Avaliação da resposta inflamatória cerebral em camundongos BALB/c e C47Bl/6 infectados por Plasmodium berghei cepa NK65.

NORINNE LACERDA QUEIROZ

Avaliação da resposta inflamatória cerebral em camundongos BALB/c e C57Bl/6

infectados por Plasmodium berghei cepa NK65

Programa de Pós-Graduação em Parasitologia Instituto de Ciências Biológicas

Universidade Federal de Minas Gerais Belo Horizonte

NORINNE LACERDA QUEIROZ

Avaliação da resposta inflamatória cerebral em camundongos BALB/c e C57Bl/6

infectados por Plasmodium berghei cepa NK65

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Parasitologia.

Área de concentração: Protozoologia

Orientadora: Profa. Érika Martins Braga – Departamento de Parasitologia

Co-orientadora: Profa. Juliana Carvalho Tavares – Departamento de Fisiologia

Programa de Pós-Graduação em Parasitologia Instituto de Ciências Biológicas

Universidade Federal de Minas Gerais Belo Horizonte

043

Q3a Queiroz, Norinne Lacerda .

Avaliação da resposta inflamatória cerebral em camundongos BALB/c e C57Bl/6 infectados por Plasmodium berghei cepa NK65 [manuscrito] / Norinne Lacerda Queiroz. – 2007.

93 f. : il. ; 29,5 cm.

Orientadora : Érika Martins Braga.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas.

1. Malária Cerebral. 2. Plasmodium berghei – Teses. 3. Modelos animais em pesquisa – Teses. 4. Inflamação – Teses. 5. Quimiocinas – Teses. 6.

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“Enfim, cada um o que quer aprova, o senhor sabe: pão ou pães, é questão de opiniães...”

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v

Agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia, ICB/UFMG, pelos conhecimentos transmitidos e pela a oportunidade de realização desta Dissertação

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Agradecimentos

Agradeço imensamente aos meus pais, Antônio e Santa, alicerces da minha vida e exemplos de dedicação. Obrigada pelo amor e apoio incondicional, a confiança e o carinho.

Aos meus irmãos, que de formas tão diferentes me acompanham e contribuem na minha vida.

Ao Glauber pelas lições...

Ao Vladmir por acreditar e me incentivar...

A Noelle pela presença constante, mesmo a distância, e por todo carinho e cumplicidade.

A professora Érika Martins Braga pela orientação e pela oportunidade de trabalhar no laboratório de Malária.

A minha orientadora e amiga Juliana Carvalho Tavares, presente em toda esta caminhada. Sou eternamente grata a sua participação na minha vida acadêmica e pessoal. Agradeço o apoio e confiança.

A professora Cláudia Martins Carneiro, pela colaboração neste trabalho. Agradeço a disponibilidade, atenção e carinho.

Ao professor Antônio Lúcio Teixeira Jr, pela colaboração e disposição. Agradeço o interesse pelo trabalho e por me incentivar.

A amiga Márcia de Carvalho Vilela, meu braço direito em muitas ocasiões, com direito a ombro amigo...

A amiga Adriana Carvalho, que muito me ensinou durante o início da minha vida acadêmica e sempre esteve disponível para contribuir no meu trabalho.

Aos colegas de mestrado: Ana Terezinha, Érika, Erlisson, Juliana, Lara, Leonardo, Liliam, Natasha e Vladimir... Pelos momentos de aprendizado, tanto na sala de aula quanto fora dela (nos churrascos e almoços...). Foi muito bom compartilhar esta experiência com todos vocês.

Aos colegas do laboratório de Neuro-Imuno Fisiologia e Malária, em especial a técnica Márcia Campos, pelo suporte nos trabalhos.

Ao professor Mauro Martins Teixeira por disponibilizar a infra-estrutura do laboratório de Imunofarmacologia para parte de meus experimentos.

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especial, ao David Herinque que acompanhou parte dos experimentos, estando a disposição para ajudar e compartilhar.

As colegas de república, Cíntia e Kézia. Agradeço a experiência de dividir.

Aos amigos da minha Montes Claros: Dalila, Ângela, Thereza, Tiana, Virgínia, Hilla, Renato, Alessandro e Tiago, pelos anos de amizade e cumplicidade. Foi muito bom contar com todos mesmo à distância.

Aos amigos conquistados em Belo Horizonte, especialmente a Carol e a Leidi.

Aos meus familiares, especialmente meus avós (Antônia, Dja e Marcelino), minha querida bisavó Regina e meus tios e tias (Clício, Marly, José Geraldo e Darcy).

Aos professores do Departamento de Parasitologia pela transmissão de conhecimentos. Ao professor Ricardo Wagner de Almeida Vitor que atenciosamente cumpriu o papel de relator desta dissertação.

Ao CNPq pelo auxílio financeiro.

Aos funcionários, especialmente a secretária Sumara, ao Seu Neri e a Rose, a quem eu guardo tanto carinho.

Enfim, aqueles que, de alguma forma, passaram pela minha vida e deixaram alguma contribuição.

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Resumo

A malária é a doença parasitária mais grave da humanidade, sendo um problema de saúde pública em mais de 100 países. A malária cerebral (MC), causada pelo

Plasmodium falciparum, é uma das formas de manifestação mais grave da malária humana e a principal causa de óbitos, apresentando mecanismos ainda desconhecidos. A patogênese da malária está associada a uma resposta imune inapropriada ou excessiva desenvolvida pelo hospedeiro para eliminar o parasito. Devido às dificuldades em acompanhar casos humanos e da limitada possibilidade de examinar os processos patológicos, modelos experimentais de MC foram desenvolvidos. Embora nenhum modelo reproduza totalmente a condição humana, o modelo experimental utilizando roedores é bem caracterizado e a grande diversidade de linhagens de camundongos, associada à infecção com diferentes espécies de Plasmodium, tem contribuído para elucidar aspectos envolvidos na patogênese da doença.

Assim, o objetivo do nosso trabalho foi avaliar a resposta inflamatória cerebral envolvida na patogênese da malária experimental induzida por Plasmodium berghei

cepa NK65 em camundongos jovens (seis semanas de idade) das linhagens BALB/c e C57Bl/6.

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infectados apresentaram aumento do número de leucócitos em rolamento e aderidos na parede do endotélioem relação aos animais controle. A contagem total e diferencial de leucócitos (linfócitos, monócitos neutrófilos, eosinófilos e basófilos) presentes no sangue periférico dos animais exibiu um padrão alterado da população celular geral e/ou específica nos animais infectados em relação aos controles. A quantificação do extravasamento do corante azul de Evans para o parênquima cerebral sugeriu modificações na permeabilidade vascular da BHE, em decorrência da infecção. Utilizando o método de ELISA, verificamos que houve um aumento significativo das concentrações da citocinas TNF-α e IFN-γ, e das quimiocinas murinas MCP-1/CCL2, RANTES/CCL5 e MIG/CXCL9 em homogenato de cérebro e no soro dos animais infectados (5 dpi) quando comparado aos animais controle.

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Abstract

Malaria is the most important parasitic disease of the humankind, representing a public health problem in more 100 countries. Cerebral malaria (CM), caused by

Plasmodium falciparum, is one of more serious manifestations of human malaria and the main cause of death by an as-yet unknown mechanism. The pathogenesis is associated with an inappropriate or excessive immune response by the host in response to the parasite. Due the difficulty to following human cases and the restriction to examine the pathologies, experimental models of CM have been developed. However, there is any model that repeats the human condition. The suitability of rodents experimental models is well characterized and the huge diversity of mouse strains associated with the infection by different species of Plasmodium have contributed to elucidated some features involved in the pathogenesis of the disease.

The aim of the present study was to evaluate the cerebral inflammatory response involved in the pathogenesis of experimental malaria induced by Plasmodium berghei

NK65 in young BALB/c and C57Bl/6 mice (six weeks).

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eosinophils and basophils) in the peripheral blood showed a different profile of the global and/or specific cellular population in infected animals, when compared to controls. The evaluation of Evans blue leakage to cerebral parenchyma suggests changes in vascular permeability of blood-brain barrier (BBB), as consequence of the infection. Using ELISA methods, we noted a significant increase in TNF-α and IFN-γ

cytokines concentrations, as well as in MCP-1/CCL2, RANTES/CCL5 and MIG/CXCL9 levels, in brain and serum of infected animals (5 dpi) in comparison to controls animals.

This work showed that young mice BALB/c and C57Bl/6 infected by P. berghei

Sumário

Lista de Abreviaturas e Siglas ... 1

Lista de Gráficos ... 3

Lista de Figuras, Quadros e Tabelas... 4

1 1 1 1 ---- IN TR O D U Ç Ã O IN TR O D U Ç Ã O IN TR O D U Ç Ã O IN TR O D U Ç Ã O... 5

1.1-A SITUAÇÃO DA MALÁRIA NO MUNDO... 6

1.2-A DOENÇA... 6

1.3-MALÁRIA CEREBRAL HUMANA... 10

1.4-MODELOS EXPERIMENTAIS DE MALÁRIA CEREBRAL... 12

1.5–INTERAÇÕES PARASITO-HOSPEDEIRO... 14

1.6–CARACTERÍSTICAS DO PLASMODIUM BERGHEI... 15

1.7-MEDIADORES INFLAMATÓRIOS... 16

1.8-RECRUTAMENTO CELULAR... 17

1.9-QUIMIOCINAS... 18

2 2 2 2 ---- JU STIF IC A TIV A JU STIF IC A TIV A JU STIF IC A TIV A JU STIF IC A TIV A... 22

3 3 3 3 ---- O B JE TIV O S O B JE TIV O S O B JE TIV O S O B JE TIV O S... 25

3.1-OBJETIVO GERAL... 26

3.2-OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 26

4 4 4 4 ---- M A TE R IA L E M É TO D O S M A TE R IA L E M É TO D O S M A TE R IA L E M É TO D O S M A TE R IA L E M É TO D O S... 27

4.1-ANIMAIS... 28

4.2-PARASITO E INFECÇÃO DOS ANIMAIS... 28

4.3-DETERMINAÇÃO DA PARASITEMIA... 28

4.4-HISTOLOGIA... 29

4.4.1 - Fixação do tecido e recorte dos órgãos ... 29

4.4.2 - Desidratação, diafanização e inclusão em parafina ... 30

4.4.3 - Microtomia ... 30

4.4.4 - Coloração... 30

4.4.4.1 - Hematoxilina-Eosina... 30

4.4.4.2 – Cresil Violeta... 31

4.4.5 - Análise Histopatológica ... 31

4.5-MICROSCOPIA INTRAVITAL... 32

4.6–CONTAGEM TOTAL E DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS... 33

4.7-AVALIAÇÃO DA PERMEABILIDADE VASCULAR... 34

4.8-MEDIDA DOS NÍVEIS DE CITOCINAS E QUIMIOCINAS NO SORO E CÉREBRO POR ELISA... 35

4.8.1 - Preparo de homogenato de cérebro de camundongo... 35

4.8.2 - Obtenção de soro de camundongos... 35

4.8.3 - Determinação de citocinas por ELISA ... 35

4.9-ANÁLISE ESTATÍSTICA... 36

5 5 5 5 ---- R E SU L TA D O S R E SU L TA D O S R E SU L TA D O S R E SU L TA D O S... 38

5.1-EVOLUÇÃO DA PARASITEMIA... 39

5.2-MORTALIDADE... 42

5.3-SINAIS CLÍNICOS... 42

5.4-HISTOLOGIA... 45

5.5-INTERAÇÃO LEUCÓCITO-ENDOTÉLIO... 50

5.6–CONTAGEM TOTAL E DIFERENCIAL DE LEUCÓCITOS... 53

5.7-AVALIAÇÃO DA PERMEABILIDADE VASCULAR... 56

5.8-DOSAGEM DAS CITOCINAS TNF-Α E IFN-Γ E DAS QUIMIOCINAS KC/CXCL8,MIG/CXCL9, MIP-1Α/CCL3,MCP-1/CCL2 E RANTES/CCL5... 58

6 6 6 6 ---- D ISCU SSÃ O D ISCU SSÃ O D ISCU SSÃ O D ISCU SSÃ O... 62

8. P E R SP E CTIV A S 8. P E R SP E CTIV A S 8. P E R SP E CTIV A S

8. P E R SP E CTIV A S... 78

9 9 9

Lista de Abreviaturas e Siglas

ANOVA – Análise de variância BHE – barreira hematoencefálica BSA – Albumina de soro bovino CEBIO – Centro de Bioterismo

CETEA – Comitê de Ética em Experimentação Animal

CCL2/MCP-1 – proteína quimioatraente de macrófagos e monócitos (monocyte-chemotactic protein-1)

CCL3/MIP-1α – proteína quimioatraente de macrófagos, monócitos e linfócitos T CD8+ (macrophage-inflammatory protein-1 alpha)

CCL5/RANTES – proteína quimioatraente de linfócitos T ativados e eosinófilos (regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted)

CXCL8/Kc – proteína quimioatraente de neutrófilos

CXCL9/MIG – monocina induzida por IFN-γ (monokine induced by IFN-γ) CCR – receptor de quimiocina tipo CC

CSF – fluido cerebroespinhal (cerebrospinal fluid) CXCR – receptor de quimiocina tipo CXC

dpi – dias pós-infecção (days post-infection)

ELISA – Ensaio imuno-sorvente por enzima ligada (Enzyme-linked immunosorbent assay) EPM – erro padrão da média

GAG – glicosaminoglicanos

HE – coloração Hematoxilina-Eosina

ICAM – Molécula de adesão intercelular (Intercellular adhesion molecule) IFN-γ – Interferon gamma

Ig - imunoglobulina IL – interleucina i.p. – intraperitoneal i.v. – intravenoso Kg – kilograma

LPS – lipopolissacarídeo MC – malária cerebral

MHC – Complexo principal de histocompatibilidade (Major Histocompatibility Complex)

µL – microlitro NO – óxido nítrico

NK – célula Natural Killer nm – nanômetro

OMS – Organização Mundial de Saúde

PBS – salina tampão fosfato (Phosphate buffered saline)

PfEMP1 – proteína 1 de membrana do eritrócito do P. falciparum r.p.m. – rotações por minuto

Lista de Gráficos

Gráfico 1 – Média das parasitemias diárias de camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens, a partir do terceiro dia pós-infecção.. ... 40

Gráfico 2 – Curva de sobrevida de camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens... 43

Gráfico 3 – Determinação da variação da massa corporal (%) de animais BALB/c e C57Bl/6 jovens. ... 44

Gráfico 4 – Número de leucócitos em processo de rolamento e de adesão na microvasculatura da pia-máter de camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens. ... 52

Gráfico 5 – Número total de leucócitos no sangue periférico de camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens...53

Gráfico 6 – Níveis de azul de Evans extravasado para o parênquima cerebral em camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens...56

Gráfico 7 – Níveis da concentração da citocina TNF-α em sobrenadante de homogenato de cérebro e em soro de camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens...59

Lista de Figuras, Quadros e Tabelas

Figura 1 - Ciclo do Plasmodium... 8

Figura 2 - Mecanismo de recrutamento de leucócitos ... 17

Figura 3 - Interações das moléculas de quimiocinas com os diferentes receptores.. ... 21

Figura 4 - Foto do sistema de microscopia intravital. ... 32

Figura 5 - Fotomicrografias de esfregaços sangüíneos corados com Giemsa... 40

Figura 6 - Fotomicrografias do córtex cerebral de camundongos BALB/c e C57Bl/6 não-infectados... 45

Figura 7 - Fotomicrografias do córtex cerebral de camundongos C57Bl/6 infectados, eutanaziados no terceiro dia de infecção...46

Figura 8 - Fotomicrografias do córtex-cerebral de camundongos infectados, eutanaziados no sexto dia de infecção...47

Figura 9 - Fotomicrografias do córtex-cerebral de camundongos BALB/c infectados, eutanaziados no nono dia de infecção...48

Figura 10 – Micrografia de videomicroscopia intravital...50

Quadro 1 – Infecção por Plasmodium em diferentes linhagens de camundongos...13

Tabela 1 - Número percentual dos tipos celulares presentes no sangue periférico de camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens...54

1

1

1

1.1 - A situação da malária no mundo

A malária é a doença parasitária mais grave da humanidade, considerada uma doença negligenciada que permanece como grave problema de saúde pública, apesar dos esforços dispensados para seu controle. Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (WHO, 2006), em torno de 3,2 bilhões de pessoas vivem em áreas de transmissão da doença, compreendendo 107 países e territórios. Apresenta incidência anual de 350-500 milhões de casos, que resultam na morte de 1,5-2 milhões de pessoas. Os países da África Tropical respondem por mais de 90% dos casos clínicos de malária no mundo e pela maioria dos casos letais, sendo as crianças as principais vítimas. A prevalência restante está distribuída entre o Sudeste Asiático, Oceania e América Latina.

Na América Latina, o maior número de casos (99%) é verificado na Amazônia brasileira (incluindo os Estados do Amazonas, Pará, Acre, Roraima, Rondônia, Amapá, Mato Grosso, Tocantins e Maranhão), com uma incidência anual de 400-700 mil casos. Além disso, o grande fluxo migratório da região Amazônica para outros estados brasileiros tem levado ao surgimento de surtos de malária em áreas consideradas livres de transmissão da doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, BRASIL, 2005).

Apesar das campanhas mundiais de erradicação da malária iniciadas na década de 1960 e das intensas ações de controle atuais, a doença permanece afligindo as populações mais carentes. O desenvolvimento de resistência às drogas antimaláricas usuais, muitas vezes utilizadas indiscriminadamente, a dificuldade do controle eficiente do mosquito vetor, em decorrência das mudanças nos parâmetros ecológicos e ambientais, e o crescimento econômico limitado de muitos países têm justificado a incapacidade dos países em desenvolvimento, da faixa tropical, no controle da malária. Em adição, a doença contribui, significativamente, para a permanente estagnação econômica destes países (GOOD et al., 2005).

1.2 - A doença

A malária é uma doença causada pelo protozoário do gênero Plasmodium,

de vários mecanismos de escape do parasito à ação do sistema imunológico (GOOD et al., 2005). É naturalmente transmitido ao hospedeiro vertebrado através da picada da fêmea do mosquito Anopheles infectado, considerado o único vetor nos casos humanos. O principal vetor no Brasil, Anopheles darlingi, apresenta hábitos antropofílicos com atividade cíclica contínua durante toda à noite, com pico nos crepúsculos matutino e noturno (TADEI & THATCHER, 2000).

Durante o repasto sangüíneo, o mosquito vetor inocula esporozoítos na derme do hospedeiro, que inicia um processo de migração para o fígado. Esta forma infectante apresenta um comportamento de migração complexo e singular, muito estudado através de microscopia de epifluorescência associado à expressão de uma proteína fluorescente pelo parasito (NATARAJAN et al., 2001; FRANKE-FAYARD et al., 2004). Os esporozoítos apresentam na derme seu movimento, denominado gliding, de forma tortuosa e intensa. Esta motilidade exibida na derme difere do perfil manifestado in vitro, que ocorre em uma velocidade constante e de forma circular. Para abandonar o sítio de inoculação, os esporozoítos, como esperado, são capazes de invadir vasos sangüíneos através de uma interação direta com a parede do vaso. Adicionalmente, foi demonstrado que são capazes de invadir vasos linfáticos. A presença de esporozoítos no interior de vasos linfáticos foi confirmada por microscopia confocal após a injeção intradermal com formas marcadas. Esporozoítos drenados para vasos linfáticos podem eventualmente alcançar a corrente sangüínea e, posteriormente, o fígado, onde podem invadir as únicas células as quais podem desenvolver in vivo, isto é, os hepatócitos (AMINO et al., 2006).

sinusóides hepáticos (STURM et al., 2006). Desta forma, os merozoítos que chegam à circulação são capazes de invadir eritrócitos, iniciando a fase eritrocítica da infecção (Figura 1).

Figura 1- Ciclo do Plasmodium. Retirado de www.imm.ul.pt.

Os sintomas clínicos da malária são, primariamente, decorrentes da ruptura de eritrócitos parasitados, já que nesta etapa ocorre a liberação na circulação sangüínea de antígenos constituintes do parasito e os formados em conseqüência de seu metabolismo, que causam uma intensa ativação do sistema imune (DE SOUZA & RILEY, 2002). Adicionalmente, o parasito altera dramaticamente a fisiologia e processos bioquímicos dos eritrócitos, com alterações na permeabilidade da membrana do eritrócito infectado e aumento do consumo de glicose (KIRK, 2001). Vale ressaltar que a proporção significativa do ciclo de vida do Plasmodium ocorre dentro dos eritrócitos e, como estes não são contidos em um sítio tecidual específico, mecanismos imunes contra o parasito podem afetar vários órgãos (GOOD et al., 2005). O baço exerce um papel crucial na eliminação do parasito da circulação e proporciona uma forte resposta hematopoiética

Fase hepática

durante a infecção (ALVES et al., 1996). Outra manifestação clínica observada em indivíduos infectados é o quadro de anemia, que pode ser decorrente de um somatório de eventos responsáveis pelo seu desenvolvimento, entre eles o processo de destruição de eritrócitos durante a liberação do parasito, o aumento da eritrofagocitose esplênica e a deficiência do mecanismo de eritropoiese (CHANG & STEVENSON, 2004).

Dezenas de espécies de Plasmodium são capazes de infectar uma ampla faixa de espécies animais, como répteis, aves e mamíferos. Quatro espécies de Plasmodium são descritas como agentes causadores da doença em humanos: Plasmodium falciparum,

Plasmodium vivax, Plasmodium malariae e Plasmodium ovale, sendo a primeira mais virulenta e a principal causadora de morte. Nas infecções por P. vivax, P. malariae e P. ovale, predomina a forma não complicada da doença, caracterizada por febre intermitente, sudorese, mal estar, vômitos e intensa debilidade física. As infecções por

P. falciparum podem levar a forma complicada, denominada malária grave, considerada uma doença multissistêmica capaz de causar malária cerebral (MC), anemia grave, insuficiência renal aguda, edema pulmonar, hipoglicemia, colapso circulatório e acidose metabólica. Entretanto, é importante ressaltar que o curso clínico da doença depende de fatores associados tanto ao parasito quanto ao hospedeiro, além de questões geográficas e sociais (MILLER et al., 2002).

O grande número de óbitos se concentra em crianças africanas, especialmente aquelas que vivem em áreas rurais remotas, com difícil acesso aos serviços de saúde. As manifestações que predominam nesta faixa etária são, principalmente, a anemia grave e a MC, freqüentemente associadas à hipoglicemia (MARSH et al., 1996). Quando o diagnóstico da malária ocorre precocemente e o tratamento é instituído de forma correta, a doença costuma ter curso benigno e evoluir sem complicações. Entretanto, o tratamento retardado ou inadequado aumenta a tendência para evolução desfavorável da doença.

1.3 - Malária cerebral humana

A MC humana é a manifestação mais grave e principal causa de óbitos em crianças jovens (menores de cinco anos) e primíparas vivendo em área endêmica, formando os principais grupos de risco (MARSH et al., 1996). Esta síndrome apresenta uma patogênese complexa, sendo definida como um estado de coma, com exclusão de outras encefalopatias, associado às manifestações neurológicas resultantes do dano endotelial e seqüestro de eritrócitos parasitados na microcirculação cerebral. Alterações morfológicas, como ativação da micróglia, redistribuição de astrócitos, modificações na barreira hematoencefálica (BHE) e dano neuronal, já foram identificadas nos portadores da MC. Entretanto, o perfil da patologia não é uniforme entre os pacientes (TURNER, 1997). O curso desta síndrome não é obrigatoriamente letal, porém, os sobreviventes desta manifestação podem desenvolver danos neurológicos permanentes (MEDANA et al., 2002).

O seqüestro de eritrócitos é um mecanismo complexo que envolve interações entre antígenos polimórficos localizados na superfície de eritrócitos infectados com estágios maduros assexuados e receptores expressados nas células endoteliais do hospedeiro. Este mecanismo é importante para a sobrevivência do parasito, evitando sua destruição no baço, não obstante pode ter grave conseqüência para o hospedeiro (BERENDT et al., 1990).

O parasito se desenvolve no interior de eritrócitos, células que não expressam moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Entretanto, os eritrócitos parasitados com estágios maduros expõem, na sua superfície, antígenos produzidos pelo parasito (GOOD et al, 2005). A proteína 1 de membrana do eritrócito do

principal ligante envolvido no seqüestro nos capilares cerebrais. Um aumento da expressão deste receptor no endotélio cerebral resulta em citoaderência, cujos danos são responsáveis pelas complicações da MC (MILLER et al., 2002). Além de apresentarem um papel importante no mecanismo de interação eritrócito-endotélio, estudos em modelos experimentais de malária grave têm demonstrado que as moléculas de adesão também podem estar envolvidas nas interações leucócito-endotélio (GRAU & KOSSODO, 1994; SUN et al., 2003) e plaquetas-endotélio (CHANG et al., 2003; GRAU et al., 2003).

Existem duas grandes teorias para explicar a patogênese da MC humana. A teoria da obstrução mecânica, proposta por Marchiafava e Bignami há mais de cem anos e confirmada por numerosos estudos posteriores, sugere que a MC é uma conseqüência direta do seqüestro de eritrócitos, que acarreta na obstrução do fluxo cerebral e hipóxia cerebral (BERENDT et al., 1994). Por outro lado, a teoria da inflamação sugere que a MC é resultado de uma resposta imune exacerbada, na qual citocinas tipo Th1, especialmente TNF-α e IFN-γ, apresentam um papel central no processo (CLARK & ROCKETT, 1994). O mérito relativo destas duas teorias tem sido extensivamente debatido, com um consenso em considerar uma hipótese conciliatória (VAN DER HEYDE

et al., 2006).

Estudos recentes têm demonstrado o envolvimento de micropartículas como um elemento chave na patogênese da MC. Estas estruturas são produzidas através de remodelamento da membrana de diversos tipos celulares, especialmente plaquetas e leucócitos, tanto de forma constitutiva quanto induzida, durante uma condição inflamatória. A produção de citocinas, como TNF-α, induz a vesiculação e liberação contínua destas micropartículas, que mantém um ambiente inflamatório favorável ao agravamento da lesão endotelial, através de propriedades coagulantes e pró-inflamatórias destes elementos (COLTEL et al, 2006).

1.4 - Modelos experimentais de Malária Cerebral

Devido às dificuldades em acompanhar casos de MC humana e da limitada possibilidade de examinar os processos patológicos, alguns modelos experimentais de MC foram desenvolvidos. O modelo experimental utilizando roedores é bem caracterizado e útil para a pesquisa científica. Modelos murinos (Quadro 1) oferecem a oportunidade de desvendar mecanismos imunológicos que podem estar envolvidos na doença, uma vez que há similaridades entre a resposta imune e características patológicas da infecção em humanos e camundongos (LAMB et al., 2006).

A grande diversidade de linhagens de camundongos associada à infecção com diferentes espécies de Plasmodium tem contribuído para elucidar alguns aspectos envolvidos na patogênese da doença (DE SOUZA & RILEY, 2002).

Entretanto, a maioria dos estudos provém do modelo de infecção por P. berghei

ANKA, que apresenta uma divisão segura entre linhagens de camundongos resistentes (BALB/c e A/J) e susceptíveis (C57Bl/6 e CBA). Estudos demonstraram que camundongos geneticamente susceptíveis e infectados com a cepa ANKA podem apresentar angústia respiratória com acidose láctica, anemia e nefrite, indicando que os mesmos podem desenvolver manifestações clínicas semelhantes à malária por P. falciparum (VAN DER HEYDE et al., 2001). Estas linhagens também desenvolvem sinais neurológicos e sintomas típicos da MC (coma, paralisia e convulsão), assim como alterações morfológicas cerebrais, como ativação de células endoteliais e micróglia, identificadas em portadores desta manifestação (MEDANA et al., 1997a). Em contrapartida, as linhagens resistentes exibem uma resposta diferencial ao parasito, não desenvolvem MC e morrem, aproximadamente, 20 dias após a infecção devido à anemia grave e hiperparasitemia (KOSSODO & GRAU, 1993).

Parasito Cepa Linhagem do camundongo

Letalidade Uso experimental

P. chabaudi chabaudi AS CB CBA C57Bl/6 BALB/c 129sv A/J DBA/2 CBA C57Bl/6 Não letal Letal Mecanismo imune

Sinais clínicos associados à malária e seqüestro

Patogênese Quimioterapia Resistência e susceptibilidade

Mecanismo imune

P. chabaudi adami

C57Bl/6 BALB/c

Não letal Mecanismo imune

P. berghei ANKA

K173 C57Bl/6 BALB/c CBA C57Bl/6 BALB/c CBA DBA Letal Letal Patogênese

Malária cerebral experimental (MCE) Seqüestro

Controle para MCE e patogênese

P. yoelii 17XL

YM 17XNL C57Bl/6 BALB/c CBA DBA Swiss C57Bl/6 BALB/c CBA DBA C57Bl/6 BALB/c CBA DBA Letal Letal Não letal Mecanismo imune Patogênese Seqüestro

Malária cerebral experimental (MCE)

Vacina Patogênese Hipoglicemia Resposta imune Vacinação P. vinckei vinckei

BALB/c Letal Sinais clínicos associados a malária e seqüestro

Patogênese Quimioterapia P. vinckei

petteri

CR C57Bl/6

BALB/c

Não letal Mecanismos imunes

Entretanto, é importante ser cauteloso quando se relaciona o modelo animal à doença humana. A extrapolação dos resultados obtidos no modelo murino de MC deve ser realizada com cuidado, pois estes apresentam diferenças significativas. No modelo murino, o leucócito é o tipo celular predominantemente seqüestrado na microcirculação cerebral de camundongos, e não os eritrócitos, como na MC humana (ADAMS et al., 2000; NEILL & HUNT, 1992). Desta forma, muitos autores consideram que não existem modelos para a MC. Entretanto, a presença de monócitos no endotélio cerebral já foi comprovada, pelo menos, na MC pediátrica (GRAU & KOSSODO, 1994).

Uma vantagem do modelo experimental murino é a disponibilidade de diferentes ferramentas genéticas (animais knockout) e moleculares que facilitam a compreensão dos mecanismos envolvidos na patogênese. Desta forma, modelos de malária experimental podem providenciar informações valiosas sobre os mecanismos básicos envolvidos nos desenvolvimento da doença (HUNT & GRAU, 2003).

1.5 – Interações parasito-hospedeiro

As interações resultantes das características genéticas do parasito e do hospedeiro estão associadas à virulência da infecção, sendo esta definida como a severidade com que um agente infeccioso provoca lesões no hospedeiro. A especificidade desta interação fornece a base da dinâmica da infecção. Entretanto, a literatura ignora como a especificidade do genótipo do parasito ou da linhagem do hospedeiro participa na virulência e patogênese, enfatizando somente o papel de um destes componentes. Desta forma, alguns modelos assumem que uma determinada linhagem de um parasito apresenta fenótipo de virulência que é estável em amplo genótipo do hospedeiro. Porém, sabe-se que a virulência do parasito sofre variação em diferentes hospedeiros. Em alguns casos, algumas linhagens de patógenos podem causar mais danos, com efeitos mais pronunciados em certos genótipos de hospedeiro (GRECH et al, 2006).

Na malária, tem sido reconhecido que fatores do hospedeiro e do parasito podem afetar o curso da doença. Exemplos de fatores de resistência/susceptibilidade associados ao hospedeiro humano são: a anemia falciforme e alelos MHC particulares. Já alguns fenótipos produzidos pelo parasito, como a citoaderência e formação de rosetas, contribuem para a gravidade da doença (revisado por GRECH et al, 2006).

(15-20 semanas) apresentam reversão dos sintomas da MC (HEARN et al., 2000). Logo, a susceptibilidade pode estar também associada à idade dos animais utilizados no estudo.

Em síntese, podemos sugerir que o curso da infecção e o progresso da doença dependem da combinação dinâmica e específica das propriedades do hospedeiro e do parasito.

1.6 – Características do Plasmodium berghei

A espécie Plasmodium berghei é a mais utilizada nos estudos experimentais e pertence ao grupo das espécies de Plasmodium que infectam roedores murinos da África Central, juntamente com P. vinckei, P. chabaudi e P. yoelii. A espécie P. berghei foi isolada em 1948, por Vincke e Lips no Zaire, em glândulas salivares da espécie silvestre de Anopheles dureni. Posteriormente (1954), Vincke encontrou o parasito no sangue dos roedores silvestres Thamnomys surdaster, Praomys jacksoni e Leggada bella

(GARNHAN, 1966). Trabalhos recentes têm demonstrado a capacidade de Anopheles stephensi, Anopheles gambiae e Aedes aegypti atuarem como vetores de P. berghei

(ALAVI et al., 2004).

Uma cepa do parasito é considerada uma amostra retirada em uma única ocasião do seu hospedeiro natural e, também, pode ser referida como isolado. A cepa NK65 de

P. berghei foi isolada em 1964, em um exemplar de Anopheles dureni, enquantoa cepa ANKA foi isolada posteriormente, em 1966, na mesma espécie(KILLICK-KENDRICK,1978). A

cepa NK65 de P. berghei causa uma infecção fulminante com altas taxas de parasitemia que evolui rapidamente para um curso letal (YOSHIMOTO et al., 1998).

O ciclo de vida, bem como a morfologia dos estágios de desenvolvimento do parasito, está conservado nas diferentes espécies que infectam mamíferos. Algumas diferenças restritas ao tempo de desenvolvimento dos diferentes estágios do ciclo e outras relacionadas com a interação do parasito com seu hospedeiro foram identificadas (GARNHAN, 1966).

O P. berghei, no hospedeiro vertebrado, apresenta preferência em invadir reticulócitos, podendo também invadir eritrócitos maduros (DEHARO et al., 1996). Em geral,

simultaneamente, no sangue ao longo da infecção. Infecções múltiplas de eritrócitos são descritas, com poliparasitismo tão extensivo que a massa citoplasmática parece ser contínua, com aspecto de esquizonte maduro. A retenção de esquizontes maduros no baço e fígado é um evento comum e já relatado para esta espécie (LANDAU &BOULARD, 1978).

Nenhuma proteína de superfície de eritrócitos infectados, equivalente a membros da PfEMP, foi descrita em espécies de roedores, com os mecanismos do seqüestro ainda desconhecidos.

A imunidade para malária em uma diversidade de hospedeiros, inclusive humanos, é marcadamente dependente da espécie do parasito, linhagem e variante-específica. Em adição a fatores genéticos, fatores do hospedeiro como idade, via e dose de infecção, também influenciam o curso da infecção (BAKKERet al, 1992).

1.7 - Mediadores inflamatórios

O fator de necrose tumoral (TNF-α) induz, em humanos e camundongos, a superexpressão de moléculas de adesão endotelial que têm sido implicadas no seqüestro de células na microvasculatura cerebral e outros órgãos. Na resposta imune inflamatória, uma função do TNF-α é estimular o recrutamento de neutrófilos e monócitos para o sítio de infecção e induzir a expressão de outros mediadores inflamatórios, em uma cascata de eventos (BROWN et al., 1999). Porém, a produção excessiva desta citocina por monócitos/macrófagos desempenha um papel chave na patogênese da MC humana e MC experimental (GRAU et al., 1987).

O desenvolvimento de complicações na malária está diretamente relacionado à resposta imune do hospedeiro. Acredita-se que a susceptibilidade seja dependente das diferenças na sensibilidade das células endoteliais ao TNF-α, com evidências favoráveis de que esta é a citocina chave na patogênese da MC (LUCAS et al., 1997). Entretanto, outro estudo demonstrou que o TNF-α pode ter um papel na gravidade da doença, porém não está diretamente relacionada à MC (LOOAREESUWAN et al., 1999).

1.8 - Recrutamento celular

Sob condições normais, os leucócitos são mantidos no centro dos vasos sangüíneos, onde o fluxo é rápido. Durante uma resposta inflamatória, o aumento dos níveis de TNF-α estimula a expressão seqüencial de diferentes moléculas de adesão no endotélio, envolvidas no recrutamento de leucócitos do sangue para o espaço intersticial. É um processo multifásico, envolvendo uma seqüência de etapas controladas por moléculas de adesão, fatores de ativação e quimiocinas. As etapas da migração celular ocorrem geralmente nas vênulas pós-capilares e consistem de um contato inicial de leucócitos com a parede do vaso, rolamento destes ao longo do endotélio, seguido de uma adesão firme e migração transendotelial (Figura 2) (PICCIO et al., 2002). O termo recrutamento de leucócitos abrange todos os eventos que mobilizam a saída de leucócitos circulantes para o tecido inflamado.

Figura 2: Mecanismo de recrutamento de leucócitos.

respeito deste processo (LEY, 2001). Entretanto, deve-se salientar que a primeira descrição do recrutamento de leucócitos durante o processo inflamatório, através de microscopia intravital, foi realizada há mais de um século por Cohnheim (citado por KUBES & KERFOOT, 2001).

O mecanismo de rolamento é mediado por uma família de moléculas de adesão, glicoproteínas conhecidas como seletinas (P-seletina, E-seletina e L-seletina), que promovem uma fraca ligação inicial dos leucócitos às vênulas nos sítios de inflamação (KERFOOT & KUBES, 2002). Em presença do fluxo sangüíneo, após um primeiro contato com a parede do vaso, os leucócitos diminuem sua velocidade e começam a rolar ao longo da superfície endotelial, o que favorece as interações entre leucócitos e endotélio (KUBES & KERFOOT, 2001). Posteriormente, os leucócitos podem ser ativados através de mudança conformacional de integrinas, moléculas presentes em sua superfície celular, (CD11/CD18, VLA-2, VLA-4, α4β7, α3β1) e, conseqüentemente, podem aderir de forma estável ao endotélio via membros da superfamília das imunoglobulinas (ICAM, VCAM, PECAM, MAdCAM) (KERFOOT & KUBES, 2002; KUBES, 2002).

A última etapa é a migração dos leucócitos através de espaços inter-endoteliais para o tecido extravascular, o que requer uma reorganização do citoesqueleto, com formação e retração de pseudópodes. Moléculas presentes em junções intercelulares do endotélio, como PECAM-1 (CD31), também estão envolvidas na migração. Uma vez no tecido conectivo, os leucócitos aderem a matriz extracelular via integrinas β1 e CD44 (KERFOOT & KUBES, 2002; KUBES, 2002).

O recrutamento de leucócitos também envolve a participação das quimiocinas, que agem sobre a expressão de moléculas de adesão e estão envolvidas na migração dirigida das células através de um gradiente de concentração (ONO et al, 2003).

1.9 - Quimiocinas

metástase tumoral, cicatrização e secreção de mediadores inflamatórios, como citocinas, radicais livres e óxido nítrico (D’AMBROSIO et al., 2003).

A classificação das quimiocinas é baseada no número e disposição de resíduos de aminoácidos entre os resíduos de cisteína conservados na cadeia N-terminal da molécula. Desta forma, as famílias foram agrupadas em C, CC, CXC e CX3C e seus receptores XCR, CCR, CXCR e CX3CR (BIBER et al., 2002). As quimiocinas que pertencem ao grupo CC são caracterizadas por duas cisteínas adjacentes; as do grupo CXC ou CX3C apresentam um e três aminoácidos entre as cisteínas, respectivamente, enquanto que as XC apresentam apenas um resíduo de cisteína (BANISOR et al., 2005). Os pares receptor-ligante das quimiocinas não apresentam especificidade absoluta, demonstrando uma alta redundância neste sistema (Figura 3). Por exemplo, o receptor CCR1 pode interagir com múltiplas quimiocinas (CCL3, CCL5, CCL7 e CCL8) (ONO

et al., 2003).

A estrutura dos receptores baseia-se em uma cadeia polipeptídica, composta por aproximadamente 350 aminoácidos, com sete domínios transmembrana que sinalizam através de uma proteína G acoplada. A interação entre uma quimiocina e seu receptor é iniciada pela ativação da proteína G, que induz um influxo de Ca++, efetivo para estimulação de outras quimiocinas e ampliação da resposta inflamatória (ONO et al., 2003). A ativação de vias de sinalização intracelulares culmina no rearranjo de filamentos de actina, modificação da forma e movimentação da célula (BAGGIOLINI, 1998).

Além da interação com seus receptores, as quimiocinas também podem se ligar a glicosaminoglicanos (GAGs) de superfície celular do endotélio vascular e da matriz extracelular (KUSCHERT et al., 1999). Tem sido sugerido que esta interação seja capaz de inibir a difusão das quimiocinas localmente produzidas e, conseqüentemente, promover a formação de um gradiente de concentração, por imobilização dessas quimiocinas, que favorece a migração celular (KUSCHERT et al., 1999; PROUDFOOT, 2006).

1994), que são as primeiras células a chegarem em grande número aos locais de infecção (ONO et al., 2003). Entre as que não possuem o motivo ERL, destacam-se IP-10/CXCL10 e MIG/CXCL9, ambas induzidas por IFN-γ, que apresentam atividade em outras populações celulares. Em humanos, MIG/CXCL9 tem sido associada com infiltrado de células T em doenças inflamatórias no SNC, como na esclerose múltipla (SIMPSON et al., 2000).

A família das quimiocinas CC é a mais diversa e numerosa, apresentando moléculas de expressão constitutiva e induzida. Os membros da família CC incluem MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4 e RANTES/CCL5, que atraem e ativam monócitos, linfócitos T, basófilos e eosinófilos que são recrutados tardiamente para os sítio de infecção (ONO et al., 2003).

Trabalhos anteriores mostraram a expressão de algumas quimiocinas (MIP-1α/CCL3 e IL-8/CXCL8) no soro de pacientes portadores de malária aguda (BURGMANN et al., 1995). Um estudo comparativo da produção de citocinas e quimiocinas em modelos experimentais de MC induzida por P. berghei ANKA demonstrou um aumento na expressão localizada das quimiocinas IP-10/CXCL10, MCP-1/CCL2, RANTES/CCL5 em tecido cerebral de camundongos infectados (HANUM et al, 2003).

As células residentes do SNC, como astrócitos, oligodendrócitos, micróglia e neurônios, quando induzidas por um estímulo inflamatório são capazes de expressar receptores funcionais de quimiocinas (BIBER et al., 2002).

Figura 3: Interações das moléculas de quimiocinas com os diferentes tipos de receptores. Extraído de Rot & von Andrian, 2004.

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As dificuldades na definição de mecanismos patogênicos em humanos por razões éticas e as similaridades entre vias de resposta imune em camundongos e humanos justificam o uso do modelo murino de MC. Modelos experimentais utilizando camundongos são versáteis e permitem a análise completa de interações moleculares e celulares. Estudos detalhados da progressão da infecção ajudam a esclarecer informações relevantes da seqüência de eventos que levam ao quadro de malária grave.

Devido às diferenças significativas entre o modelo animal e a doença humana, muitos autores consideram que não existem modelos apropriados para a MC. Entretanto, estudos recentes indicam um acúmulo significativo de plaquetas e leucócitos na MC humana, que têm favorecido a comparação dos achados da infecção de camundongos com P. berghei com a infecção humana.

A maioria dos estudos de imunopatogênese da malária grave provém do modelo de infecção por P. berghei ANKA, com uma definição segura de resistência e susceptibilidade entre linhagens de camundongos. Entretanto, é reconhecido o envolvimento de polimorfismo de cepas do parasito na determinação da resposta imunológica e na patogênese da infecção. Outra característica que deve ser levada em consideração é a presença de múltiplas vias de progressão da doença. Logo, o estudo em modelos murinos não deve se deter em apenas um único modelo já definido, o que pode limitar a compreensão dos mecanismos envolvidos na MC.

Neste estudo avaliamos a resposta inflamatória cerebral da infecção experimental por P. berghei cepa NK65 em camundongos jovens das linhagens BALB/c e C57Bl/6, que apresentam perfis de resistência e de susceptibilidade bem determinados para a infecção por P. berghei ANKA.

Desta forma, buscou-se associar estudos de microscopia intravital com parâmetros histopatológicos e perfil de quimiocinas em camundongos jovens infectados com P. berghei NK65 para a compreensão de fatores determinantes da resposta inflamatória na MC. A escassez de estudos que empregam a técnica de microscopia intravital no cérebro para estudar recrutamento celular e de dados sobre o perfil de quimiocinas no tecido cerebral, torna o trabalho original, com informações que vão além das já descritas na literatura.

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3.1 - Objetivo geral

Caracterizar a infecção por P. berghei cepa NK65 em linhagens de camundongos BALB/c e C57Bl/6 jovens, avaliando suas implicações inflamatórias no Sistema Nervoso Central.

3.2 - Objetivos específicos

3.2.1 - Avaliar parasitemia e parâmetros clínicos da malária em camundongos BALB/c e C57Bl/6 infectados com P. berghei cepa NK65.

3.2.2 - Determinar as alterações histopatológicas cerebrais nos camundongos BALB/c e C57Bl/6 ao longo da infecção por P. berghei cepaNK65.

3.2.3 - Avaliar in vivo os processos de rolamento e adesão de leucócitos no endotélio vascular da pia-máter nos camundongos infectados através da técnica de microscopia intravital.

3.2.4 - Quantificar o número total e diferencial de leucócitos presentes no sangue periférico dos animais controle e infectados.

3.2.5 - Verificar as possíveis alterações na permeabilidade vascular da BHE acarretadas pela infecção.

3.2.6 - Quantificar a concentração das citocinas TNF-α e IFN-γ e das quimiocinas murinas Kc/CXCL8, MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5 no tecido cerebral e no soro do modelo de malária experimental induzida por P. berghei

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4.1 - Animais

Camundongos das linhagens BALB/c e C57Bl/6, fêmeas, jovens, com idade de seis semanas, obtidos no Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (CEBIO-ICB-UFMG) foram utilizados neste estudo. Os animais foram mantidos com água e ração ad libitum. Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA), protocolo número 005/05.

4.2 - Parasito e infecção dos animais

A cepa NK65 de P. berghei foi isolada na África em 1964, em um exemplar de

Anopheles dureni e vem sendo conservada como um isolado desde então (KILLICK -KENDRICK,1978). Uma amostra foi cedida pela Dra. Luzia Helena Carvalho do Laboratório

de Malária do Centro de Pesquisa René Rachou FIOCRUZ/MG e vem sendo mantida no laboratório de Malária do Departamento de Parasitologia da Universidade Federal de Minas Gerais desde o ano de 2000. O parasito é criopreservado e para a infecção, uma amostra foi estavelmente descongelada e inoculada em animal para uma primeira passagem que serviu de fonte dos parasitos.

Os camundongos foram infectados intra-peritonealmente (i.p.) com inóculo padronizado de 106 hemácias parasitadas em solução tampão fosfato estéril (PBS) para garantir um grau de infecção uniforme nos diferentes grupos (GRAU et al., 1986).

4.3 - Determinação da parasitemia

parasitemia foi estimada em 1000 eritrócitos contados. A contagem foi realizada em campos adjacentes para evitar variações intensas.

O eritrócito contendo dois ou mais parasitos foi considerado como um eritrócito parasitado. A parasitemia foi expressa em percentagem:

% parasitemia = número de eritrócitos parasitados X 100 1000

Um acompanhamento da variação de peso dos animais foi realizado ao longo da infecção, juntamente com observações qualitativas de manifestações clínicas nos animais. Os animais que sobreviveram ao longo da realização de todas as etapas dos experimentos foram adicionados à curva de sobrevida.

4.4 - Histologia

Para avaliar a cinética das alterações histopatológicas cerebrais pós-infecção, 40 animais de cada linhagem foram utilizados. Em cada grupo, três animais foram retirados e utilizados como controles (sem infecção). O restante, isto é 37 animais de cada linhagem, foram infectados com o P. berghei NK65 e a partir desta data, três camundongos foram sacrificados diariamente, o que permitiu um acompanhamento das mudanças patológicas acarretadas pela infecção. Este acompanhamento foi realizado até o nono dpi para os animais da linhagem BALB/c e sétimo dpi para animais C57Bl/6, em virtude da mortalidade de alguns animais ao longo do tempo.

4.4.1 - Fixação do tecido e recorte dos órgãos

Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical. Durante a necropsia, o cérebro foi coletado e fixado por imersão em solução de formol tamponado a 4%, pH 7.2, com o objetivo de preservar a morfologia e a composição do tecido. Após o período de fixação, os tecidos foram recortados e seccionados transversalmente. A cada animal foi dado um código que apenas foi revelado ao final de todas as análises.

4.4.2 - Desidratação, diafanização e inclusão em parafina

Os tecidos foram submetidos à desidratação em concentrações crescentes de álcool (70%, 80%, 90% e absoluto) sendo que os fragmentos permaneceram imersos por um período de 30 minutos em cada álcool.

Após a etapa de desidratação, foi realizado o processo de diafanização, que tem como objetivo tornar o tecido translúcido. A diafanização consistiu em submeter os fragmentos a dois banhos de xilol com duração de 20 minutos cada. Posteriormente, os tecidos foram impregnados e incluídos em parafina.

4.4.3 - Microtomia

Os blocos de parafina, contendo o fragmento do órgão, foram submetidos à microtomia, sendo obtidos dois cortes seriados com 4 micrômetros de espessura. Cada corte foi colocado em banho-maria para que as fitas fossem esticadas e logo depois as lâminas foram colocadas na estufa para secarem a temperatura de 60o C.

4.4.4 - Coloração

4.4.4.1 - Hematoxilina-Eosina

A coloração de rotina HE (Hematoxilina-Eosina) foi realizada nas lâminas com cortes do tecido cerebral para uma observação geral das alterações histopatológicas.

absoluto rapidamente e levadas à estufa a 60o C por alguns minutos para secagem. Depois de secas, as lâminas foram imersas em xilol e montadas com Entellan (Merck) e lamínula.

4.4.4.2 – Cresil Violeta

Em adição a coloração Hematoxilina-Eosina, foi realizada a coloração pelo método do Cresil Violeta no tecido cerebral, o qual permite a identificação do dano neuronal, além das observações histopatológicas gerais. Para a realização desta coloração, as lâminas foram desparafinizadas e hidratadas assim como na coloração pela HE. Depois foram coradas pelo Cresil Violeta por 10 minutos e diferenciadas em solução tampão ácido acético/acetato, por tempo variável (observação visual) até a descoloração parcial das estruturas. Em seguida as lâminas foram colocadas na estufa a 60OC para secagem. A montagem das lâminas foi realizada com Entellan e lamínula.

4.4.5 - Análise Histopatológica

4.5 - Microscopia intravital

Animais controle, não-infectados, (n=7) e animais com cinco dias de infecção (n=7) de cada grupo foram submetidos à técnica da microscopia intravital, para visualização da microvasculatura cerebral.

Figura 4- Foto do sistema de microscopia intravital.

formada uma janela para visualização dos vasos sangüíneos da pia-máter. Este procedimento não rompe a barreira vascular cerebral. A superfície cerebral dos animais foi continuamente superfundida com uma solução de fluido cerebroespinhal (CSF) artificial (composição iônica em mmol/L: NaCl 132, KCl 2.95, CaCl2 1.71, MgCl2 0.64,

NaHCO3 24.6, dextrose 3,71 e uréia 6.7) à temperatura de 37ºC, pH 7,35, que mantém a

preparação estável, sem evidência de inflamação no nível basal (CARVALHO-TAVARES

et al., 2000).

Um microscópio (Olympus BX40), com objetiva 10X, foi utilizado para observar os eventos microcirculatórios nos vasos cerebrais. Após a localização dos vasos a serem estudados, injetou-se intravenosamente (i.v.) uma pequena quantidade (0,5mg/kg) do corante rodamina 6G. A fluorescência associada à rodamina 6G foi visualizada com epi-iluminação a 510-560 nm, usando um filtro de emissão de 590 nm. Uma câmera de vídeo (Optronics) projetou as imagens que foram gravadas em vídeo-cassete (VHS, Semp Toshiba, modelo x685) para posterior análise. O número de leucócitos em rolamento e adesão foi determinado através da análise dos vídeos, em uma área determinada (100µm). O rolamento de leucócitos é definido como células movendo a uma velocidade menor que o fluxo sangüíneo. Os leucócitos são considerados aderidos quando permanecem estacionários ao endotélio por um período de 30 segundos. O rolamento, por ser um processo dinâmico, foi expresso como número de células /minuto. A adesão leucocitária foi expressa como células aderidas ao endotélio vascular (em 100µm de comprimento do vaso).

4.6 – Contagem total e diferencial de leucócitos

Para a contagem total de leucócitos, 5µl do sangue de cada animal foi coletado e diluído em 95µl de solução de Turk. Após homogenização, 10µl da solução foi colocada em câmera de Neubauer para a contagem total das células. A contagem foi realizada em microscópio óptico, em aumento de 10X. O valor encontrado foi multiplicado pela diluição e o fator de correção da câmera de Neubauer.

A contagem diferencial de leucócitos foi realizada em esfregaços sangüíneos corados com May-Gruwald e Giemsa, o que permite a identificação dos tipos celulares presentes no sangue periférico dos animais infectados e controles. Os esfregaços sangüíneos, devidamente identificados, foram examinados ao microscópio óptico (aumento 1000X - imersão). A contagem percentual dos diferentes tipos celulares foi estimada em 100 células, com auxílio de um contador diferencial.

Para o cálculo do número diferencial dos tipos celulares presentes no sangue periférico foi utilizada a seguinte regra:

nº diferencial = nº total de leucócitos x nº percentual 100

4.7 - Avaliação da permeabilidade vascular

Para a avaliação da permeabilidade da BHE, utilizou-se o corante azul de Evans como um marcador do extravasamento de albumina, como descrito previamente por Belayev et al., (1996), em protocolo modificado. O método consiste na determinação espectrofotométrica da quantidade de azul de Evans extravasado para o parênquima cerebral.

4.8 - Medida dos níveis de citocinas e quimiocinas no soro e cérebro por ELISA

4.8.1 - Preparo de homogenato de cérebro de camundongo

Os cérebros de oito animais não-infectados (controle) e de dez animais com cinco dias de infecção foram retirados, devidamente acondicionados e, quando necessário, estocados a -200C. As amostras foram posteriormente pesadas (100 mg) e colocadas em 1 mL de solução inibidora de protease, adequada para extração de citocinas [NaCl 0,4 M; Tween 20 0,05%; Albumina de soro bovino (BSA) 0,5%; Fluoreto de fenilmetilsufonila (PMSF) 0,1mM; cloreto de benzetônio 0,1 mM; EDTA 10 mM; 20 UI de aprotinina], preparada a partir de uma solução de tampão fosfato (NaCl 8 g, KCl 0,2 g e Na2HPO4.12H2O 2,89 g diluídos em 1 litro). As amostras foram

maceradas por um homogenizador de tecidos (Ultra-Turrax) e o homogenato foi centrifugado a 10000 r.p.m./10 min, a 40C. O sobrenadante foi recolhido, aliquotado e estocado a –200C até o uso (DOS SANTOS et al., 2005).

4.8.2 - Obtenção de soro de camundongos

Após anestesia, oito camundongos infectados (5dpi) e sete animais controle de cada linhagem sofreram exsanguinação através do plexo retro-orbital, e o sangue foi coletado em tubos individuais. Para obtenção do soro, as amostras foram mantidas durante uma hora em temperatura ambiente e uma hora a 40C. Posteriormente, o material foi centrifugado a 3000 r.p.m./10 min e o soro foi recuperado e estocado a – 200C até o uso.

4.8.3 - Determinação de citocinas por ELISA

TNF-α e IFN-γ e das quimiocinas MCP-1/CCL2, Kc/CXCL8, RANTES/CCL5, MIG/CXCL9 e MIP-1α/CCL3 foram avaliadas no sobrenadante de homogenato de cérebro em diluição 1:3 em PBS contendo 0,1% de soro albumina bovina (BSA). Adicionalmente, a concentração sistêmica de TNF-α foi avaliada no soro dos animais em um protocolo semelhante (diluição 1:3 em PBS/BSA 0,1%).

Em placas de 96 poços (Nunc. Immunosorb, Naperville), foram adicionados 100 µl/poço do anticorpo de captura, sendo este específico para cada molécula e em concentração adequada. Esta solução permaneceu em contato com a placa durante 18 h a 4oC e foi, posteriormente, lavada cinco vezes com PBS/Tween 0,1%, utilizando um lavador de placas automático (ELX50, Bio-Tet Instruments, INC). Logo após, foram adicionados 200 µl/poço de solução de bloqueio (PBS/BSA 1%). O tempo de bloqueio foi de duas horas sob agitação. Transcorrido este tempo, houve nova lavagem das placas e 100 µl de cada amostra foram adicionados à placa. Paralelamente, para o estabelecimento de cada curva padrão, foram utilizadas diferentes diluições das quimiocinas, a partir das seguintes concentrações iniciais: TNF-α, 2000 pg/mL; IFN-γ, 2000 pg/mL; Kc/CXCL8, 1000pg/mL; MCP-1/CCL2, 500pg/mL; RANTES/CCL5, 2000pg/mL; MIG/CXCL9, 1000 pg/mL; MIP-1α/CCL3, 1000 pg/mL. As placas foram incubadas por mais 18 h a 4oC. As placas foram lavadas e foram adicionados 100 µl/poço de solução de anticorpo de detecção, biotinilado e específico para cada molécula. As placas foram incubadas por uma hora e foram lavadas em seguida. Transcorrida esta etapa, foram adicionadas a cada placa uma solução contendo estreptavidina ligada à peroxidase (HRP, Pharmingen). Após 30 minutos, a placa foi novamente lavada, a continuação foi adicionado o tampão substrato contendo o-fenilenodiamina (OPD, Sigma) e H2O2 (Merck). Após cerca de 30 minutos, a reação foi

interrompida com 50 µl de ácido sulfúrico (H2SO4) 1M. O produto da oxidação do OPD

foi detectado por colorimetria em leitor de placas a 492 nm (Molecular Devices, USA). A concentração referente a cada amostra foi calculada a partir da curva padrão correspondente.

4.9 - Análise estatística

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5.1 - Evolução da parasitemia

O curso da infecção foi monitorado diariamente e a evolução da parasitemia foi acompanhada através de esfregaços sangüíneos, a partir do terceiro dia pós-infecção. A observação microscópica dos esfregaços sangüíneos confirmou a infecção em todos os animais que desenvolveram aumento gradual de parasitemia (Gráfico 1), demonstrando uma alta capacidade de multiplicação do parasito. Os animais C57Bl/6 tiveram a parasitemia avaliada até sétimo dia pós-infecção, devido à morte precoce destes. Esta linhagem, ainda, desenvolveu uma parasitemia menor quando comparado com os animais BALB/c. Através de análise estatística, verificamos que esta evolução foi significativamente diferente ao longo do tempo (p<0.0001) e, entre as linhagens no sexto dia pós-infecção (p<0.01).

Diferentes formas evolutivas de P. berghei NK65 foram visualizadas nos esfregaços sangüíneos analisados. Trofozoítos jovens e maduros e esquizontes foram detectados no esfregaço. Também foram verificadas, nos esfregaços sangüíneos, anormalidades morfológicas envolvendo a membrana celular dos eritrócitos (Figura 5).

Gráfico 1 – Média das parasitemias diárias de camundongos BALB/c e C57Bl/6, a partir do terceiro dia pós-infecção, infectados com P. berghei NK65 com um inóculo padronizado de 106 hemácias parasitadas pela via intraperitoneal. A parasitemia foi avaliada através de esfregaços sangüíneos sob microscopia óptica (aumento 1000X - imersão). Os dados foram analisados pelo teste Two-way ANOVA, onde ** (p<0.01) e *** (p<0,0001) indicam diferenças significativas entre os níveis de parasitemia entre as linhagens, tanto no sexto dia pós-infecção quanto ao longo do curso da infecção (n=10 para cada grupo). O experimento foi repetido e confirmado. † representa a morte dos animais.

3 4 5 6 7 8

0 10 20 30 40 50 60 70

BALB/c C57Bl/6

**

***

†

Dias após a infecção

P

a

ra

s

it

e

m

ia

(

%

Figura 5- Fotomicrografias de esfregaços sangüíneos corados com Giemsa, X1000. A- Parasitemia leve, com 3% de hemácias parasitadas, B- Parasitemia moderada, com 35% de hemácias parasitadas e C- Parasitemia acentuada, com 66% de hemácias parasitadas, estas apresentando deformidades estruturais.

A

B

5.2 - Mortalidade

A infecção por P. berghei cepa NK65 desenvolveu-se de forma aguda com curso letal para as duas linhagens. A mortalidade foi expressa como percentagem de sobrevida e apresentou um perfil diferente para as duas linhagens (Gráfico 2). A mortalidade dos animais da linhagem BALB/c iniciou-se no sétimo dia e perdurou até o décimo primeiro, com um pico no oitavo dia pós-infecção. Os animais C57Bl/6 apresentaram uma letalidade precoce, com intervalo de confiança (95%) nos dias seis e sete pós-infecção. Houve diferenças significativas na sobrevida em relação ao tempo (p<0.0001) e entre as linhagens (p<0.001).

5.3 - Sinais clínicos

A análise de variação da massa corporal dos animais de cada linhagem foi mensurada em animais controle e infectados, ao longo do tempo (Gráfico 3). Os animais infectados apresentaram uma perda de massa acentuada ao longo da infecção, sendo compatíveis com as altas parasitemias e com a mortalidade dos animais. Animais controle da linhagem BALB/c apresentaram um aumento gradual da massa ao longo das observações. Já os animais infectados desta linhagem, no sexto dia pós-infecção, apresentaram uma queda expressiva da massa (-10,99 ± 1,99 %), um quadro que persiste no oitavo dia (-24,11 ± 0,60 %) (Gráfico 3-A). Para a linhagem C57Bl/6 foi encontrado um perfil semelhante após a infecção. Os animais controle C57Bl/6 mantiveram o peso ao longo das observações, enquanto animais infectados apresentaram uma perda da massa no sexto dia pós-infecção (-13,26 ± 2,38 %), que também persistiu no oitavo dia (-14,69 ± 12,16 %) (Gráfico 3-B).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0

20 40 60 80 100

BALB/c C57Bl/6

***

Dias após a infecção

S

o

b

re

v

id

a

(

%

)

4 d 6 d 8 d 4 dpi 6 dpi 8 dpi -30 -20 -10 0 10

Controle

Infectado

BALB/c

4 d 6 d 8 d 4 dpi 6 dpi 8 dpi

-30 -25 -20 -15 -10 -5 0 5

Controle

Infectado

C57Bl/6

Gráfico 3- Variação da massa corporal (%) de animais BALB/c (A) e C57Bl/6 (B) infectados com Plasmodium berghei NK65, inóculo padronizado de 106 hemácias parasitadas pela via intraperitoneal, em relação aos controles não-infectados.(n=10 para o grupo infectado de cada linhagem e n=5 para o grupo controle).

A