temperatura média
anual de 26oC durante a maior parte da região (Silva 2004) e abrange mais de 750.000
km2 na região nordeste do Brasil sendo o único bioma brasileiro que está situado
inteiramente no interior do território brasileiro (Leal et al. 2003). A cobertura vegetal é
24
Figura 3. Localização da área de estudo, Russas, CE, Brasil (04°57’39.8” S e 37°54’26.2” W). (A) Poça seca no período de estiagem; (B) Poça cheia no período
chuvoso.
3.2 Pluviosidade e parâmetros limnológicos das poças
Os dados de pluviosidade foram obtidos e monitorados através do FUNCEME
(Fundação Cearense de Meteorologia e Recursos Hídricos), Ceará, CE e no
Departamento de Metereologia e Recursos Hídricos da EMPARN (Empresa de Pesquisa
Agropecuária do Rio Grande do Norte S/A), Natal/RN.
O diâmetro e a profundidade das poças foram medidos. Os valores da
temperatura da água (ºC), concentração do oxigênio dissolvido (mgL-1), pH e
condutividade elétrica (μ Scm-1) foram registrados in situ, através de sondas específicas
do kit multiparâmetro WTW multi 340i. A calibragem do equipamento sempre foi
25
3.3 Captura dos peixes
Extensas campanhas de coletas de peixes foram realizadas em várias bacias
hidrográficas nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará, durante 2011 a 2013.
Exemplares de H. antenori foram capturados em agosto de 2011 e novamente em maio
de 2013, quando as poças temporárias estavam cheias durante a estação chuvosa da
região. Devido à falta das chuvas e a estiagem prolongada no ano de 2012, as poças
temporárias não encheram e os peixes não foram capturados. Esta foi a estiagem mais
intensa dos últimos 50 anos (WMO 2012).
As coletas foram efetuadas utilizando rede de arrasto de mão (50 x 150 cm) e
puçá (60 x 60 cm de diâmetro) de malha tipo industrial 2 mm (Figura 4). Após a
captura, os exemplares foram acondicionados de acordo com o estudo a ser realizado.
Alguns foram fixados em formol 10% no local da coleta e posteriormente conservados
em álcool 70° % para identificação taxonômica. Outra parte de peixes capturados foi
transportados vivos em caixas térmicas para o Laboratório de Ictiologia do
Departamento de Oceanografia e Limnologia do Centro de Biociências da UFRN para
estudo de comportamento, estudos histológicos (gônadas e trato digestório) e
citogenética. As medidas morfométricas e as contagens merísticas foram realizadas para
confirmar sua taxonomia (Costa 2006).
Para cada espécime foram registradas as medidas de comprimento total (TL em
cm) (distância entre a extremidade anterior da maxila à extremidade final da nadadeira
caudal), comprimento padrão (SL em cm) (distância entre a extremidade anterior da
maxila à última vértebra da coluna vertebral), utilizando-se um paquímetro com
precisão de 0,05mm e peso total (W em g) foi obtido com uma balança de precisão
26
A captura de peixes para a realização do estudo foi autorizada pelo
ICMBIO-MMA (Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade do Ministério do
Meio Ambiente) / SISBIO (Sistema de Autorização e informações sobre a
biodiversidade). O número de autorização é 27451.
Figura 4. Captura de peixes e medições das poças temporárias do semiárido brasileiro. (A) Medição do diâmetro da poça; (B) Medição da profundidade da poça; (C) Puçá para
captura dos peixes; (D) Peixe anual capturado.
3.4 Espécie em estudo
Hypsolebias antenori (Costa, 2006) (Figura 5) é uma espécies endêmica e rara
do semiárido brasileiro. Foi coletada pela primeira vez em 1945 no Ceará, nordeste do
Brasil. Em 1981 esta espécie foi descrita dentro do gênero Simpsonichthys (Costa,
A
B
27
2002). Em 2006 houve uma nova revisão taxonômica do gênero Simpsonichthys
considerando essa espécie no subgênero Hypsolebias (Costa, 2006).
Posição taxonômica: Superclasse: Pisces
Classe: Actinopterygii
Ordem: Cyprinodontiformes
Família: Rivulidae
Gênero: Hypsolebias
Espécie: Hypsolebias antenori (Costa, 2006)
Figura 5. Espécie em estudo: (A). Macho e (B). Fêmea de Hypsolebias antenori (Foto do autor).
1 cm B
A
28
3.5 Caracterização morfométrica e merística
As características morfométricas foram realizadas com auxílio de um
paquímetro e régua para obtenção das seguintes medidas em mm: Comprimento total
(TL), comprimento padrão (SL), comprimento da cabeça (LLۥ) comprimento do focinho
(LO), altura máxima do corpo (H), diâmetro do olho (oo), espaço inter-orbital (EIO)
comprimento da pré-dorsal (LD), pré-peitoral (LP), pré-ventral (LV) e da pré-anal (LA),
altura máxima do corpo (H), comprimento da nadadeira dorsal (CD), base da nadadeira
dorsal (DDۥ), comprimento da nadadeira peitoral (CP), base da nadadeira peitoral (PPۥ),
comprimento da nadadeira ventral (CV), base da ventral (VVۥ), comprimento da
nadadeira anal (CA), base da anal (AAۥ).
A caracterização merística foi realizada através da contagem dos lepdotríquios
(espinhos duros e moles) dorsais, anais, peitorais e ventrais com a finalidade de auxiliar
na confirmação da espécie.
3.6 Proporção sexual
Os peixes foram dissecados e as gônadas removidas, pesadas e examinadas para
identificar os sexos. A proporção entre os sexos foi verificada através da análise de
distribuição de freqüência relativa mensal de machos e de fêmeas durante o período de
estudo, sendo aplicado o teste Qui-quadrado determinado por:2–2( O–E )2/E, onde,
O= freqüência observada, E= proporção sexual esperada que seja de 50% sendo para o
grau de liberdade igual a 1 e nível de significância de 5%; os valores de 2 3,84
indicam diferenças significativas (Vazzoler 1996).
3.7 Relação peso e comprimento
A estrutura em comprimento dos peixes foi determinada com base na
distribuição das médias de frequências das classes de comprimento total para cada sexo,
29
determinada com base na distribuição das médias de frequências das classes de peso
total para cada sexo (Santos 1978; Vazzoler 1996). Para a obtenção da relação peso
total/comprimento total, procedeu-se à distribuição gráfica dos pontos empíricos
individuais destas variáveis, considerando o comprimento total como variável
independente e o peso total como variável dependente. A tendência dos pontos em
forma de curva demonstrou o tipo de crescimento (Le Cren 1951; Froese 2006)
Wt = a . Ltb Onde,
Wt = Peso total em gramas;
Lt = Comprimento total em cm;
a = Fator de condição relacionado com o grau de engorda do;
b = Constante relacionada com o tipo de crescimento da espécie.
3.8 Características macroscópicas e microscópicas das gônadas e trato digestório Os estádios de desenvolvimento das gônadas de ambos os sexos foram
verificados. Para as fêmeas serão considerados: o grau de turgidez, coloração,
vascularização, peso e comprimento das gônadas em relação ao espaço ocupado na
cavidade celomática. Para os machos foram considerados: coloração, tamanho do
testículo e a existência do sêmen. O exame macroscópico das gônadas permite a
identificação do sexo e o grau de maturação das gônadas. Foram registradas as
características das gônadas, tais como: turgidez, coloração, volume e aspecto
morfológico. A freqüência relativa (%) foi determinada para cada estádio de
desenvolvimento gonadal em todos os meses de coleta, com o objetivo de identificar a
30
Foram utilizadas sete gônadas dos peixes de cada sexo em diferentes estádios de
desenvolvimento e cinco tratos digestório dos peixes. Os procedimentos histológicos
foram realizados no Laboratório de Técnicas Histológicas do Departamento de
Morfologia do Centro de Biociências da UFRN.
Os peixes foram seccionados ventralmente, até a cavidade celomática e em
seguida, foi feita a retirada das gônadas e do trato digestório. Foram retirados
fragmentos dos terços anterior, médio e posterior das gônadas (testículos e ovários) em
diferentes fases de desenvolvimento e fragmentos dos órgãos digestórios, que faziam
parte das regiões esofágica, estomacais (cárdica, fúndica e pilórica) e do intestino
anterior, médio e posterior. Após seguiram-se as técnicas histológicas de routina (Figura
6). Os cortes com cerca de 5 a 7µm de espessura foram corados seguindo protocolos
histológicos convencionais de HE – Hematoxilina de Harris, Eosina e PAS – Ácido
Periódico Schiff (Behmer et al. 1976). Posteriormente, os diferentes tipos de células
germinativas e estruturas foram identificadas e fotografadas utilizando-se um
microscópio Olympus CH30 acoplado a uma câmera digital Olympus PM - 10 AK. As
31
Figura 6. Procedimentos técnicos histológicos realizados para confecção das laminas das gônadas e dos tratos digestórios dos peixes.
3.9 Fecundidade e tipo de desova
Para a determinação da fecundidade (potencial reprodutivo) foram utilizados 14
ovários das fêmeas em estádio maduro. As gônadas foram pesadas e foi feita uma
incisão longitudinal nas gônadas e em seguida colocadas em solução de Gilson. Depois Secção mediana 5 mm das gônadas em diferentes estádios de desenvolvimento
Fixação em Bouin 12h
Desidratação em banhos de álcool etílico a 70, 80, 90, 100 %, de 1 h cada
Diafanização em banhos de xilol, de 30 minutos cada
Inclusão em blocos de parafina
Cortes de 5 -7μ m de espessura no micrótomo
Desparafinização dos cortes em 2 banhos de xilol, de 5 minutos cada
Desidratação em banhos de álcool a 100, 90, 80 e 70 %, de 5 minutos cada
Coloração em HE durante 2 minutos
Lavagem das lâminas em água corrente por 10 minutos
Coloração em eosina durante 3 minutos
Desidratação em banhos de álcool etílico de 80, 90, 100 %, de 5 minutos cada
Diafanização em 2 banhos de xilol, de 5 minutos cada
32
de três dias os ovócitos foram liberados do estroma ovariano e três réplicas foram
lavadas e contadas utilizando uma placa de Bogorov. A fecundidade total foi estimada
por regra de três simples a partir da média do número de ovócitos das três réplicas e
média do peso das mesmas pelo peso total dos ovócitos na gônada (Vazzoler 1996;
Gomiero et al, 2007). O tipo de desova foi determinado através da análise das lâminas
histológicas das gônadas e pela distribuição das freqüências relativas de cada estádio de
maturação das gônadas (Vazzoler 1996; Araújo & Chellappa 2002).
3.10. Preparação de cromossomos mitóticos Técnica de estimulação mitótica
Para obtenção de mitoses e conseqüentemente metáfases, os exemplares foram
estimulados mitoticamente através da técnica preconizada por Molina (2001) e (Molina
et al. 2010), que faz uso de complexos de antígenos bacterianos e fúngicos. Este
procedimento consiste na inoculação intramuscular de solução do composto (2
comprimidos/1ml de água destilada); na proporção de 1ml/50g de peso corporal, por um
período de 24 a 48 horas. Decorrido este tempo, os exemplares foram anestesiados com
óleo extraído de cravo (Syzygium aromaticum) (Eugenol) e posteriormente sacrificados
para extração do rim cefálico.
Técnica de obtenção de cromossomos mitóticos
A técnica de obtenção de cromossomos mitóticos adotada seguiu o método
preparação in vitro descrito por Gold et al. (1990). Os exemplares tiveram o rim anterior
(cefálico) e posterior removidos e utilizados para obtenção de suspensão celular. Estes
foram colocados em 9 ml de meio de cultura RPMI 1640 e dissociados com ajuda de
seringas de vidro, transferindo o material logo em seguida para tubos de centrífuga de
15ml, completando o volume até 10ml do mesmo. Foi adicionada solução de colchicina
33
ambiente. Em seguida o material foi centrifugado por 10 minutos a 900rpm. Após o
excedente ser removido foram acrescentados 9 ml de solução hipotônica (KCl 0,075M),
por 28 a 30 minutos em temperatura ambiente. Ao término da hipotonização a
suspensão celular foi novamente centrifugada por 10 minutos. Para fixação do material
foi utilizada solução fixadora de Carnoy (metanol e ácido acético 3:1) em três ciclos de
centrifugação por 10 minutos, sendo o material então conservado à -20ºC em tubos de
1,5ml com tampa.
Preparação das lâminas
Um total de três ou quatro gotas de suspensão celular foram gotejadas sobre uma
lâmina recoberta com um filme d’água destilada aquecida à 60oC, após secar ao ar, foi
corada com solução Giemsa 5% , diluído em tampão fosfato pH 6,8, por um período de
08 minutos, posteriormente lavada com água destilada e seca ao ar.
Análises cromossômicas
Lâminas previamente preparadas com as suspensões celulares de cada indivíduo
foram analisadas através de microscópio óptico, sob o aumento de 1000X. Uma média
de 30 metáfases foi analisada para cada exemplar, visando o estabelecimento do valor
diploide modal e a definição dos padrões cariotípicos para a espécie. As melhores
metáfases foram fotografadas em fotomicroscópio de epifluorescência (OlympusTM
BX50), sob aumento de 1000X, por meio de sistema digital de captura DP73, Olympus,
com o uso dos software DPController, v. 1.2.1.108 (Olympus Optical Co. Ltd.), e
utilizadas na construção do cariótipo e definição da fórmula cromossômica. A
montagem dos cariótipos deu-se pela ordenação dos cromossomos quanto à posição dos
centrômeros em metacêntricos (m) com a razão entre o braço maior e menor (RB)
variando de 1,00 a 1,70; submetacêntricos (sm), RB = 1,71–3,00; subtelocêntricos (st),
34
Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)
As regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foram evidenciadas de acordo
com a técnica descrita por Howell e Black (1980). A técnica consistiu em depositar
sobre uma lâmina quatro gotas de uma solução de gelatina (1g de gelatina diluída em 50
ml de água e 0,5ml de ácido fórmico). A esta solução foram misturadas quatro gotas de
nitrato de prata (Ag-NO3) à 50%, cobrindo-a em seguida com lamínula. Logo após o
material foi incubado em estufa a 60ºC entre dois a quatro minutos, até que uma
coloração âmbar aparecesse. Ao término do processo a lâmina foi lavada com água
destilada, seca ao ar e analisada ao microscópio.
Detecção de Heterocromatina Constitutiva (Banda-C)
A observação de regiões de heterocromatina constitutiva foi realizada de acordo
com o método desenvolvido por Summer (1972), com pequenas alterações visando uma
melhor qualidade das preparações. Inicialmente lâminas com material mitótico
preparadas previamente de três a cinco dias foram imersas em HCl 0,2 N à temperatura
ambiente, por 15 minutos, lavando-a logo em seguida em água destilada e seca ao ar.
Após isto, as lâminas foram incubadas numa solução Ba(OH)2.8H2O a 5% durante um
período de 1 à 2 minutos à 42ºC. Após incubação foram lavadas rapidamente em HCl
0,2N, lavadas com água destilada e incubadas em solução de 2xSSC à 60ºC por 60
minutos, sendo posteriormente lavadas em água destilada e coradas com solução
Giemsa 6% diluída em tampão fosfato (pH 6,8) e visualizadas ao microscópio.
Coloração com Fluorocromos base-específicos
Para a dupla coloração com os fluorocromos CMA3 e DAPI, as lâminas foram
envelhecidas por três dias, coradas no escuro com 10 µL de CMA (0,5 mg/mL) por 30
mim e em seguida coradas com 10 µL de DAPI (2 µL/mL) por 60 minutos (Carvalho et
35
preservadas em câmara escura, por três dias e então analisadas. As metáfases foram
fotografadas em fotomicroscópio de epifluorescência OlympusTM BX50 com filtros
apropriados, em aumento de 1000X por meio de sistema digital de captura de imagens
Olympus modelo DP73 com o uso dos software DPController, v. 1.2.1.108 (Olympus
Optical Co. Ltd.).
3.11 Manutenção do estoque dos peixes no laboratório
Vinte exemplares de cada espécie estudada foram capturados vivos,
transportados para o Laboratório de Ictiologia do Departamento de Oceanografia e
Limnologia e aclimatados separadamente em tanques retangulares de cimento amianto
(de 1,50 x 0,65 x 0,97m) com capacidade para 1000 litros, durante 10 dias antecedendo
aos experimentos. A qualidade da água foi mantida por sifonamento das fezes e restos
alimentares a cada dois dias, aeração constante e filtro biológico. O pH foi avaliado por
papel indicador. Um terço da água foi substituída duas vezes por semana para manter
sua transparência e facilitar as observações.
Foram mantidas as condições adequadas à sobrevivência e reprodução dos
peixes, com temperatura em torno de 28ºC, pH entre 7,0 a 7,5 e a concentração do
oxigênio dissolvido entre 7,0 a 8,0 mgL-1. Os parâmetros físico-químicos tais como pH
e temperatura foram verificados diariamente. O fotoperíodo foi controlado para 12 horas
de luz (6:00-18:00 h) utilizando um temporizador digital. A aeração dos tanques foi
feita através de um sistema constituído de mangueiras plásticas e aeradores. Os peixes
foram vistoriados a cada dia para controle de doenças. A alimentação diária oferecida
foi de 3% do peso corporal, dividida duas vezes ao dia (inicio da manhã e final da
36
3.12 Observações do comportamento agressivo dos peixes
Para observações (em condição laboratorial) foram utilizados 20 machos e 20
fêmeas de H. antenori, sem nenhuma manipulação. Quatro aquários aquários (30 x 15
x 30 cm), com capacidade para 13,5L de água. O fundo do aquário foi preparado com
substratos, turfa (Pó de coco), plantas. As observações foram realizadas através do
método focal contínuo, registrando-se a frequência dos comportamentos. Foi utilizado
um cronômetro para registrar a duração dos comportamentos observados. Foram
realizados 60 min de observação por aquário pela manhã e 30 min à tarde (Cacho et
al., 1999). Foram realizadas gravações com uma filmadora digital com tripé,
totalizando 180 minutos de filmagem de para cada aquário. A descrição de toda
metodologia está descrita no artigo 8.
3.13 Testes estatísticos
Para determinar diferenças estatisticamente significativas na proporção de
machos e fêmeas da espécie em estudo foi realizado o teste do χ2 (qui-quadrado) ao
nível de significância de 5%. O teste Komogorov Smirnov (KS) foi utilizado para
confirmar se os dados de comprimento e peso total apresentavam distribuição normal,
tanto para machos quanto para fêmeas. Para a determinação da ocorrência de diferenças
significativas entre essas variáveis durante o período amostrado foram realizados testes
de T-Student (t), ao nível de significância de 5%. Foram realizados os Testes ANOVA
(one way) seguido do teste de Tukey, para observar diferenças entre os tratamentos das
observações do comportamento e ANOVA (two way) para observar diferenças dos
comportamentos entre turnos e entre os sexos, seguido do teste de Holm Sidack. Foi
realizada a análise multivariada de correlação canônica (CA) para verificar possíveis
correlações entre os comportamentos. Os softwares utilizados na realização destes testes
37
3.14 Normalização do texto
A estrutura do texto, as citações, as referências bibliográficas e a diagramação da
dissertação foram feitas baseadas nas normas do Guia de formatação de tese do
Programa de Psicobiologia. Enquanto que os artigos foram elaborados conforme as
38
O presente trabalho resultou em oito artigos científicos. Desses quatro já foram
publicados, dois foram aceitos para publicação e um foi submetido para publicação e
uma esta em preparação para ser submetidos a revistas científicas:
Artigo 1
Composição da ictiofauna das bacias hidrográficas do Rio Grande do Norte, Brasil
(Artigo publicado na revista Biota Amazônia)
Artigo 2
Proporção sexual e Relação peso-comprimento do peixe anual Hypsolebias antenori
(Cyprinodontiformes: Rivulidae) de poças temporárias da região semiárida do Brasil
(Artigo publicado na revista Biota Amazônia)
Artigo 3
Anatomy and histology of the digestive tract of a rare annual fish Hypsolebias antenori
(rivulidae) from Brazil
(Artigo publicado na revista Animal BiologyJournal–USA) Artigo 4
Gonad development and Reproductive strategy of a rare annual fish Hypsolebias
antenori from the semiarid region of Brazil
(Artigo submetido na revista The Scientific World Journal)
Artigo 5
Reproductive characteristics and strategies of freshwater fish species from the semiarid
region of Brazil
(Artigoaceito para publicação na revista Animal BiologyJournal–USA)
Artigo 6
Karyotype Patterns of Hypsolebias antenori (Cyprinodontiformes: Rivulidae): An
Endangered Killifish of the Semiarid Region of Brazil
(Artigo publicado na revista The Scientific World Journal)
Artigo 7
Conservation status of an endangered annual fish Hypsolebias antenori (Rivulidae) from
Northeastern Brazil
(Artigoaceito para publicação na revista BrazilianJournalofBiology)
Artigo 8
Descrição das atividades do comportamento agressivo do macho de Hypsolebias
39
Artigo 1
Composição da ictiofauna das bacias hidrográficas do Rio Grande do Norte, Brasil Composition of the fish fauna of the hydrographic basinsof RioGrande do
Norte,Brazil.
Wallace Silva do Nascimento, NirleiHirachy Costa Barros, Andréa Soares de Araújo, Liliane de Lima Gurgel, BhaskaraCanan, Wagner Franco Molina, Ricardo S. Rosa e
SathyabamaChellappa
Responde aoobjetivo específico 1 Publicado na revista Biota Amazônia
46
49
50
51
52
Artigo 2
Proporção sexual e Relação peso-comprimento do peixe anual
Hypsolebias antenori (Cyprinodontiformes: Rivulidae) de poças
temporárias da região semiárida do Brasil
Wallace S. Nascimento, Maria Emília Yamamoto, Sathyabama Chellappa
Responde aos objetivos específicos 2 e 3
Publicado na revista Biota Amazônia
61
Artigo 3
Anatomy and histology of the digestive tract of a rare annual fish
Hypsolebias antenori (rivulidae) from brazil
Anatomia e histologia do trato digestório deHypsolebias antenori
(Rivulidae) um peixe anual raro do Brasil
Wallace Silva do Nascimento, Naisandra Bezerra da Silva,
Maria Emília Yamamoto and SathyabamaChellappa
Responde aoobjetivo específico 4
Artigo publicado na Revista: Animal Biology Journal
74
Artigo 4
Gonad development, fecundity and type of spawning in an endangered
annual fish Hypsolebias antenori (Cyprinodontiformes: Rivulidae)
Desenvolvimento gonadal, fecundidade e tipo de desova de um peixe
anual ameaçado Hypsolebias antenori (Cyprinodontiformes: Rivulidae)
Wallace Silva do Nascimento, Naisandra Bezerra da Silva; Maria Emília Yamamoto & Sathyabama Chellappa
Responde ao objetivo específico 5
Artigo submetido na Revista: The Scientific World Journal
ISSN: 2356-6140 (Print) ISSN: 1537-744X (Online)
75
Gonad development, fecundity and type of spawning in an endangered annual fish
Hypsolebias antenori (Cyprinodontiformes: Rivulidae)
Wallace Silva do Nascimento1, Naisandra Bezerra da Silva2, Maria Emília Yamamoto1, Sathyabama Chellappa1
1
Programa de Pós-Graduação em Psicobiologia, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Av. Salgado Filho, 3000, Lagoa Nova, Natal, Rio Grande do Norte, CEP 59.072-970 Brasil.
E-mail address: wallacesnbio@hotmail.com; emiliayamamoto@gmail.com;
chellappa.sathyabama63@gmail.com
2
Departamento de Morfologia, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Av. Salgado Filho, 3000, Lagoa Nova, Natal, Rio Grande do Norte, Brasil. CEP 59.072-970.
E-mail address: naisandra@ufrnet.br
Correspondence should be addressed to Sathyabama Chellappa;
chellappa.sathyabama63@gmail.com
Hypsolebias antenori (Cyprinodontiformes: Rivulidae), is an endangered rare annual fish, which is endemic to the northeastern semiarid region of Brazil. This fish completes
its life cycle in seasonal pools. The eggs hatch at the onset of the rainy season,
hatchlings grow rapidly and adults reproduce during the rainy season. When the water
puddles dry the entire population dies during the dry season. The resistant eggs, which
are buried in the bottom of the dried pools, go through diapause stages, during which
time the embryonic development becomes temporarily arrested. With the onset of the
next rainy season, the eggs hatch and a new generation is formed. This work presents
aspects of gonad development, fecundity and type of spawning of H. antenori captured
from seasonal pools of northeastern Brazil. The ovarian and testicular developmental
stages were verified using macroscopic and histological techniques. The macroscopic
characteristics of gonads indicated four maturation stages, whereas, the histological
analyses revealed five phases of oocyte development and four phases of spermatocyte
76
vitelogenic oocytes per batch. This fish is an r strategist, which helps its propagation
within its short life span.
Keywords: Hypsolebias antenori, annual fish, gonad development, reproductive aspects.
1. Introduction
The success of teleost fish in different aquatic environments is a reflection of the
various reproductive strategies presented by the group. The reproductive strategies of
fish include extreme tactics that permitted adaptation to environments, where both
biotic conditions, such as food availability and predation pressure, as well as the abiotic
conditions, such as temperature, rainfall, photoperiod, oxygen availability, among
others, vary widely in space and time [1, 2]. The variables of reproductive behavior
reflect the adaptation of the organism to certain difficulties imposed by the environment
and can be used as information to maintain stocks. Thus, information about the
reproductive process is important and necessary to subsidize management and
conservation of species.
Rivulidae (Cyprinodontiformes: Aplocheiloidei) is one of the largest families of
freshwater fish of the Neotropical region, which is taxonomically composed of 30
genera and 350 valid species [3, 4]. It is a diverse group of fish, most popularly known
as "killifishes", which occur in seasonal freshwater pools of tropical and subtropical
areas of South America [5]. This group of fish exhibits short life cycles, accelerating the
process of sexual maturation and completion of reproductive cycle during the rainy
season. When the temporary water pools dry the entire population dies off [6, 7]. To
survive under these extreme conditions, fish eggs are deposited in the sediment of the
seasonal pools, which go through diapause stages during which time the embryonic
development becomes temporarily arrested. With the onset of the next rainy season
these eggs hatch out and a new generation is formed [8, 9, 10, 6].
Hypsolebias antenori is an endangered rare annual fish which is endemic to the semiarid region of Brazil [11]. H. antenori exhibits significant sexual dimorphism.
Males of this species have a deep convex body which is laterally compressed, with well
developed dorsal and anal fins. The males are very brightly coloured, with a
