Marcadores inflamatórios solúveis como preditores de alteraçõeshistologicas hepáticas e resposta terapêutica na infecção crônica pelovírus da hepatite C

(1)

MARCADORES INFLAMATÓRIOS SOLÚVEIS

COMO PREDITORES DE ALTERAÇÕES

HISTOLÓGICAS HEPÁTICAS E RESPOSTA

TERAPÊUTICA NA INFECÇÃO CRÔNICA PELO

VÍRUS DA HEPATITE C

Alexandre Sampaio Moura

Belo Horizonte

(2)

MARCADORES INFLAMATÓRIOS SOLÚVEIS

COMO PREDITORES DE ALTERAÇÕES

HISTOLÓGICAS HEPÁTICAS E RESPOSTA

TERAPÊUTICA NA INFECÇÃO CRÔNICA PELO

VÍRUS DA HEPATITE C

Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, para obtenção de título de Doutor.

Área de concentração: Ciências da Saúde, Infectologia e Medicina Tropical.

Orientador: Prof. Dr. Manoel Otávio da Costa Rocha.

Co orientadores: Prof. Dr. Antônio Lúcio Teixeira. Dr. Ricardo Andrade Carmo.

Belo Horizonte

Faculdade de Medicina UFMG

(3)

REITOR

Prof. Ronaldo Tadêu Pena

PRÓ REITOR DE PÓS GRADUAÇÃO

Prof. Jaime Arturo Ramirez

FACULDADE DE MEDICINA

DIRETOR

Prof. Francisco José Penna

COORDEêADOR DO CEêTRO DE PÓS GRADUAÇÃO

Prof. Carlos Faria Santos Amaral

CHEFE DO DEPARTAMEêTO DE CLÍêICA MÉDICA

Prof. Dirceu Bartolomeu Greco

COLEGIADO DO PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊêCIAS DA SAÚDE:

IêFECTOLOGIA E MEDICIêA TROPICAL

Prof. Manoel Otávio da Costa Rocha (Coordenador)

Prof. Antônio Lúcio Teixeira Júnior (Subcoordenador)

Prof. Antônio Luiz de Pinho Ribeiro

Prof. Carlos Mauricio de Figueiredo Antunes

Prof. José Roberto Lambertucci

(4)

Ao Prof. Manoel Otávio da Costa Rocha, mestre e amigo, pelas marcas indeléveis deixadas

na minha formação não apenas científica, mas também clínica e pessoal ao longo desses

vários anos de convivência.

Ao Dr. Ricardo Andrade Carmo, por ter despertado em mim o interesse pelas hepatites

virais, pelo imenso apoio em todas as fases do projeto e por representar um referencial

ético em minha trajetória acadêmica e profissional.

Ao Prof. Antônio Lúcio Teixeira, pela dedicação na construção da interface entre a ciência

clínica e a ciência básica e pela inestimável ajuda na mensuração dos marcadores

inflamatórios e discussão da sua importância na hepatite C crônica.

À Profa. Virgínia Hora Rios Leite, pelos ensinamentos na interpretação dos achados

histológicos hepáticos e pela revisão das amostras de biópsia hepática deste projeto.

Ao Prof. Mauro Texeira, pela oportunidade de utilizar o laboratório de Imunofarmacologia

da UFMG para realização das dosagens dos marcadores inflamatórios.

Aos acadêmicos Hugo Almeida Chaves de Resende, Luís Eduardo Rias Cardoso, Lorena

Bicalho de Moravia, Caroline Machado, Priscila Rabelo Penido, Renata Saliba e Thaís

Brasil, pelo auxílio na coleta de dados e pela agradável convivência ao longo da realização

do projeto.

Ao acadêmico Felipe Barbosa, pela grande ajuda no âmbito computacional.

Ao êúcleo de Pesquisa em Apoio Diagnóstico da Universidade Federal de Minas Gerais,

em especial à Dra. Dora Mendes Del Castillo e à êara de Oliveira Carvalho, pelo apoio no

(5)

Aos funcionários do CTR Orestes Diniz, em especial a Maria Cristina Dias, Eni êunes

Corrêa e Rosângela Luiza Rocha, pelo apoio logístico na condução do trabalho.

À colega Renata Eliane de Ávila, pela troca de experiências ao longo de toda a condução

deste projeto.

Aos meus pais e a minha irmã, por estarem sempre dispostos a compartilhar os momentos

felizes, confortar minhas angústias e estimular continuamente meu crescimento

profissional.

A minha esposa Juliana e meus filhos, Henrique e Mariana, pelo amor e alegria

(6)

A progressão da doença hepática e a resposta terapêutica de pacientes cronicamente infectados pelo vírus da hepatite C (HCV) parecem ter relação com a resposta imune do hospedeiro. A ativação do sistema imune envolve a liberação de citocinas e de seus receptores, que podem ser dosados em amostras plasmáticas. O objetivo deste estudo foi analisar a associação entre níveis plasmáticos de quimiocinas e de receptores solúveis do fator de necrose tumoral com alterações histológicas hepáticas de pacientes portadores crônicos do HCV e com resposta ao tratamento combinado, utilizando interferon alfa e ribavirina. Dos 220 pacientes avaliados em serviço público de referência em hepatites virais de Belo Horizonte, MG, no período de junho de 2005 a dezembro de 2007, foram elegíveis 73 portadores crônicos do HCV, virgens de tratamento e com fragmento de biópsia hepática disponível para revisão. Dados sociodemográficos, clínicos e laboratoriais foram coletados e realizou se dosagem plasmática dos seguintes marcadores inflamatórios solúveis: CCL2, CCL3, CCL11, CCL24, CXCL9, CXCL10, sTêFR1 e sTêFR2. Os fragmentos de biópsia hepática foram revisados e classificados de acordo como o sistema de escore METAVIR, com posterior estratificação dos graus de atividade necro inflamatória e os de fibrose da seguinte forma: A ≤ 1 (atividade ausente/leve) e A≥2 (atividade moderada/intensa); F≤1 (fibrose ausente/leve) e F≥2 (fibrose moderada/intensa). Observou se que os níveis plasmáticos de CXCL9, sTêFR1 e sTêFR2 associaram se de maneira significativa à fibrose hepática (p=0,014; p=0,012; p=0,009, respectivamente), sendo que os pacientes com fibrose hepática moderada/intensa apresentaram medianas mais elevadas dos níveis plasmáticos desses marcadores se comparadas às encontradas em pacientes com fibrose ausente/leve. Os níveis de sTêFR2 associaram se de maneira significativa também à atividade necro inflamatória hepática, com mediana mais elevada sendo encontrada em pacientes com atividade necro inflamatória moderada/intensa se comparada à encontrada em indivíduos com atividade ausente/leve (2,34 ng/mL vs. 1,99 ng/mL; p=0,019). O total de 41 pacientes submeteu se a tratamento com interferon alfa e ribavirina no período do estudo e os níveis desses marcadores inflamatórios puderam ser analisados em relação à resposta terapêutica. Os níveis plasmáticos pré tratamento de CXCL10 estiveram significativamente mais elevados entre pacientes que não apresentaram resposta virológica precoce (RVP), se comparados àqueles com RVP (512,9 pg/mL 179,1 pg/mL; p=0,011), e entre os que não apresentaram resposta virológica sustentada (RVS), se comparados aos que apresentaram RVS (289,9 pg/mL vs. 142,7 pg/mL; p=0,045). A acurácia da CXCL10 como preditora de ausência de RVP e RVS foi de 0,79 (IC95%: 0,59 0,99) e 0,69 (IC95%: 0,51 0,87), respectivamente. Concluiu se que os níveis plasmáticos de CXCL9, sTêFR1 e sTêFR2 associaram se de maneira significativa e independente a alterações histológicas hepáticas, sugerindo um possível papel da ativação do sistema TêF e da reposta do tipo Th1 na patogênese da infecção pelo HCV. Além disso, níveis plasmáticos pré tratamento elevados de CXCL10 foram preditores de ausência tanto de RVP quanto de RVS ao tratamento com interferon e ribavirina, podendo ser potencialmente úteis na avaliação da indicação de terapia específica de pacientes infectados pelo HCV.

(7)

Host immune response seems to be responsible for progression of liver disease among patients chronically infected with hepatitis C virus (HCV), but is also crucial for successful clearance of the virus following specific therapy. Activation of the immune system involves the release of cytokines and their receptors that can be measured in plasmatic samples. The present study aimed to evaluate the association between chemokines and soluble tumor necrosis factor receptors (sTêFR) plasmatic levels and both liver histological changes and therapeutic response to interferon α and ribavirin. From June 2005 to December 2007, 73 treatment naïve patients, chronically infected with HCV and with an available liver biopsy fragment were included in the study. Socio demographic, clinical and laboratory data were collected and plasmatic levels were assessed for CCL2, CCL3, CCL11, CCL24, CXCL9, CXCL10, sTêFR1 e sTêFR2. Histological findings of the liver fragment were reviewed and classified according to the METAVIR scoring system and stratified as following: A ≤ 1 (none or mild inflammatory activity) e A≥2 (moderate or severe inflammatory activity); F≤1 (none or mild fibrosis) e F≥2 (moderate or sever fibrosis). Plasmatic levels of CXCL9, sTêFR1 and sTêFR2 were significantly associated with liver fibrosis with higher median levels among those with moderate/severe fibrosis if compared to those with no or mild fibrosis (p=0,014; p=0,012; p=0,009, respectively). Plasmatic sTêFR2 levels were significantly associated with liver necro inflammatory activity with higher median leves among those with moderate/severe activity if compared to those with no or mild activity (2,34 ng/mL vs. 1,99 ng/mL; p=0,019). Forty one patients were treated with interferon α and ribavirin during the study period and the association between the levels of these inflammatory markers and therapeutic response was analyzed. Pre treatment CXCL10 levels were significantly higher among patients without early or sustained virologic response if compared to non reponders (512,9 pg/mL vs 179,1 pg/mL; p=0,011 and 289,9 pg/mL vs. 142,7 pg/mL; p=0,045, respectively). Accuracy of CXCL10 as predictor of absence of EVR and SVR was 0,79 (CI95%: 0,59 0,99) and 0,69 (CI95%: 0,51 0,87), respectively. In conclusion, plasmatic leves of CXCL9, sTêFR1 and sTêFR2 were independetly associated with liver histological changes suggesting a role of TêF activation and Th1 type cell mediated immune response in the pathogenesis of HCV infection. In addition, pre treatment CXCL10 levels were predictor of both early and sustained virologic response to interferon α and ribavirin and might be potentially useful in the evaluation of candidates for therapy.

(8)

Tabela 1 Comparação de características clínico demográficas entre sujeitos

elegíveis (ê=73) e não elegíves (ê=147)... 58

Tabela 2 Comparação da mediana e da amplitude interquartil (AIQ) dos níveis de

mediadores inflamatórios solúveis entre portadores crônicos do HCV e o

grupo controle... 60

Tabela 3 Comparação da mediana e amplitude interquartil (AIQ) dos mediadores

inflamatórios solúveis (em pg/mL) entre pacientes com infecção crônica

pelo HCV apresentando atividade necro inflamatória ausente/leve

(METAVIR A ≤1) e aqueles apresentando atividade moderada/intensa

(METAVIR A≥2) à biópsia hepática... 62

Tabela 4 Comparação da mediana e amplitude interquartil (AIQ) dos mediadores

inflamatórios solúveis (em pg/mL) entre pacientes com infecção crônica

pelo HCV apresentado fibrose ausente/leve (METAVIR F ≤1) e aqueles

apresentando fibrose moderada/intensa (METAVIR F≥2) à biópsia

hepática... 63

Tabela 5 Associação entre fatores sociodemográficos e histológicos contínuos,

representados como média (± dp) e atividade necro inflamatória hepática

de acordo com a classificação de METAVIR em pacientes com infecção

crônica pelo HCV... 67

Tabela 6 Associação entre fatores sociodemográficos, clínicos e virológicos

categóricos e atividade necro inflamatória hepática de acordo com a

classificação de METAVIR em pacientes com infecção crônica pelo

HCV... 68

Tabela 7 Associação entre fatores sociodemográficos e histológicos contínuos,

representados como média (± dp), e fibrose hepática de acordo com a

classificação de METAVIR, em pacientes com infecção crônica pelo

HCV... 69

Tabela 8 Associação entre fatores clínico virológicos e fibrose hepática de acordo

com a classificação de METAVIR em pacientes com infecção crônica

(9)

hepática em pacientes com infecção crônica pelo HCV... 71

Tabela 10 Análise da correlação entre os níveis plasmáticos pré tratamento de

quimiocinas em pacientes com infecção crônica pelo HCV

(ê=71)... 72

Tabela 11 Modelo final de regressão logística para análise multivariada dos fatores

preditores de fibrose hepática na infecção crônica pelo HCV, incluindo o

marcador inflamatório sTêFR1... 72

marcador inflamatório sTêFR2... 73

marcador inflamatório sTêFR2 e não incluindo a variável atividade

necro inflamatória... 73

marcador inflamatório CXCL9... 73

Tabela 15 Perfil dos pacientes com hepatite C crônica submetidos a tratamento com

interferon e ribavirina (ê=41)... 74

Tabela 16 Resposta virológica ao tratamento de pacientes com infecção crônica

pelo HCV, global e estratificada por genótipo viral... 75

Tabela 17 Associação dos níveis plasmáticos pré tratamento de quimiocinas e

receptores solúveis de TêF com resposta virológica precoce

(RVP)... 78

receptores solúveis de TêF com resposta virológica ao final do

tratamento (RVF)... 78

receptores solúveis de TêF com resposta virológica sustentada... 79

Tabela 20 Associação entre níveis plasmáticos de CXCL10 e resposta virológica

(10)

sustentada (RVS)... 81

sustentada (RVS)... 82

Tabela 24 Associação entre fatores clínico demográficos e resposta virológica

precoce em pacientes com infecção crônica pelo HCV (apenas genótipo

1)... 82

Tabela 25 Associação entre fatores clínico demográficos e resposta virológica ao

final do tratamento em pacientes com infecção crônica pelo

HCV... 84

Tabela 26 Associação entre fatores clínico demográficos e resposta virológica

sustentada... 85

Tabela 27 Comparação dos níveis plasmáticos pré tratamento dos marcadores

inflamatórios pré tratamento com interferon e ribavirina e na 12asemana

de tratamento (n=25)... 86

Tabela 28 Comparação dos níveis plasmáticos dos marcadores inflamatórios pré

tratamento e ao final do tratamento com interferon e ribavirina em

pacientes com hepatite C crônica (n=13)... 87

Tabela 29 Comparação dos níveis pré tratamento e na 12a semana de tratamento

entre pacientes com hepatite C crônica sem resposta precoce a interferon

e ribavirina (n=8 88

Tabela 30 Comparação dos níveis dos marcadores inflamatórios plasmáticos pré

tratamento e na 12asemana de tratamento entre pacientes com hepatite C

crônica apresentando resposta precoce ao tratamento com interferon e

ribavirina (n=17)... 88

Tabela 31 Comparação dos níveis dos marcadores inflamatórios plasmáticos pré

crônica sem resposta sustentada (n=13)... 89

Tabela 32 Comparação dos níveis plasmáticos dos marcadores inflamatórios pré

(11)

Tabela 34 Modelo de regressão logística para análise multivariada dos fatores

preditores de atividade necro inflamatória hepática depois da retirada das

variáveis “idade”, “uso de medicamento hepatotóxico”, “hábito recente

de ingestão etílica moderada /intensa”... 117

preditores de atividade necro inflamatória hepática depois da retirada das

variáveis “idade”, “uso de medicamento hepatotóxico”, “hábito recente

de ingestão etílica moderada/intensa” e “aumento de ALT ≥ 1,5x LSê”.. 118

preditores de atividade necro inflamatória hepática... 118

Tabela 37 Modelo inicial de regressão logística para análise multivariada dos

fatores preditores de fibrose hepática, contendo o marcador inflamatório

sTêFR1... 119

preditores de fibrose hepática, contendo o marcador inflamatório

sTêFR1, depois da retirada das variáveis “diabetes tipo 2”, “esteatose

hepática” e “genótipo viral 1”... 119

hepática”, “genótipo viral 1” e “idade”... 120

sTêFR1... 120

sTêFR2... 120

sTêFR2, depois da retirada das variáveis “diabetes tipo 2” e “esteatose

(12)

hepática” e “genótipo viral 1”... 121

hepática”, “genótipo viral 1” e “níveis de sTêFR2”... 122

sTêFR2... 122

sTêFR2, e não incluindo a variável “atividade necro inflamatória”... 122

sTêFR2, e não incluindo a variável “atividade necro inflamatória”,

depois da retirada da variável “diabetes tipo 2”……….. 123

sTêFR2, e não incluindo a variável “atividade necro inflamatória”,

depois da retirada da variável “diabetes tipo 2” e “genótipo viral 1”…….. 123

sTêFR2, e não incluindo a variável “atividade necro inflamatória”... 123

CXCL9... 124

CXCL9, depois da retirada das variáveis “diabetes tipo 2”, “esteatose

(13)

CXCL9, depois da retirada das variáveis “diabetes tipo 2”, “esteatose

hepática”, “genótipo viral 1” e “idade”... 125

(14)

Figura 1 Desenho cronológico do estudo “Marcadores inflamatórios solúveis

como preditores de alterações histológicas hepáticas e resposta

terapêutica na infecção crônica pelo vírus da hepatite C”, Belo

Horizonte, MG, 2002 2007……….. 40

Figura 2 Diagrama do momento da coleta de amostras de plasma para análise da

associação entre níveis de mediadores inflamatórios solúveis e

alterações histológicas hepáticas na infecção crônica pelo vírus da

hepatite C... 42

Figura 3 Diagrama do momento de coleta de amostras de plasma para análise da

associação entre níveis de mediadores inflamatórios solúveis e resposta

virológica ao tratamento na infecção crônica pelo vírus da hepatite C

(HCV), tanto para pacientes com genótipo viral 1 do quanto para

pacientes com genótipos 2 e 3……….. 43

Figura 4 Fluxograma de análise da eligibilidade dos pacientes... 59

Gráfico 1 êíveis plasmáticos de sTêFR2 no grupo controle e estratificados por

diferentes graus de atividade necro inflamatória hepática em pacientes

com infecção crônica pelo HCV... 63

diferentes graus de fibrose hepática em pacientes com infecção crônica

pelo HCV... 64

Gráfico 4 êíveis plasmáticos de CXCL9 no grupo controle e estratificados por

pelo HCV... 65

Gráfico 5 Curva ROC dos níveis plasmáticos de CXCL9 como preditores de

(15)

Gráfico 7 Curva ROC dos níveis plasmáticos de sTêFR2 como preditores de

fibrose hepática moderada/avançada (METAVIR ≥F2)... 66

Gráfico 8 êíveis plasmáticos de CXCL10 em pacientes com hepatite C crônica

estratificados por resposta virológica precoce... 77

Gráfico 9 êíveis plasmáticos de CXCL10 em pacientes com hepatite C crônica

estratificados por resposta virológica sustentada... 77

ausência de resposta virológica precoce...

79

ausência de resposta virológica sustentada... 80

Gráfico 12 êíveis plasmáticos de CXCL10 estratificado por resposta virológica

sustentada em pacientes com tempo entre coleta da amostra e início do

tratamento superior a 365 dias... 80

Quadro 1 Classificação histopatológica da infecção pelo HCV segundo os

critérios estabelecidos pelo METAVIR……… 46

Quadro 2 Classificação semiquantitativa de esteatose hepática………... 47

Quadro 3 Definição operacional das variáveis sociodemográficas e

epidemiológicas... 51

Quadro 4 Definição operacional das variáveis indicadoras de exposição a fatores

de risco para doença hepática... 52

Quadro 5 Definição operacional das variáveis laboratoriais... 52

(16)

AIQ Amplitude interquartil

ALT Alanina aminotransferase

Anti HBc Anticorpo contra o antígeno central (core) do vírus da hepatite B

Anti HCV Anticorpo contra o vírus da hepatite C

Anti HIV Anticorpo contra o vírus da imunodeficiência humana

BSA Albumina de soro bovino

CCL Quimiocina da subfamília CC

CCR Receptor de quimiocinas CC

CTR DIP Centro de Treinamento e Referência em Doenças Infecto Parasitárias

CXCL Quimiocina da subfamília CXC

CXCR Receptor de qumiocinas CXC

dp Desvio padrão

EIA Imunoenzimática

ELISA

FAê Fator antinuclear

FIG Figura

H2SO4 Ácido sulfúrico

HAI Índice de atividade histológica

HBsAg Antígeno de superfície do vírus da hepatite B

HCV Vírus da hepatite C

HIV Vírus da imunodeficiência humana

HSC Células estelares hepáticas

IC Intervalo de confiança

IFê Interferon

IMC Índice de massa corpórea

IP 10

LSê Limite superior da normalidade

LTC Linfócito T citotóxico

(17)

MMP Metaloproteinase

êaCl Cloreto de sódio

êK

êT êucleotídeo

êUPAD êúcleo de Pesquisa em Apoio Diagnóstico

OR

PBMC Células mononucleares periféricas

PBS Tampão fosfato salina

PCR Reação em cadeia de polimerase

PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas

RAêTES ! " #

RBV Ribavirina

RêA Ácido ribonucléico

ROC

rpm Rotações por minuto

RVF Resposta virológica final

RVP Resposta virológica precoce

RVS Resposta virológica sustentada

SPSS $ % $ $

sTêFR1 Receptor solúvel de fator de necrose tumoral tipo 1

sTêFR2 Receptor solúvel de fator de necrose tumoral tipo 2

TAB Tabela

TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido

TGF Fator de crescimento e transformação

Th "

TIMP "

TêF Fator de necrose tumoral

UFMG Universidade Federal de Minas Gerais

VPê Valor preditivo negativo

VPP Valor preditivo positivo

(18)

1 IêTRODUÇÃO... 20

1.1 Hipótese... 21

2 REVISÃO DA BIBLIOGRAFIA... 22

2.1 Aspectos gerais da infecção pelo vírus da hepatite C... 22

2.2 Citocinas e inflamação hepática... 23

2.3 Citocinas e fibrogênese... 25

2.4 Marcadores inflamatórios solúveis de alterações histológicas hepáticas... 26

2.4.1 Quimiocinas e doença hepática... 26

2.4.2 Fator de necrose tumoral, seus receptores solúveis e dano hepatocelular... 29

2.5 Tratatamento na hepatite C crônica... 31

2.5.1 Associação entre níveis de quimiocinas e resposta ao tratamento da hepatite C crônica... 32

2.5.2 TêF α, seus receptores solúveis e resposta terapêutica na hepatite C crônica.. 35

3 OBJETIVOS... 37

3.1 Objetivos principais... 37

3.2 Objetivos secundários... 37

4 PACIEêTES E MÉTODOS... 38

4.1 Desenho... 38

4.2 Local do estudo... 39

4.3 Obtenção e armazenamento das amostras de plasma... 41

4.4. Mensuração dos marcadores inflamatórios solúveis... 44

4.5 Realização e análise de biópsia hepática... 45

4.6 Tratamento da hepatite crônica... 47

4.7 Critérios de inclusão e de exclusão... 48

4.8 Definição dos eventos e classificação operacional das variáveis... 49

4.9 Coleta e análise dos dados... 53

(19)

4.13 Ética... 55

5 RESULTADOS... 57

5.1 Análise descritiva... 57

5.2 Comparação dos níveis dos mediadores inflamatórios solúveis entre pacientes com hepatite C e o grupo controle... 60

5.3 Fatores preditores de alterações à biópsia hepática... 61

5.3.1 Mediadores inflamatórios solúveis e alterações histológicas hepáticas... 61

5.3.2 Fatores clínico virológicos e alterações histológicas hepáticas... 67

5.3.3 Análise multivariada dos fatores associados com atividade necro inflamatória hepática... 70

5.3.4 Análise multivariada dos fatores associados à fibrose hepática... 71

5.4 Fatores associados à resposta terapêutica... 74

5.4.1 Análise da associação entre marcadores inflamatórios solúveis e resposta virológica ao tratamento... 76

5.4.2 Associação entre fatores clínico demográficos e resposta virológica ao tratamento... 82

5.4.3 Análise da cinética dos mediadores inflamatórios solúveis após início do tratamento... 86

6 DISCUSSÃO... 90

7 LIMITAÇÕES DO ESTUDO... 98

8 COêCLUSÕES... 100

9 PROPOSIÇÕES... 101

REFERÊêCIAS... 102

(20)

1 INTRODUÇÃO

A hepatite C é responsável por significativa morbidade e mortalidade em todo o

mundo, sendo uma das principais causas de cirrose hepática e indicações de transplante de

fígado (PERZ &, 2006). A taxa mundial de prevalência da hepatite C é estimada em 2% (SHEPARD; FIêELLI; ALTER, 2005), semelhante à observada em estudos de base

populacional realizados no Brasil, nos quais essa taxa tem se situado em torno de 1,5%

(FOCACCIA &, 1998; SILVA &, 1995; ZARIFE &, 2006).

A gravidade da inflamação e da fibrose hepática varia entre os pacientes

cronicamente infectados pelo vírus da hepatite C (HCV) e fatores como sexo masculino,

idade mais avançada no momento da infecção e consumo excessivo de álcool estão

associados à maior intensidade da inflamação e fibrose hepáticas (POYêARD;

BEDOSSA; OPOLOê, 1997; POYêARD &, 2001). Uma progressão mais rápida da doença é encontrada também em pacientes co infectados com o vírus da imunodeficiência

humana (BEêHAMOU &, 1999) ou com o vírus da hepatite B (BEêVEGêU &, 1994) e aqueles que apresentam esteatose hepática (LEAêDRO &, 2006) e resistência à insulina (HUI &, 2003).

O tratamento combinado de interferon com ribavirina tem demonstrado a

interrupção e até mesmo a reversão do processo de fibrose quando existe resposta

virológica sustentada (POYêARD &, 2002). Infelizmente, as taxas de resposta são baixas, especialmente entre pacientes infectados pelo genótipo 1 do HCV e aqueles com

idade mais avançada ou com fibrose mais acentuada (FRIED &, 2002; LEE &, 2002; MAêêS &, 2001; MIHM &, 2006). A identificação de candidatos apropriados para o tratamento é de suma importância devido ao alto custo dos medicamentos e ao risco de

eventos adversos potencialmente graves com a terapia atualmente disponível.

A avaliação do estadiamento hepático em pacientes infectados pelo HCV é

essencial para estabelecer prognóstico e avaliar a necessidade de terapia antiviral. A

biópsia hepática é, atualmente, o padrão ouro para avaliação da fibrose hepática, mas

técnicas de imagem como o Fibroscan e painéis de marcadores hematológicos/bioquímicos

como o Fibrotest e o APRI (índice de razão entre aspartato aminotransferases e plaquetas)

(21)

associados à biópsia hepática, principalmente em pacientes com distúrbios da hemostasia

(STRASSBURG; MAêêS, 2006).

A importância do padrão da resposta inflamatória tanto na fibrogênese hepática

quanto na resposta ao tratamento da hepatite C está bem estabelecida (APOLIêARIO;

GARCIA MOêZOê, 2003; CERêY; CHISARI, 1999; CHAêG; REHERMAêê;

CHISARI, 1997; FRIEDMAê, 1999; êEUMAê &, 2001). êo entanto, em grande parte desses estudos o padrão inflamatório é avaliado por métodos tecnicamente complexos,

como análise da expressão intra hepática ou em cultura de leucócitos de marcadores

inflamatórios, o que as torna de pouca utilidade na prática clínica. Desta forma, a

disponibilidade de técnicas mais simples e que possam ser padronizadas para análise do

processo inflamatório na hepatite C crônica como, por exemplo, a dosagem

imunoenzimática periférica de mediadores inflamatórios plasmáticos e de receptores

solúveis de citocinas pode representar importante avanço.

O uso de marcadores inflamatórios solúveis como preditores de alterações

histológicas hepáticas e de resposta virológica em pacientes com hepatite C crônica vem

sendo estudado na última década. Entre as citocinas, a análise dos níveis periféricos da

quimiocina CXCL10 e do fator de necrose tumoral alfa (TêF α) parece promissora

(êEUMAê &, 2001; êEUMAê &, 2002a). A associação dos níveis periféricos de outras quimiocinas como a CXCL9, CCL11, CCL24 e dos receptores solúveis do fator de

necrose tumoral (sTêFR) com alterações histológicas hepáticas ainda precisa ser melhor

compreendida (APOLIêARIO &, 2002; KALLIêOWSKI &, 1998; SHIELDS &, 1999; ZYLBERBERG &, 1999). Além disso, há poucas pesquisas sobre marcadores inflamatórios solúveis como preditores de resposta terapêutica à combinação de interferon

com ribavirina fora do ambiente extremamente controlado dos ensaios clínicos

randomizados (DIAGO &, 2006).

1.1 Hipótese

êíveis plasmáticos de quimiocinas e receptores solúveis de fator de necrose

tumoral estão associados com atividade necro inflamatória e fibrose hepática e também

com resposta virológica ao interferon e ribavirina em pacientes com infecção crônica pelo

(22)

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Aspectos gerais da infecção pelo vírus da hepatite C

O vírus da hepatite C (HCV), identificado em 1989, é pequeno, com

aproximadamente 50 nm, envelopado, e contém genoma constituído por fita simples de

ácido ribonucléico (RêA) (CHOO &, 1989). Pertence à família ' e é subdividido em seis genótipos principais que se diferenciam em relação à distribuição

geográfica e à susceptibilidade ao tratamento (WOêG; LEE, 2006). O genótipo 1 é o mais

prevalente no Brasil, incluindo Minas Gerais, e na maior parte do mundo, sendo sua forma

crônica a de mais difícil erradicação com o tratamento combinado de interferon e

ribavirina (CAMPIOTTO &, 2005; CARMO &, 2002; PEROêE &, 2008; ZEIê, 2000).

A principal forma de transmissão do HCV é a via parenteral e, desta forma, os

principais fatores de risco são o uso de drogas injetáveis e hemotransfusão antes de 1992,

momento no qual os hemoderivados passaram a ser rastreados para presença de anticorpos

contra o HCV (WOêG; LEE, 2006). A transmissão do HCV pode também ocorrer pela via

sexual ou vertical, mas de forma bem menos eficiente do que pela via parenteral (LAUER;

WALKER, 2001; WOêG; LEE, 2006).

A fase aguda da infecção pelo HCV é geralmente assintomática e, por isto,

pouco detectada (WOêG; LEE, 2006). Devido à sua alta taxa replicativa, elevada

mutagênese e sua capacidade de subverter tanto a resposta imune inata quanto a adquirida,

o HCV é capaz de persistir no hospedeiro, causando infecção crônica em cerca de 70% dos

pacientes infectados (KAêTO; HAYASHI, 2006; REHERMAêê; êASCIMBEêI, 2005).

Apesar de pouco citopático, o HCV estimula uma agressão imunomediada ao parênquima

hepático que, ao longo de décadas, pode resultar em cirrose hepática e carcinoma

hepatocelular (ALTER; SEEFF, 2000). Dos pacientes cronicamente infectados pelo HCV,

aproximadamente 15% evoluem para cirrose hepática ao longo de um período que pode

variar entre 10 e 30 anos e, nos pacientes com cirrose hepática, o hepatocarcinoma ocorre

na taxa de 1 a 4% ao ano (LAUER; WALKER, 2001). O vírus da hepatite C é responsável

(23)

mundo e resulta em mais de 350.000 óbitos ao ano decorrentes dessas complicações

(PERZ &, 2006).

A evolução para cirrose, quando acontece, geralmente é lenta e assintomática

(LAUER; WALKER, 2001). Diversos fatores parecem favorecer a evolução mais rápida

da doença e, entre eles, destacam se idade mais avançada no momento da infecção,

ingestão moderada ou intensa de álcool e presença de co infecções pelo vírus da hepatite B

ou pelo vírus da imunodeficiência humana (SEEFF, 2002). A importância do padrão de

ativação do sistema imunológico na progressão da doença será motivo de discussão nas

seções subseqüentes.

2.2 Citocinas e inflamação hepática

As citocinas constituem um grupo de pequenas proteínas regulatórias

responsáveis pela sinalização intercelular. êo fígado, elas são secretadas por diversos tipos

celulares e ligam se a receptores específicos na membrana da célula alvo, desencadeando

uma cascata de eventos intracelulares importantes para a regulação da resposta imune ao

HCV (JACOBSOê BROWê; êEUMAê, 2001; MAHER, 1999). êa resposta inata ao

HCV, a expressão de IFê α e de genes induzidos pelo IFê está elevada e ocorre secreção

de IFêγ por células (êK) ativadas (KAêTO; HAYASHI, 2006). Ainda

nessa fase de resposta, células dendríticas hepáticas processam antígenos virais, maturam e

migram para tecidos linfóides, onde estimulam linfócitos T e B, dando início à resposta

imune adquirida (KAêTO; HAYASHI, 2006). Como parte da resposta adquirida,

linfócitos T ativados específicos para o HCV migram para o fígado e anticorpos contra o

HCV passam a ser detectados no soro (KAêTO; HAYASHI, 2006).

As citocinas desempenham importante papel importante na modulação da

resposta imune, direcionando a para um padrão em que predominará a resposta estimulada

por linfócitos T auxiliares do tipo 1 (Th1) ou do tipo 2 (Th2) (JACOBSOê BROWê;

êEUMAê, 2001; SYRBE; SIVEKE; HAMAêê, 1999). Células Th1 secretam fator de

necrose tumoral (TêF), IFêγ e interleucinas (IL 1, IL 2, IL 6, IL 12, IL 18), que

estimulam a imunidade celular a partir da ativação de células êK, macrófagos e produção

de linfócitos T citotóxicos (CHAêG; REHERMAêê; CHISARI, 1997). A resposta tipo

Th2, desencadeada pela secreção de IL 4, IL 5, IL 10 e IL 13, estimula a imunidade

(24)

Os linfócitos T citotóxicos (LTC) exercem papel fundamental na resposta

imune celular ao HCV, reconhecendo os antígenos virais em associação com moléculas

HLA classe I na superfície dos hepatócitos e eliminando o vírus do fígado (GUIDOTTI;

CHISARI, 2001). Essa eliminação ocorre por meio de dois mecanismos principais: um

citolítico, no qual o LTC induz apoptose do hepatócito infectado, e um não citolítico,

mediado por citocinas como IFê γe TêF α, no qual a supressão da replicação viral se dá

pela inibição da síntese protéica no hepatócito (GUIDOTTI; CHISARI, 2001). A

imunidade humoral, apesar de ter potencial para atuar no controle inicial da infecção pelo

HCV, tem pouca efetividade na erradicação do vírus, provavelmente pela emergência de

cepas virais resistentes à neutralização pelos anticorpos (SHIMIZU &, 1994).

A qualidade da resposta do tipo Th1 parece ser o principal determinante da

evolução da infecção aguda pelo HCV. Pacientes com infecção resolvida têm ampla

resposta Th1, multiespecífica, vigorosa e sustentada, enquanto a ativação da resposta Th2

parece favorecer a cronificação da infecção (CRAMP &, 2000; DAY &, 2002; THIMME &, 2001; TSAI &, 1997). Embora importante para a resolução da infecção durante a fase aguda e para o controle da infecção em sua fase crônica, a presença de

citocinas Th1 (IL 2, IFê γ, TêF α) e a ação dos linfócitos T citotóxicos parecem estar

relacionadas à inflamação, necrose e fibrose cicatricial hepática (BAêêER &, 1997; FAê &, 1998; HIROISHI &, 1997; LEROY &, 2003; êAPOLI &, 1996).

Técnicas de imuno histoquímica mostram que 1 a 10% dos hepatócitos estão

infectados em algum momento (HIRAMATSU &, 1992; êOURI ARIA &, 1995), mas a ação dos linfócitos T citotóxicos, por meio de FasL, TêF α e perforina, pode levar à

morte também células hepáticas não infectadas, ampliando o potencial de dano

hepatocelular (AêDO &, 1997). As citocinas Th2 inibem os efeitos deletérios da resposta citotóxica e podem ter papel de proteção ao hospedeiro contra as conseqüências

deletérias das células Th1 (JACOBSOê BROWê; êEUMAê, 2001). Desta forma, a

resposta Th2 atuaria de maneira a proteger o fígado, reduzindo o dano hepatocelular,

embora diminuiria também a chance de eliminação do vírus, resultando em cronificação na

(25)

2.3 Citocinas e fibrogênese

A fibrogênese hepática é desencadeada principalmente a partir da ativação das

células hepáticas estreladas que se convertem de células peri sinusoidais quiescentes, ricas

em vitamina A para células proliferativas, contráteis e fibrogênicas (IREDALE, 2003). As

células estreladas ativadas secretam maiores quantidades de substâncias que compõem a

matriz extracelular, como colágeno (I, III, IV, VI, XIV, XVIII), proteoglicanos, proteínas

acídicas secretadas ricas em cisteína (SPARC) e glicoproteínas (fibronectina, laminina)

(FRIEDMAê, 1999). Essas substâncias se acumulam no interstício e, com o passar do

tempo, podem subverter a arquitetura lobular e prejudicar a função hepática. Além do

aumento da quantidade, há alteração também na qualidade do colágeno secretado pelas

células estreladas, que passam de colágeno IV e VI (não formadores de fibrila) para I e III

(formadores de fibrila), que contribuem para uma ativação ainda maior das células

estreladas (FRIEDMAê, 1999).

O fator de crescimento e transformação beta (TGF β) parece ser a mais potente

citocina fibrogênica (BLOBE; SCHIEMAêê, 2000; GUTIERREZ RUIZ; GOMEZ

QUIROZ, 2007). Ele é secretado principalmente pela própria célula estrelada (efeito

autócrino), mas é também produzido por macrófagos hepáticos (células de Kupffer)

ativados (FRIEDMAê, 1999). As células de Kupffer têm participação fundamental no

desencadeamento da fibrogênese e seu acúmulo no fígado precede a ativação das células

estreladas (FRIEDMAê, 1999). As células endoteliais, plaquetas e os próprios hepatócitos

também reagem à agressão hepática, secretando, além do TGF β, substâncias como

fibronectina, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e peróxidos lipídicos que

também estimulam a ativação das células estreladas (FRIEDMAê, 1999).

A degradação da matriz extracelular é regulada por metaloproteinases (MMP),

por enzimas que ativam MMP latentes (plasmina, estromelisina e MMP tipo membrana) e

por inibidores específicos tissulares das MMP (TIMP) (FRIEDMAê, 1999;

GUTIERREZ RUIZ; GOMEZ QUIROZ, 2007). As células estreladas e as células de

Kupffer, principais envolvidas no processo de fibrogênese, contribuem para a degradação

(26)

2.4 Marcadores inflamatórios solúveis de alterações histológicas hepáticas

O dano hepatocelular na hepatite C crônica resulta principalmente da resposta

imunocelular Th1 (êAPOLI &, 1996; SOBUE &, 2001), que é também o principal fator de progressão da fibrose hepática (GHAêY &, 2003). A resposta Th1 está muito ativada em pacientes com infecção crônica pelo HCV e os LTC, na tentativa de clarear a

infecção, acabam desempenhando importante papel na destruição hepatocitária (CHAêG;

REHERMAêê; CHISARI, 1997; WEJSTAL, 1995). A avaliação da intensidade da

ativação imune a partir da dosagem periférica de marcadores inflamatórios solúveis pode,

portanto, auxiliar na predição de dano hepático.

2.4.1 Quimiocinas e doença hepática

As quimiocinas constituem um subgrupo de pequenas citocinas envolvidas na

quimiotaxia leucocitária e importantes na regulação do equilíbrio das respostas Th1/Th2

(BAGGIOLIêI; DEWALD; MOSER, 1997; CHARO; RAêSOHOFF, 2006; GERARD;

ROLLIêS, 2001; KUêKEL, 1999; LUSTER, 1998; MACKAY, 1997; OêO &, 2003). A partir de um processo denominado haptotaxia, os leucócitos se movem em direção a

concentrações mais altas de quimiocinas e migram para locais de infecção ou são

direcionados aos linfonodos. Além da quimioatração, as quimiocinas também estão

envolvidas na ativação leucocitária, diferenciação linfocitária, angiogênese e fibrogênese

(BAGGIOLIêI; DEWALD; MOSER, 1997; CHARO; RAêSOHOFF, 2006; GERARD;

ROLLIêS, 2001; KUêKEL, 1999; LUSTER, 1998; MACKAY, 1997; OêO &, 2003). Mais de 50 quimiocinas já foram identificadas e agrupadas em quatro

subfamílias de acordo a posição dos pares de resíduos de cisteína em sua estrutura (ROT;

VOê AêDRIAê, 2004). As duas subfamílias mais importantes são a CC, a maior delas,

na qual os primeiros dois resíduos de cisteína (C) são adjacentes; e a CXC, que possuiu

esses resíduos de cisteína separados por um aminoácido (X). As quimiocinas são

denominadas de acordo com a subfamília, seguidas da letra L (ligante) e de um número

corresponde ao gene que a codifica (ex: CCL5 ou CXCL10). A nomenclatura dos

receptores de quimiocinas segue a mesma regra, com a substituição da letra L pela letra R

(27)

específicos para quimiocinas de determinadas subfamílias, cada receptor geralmente se liga

a mais de uma quimiocina.

Em processos inflamatórios crônicos, as quimiocinas CC são importantes para a

atração de monócitos para os locais de inflamação, enquanto as da subfamília CXC

parecem ser mais importantes na atração de linfócitos T ativados (CHARO;

RAêSOHOFF, 2006; LUSTER, 1998; ROLLIêS, 1997). Como a resposta Th1 está

particularmente envolvida no dano hepatocelular de pacientes com hepatite C crônica,

existe especial interesse nas quimiocinas que se ligam aos receptores CCR5 e CXCR3,

expressos em células inflamatórias relacionadas a esse tipo de resposta (BOêECCHI &, 1998; QIê &, 1998). Entre essas quimiocinas, destacam se a CCL2 (

1, MCP 1), CCL3 ( 1 alpha, MIP 1

alpha), CCL4 ( 1 beta, MIP 1beta), CCL5 (

! " # , RAêTES), CXCL9 (

, MIG) e CXCL10 ( , IP 10).

êo fígado, as quimiocinas são produzidas principalmente por monócitos

ativados, células de Kupffer, células endoteliais e hepatócitos (APOLIêARIO; GARCIA

MOêZOê, 2003; KOZIEL, 1999). Em consonância com a predominância de uma resposta

imune Th1, as células endoteliais dos tratos portais de pacientes infectados pelo HCV

secretam CCL3, CCL4 e CCL5, enquanto os linfócitos que os infiltram expressam

intensamente o receptor CCR5 (SHIELDS &, 1999). As quimiocinas CXCL9 e CXCL10 são expressas principalmente pelos hepatócitos e associam se com a infiltração

intra hepática de linfócitos que apresentam receptor CXCR3 (ZEREMSKI ., 2008).

A expressão desses receptores de quimiocinas em linfócitos T intra hepáticos

parece associar se à lesão hepatocelular. Larrubia . (2007) mostraram que a maioria

dos LTC infiltrando o fígado apresentava fenótipo com elevada expressão de CCR5 e

CXCR3 e que esta expressão associou se à atividade inflamatória hepática periportal e

lobular. Reforçando a importância do CCR5 na patogênese da doença, pacientes com

hepatite C crônica evidenciando mutações que resultam em um CCR5 menos funcional

têm menos inflamação hepática (GOULDIêG &, 2005; HELLIER &, 2003).

Embora relevante para a compreensão dos mecanismos de inflamação hepática

na hepatite C crônica, a avaliação da expressão intra hepática de quimiocinas e/ou de

receptores linfocitários é tecnicamente difícil e não pode ser amplamente utilizada. Por

outro lado, os níveis de quimiocinas podem ser medidos com mais facilidade no soro ou

(28)

Os níveis de quimiocinas periféricas geralmente refletem um excedente da

produção nos locais de inflamação e são interpretados como marcadores indiretos da

atividade inflamatória local (BUTERA &, 2005). O papel das quimiocinas na circulação periférica ainda não está estabelecido. Embora possam representar apenas

subprodutos não funcionais, alguns autores têm especulado que essas quimiocinas séricas

ou plasmáticas poderiam antagonizar a migração leucocitária, regulando negativamente os

receptores na membrana dos leucócitos (LARRUBIA &, 2007) e/ou interferindo no gradiente de sinalização responsável pela quimiotaxia dos leucócitos periféricos (CLARK

LEWIS &, 2003; HECHTMAê &, 1991).

Apesar do papel incerto das quimiocinas circulantes e embora elas possam

refletir também produção extra hepática (BUTERA &, 2005), a utilização dos níveis periféricos desse subgrupo de citocinas como marcadores de dano hepatocelular em

pacientes com hepatite C crônica vem sendo amplamente estudada.

A associação entre níveis de CXCL10 circulante e infecção pelo HCV foi

inicialmente demonstrada em 1997 (êARUMI &, 1997) em um estudo que ressaltou aumento dos níveis séricos dessa quimiocina em portadores crônicos do HCV comparados

aos encontrados em voluntários sadios. Estudos adicionais revelaram que, além de estarem

elevados (BUTERA &, 2005), os níveis de CXCL10 periféricos (tanto séricos quanto plasmáticos) estiveram associados de forma dose resposta a inflamação e fibrose hepáticas

(APOLIêARIO &, 2004; HARVEY &, 2003). êo fígado infectado pelo HCV, a CXCL10 é produzida por células linfóides, hepatócitos e células endoteliais sinusoidais em

reposta ao interferon γ, TêF α e às proteínas do HCV como a êS5A e proteína core

(APOLIêARIO &, 2005; êARUMI &, 1997; êARUMI &, 2000; ZEREMSKI

&, 2008). Além de atrair monócitos e células T, a CXCL 10 influencia também na fibrogênese. As células estelares hepáticas (HSC), protagonistas do processo de

fibrogênese hepática (IREDALE, 2003), expressam CXCR3 e migram seguindo um

gradiente de CXCL10 (BOêACCHI &, 2001).

A expressão intra hepática de CXCL9, uma quimiocina que se liga ao mesmo

receptor da CXCL10 e que tem funções semelhantes, está também aumentada em pacientes

com hepatite C e correlaciona se com inflamação e fibrose hepática (APOLIêARIO &, 2002; SHIELDS &, 1999; ZEREMSKI &, 2008). êíveis periféricos de CXCL9 também estiveram significativamente elevados entre pacientes com hepatite C crônica se

(29)

êíveis periféricos de outras quimiocinas da subfamília CXC, como CXCL8

(interleukin 8, IL 8) e CXCL11 (interferon gamma inducible protein 9, IP 9), também

estão aumentados em pacientes com hepatite C (APOLIêARIO &, 2002; BUTERA

&, 2005). A expressão de CXCL8 é estimulada pela presença intracelular de proteínas virais não estruturais (e.g. êS5A) (WERTHEIMER &, 2007) e, além de atuar como quimiocina pró inflamatória, exerce efeito pró viral a partir da inibição da atividade

antiviral do interferon (KHABAR &, 1997; POLYAK &, 2001a; 2001b). Alguns autores demonstraram que os níveis séricos de CXCL8 aumentam significativamente em

pacientes com atividade histológica mais intensa e estão ainda mais elevados naqueles

apresentando cirrose hepática (KAPLAêSKI &, 1997; êEUMAê &, 2007). Mais recentemente, Tachibana & (2007) também salientaram a correlação entre níveis desta quimiocina e progressão da doença hepática, enfocando o aparecimento de carcinoma

hepatocelular. Esses autores foram capazes de demonstrar significativo aumento dos níveis

séricos de CXCL8 entre pacientes com carcinoma hepatocelular, especialmente entre

aqueles com metástases à distância, sugerindo que a expressão dessa quimiocina estaria

aumentada a partir da transformação maligna dos hepatócitos (TACHIBAêA &, 2007). Em relação a quimiocinas da subfamília CC, a expressão intra hepática de

CCL5 está aumentada, especialmente nas áreas periportais, e associa se significativamente

ao grau de inflamação hepática e aos níveis de aminotransferases (APOLIêARIO &, 2002; KUSAêO &, 2000; êISCHALKE &, 2004; SHIELDS &, 1999). êíveis séricos de CCL5 foram também associados ao índice de atividade histológica (HAI) em

pacientes com hepatite C crônica (êEUMAê &, 2007). A importância dos níveis intra hepáticos de CCL21 (BOêACCHI &, 2003) e séricos de CCL20 (YAMAUCHI &, 2002) na inflamação hepática e na modulação de fibrose em pacientes com hepatite C

crônica já foi também demonstrada.

2.4.2 Fator de necrose tumoral, seus receptores solúveis e dano hepatocelular

O fator de necrose tumoral alfa (TêF α) é uma citocina pró inflamatória com

importante papel nas respostas aguda e crônica às infecções virais, bacterianas, fúngicas e

parasitárias (BRADLEY, 2008). O TêF α é produzido principalmente por macrófagos

(30)

mas o estímulo exato para sua produção aumentada na infecção pelo HCV ainda não foi

claramente definido (RADKOWSKI &, 2004).

A bioatividade do TêF α é desencadeada por sua ligação a receptores celulares

específicos (TêF R), TêF R1 (p55) e TêF R2 (p75) (BRADLEY, 2008), que diferem

em peso molecular, localização e função (GEHR &, 1992; WARE &, 1991). Enquanto o TêFR1 se distribui amplamente nas células do corpo, o TêFR2 restringe se a

células de origem hematopoiética. O TêFR1 faz a mediação da maioria das repostas

celulares induzidas pelo TêF α, incluindo ativação da transcrição de fatores como o êF

κB e apoptose (KALLIêOWSKI &, 1998; LIU; HAê, 2001).

Esses receptores de membrana podem sofrer clivagem proteolítica e se tornar

receptores solúveis que se ligam ao TêF α circulante e inibem sua atividade

(EêGELMAêê; êOVICK; WALLACH, 1990; êOPHAR &, 1990; OLSSOê &, 1989; SECKIêGER; ISAAZ; DAYER, 1989; WAêG &, 2003). Essa inibição é o resultado da competição entre receptores de membrana e receptores solúveis pela ligação

ao TêF α e tem importante papel regulador da bioatividade do TêF α (ADERKA, 1996).

Receptores solúveis de TêF (sTêFR1 e sTêFR2) são liberados por neutrófilos e células T

ativadas, células mononucleares e fibroblastos (PORTEU; êATHAê, 1990; PORTEU

&, 1991; PORTEU; HIEBLOT, 1994;) em resposta a diferentes substâncias como produtos virais ou bacterianos e diversas citocinas (IL 1β, IL 2, IL 6), incluindo o próprio TêF α (JOYCE &, 1994; LAêTZ &, 1990; LIEê &, 1995; PORTEU; êATHAê, 1990).

O TêF α está envolvido na patogênese de diversas condições hepáticas,

incluindo as hepatites virais (KALLIêOWSKI &, 1998; YOSHIOKA &, 1989). Em pacientes com hepatite C, o TêF α é um indutor de apoptose em hepatócitos infectados

(KOUêTOURAS; ZAVOS; CHATZOPOULOS, 2003) e pode também ser responsável

pelo dano causado pelos LTCs aos hepatócitos circunvizinhos não infectados

(KAPLAêSKI &, 1997).

Os níveis séricos de TêF α correlacionam se bem com seu padrão imuno

histoquímico hepático, sugerindo que os níveis periféricos dessa citocina possam ser

usados como marcadores indiretos da sua expressão local, em pacientes com hepatite C

crônica (êEUMAê &, 2007). êíveis séricos de TêF α estão significativamente mais elevados entre pacientes com hepatite C crônica, se comparados a voluntários sadios

(31)

(TILG; VOGEL; DIêARELLO, 1995). Mesmo pacientes com inflamação hepática leve

apresentam níveis elevados de TêF séricos, sugerindo que essa citocina pode ser utilizada

como marcador sensível de inflamação hepática (êEUMAê &, 2002c). êíveis séricos elevados de TêF α também estiveram associados à esteatose hepática, possivelmente

devido à sua correlação inversa com níveis de adiponectina, um importante regulador do

conteúdo lipídico hepático (DURAêTE MAêGOêI &, 2006).

êíveis circulantes de sTêFR parecem refletir ativação do sistema TêF (DIEZ

RUIZ &, 1995), embora não esteja claro se esses receptores solúveis provêm do fígado e/ou de células mononucleares periféricas (KALLIêOWSKI &, 1998). Como o sTêFR tem mais estabilidade e maior meia vida que o TêF circulante, tem sido considerado

melhor marcador de atividade inflamatória (VAê ZEE &, 1992).

Assim como em relação ao TêF, os níveis séricos dos receptores solúveis dessa

citocina (sTêFR1 e sTêFR2) também se associaram de maneira significativa aos níveis de

aminotransferases e ao grau de inflamação e fibrose hepática em diversos estudos

envolvendo pacientes com hepatite C crônica (ITOH &, 1999; KAKUMU &, 1997; KALLIêOWSKI &, 1998; ZYLBERBERG &, 1999).

2.5 Tratamento na hepatite C crônica

O tratamento atual dos pacientes com hepatite C crônica é baseado na

combinação de interferon α (IFê α), em sua forma convencional ou peguilada, e ribavirina

(RBV), por 24 a 48 semanas, dependendo do genótipo viral (BRASIL, 2007; DE ARAUJO

&, 2007; STRADER &, 2004).

O IFê α exógeno age de maneira similar ao endógeno por meio da indução de

genes estimulados pelo interferon (ISGs), que estabelecem um estado antiviral no interior

das células (FELD; HOOFêAGLE, 2005; TILG, 1997). Além dessa atividade antiviral, o

IFê α fortalece tanto a resposta imune inata quanto a adquirida de interações com

linfócitos T, células êK e células dendríticas (TILG, 1997).

A ribavirina é um análogo de guanosina que parece atuar como um agente

antiviral principalmente por meio da indução de mutagênese do HCV, resultando em baixa

aptidão replicativa (FELD; HOOFêAGLE, 2005). A ribavirina parece atuar também como

imunomoduladora, alterando o balanço Th1/Th2 em favor de uma resposta Th1 (TAM

(32)

Resposta virológica sustentada (RVS), ou seja, HCV RêA sérico indetectável

24 semanas após o término do tratamento, é observada em quase a metade dos pacientes

tratados. Fatores como idade, genótipo, carga viral e índice de massa corpórea interferem

na taxa de resposta (FRIED &, 2002; MAêêS &, 2001). O desfecho do tratamento da hepatite C parece ser influenciado também pela capacidade da resposta imunocelular de

controlar a replicação viral. Uma resposta Th1 precoce parece ser importante para o

clareamento viral durante a hepatite C aguda (GUIDOTTI; CHISARI, 2001; KAMAL

&, 2004; REHERMAêê; êASCIMBEêI, 2005) e um resposta de células T HCV específicas também está associada à resposta terapêutica entre pacientes cronicamente

infectados (CRAMP &, 2000; KAMAL &, 2002; 2004; êELSOê &, 1998).

2.5.1 Associação entre níveis de quimiocinas e resposta ao tratamento da hepatite C crônica

A atividade intra hepática dos linfócitos T citotóxicos é fundamental na

resposta terapêutica de pacientes com hepatite C crônica (êELSOê &, 1998) e, desta forma, as quimiocinas envolvidas na atração dessas células para o fígado podem

desempenhar importante papel na erradicação do HCV.

Como já mencionado, as quimiocinas CCL3, CCL4 e CCL5, mediante sua

interação com o receptor CCR5 presente nos leucócitos, são importantes na resposta imune

ao HCV. Uma expressão reduzida de CCR5 reduz a resposta de citocinas Th1 em pacientes

com hepatite C crônica (LECHêER &, 2000; WOITAS &, 1997) e pode, portanto, prejudicar a resposta terapêutica. A expressão de CCR5 é positivamente regulada pelo

interferon (YAêG &, 2001) e inibida pela proteína viral de envelope E2 (êATTERMAêê &, 2004).

Para compreender melhor o papel do CCR5 no tratamento de pacientes com

hepatite C crônica, alguns estudos foram conduzidos com indivíduos apresentando

mutações que impedem a expressão funcional desse receptor. Esses estudos referenciaram

que a mutação CCR5 Delta 32 esteve associada à menor resposta à monoterapia com IFê

(AHLEêSTIEL &, 2003), embora essa diferença não tenha sido observada quando o interferon foi utilizado em combinação com a ribavirina (GLAS &, 2003).

As células Th1 efetoras também expressam o receptor CXCR3 (VOê

(33)

está associado a melhores taxas de resposta virológica sustentada (LARRUBIA &, 2007). Esta última pesquisa também demonstrou que todos os pacientes que falharam em

aumentar os níveis de LTC com elevada expressão de CXCR3 depois de 24 semanas de

tratamento também falharam em obter resposta virológica sustentada (LARRUBIA &, 2007).

A quimiocina CXCL10, um ligante do CXCR3, está associada à resposta

terapêutica de pacientes com hepatite C crônica. êíveis periféricos pré tratamento de

CXCL10 estiveram inversamente associados à resposta à terapia tanto com interferon em

monoterapia (BUTERA &, 2005) como em combinação com a ribavirina (APOLIêARIO &, 2004; DIAGO &, 2006). A associação entre os níveis periféricos de CXCL10 e desfecho terapêutico foi demonstrada tanto para interferon convencional

(êARUMI &, 1997) quanto para o peguilado (APOLIêARIO &, 2004; BUTERA

&, 2005; LAGGIêG &, 2006; ROMERO &, 2006), com níveis mais elevados encontrando se significativamente associados a piores respostas terapêuticas. Essa

associação foi constatada tanto para resposta virológica rápida quanto para resposta

virológica sustentada (LAGGIêG &, 2006; ROMERO &, 2006). Dois estudos diferentes mostraram que níveis periféricos de CXCL10 superiores a 600 pg/mL

apresentaram valor preditivo negativo para RVS de aproximadamente 80% e que alcançou

100% em pacientes difíceis de serem tratados (e.g. alto índice de massa corpórea e alta

carga viral) (LAGGIêG &, 2006; ROMERO &, 2006).

êíveis séricos de CXCL10 durante o tratamento também foram preditores de

resposta terapêutica. êarumi & (1997) relataram que uma redução dos níveis de CXCL10 precedeu a resposta terapêutica e que aqueles com resposta virológica sustentada

normalizaram completamente seus níveis. Pacientes que não eliminaram o HCV após o

tratamento mantiveram níveis elevados de CXCL10, em comparação aos encontrados em

respondedores virológicos, mesmo que tenham normalizado as aminotransferases, isto é,

que tenham apresentado resposta bioquímica (ITOH &, 2001).

Diferentes teorias têm sido apresentadas para explicar a relação entre níveis

elevados de CXCL10 e baixas taxas de resposta. êíveis elevados de CXCL10 periférico

poderiam prejudicar o gradiente de sinalização tanto de CXCL10 quanto de CCL5

(BUTERA &, 2005) ou poderiam regular negativamente receptores CCR5 em LTC circulantes (LARRUBIA &, 2007). Uma explicação diferente foi proposta por Diago

. (2006), que sugeriram que os níveis elevados de CXCL10 poderiam resultar em

(34)

seletiva do HCV, promovendo o aparecimento de maior número de mutantes do HCV

passíveis de escape da resposta imune, que seriam de mais difícil erradicação com a terapia

específica (DIAGO &, 2006).

Outros dois ligantes do CXCR3 CXCL9 e CXCL11 também foram avaliados

como preditores de resposta ao tratamento em pacientes com hepatite C crônica. êíveis

plasmáticos de CXCL9 apresentaram redução significativa em pacientes com RVS, mas os

níveis pré tratamento não se associaram às taxas de resposta (BUTERA &, 2005). Os mesmos autores não referiram associação entre níveis plasmáticos pré tratamento de

CXCL11 e resposta terapêutica nem alterações dos níveis durante o tratamento (BUTERA

&, 2005).

CXCL8, uma quimiocina que se liga aos receptores CXCR1 e CXCR2, está

envolvida na inibição da ação do interferon. Possivelmente devido a essa ação inibitória,

níveis séricos de CXCL8 mais elevados associaram se à falha na resposta à terapia

antiviral em pacientes com hepatite C crônica (MIHM &, 2004; êEUMAê &, 1999; POLYAK &, 2001b).

A cinética das quimiocinas CC durante tratamento de pacientes com hepatite C

crônica também foi investigada. Yamauchi . (2002) descreveram níveis séricos de

CCL20 aumentados duas semanas após o início de monoterapia com interferon entre

respondedores, enquanto os não respondedores não manifestaram mudança significativa

nos níveis séricos dessa quimiocina. Entretanto, os níveis de CCL20 pré tratamento foram

similares comparando respondedores e não respondedores, não sendo úteis como

preditores de resposta terapêutica (YAMAUCHI &, 2002).

O papel do CCL2 e de seu receptor, CCR2, como preditores de resposta

terapêutica entre pacientes com hepatite C ainda não foi bem esclarecido. Um estudo

demonstrou associação entre a cinética dos níveis séricos de CCL2 e taxas de resposta

virológica (PAêASIUK; PROKOPOWICZ; PAêASIUK, 2004), mas outra pesquisa

falhou em verificar qualquer associação da resposta virológica com polimorfismos do gene

CCL2 e CCR2 (MOêTES CAêO &, 2007).

2.5.2 TNFEα, seus receptores solúveis e resposta terapêutica na hepatite C crônica

O TêF α parece não estar diretamente envolvido na eliminação do HCV, pois

(35)

sabe se que a síntese de TêF α é suprimida pelo IFê α durante o tratamento (ABU

KHABAR; ARMSTROêG; HO, 1992) e essa supressão parece ser um dos mecanismos

pelo qual a normalização das aminotransferases pode ocorrer durante o tratamento, mesmo

com a persistência da infecção (FABRIS &, 1999).

Em pacientes com hepatite C crônica recebendo terapia combinada com IFê α

e ribavirina, os níveis séricos de TêF α reduziram se significativamente ao final do

tratamento e esse declínio acompanhou aquele observado nos níveis de aminotransferases

(êEUMAê &, 2001). Entre os respondedores, os níveis de TêF α sustentaram se em valores mais baixos durante o acompanhamento pós tratamento, enquanto entre os

recidivantes retornaram àqueles encontrados antes do tratamento. A queda de TêF α foi

mais acentuada ao final do tratamento entre os que receberam terapia combinada se

comparados àqueles que receberam IFê α em monoterapia (êEUMAê &, 2002b). A avaliação dos níveis pré tratamento do TêF α parece ser também útil na

predição de resposta terapêutica. Pacientes com níveis séricos de TêF α pré tratamento

mais baixos (êEUMAê &, 1999) ou menores níveis pré tratamento de expressão do TêF α em células mononucleares periféricas (PBMC) (LARREA &, 1996) apresentaram melhores taxas de resposta ao tratamento com IFê α. Um estudo conduzido

por Zein &(2005) usando etanercept, um antagonista TêF α, nas primeiras 24 semanas de tratamento com IFê α e ribavirina, resultou em taxas de respostas mais altas durante o

tratamento.

Ressalta se que o papel dos níveis de TêF α como preditores ainda precisa ser

mais bem compreendido, já que um outro trabalho não mostrou diferença entre os níveis

pré tratamento de TêF α entre respondedores e não respondedores à monoterapia com

IFê α (KALLIêOWSKI &, 1998).

Em relação aos receptores solúveis de TêF (sTêFR), sua influência na

homeostasia do sistema TêF pode contribuir para a ação antiinflamatória do IFê α. êa

infecção pelo vírus da hepatite B, níveis séricos elevados de sTêFR antes da terapia com

interferon associaram se a sucesso terapêutico (MARIêOS &, 1995). êa hepatite C, o papel do sTêFR não está ainda bem esclarecido. Um aumento dos níveis de sTêFR,

especialmente no sTêFR1, ocorre poucas horas após administração de IFê α (TILG;

VOGEL; DIêARELLO, 1995), mas este aumento parece ser temporário, não sendo

encontrada alterações nos níveis séricos tanto de sTêFR1 quanto de sTêFR2 três meses

(36)

indivíduos com resposta sustentada, enquanto os níveis entre os não respondedores

permaneceram inalterados (ITOH &, 1999). Entretanto, os níveis séricos pré tratamento de sTêFR1 ou sTêFR2 não foram capazes de predizer resposta virológica em pacientes

tratados em monoterapia com IFê α (KALLIêOWSKI &, 1998).

Considerando as características do sTêFR, que incluem maior estabilidade na

circulação periférica, pesquisas adicionais são necessárias para melhor compreender o

(37)

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivos principais

• Analisar a associação dos níveis plasmáticos de quimiocinas e receptores solúveis de fator de necrose tumoral com atividade necro inflamatória e fibrose hepática em

pacientes com infecção crônica pelo vírus da hepatite C.

• Analisar a associação dos níveis plasmáticos pré tratamento de quimiocinas e receptores solúveis de fator de necrose tumoral com resposta virológica ao

tratamento com interferon e ribavirina em pacientes com infecção crônica pelo

vírus da hepatite C.

3.2 Objetivos secundários

• Identificar fatores clínicos, epidemiológicos, bioquímicos e virológicos associados à atividade necro inflamatória e fibrose hepática nos pacientes com infecção

crônica pelo vírus da hepatite C.

• Identificar fatores clínicos, epidemiológicos, bioquímicos e virológicos associados à resposta de pacientes com infecção crônica pelo vírus da hepatite C ao tratamento

com interferon e ribavirina.

• Analisar a cinética dos níveis plasmáticos de quimiocinas e receptores solúveis de fator de necrose tumoral após início do tratamento com interferon e ribavirina e sua

associação com resposta virológica em pacientes com infecção crônica pelo vírus

(38)

4 PACIENTES E MÉTODOS

41 Desenho

Trata se de estudo observacional, coorte prospectivo, com coleta de dados

realizada entre junho de 2005 e junho de 2008. A inclusão de pacientes ocorreu de junho

de 2005 a dezembro de 2007, período no qual pacientes consecutivos com infecção crônica

pelo vírus da hepatite C (HCV), atendidos em consultas de acompanhamento no

Ambulatório de Hepatites do Centro de Treinamento e Referência em Doenças Infecciosas

(CTR DIP) Orestes Diniz, foram triados pelos pesquisadores do estudo (FIG. 1). Os

pacientes que preencheram critérios de eligibilidade nessa avaliação de triagem foram

convidados a participar da pesquisa e os que aceitaram, após lerem e assinarem termo de

consentimento livre e esclarecido (APÊêDICE A), tiveram amostras plasmáticas

analisadas em relação à concentração dos seguintes marcadores inflamatório solúveis:

CCL2, CCL3, CCL11, CCL24, CXCL9 e CXCL10, sTêFR1 e sTêFR2. Dados

sociodemográficos e clínicos foram obtidos pela revisão de prontuário e complementados

por entrevista aplicada logo após a consulta clínica.

Realizou se análise transversal da associação entre os níveis plasmáticos dos

marcadores inflamatórios solúveis e o grau de atividade necro inflamatória e de fibrose

presentes em fragmento de biópsia hepática. Procedeu se à análise longitudinal da

associação entre resposta terapêutica e os mesmos marcadores inflamatórios anteriormente

descritos, dosados em amostras plasmáticas coletadas antes do início do tratamento, na 12a

semana de tratamento e ao seu final.

Para constituírem o grupo controle, acompanhantes de pacientes vinculados ao

serviço e estudantes de Medicina que atendiam aos critérios de eligibilidade foram

convidados a participar. Aqueles que aceitaram, após lerem e assinarem termo de

consentimento livre e esclarecido, foram submetidos à coleta de sangue para dosagem

plasmática dos mesmos marcadores inflamatórios analisados nos pacientes com hepatite C