Prevalência de genótipos e de mutantes pré-core A-1 8 9 6 do vírus da
hepatite B e suas implicações na hepatite crônica, em uma
população da Amazônia oriental
Prevalence of hepatitis B virus genotypes and the occurrence of precore mutation A-1896
and to correlate them with the clinical presentation of chronic hepatitis, in a
population group of the Eastern Amazon region
Simone Regina Souza da Silva Conde
1, Lizomar de Jesus Pereira Móia
1, Mar ia Silvia Br ito
Bar bosa
1, Ivanete do Socorro Abarcado Amaral
1, Esther Castello Branco de Mello Miranda
1, Manoel
do Carmo Pereira Soares
2, Elizabete Maria de Figueiredo Brito
2, Olglaíze do Socorro Costa Souza
2,
Marialva Tereza de Araújo
3, Sâmia Demachki
3, João Renato Pinho Rebello
4, Michele Gomes
Soares Mesquita
4, Denis Alberto Bertollini
4e Ricardo Ishak
3RESUMO
A i n f e c ç ã o pe lo vi ru s da he pa ti te B a pre se n ta a m plo e spe c tro de m a n i f e sta ç õ e s c lí n i c a s. Ob je ti va n do c o n he c e r o s ge n ó ti po s d o HBV m a i s p re va le n te s e d e te rm i n a r a o c o rrê n c i a d a m u ta ç ã o p ré - c o re A- 1 8 9 6 , e m u m a p o p u la ç ã o d a Am a zô n i a o ri e n ta l, c o rre la c i o n a n d o c o m o d i a gn ó sti c o c lí n i c o , f o ra m se le c i o n a d o s 5 1 p a c i e n te s p o rta d o re s c rô n i c o s d e HBsAg e HBV- DNA p o si ti vo s e d i vi d i d o s e m trê s gru p o s: gru p o A ( n = 1 4 , p a c i e n te s a ssi n to m á ti c o s) ; gru p o B ( n = 2 0 , si n to m á ti c o s HBe Ag p o si ti vo s) e gru p o C ( n = 1 7 , si n to m á ti c o s HBe Ag n e ga ti vo s) , se n d o u sa d o o se q u e n c i a d o r a u to m á ti c o ABI m o d e lo 377 pa ra ide n tific a ç ã o de ge n ó tipo s e m u ta n te s pré - c o re . Os re su lta do s e vide n c ia ra m o ge n ó tipo A c o m o o m a is pre va le n te , 8 1 ,8 %, 8 9 ,5 % e 9 3 ,7 %, n o s gru p o s A, B e C, re sp e c ti va m e n te . A m u ta ç ã o p ré - c o re A- 1 8 9 6 f o i e n c o n tra d a e m 1 1 ,5 % ( 3 / 2 6 ) , se n d o to d o s a ssi n to m á ti c o s. Co n c lu i u - se q u e n a p o p u la ç ã o e stu d a d a o ge n ó ti p o A f o i o m a i s p re va le n te e h o u ve b a i x a o c o rrê n c i a d o m u ta n te p ré - c o re A- 1 8 9 6 , a m b o s n ã o se c o n sti tu i n d o f a to re s a gra va n te s d a d o e n ç a h e p á ti c a .
Pal avr as-chave s: He p a ti te B c rô n i c a . Ge n ó ti p o s. Mu ta ç ã o p ré - c o re . Ep i d e m i o lo gi a . Clí n i c a .
ABSTRACT
He p a ti ti s B vi ru s ( HBV) i n f e c ti o n p re se n ts i tse lf wi th a va ri e ty o f c li n i c a l m a n i f e sta ti o n s. Th e p re se n t wo rk a i m s to d e sc ri b e th e p re va le n c e o f HBV ge n o typ e s a n d th e o c c u rre n c e o f p re c o re m u ta ti o n A- 1 8 9 6 i n a p o p u la ti o n gro u p o f th e Ea ste rn Am a zo n re gi o n o f Bra zi l a n d to c o rre la te th e m wi th th e c li n i c a l p re se n ta ti o n o f c h ro n i c HBV i n f e c ti o n . 5 1 HBsAg c a rri e rs ( HBV- DNA p o si ti ve ) we re se le c te d a n d d i vi d e d i n to th re e gro u p s: A ( 1 4 a sym p to m a ti c su b je c ts) , B ( 2 0 HBe Ag p o si ti ve sym p to m a ti c p a ti e n ts) a n d C ( 1 7 HBe Ag n e ga ti ve sym p to m a ti c p a ti e n ts) . Usi n g a n a u to m a e d DNA se q u e n c e r ABI m o d e l 3 7 7 b y se q u e n c i n g f o r d e te rm i n e d o f ge n o typ e s a n d p re c o re m u ta ti o n . Th e re su lts sh o we d th a t th e ge n o typ e A wa s th e m o st c o m m o n ly f o u n d ( 8 1 ,1 %, 8 9 ,5 % a n d 9 3 ,7 % i n gro u p s A, B a n d C, re sp e c ti ve ly) a n d p re c o re m u ta ti o n A- 1 8 9 6 wa s d e sc ri b e d i n 1 1 ,5 % ( 3 /2 6 ) o f gro u p A su b je c ts. Ge n o typ e A o f HBV wa s th e m o st p re va le n t ( 8 9 ,1 %) a n d lo w o c c u rre n c e o f p re c o re m u ta ti o n A- 1 8 9 6 , b o th n o t a sso c i a te wi th th e wo rst o u tc o m e o f th e c h ro n i c i n f e c ti o n o f HBV.
Ke y-words: Ch ro n i c h e p a ti ti s B. Ge n o typ e s. Pre c o re m u ta ti o n . Ep i d e m i o lo gy. Cli n i c a l.
1 . Fundaç ão Santa Casa de Miseric ó rdia do Pará, B elém, PA, 2 . Instituto Evandro Chagas, B elém,PA, 3 . Universidade Federal do Pará, B elém, PA. 4 . Instituto Ado lfo Lutz, São Paulo , SP.
En de r e ço par a cor r e spon dê n ci a: Dra. Simo ne Regina So uza da Silva Co nde. Rua dio go Mó ia 1 9 7 /9 0 1 , Umarizal, 6 6 0 5 5 -1 7 0 B elém, PA. Tel: 9 1 9 1 1 2 -8 8 8 9
A infe c ç ão pe lo vír us da he patite B ( HB V) apr e se nta distribuiç ão universal, rec onhec endo-se a existênc ia de 3 5 0 milhões de portadores crônicos, sendo responsável por um milhão de óbitos por ano1 1. O estudo da história natural da hepatite B
evidenciou manifestações clínicas variáveis, na dependência de fatores relacionados ao hospedeiro e ao próprio vírus, sendo descritos quadros agudos assintomáticos ou oligossintomáticos ou ictéricos, possibilidade de hepatite fulminante, cronificação e desenvolvimento de portadores ina tivo , c irrose hepátic a e hepatocarcinoma5 18.
O HBV é o protótipo da família He pa dna virida e e em seu genoma composto por DNA de fita dupla incompleta se reconhece quatro principais regiões de transcrição (ORF) : a) o gene P que codifica a polimerase viral; b) o gene pré-C/C ( core) responsável pela codificação do HBcAg e de outra proteína não estrutural, o HBeAg; c) o gene pré-S1/S2 e S ( superfície) codificante do HBsAg e das proteínas conhecidas como L e M, e d) o gene X que através de sua transcrição produz a proteína X1 2. O seqüenciamento da
região S do genoma do HBV revelou a presença de sete genótipos do HBV, de A a G3 3 3 4 4 1, os quais possuem uma distribuição
geográfica peculiar.
A presenç a do HB eAg no so ro é epidemio lo gic amente relac ionado c om a replic atibilidade e c ontagiosidade do vírus. Porém, em estudos pioneiros Carman e t a l7 e Okamoto e t a l3 5
identific aram mutantes que não sintetizavam o HB eAg, não interferindo, porém, no c ic lo replic ativo do mesmo, surgindo o termo mutaç ão pré-c ore. A princ ipal c ausa desta mutaç ão deve-se à substituiç ão da G ( guanina) pela A ( adenina) na posição do nucleotídio ( nt) 1 8 9 6 , e mais raramente no nt 1 8 9 9 , mo dific ando o c ó do n TGG espec ífic o par a o amino ác ido tr i p to fa n o p a r a u m c ó do n de p a r a da p r e c o c e TAG, princ ipalmente nos genótipos que possuem a timina ( T) no nt 1 8 5 4 , portanto no B, C, D e F, e raro no A genótipo9 1 4.
Vá r io s e s tudo s te n ta m c o r r e la c io n a r o s dife r e n te s genó tipo s c o m a maio r o u meno r gravidade do s quadro s c línic os resultantes da infec ç ão c rônic a pelo HB V2 0 4 3 4 4 4 5,
assim c omo a presenç a da mutaç ão pré-c ore. Nesta última situaç ão, os resultados ainda são mais c ontroversos, visto que a prevalênc ia destes mutantes em hepatopatas c rônic os é e le vada nas r e giõ e s do Me dite r r âne o4 1 4 3 8, no Or ie nte
Médio2 3 e no leste asiátic o1 3 2 4 2 8 3 2, po rém baixa ao no rte
europeu, EUA e B rasil8 2 9 3 9; e ainda são identific ados mutantes
em portadores inativos do vírus1 5 3 2 3 6.
Sendo a região Amazônic a c onsiderada uma área de alta prevalênc ia do HBV e a falta de estudos sobre a prevalênc ia de genótipos e mutantes pré-c ore nesta populaç ão, o presente trabalho objetiva c onhec er os genótipos mais prevalentes do HBV e a desc riç ão da prevalênc ia de mutaç ão pré-c ore A– 1 8 9 6 entre os pac ientes portadores de hepatite c rônic a B, em uma populaç ão da Amazônia oriental, assim c omo c orrelac ionar c om as c arac terístic as epidemiológic as, c línic as e virológic as.
MATERIAL E MÉTODOS
Po pula ç ã o de e s tudo . Se le c io no u- se 5 1 pac ie nte s portadores c rônic os do HB sAg ( HB V-DNA positivo) atendidos no Pr o gr a m a de He pa to pa tia s Cr ô nic a s do Ho spita l da
Fundação Santa Casa de Misericórdia do Pará, localizado na cidade de B elém. Exc luíram-se do estudo pac ientes c om infec ç ão simultânea pelo vírus da hepatite C ( HCV) , delta ( HDV) ou vírus da imunodeficiência humana ( HIV) , ou os que utilizaram qualquer tipo de tr atame nto antivir al pr é vio . O to tal de pac ie nte s selecionados foi divido em três grupos: grupo A formado por pacientes assintomáticos HBeAg positivos e negativos ( n: 1 4 ) ; grupo B, por aqueles pacientes sintomáticos HBeAg positivos ( n: 2 0 ) ; e grupo C, por pacientes sintomáticos HBeAg negativos e anti-HBe positivos ( n: 1 7 ) . Estes foram submetidos a exames c línic o s, lab o r ato r iais, so r o ló gic o s, ultr a- so no gr áfic o s, endoscópicos e, quando indicado, a biópsias hepáticas para estadiamento. Após a identificação destes grupos, procedeu-se a genotipagem de todos os espécimes e o seqüenciamento da região pré-core nos portadores do HBV com HBeAg negativo, tanto assintomáticos quanto sintomáticos.
Testes sorológicos e de pesquisa do HBV-DNA. Para os exames sorológicos das hepatites B, C e D foram utilizados EIE, tipo ELISA, com k its comerciais. Todos os soros foram examinados para a presença de HBsAg ( Organon Teknika
, Holanda) , anti-HBc ( Organon Teknika
, Holanda) , anti-HBs ( Abbott
, EUA) e anti-HCV ( Ortho Clinical Diagnostics
, Alemanha) . Nas amostras positivas para o HBsAg foi efetuada a pesquisa do HBeAg, anti-HBe, anti-HBc IgM a anti-HD ( Organon Teknika
, Holanda) .O HB V- DNA fo i pe s q uis a do do m o do q ua lita tivo e q uantitativo utilizando -se k its c o me r c iais do lab o r ató r io Roc he
( AMPLICOR HB V MONITORTM) , que utiliza a PCRpara a amplific aç ão e hibridizaç ão do DNA.
Geno tipagem do HBV. Para detec ç ão da região S do HB V-DNA no so r o po r PCR, fo i e mpr e gada a té c nic a de e xtr aç ão de se nvo lvida po r Kane k o e t a l1 9 e po r Kwo k &
Higuc hi2 5 c om pouc as modific aç ões. A extraç ão do DNA viral
se proc edeu pelo NaOH e os prim e rs utilizados nas PCR foram o FHB S1 ( GAG TCT AGA CTC GTG GTG GAC TTC) , o RHB S1 , para a primeira reaç ão e o FHB S2 ( CGT GGT GGA CTT CTC TCA ATT TTC) e RHB S2 ( GCC ARG AGA AAC GGR CTG AGG CCC) para a segunda.
A análise do produto de PCR se procedeu com a aplicação em gel de agarose, submetido à corrente elétrica de 150 V por 35 minutos e revelada a reação com a utilização de uma fonte de ultravioleta ( UV) . O produto foi fotografado com máquina tipo
Po la ro id. As amostras foram c onsideradas positivas quando apresentaram uma banda de 4 5 0 pb, quando comparadas ao padrão. As amostras positivas foram seqüenc iadas por PCR, derivada da meto do lo gia de Sanger e t a l3 7 utilizando -se
didesoxinucleotídeos ( dNTPs) contendo marcadores fluorescentes, conforme o k it ABI PrismR BigDyeTM Terminator ( PE Applied
Biosystems) .
A a n á lis e do s ge n ó tipo s fo i r e a liza da po r m e io da c omparaç ão das seqüênc ias obtidas c om as já c onhec idas do s diferentes genó tipo s de HB V. Para esta análise fo ram utilizados os programas EditSeq e Megalign do pac ote DNAstar ( Lasergene Inc , USA) .
amostras HBeAg negativas dos grupos A e C. A extração do DNA viral se procedeu com a utilização da solução de isotiocianato de guanidina ( soluç ão GT) e os prim e rs para a primeira e segunda PCR foram o EP1 .1 ( TCA TGG AGA CCA CCG TGA AC) e EP1 .2 ( GGA AAG AAG TCA GAA GGC AA) e o EP2 .1 ( CAT AAG AGG ACT CTT GGA CT) e EP2 .2 ( GGC AAA AAA GAG AGT AAC TC) , respectivamente. Após a colocação do produto em gel de agarose a 1 % e submetido a corrente elétrica, revelou-se a reação com a utilização de uma fonte de ultravioleta ( UV) , fotografando com máquina tipo Po la ro id, sendo consideradas positivas quando apresentaram uma banda de 3 0 0 pb.
Os produtos das reaç ões de amplific aç ão foram aplic ados e m ge l de po lic r ilamida e sub me tido s à e le tr o fo r e se no se q ue nc iado r auto mátic o , mo de lo AB I Pr ismTM 3 7 7 DNA
Sequenc er ( Perkin Elmer) . As seqüênc ias da região pré-c ore fo r am alinhadas a uma se q üê nc ia c o nhe c ida da me sma r e giã o , livr e de m uta ç õ e s , utiliza n do - s e p a r a is to o s programas EditSeq e Megalign do pac ote DNAstar ( Lasergene I n c , USA) . Po s te r io r m e n te , a n a lis o u- s e o s po n to s da s seqüênc ias que fo ram marc ado s po r serem diferentes da seqüênc ia c onsenso, visando o enc ontro de mutaç ões A-1 8 9 6 e A-1 8 9 9 , além de outras c itadas em public aç ões c ientífic as.
Para a análise estatístic a foram utilizados os programas EPIINFO 6 .0 4 b e B iostat 2 .03. Utilizaram-se testes estatístic os
paramétric os da ANOVA de um e de dois c ritérios e os não-paramétric os de Kruskal-Wallis e de Kolmogorov-Smirnov, nos c asos de análise de variânc ia de mais de duas amostras. P a r a d u a s a m o s tr a s i n d e p e n d e n te s , o s te s te s n ã o paramétric os empregados foram o qui-quadrado e o teste exato de Fisher. Estabelec eu-se em 0 ,0 5 ( 5 % ) o nível de rejeiç ão da hipótese de nulidade ( valor de p < 0 ,0 5 ) .
O presente trabalho foi aprovada pelo Comitê de Ética Médica da Fundação Santa Casa de Misericórdia do Pará, e os pacientes selecionados foram conscientizados sobre os objetivos do estudo e assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, permitindo assim a realização da investigação.
RESULTADOS
Os tr ê s gr upo s fo r m ado s se c ar ac te r izar am po r um pr edo mínio to tal do sexo masc ulino , c ada um do s quais apresentando apenas um pac iente do sexo feminino. A média das idades foram de 3 2 ,4 + 1 2 ,3 anos ( variação de 1 0 -6 0 anos) para o grupo A, 4 1 ,6 + 2 6 ,3 anos ( variaç ão de 1 -8 4 anos) para o B e 5 2 ,3 + 1 5 ,3 anos ( variaç ão de 6 -7 2 anos) para o C. A dife r e nç a de sta s m é dia s se m o str o u e sta tistic a m e nte signific ante entre os grupos A e C, c om valor de p igual a 0 ,0 2 8 . As c o mplic aç õ e s c línic as e m de c o r r ê nc ia da do e nç a hepátic a, oc orridas em 7 /2 0 ( 3 5 % ) pac ientes do grupo B e em 9 /1 7 ( 5 3 % ) do grupo C, e a letalidade de 1 5 % ( 3 /2 0 ) do s p a c ie n te s do gr up o B e 3 5 , 2 % ( 6 /1 7 ) do C n ã o apresentaram diferenç as estatístic as entre si.
Nas dosagens de AST, ALT, bilirrubina total, FA, GGT e globulinas, o grupo A apresentou menores valores do que no grupo B (p: 0 ,0 0 5 ) e C (p: 0 ,0 0 1 ) . As médias das dosagens
de albumina e atividade protrombínic a foram menores nos gr upo s B e C e m r e laç ão ao A ( Tab e la 1 ) e a dife r e nç a mostrou-se estatistic amente signific ante (p: 0 ,0 0 1 e p: 0 ,0 0 7 , respec tivamente) .
Com relação às cargas virais, o grupo B apresentou níveis superiores às do A e C, com valor de p igual a 0 ,0 0 4 ( Figura 1 ) . Ressalta-se que o único indivíduo HBeAg positivo do grupo A possuía carga viral de 7 ,3 3 2 ( log1 0) , muito acima dos demais membros deste mesmo grupo.
O dia gn ó s tic o fin a l do s pa c ie n te s do gr upo B e C e n c o n tr a m - s e e x po s to s n a Ta b e la 2 . Nã o fo i po s s íve l demonstrar diferenç a estatístic a entre eles.
Geno tipagem do HBV. Das 5 1 amo str as de so r o de pac ientes proc essadas para genotipagem, c onseguiu-se êxito em 1 1 ( 7 9 % ) do grupo A, 1 9 ( 9 5 % ) do grupo B e 1 7 ( 9 4 % ) do grupo C. As amo stras que não se c o nseguiu efetuar a
8
6
4
2
0
grupo A
grupo B
grupo C
grupo viral (log)
Fi gu ra 1 - Me d i a n a e q u a rti s d a s c a rga s vi ra i s ( e m lo g1 0) d o HBV d o s gru p o s A, B e C.
Ta bela 1 - Exa m es la bo ra to ria is co m plem enta res do s pa cientes do s grupo s A, B e C.
Grupo A Grupo B Grupo C
média + DP média + DP média + DP
ALT 33,2 135,5 115,1 p: 0,002*
( 08-54 iu/l) + 22,0 + 223,7 + 137,9
Bilirrubina total 0,7 3,1 3,0 p:0,041*
( 0,4-1,4 mg/dl) + 0,3 + 3,8 + 3,0
GGT 34,3 122,0 98,6 p:0,020*
( 08-63 IU/L) + 28,9 + 220,1 + 73,9
Fosfatase alcalina 61,1 181,0 155,3 p: 0,001*
( 36-55 g/dl) + 30,6 + 142,5 + 82,3
Albumina 4,7 3,2 3,6 p: 0,001*
( 3,5-5,5 g/dl) + 0,6 + 1,0 + 1,1
AP 90,8 67,9 53,1 p: 0,007*
( > 70%) + 14,6 + 29,5 + 24,8
DP: desvio padrão. ( ) : valores normais e unidades de referência. ns: não significante (p
extraç ão do ác ido nuc léic o apresentaram c arga viral baixa, inferior a 2 .5 0 0 c ópias/mL ( Figura 2 ) .
A ge no tipa ge m da s 4 6 a m o str a s po sitiva s r e ve lo u a presenç a do genótipo A na grande maioria dos pac ientes, 8 9 ,1 % ( 4 1 /4 6 ) , seguido dos genótipos F em 8 ,7 % ( 4 /4 6 ) e D em 2 ,2 % ( 1 /4 6 ) . A distribuiç ão dos genótipos enc ontrados nos grupos estudados está resumida na Tabela 3 .
A média da c arga viral ( em log1 0) das 4 1 amostras c om genótipo A, 7 .0 0 8 c ópias/mL, e a dos c inc o pac ientes c om ge n ó tipo s n ã o A, 6 . 7 1 6 c ó pia s /m L n ã o a pr e s e n ta r a m diferenç a estatístic a signific ante ( Figura 4 ) .
O c aso de ge nó tipo D e nc o ntr ava-se na c o ndiç ão de assintomátic o. Nos quatro indivíduos c om genótipo F, c ada grupo de diagnóstic o, assintomátic o, hepatite c rônic a, c irrose
Ta bela 2 - Dia gnó stico fina l ( clínico e/o u histo pa to ló gico ) do s pa cientes do s grupo s B e C.
Grupo B ( 20) Grupo C ( 17)
Diagnóstico nº % n %
Hepatite crônica 8 40,0 5 29,5 ns
Cirrose hepática 9 45,0 7 41,0 ns
Hepatocarcinoma 3 15,0 5 29,5 ns
ns: não significante (p > 0,05)
a
b
c
d
e
f
g
h
450 pb
Ta bela 3 - Distribuiçã o do s genó tipo s do HBV no s grupo s A, B e C.
Genótipos
Grupos No A % D % F %
A 11 9 81,8 1 9,1 1 9,1
B 19 17 89,5 0 - 2 10,5
C 16 15 93,7 0 - 1 6,3
Total 41 89,1 1 2,2 4 8,7
Qua nto à pr o c e dê nc ia de s te s pa c ie nte s ( Figur a 3 ) , observou-se que a maior parte dos pac ientes c om genótipo A, 6 8 ,3 % ( 2 8 /4 1 ) , proc ediam da região metropolitana de B elém e da região sudeste do Pará. O pac iente c om genótipo D proc edeu de B elém, assim c omo dois outros c om genótipo F. Deste último genótipo, um terc eiro pac iente era oriundo de Cametá ( B aixo Toc antins) e o quarto, de Vizeu, nordeste do Estado do Pará.
As c arac terístic as demográfic as dos pac ientes ( Tabela 4 ) não mostraram diferenç as estatístic as, quando distribuídas de ac ordo c om o genótipo enc ontrado.
A pr esenç a do HB eAg entr e o s indivíduo s po r tado r es do ge nó tipo A fo i de 4 3 ,9 % ( 1 8 /4 1 ) , taxa se me lhante a enc ontrada nos do genótipo não A.
Figura 2 - De te c ç ã o po r e le tro fo re se e m ge l de a ga ro se a 1% do pro duto de a m plific a ç ã o da re giã o S do HBV ( 450 pb ) . Lanes a , b , c , f e g: a m o stra s po sitiva s; lane d: c o ntro le ne ga tivo ; lane e : a m o stra ne ga tiva ,
lane h: pa drã o .
Fi gu ra 3 - Pro c e d ê n c i a d o s p a c i e n te s c o m ge n ó ti p o A e n ã o A d o HBV.
Ta bela 4 - Ca ra cterística s dem o grá fica s do s pa cientes co m genó tipo s A e nã o A ( D e F) .
Genótipo A Genótipo não A
Características ( 41) ( D: 1 e F: 4)
Sexo M/F 39 / 2 5 / 0 ns
Idade ( anos) média + DP 44 + 22,6 33 + 11,6 ns
Cor ( %) ns
branca 13,5 25,0
negra 5,4 0
parda 78,4 75,0
amarela 2,7 0
ns: não significante (p > 0,05)
hepátic a e hepatoc arc inoma, rec ebeu um representante. Os r e p r e s e n ta n te s d o ge n ó ti p o A e r a m e m 2 2 % ( 9 /4 1 ) assintomátic os, em 2 6 ,8 % ( 1 1 /4 1 ) portadores de hepatite c rônic a, 3 6 ,6 % ( 1 5 /4 1 ) portadores de c irrose hepátic a e, finalmente, 1 4 ,6 % ( 6 /4 1 ) portadores de CHC ( Tabela 5 ) .
anos e assintomátic os. As médias das c argas virais ( em log1 0) dos três indivíduos 4 ,7 3 5 c ópias/mL, e a do restante dos 2 3 sem mutaç ão pré-c ore A-1 8 9 6 /A-1 8 9 9 , 4 ,9 2 2 c ópias/mL, não apresentaram diferenç as estatistic amente signific antes entre si, c om p: 0 ,3 9 9 .
DISCUSSÃO
Na caracterização dos grupos estudados, observou-se um predomínio do sexo masculino e da faixa etária adulta nos três. Contudo, o grupo A possuía média de idade inferior aos demais, com significância estatística em relação ao grupo C. Este dado se assemelha com os trabalhos de Mangia e t a l2 9 e Niitsuma e t
a l3 2, em que os pacientes portadores assintomáticos do HBV eram
mais jovens em relação aos doentes crônicos HBeAg negativos. O grupo B, composto de pacientes HBeAg positivos, foi o que apresentou a maior média de carga viral ( em log1 0) , com valores significativamente maiores do que os encontrados nos grupos A e C (p: 0 ,0 0 4 ) . Chu e t a l1 0 ao analisarem 7 9 pacientes com hepatite c rô nic a B , to do s c o mpro vado s histo lo gic amente, encontraram níveis séricos do HBV-DNA por dot-blot de 9 4 4 pg/mL nos HBeAg positivos, sendo maior do que os 5 8 pg/mL encontrados nos anti-HBe positivos. A média de idade e a carga viral se mostraram inversamente proporcionais no grupo B e foi menor do que nos pacientes do grupo C.
A genotipagem das amostras do HB V mostrou que 8 9 ,1 % pertenc iam ao genótipo A, 8 ,7 % ao F e 2 ,2 % ao D. Os estudos de ge no tipa ge m de sc r e ve m um a o c o r r ê nc ia va r ia da de genótipos de ac ordo c om a situaç ão geográfic a examinada.
O genótipo A é o mais prevalente no norte europeu, na Áfric a ( seguido em menor proporç ão pelo D e E) , EUA e em desc riç ões de prevalênc ia de populaç ões urbanas c om alto fluxo migratório de países da Améric a do Sul2 7 3 0 3 3 3 4 3 9.
A genotipagem das amostras provenientes de cinco países da Améric a Central ( Nic arágua, Costa Ric a, Guatemala, El Salvador e Honduras) detectou a presença do genótipo F em 7 9 % das amostras, além de 1 4 % do genótipo A, 6 % do D e 1 % do C 2 , sugerindo ser o F o genótipo nativo da região2. Moraes
e t a l3 1 demonstrando uma téc nic a de PCR espec ífic a para geno tipar amo stras de HB V, identific o u em 5 4 espéc imes provenientes de Manaus ( AM) e Macapá ( AP) 6 9 % de genótipo
Ta bela 5 - Presença do HBeAg, do sa gem da ca rga vira l e o dia gnó stico do s ca so s co m genó tipo A e do s genó tipo s nã o A ( D e F) .
Genótipo A Genótipo diferente de A
( 41) ( D: 1 e F: 4)
HBeAg positivo 18 2 ns
Média da carga viral 7,008 6,716 ns
( log1 0) + DP ( cópias/mL) + 7,156 + 7,040
Diagnóstico ns
assintomático 9 2
hepatite crônica 12 1
cirrose hepática 14 1
hepatocarcinoma 6 1
ns: não significante (p > 0,05)
Mutação pr é- co r e A- 1 8 9 6 / A- 1 8 9 9 do HBV. No total de amostras testadas, 1 1 ,5 % ( 3 /2 6 ) mostraram-se positivas para as mutaç ões pesquisadas ( Tabela 6 ) . No grupo A ( Figura 5 ) , a presenç a de mutaç ão pré-c ore foi enc ontrada em três ( 2 5 % ) amostras, sendo uma do tipo 1 8 9 6 , uma do tipo A-1 8 9 9 e uma do tipo c ombinado A-A-1 8 9 6 c om A-A-1 8 9 9 . No grupo C, não foi possível evidenc iar tal mutaç ão. Ainda assim, o resultado não mo stro u diferenç a estatístic a entre o s do is grupos analisados ( valor de p igual a 1 ) .
Ta bela 6 - Preva lência de m uta çã o pré-co re A-1896 e A-1899 no s pa cientes do s grupo s A e C HBeAg nega tivo s.
Grupo A ( 12) Grupo C ( 14) Total
Positivo ( n) % ( 3) 25,0* 0 ( 3) 11,5
Negativo ( n) % ( 9) 75,0 ( 14) 100,0 ( 23) 88,5
Total ( 12) 100,0 ( 14) 100,0 ( 26) 100,0
* Um caso de mutação 1896, um de 1899 e um caso de associação da 1896 e A-1899.
Fi gu ra 5 - Se q ü ê n c i a s n u c le o tí d i c a s d a re gi ã o p ré - c o re d o HBV d e 1 2 a m o stra s d o s p a c i e n te s d o gru p o A. ( - ) : n u c le o tí d e o s. ( - ) : n t 1 8 5 4 . ( - ) : n t 1 8 9 6 . n t( - ) : n t 1 8 9 9 .
.
: c e p a se lva ge m ..
: c e p a c o m m u ta ç ã o p ré - c o re A- 1 8 9 9 / A- 1 8 9 6 e 1 8 9 9 / A- 1 8 9 6 .A presenç a do mutante pré-c ore foi observada em dois c asos de genótipo A, nos quais também a mutaç ão T-1 8 5 8 estava presente, e em um c aso de genótipo D. Contudo, outras m uta ç õ e s ta m b é m fo r a m e n c o n tr a da s , e n tr e a s q ua is destac am-se a T-1 7 6 2 e a A-1 7 6 4 ( Tabela 7 ) .
Os três indivíduos portadores do HB V mutante pré-c ore A-1 8 9 6 / A-1 8 9 9 eram do sexo masc ulino, proc edentes da região metropolitana de B elém e c om idades de 2 2 , 3 4 e 2 9
Ta bela 7 - Rela çã o de tipo s de m uta çõ es pré-co re enco ntra da s no s grupo s A e C.
Grupo A ( 12) Grupo C ( 15) Total ( 27)
Tipo de mutação no % no % no %
T-1858, A-1896 1 8,3 0 - 1 3,7
T-1762, A-1764, T-1858, A-1899 1 8,3 0 - 1 3,7
T-1762, A-1764, T-1858, A-1896, A-1899 1 8,3 0 - 1 3,7
T-1762, A-1764 5 41,8 8 53,2 13 48,2
C-1814 1 8,3 1 6,7 2 7,4
T-1762, A-1764, C-1814 2 16,7 2 13,3 4 14,8
T-1762 0 - 1 6,7 1 3,7
T-1762, A-1764, T-1858 0 - 1 6,7 1 3,7
A, 3 1 % de D e 7 ,4 % de F, e sugeriu que em outros estudos houve uma superestimaç ão do genó tipo F. Em trabalho rec ente, Bertolini e t a l6 demonstraram em três comunidades indígenas
da região Amazônica o predomínio total do genótipo F e em uma quarta 1 0 0 % dos pesquisados pertenciam ao genótipo A, se ndo q ue e sta c o m unidade m antinha um alto gr au de aculturação e contato com populações tri-híbridas.
O genótipo D é o predominante no sul da Europa e parte do Oriente Médio. Ao norte e sudoeste do continente asiático se destacam os genótipos B e C2 7 3 3 3 4. Trabalhos realizados com
aborígenes australianos evidenciaram a presença do genótipo C1.
Ao de s c r e ve r e m o ge nó tipo G, e m pa c ie nte s no r te -americ anos e franc eses c ronic amente infec tados pelo HB V, Stuyver e t a l4 1 observaram que o genótipo A também era o
mais prevalente, c om 5 4 % do total de c asos, seguido do D ( 1 9 % ) , C ( 1 2 % ) , G ( 1 1 % ) , B ( 3 % ) e E ( 1 % ) . Neste estudo, o genótipo F não foi enc ontrado.
Como se pode observar, a extensão geográfica do Brasil, as diferenças regionais de cultura, diferenças de poder aquisitivo, composição étnica, padrões de conforto, educação, dentre outros, c onseguem influenc iar na grande variabilidade não só da prevalência do HBV4 0, como também de seus genótipos de acordo
com a classificação atual no seqüenciamento da região S6 31 39.
Comunidades epidemiologic amente fec hadas c onseguem te r intr o duzido um ge nó tipo e m antê - lo c o m o o únic o c irc ulante, enquanto que aqueles grupos em que ac ontec e a c irc ulaç ão de vários genótipos, as freqüênc ias de oc orrênc ia s ã o va r ia da s e nã o e xis te , a pa r e nte m e nte , a lgum fa to r biológic o do vírus que favoreç a o predomínio de um ou outro genó tipo . A maio r influênc ia, pro vavelmente, se dá pelo s fatores assoc iados à transmissão do HB V.
No presente trabalho, não foi possível mostrar a influênc ia de po ssíve is var iaç õ e s ge no típic as c o m as manife staç õ e s c línic as e a gravidade da doenç a hepátic a c rônic a pelo HB V, c omo já proposto em outros estudos2 0 2 1 4 3 4 5.
A proc ura da mutaç ão pré-c ore A-1 8 9 6 e/ou A-1 8 9 9 nos pac ientes HB eAg negativos, grupos A e C, mostrou que nos 1 2 seqüenc iamentos dos pac ientes assintomátic os, três ( 2 5 % ) possuíam esta mutaç ão, enquanto que em 1 4 pac ientes do grupo sintomátic o HB eAg negativo, em nenhum foi possível m o str ar a m utaç ão . A b aixa pr e valê nc ia de sta m utaç ão , 1 1 , 5 % ( 3 /2 6 ) já era esperada devido a alta prevalênc ia do genótipo A nos grupos estudados.
A mutação pré-core A-1 8 9 6 em pacientes assintomáticos HBeAg negativos foi descrita por diversos autores1 5 2 3 2 9 3 2 em
uma proporção extremamente variável, de 1 7 , 6 % a 5 7 ,2 %, de acordo com a região estudada. Nos locais onde predominam os genótipos B, D ou C, nos pacientes hepatopatas crônicos HBeAg negativos, a mutação pré-core é encontrada em 3 5 % a 1 0 0 % dos casos1 4 1 6 2 3 3 8 4 6, enquanto nos países de maior prevalência
do genótipo A, a mutação A-1 8 9 6 se situa entre 2 8 ,5 % a 4 5 ,2 %, e nc o ntr ada pr inc ipalme nte e m pac ie nte s c o m ge nó tipo s diferentes do A, nestas populações2 9 3 9 4 5.
A presenç a da mutaç ão mesmo em uma freqüênc ia baixa era esperada no grupo C. Por outro lado, a diferenç a entre
o s gr upo s A e C n ã o fo i e s ta tis tic a m e n te s ign ific a n te , denotando não ser este um fator influenc iador na evoluç ão c línic a dos pac ientes em questão.
No presente trabalho, outras mutações nas regiões promotoras do core e pré-core também foram identificadas. Merecem destaque as mutações T-1762 e A-1764, as quais foram encontradas em 76,9% dos casos, incluindo os três grupos. A presença dessas mutações foi descrita por Takahashi e t a l42 43 e Karasawa e t a l2 2, os quais associaram a combinação das mesmas com a mutação A-1896 e descreveram a possibilidade das mutações influenciarem na evolução clínica dos pacientes infectados pelo HBV.
Estudo s futur o s c o m c asuístic as maio r e s de ve r ão se r efetuados para se busc ar uma análise mais abrangente sobre a influênc ia dos genótipos e mutaç ão pré-c ore do HB V na evoluç ão c línic a dos pac ientes c ronic amente infec tados, na Amazônia oriental, assim c omo o signific ado da presenç a das mutaç ões promotora do c ore, T-1 7 6 2 e A-1 7 6 4 .
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