Estudo Molecular de
Vibrio cholerae
não-O1 isolado de zooplâncton
da Baía de São Marcos/São Luis – MA, Brasil
Molecular study of Vibrio cho le ra e
non-O1 isolated from zooplankton
of São Marcos Bay/São Luis – MA, Brasil
Eloisa da Graça do Rosario Gonçalves
1, Nilma Cintra Leal
2e Ernesto Hofer
3RESUMO
O e studo fo i de se nvo lvido co m o o b je tivo de a na lisa r o pe rfil pla sm idia l, pe sq uisa r ge ne s de virulê ncia e ide ntifica r o s pe rfis ge né tico s de 31 ce pa s de Vibrio cholerae nã o O1 iso la da s de zo o plâ ncto n do s e stuá rio s do s rio s Anil e Ba ca nga e m Sã o Luis – MA. O e studo do DNA pla sm idia l re ve lo u a pre se nça de 2 a 3 pla sm íde o s e m 10 ce pa s, co m pe so s m o le cula re s va ria ndo de 5,5 a 40 k ilo b a se s. A rib o tipa ge m re ve lo u um pe rfil co m um a to da s a s ce pa s. A a m plifica çã o do DNA ge nô m ico po r PCR nã o re ve lo u o s ge ne s ctxA, ace e zot, m o stra ndo tra ta r- se de ce pa s nã o pa to gê nica s, e nq ua nto a RAPD- PCR ide ntifico u m últiplo s pe rfis ge né tico s, a cha do co m pa tíve l co m o gra nde po te ncia l de va ria b ilida de de sta e spé cie .
Palavras-chave s: Vibrio cholerae nã o O1. Ba ía de Sã o Ma rco s. Eco lo gia . Estudo m o le cula r.
ABSTRACT
The study wa s de ve lo pe d to a na lyze the pla sm idia l DNA, re se a rch virule nce ge ne s a nd ide ntify ge ne tic dive rsity o f 31 stra ins o f
Vibrio cholerae no n-O1 iso la te d fro m zo o pla nk to n o f the Ba ca nga a nd Anil rive rs in Sã o Luis-MA. The study o f pla sm idia l DNA sho we d 2 o r 3 pla sm ids fro m 10 stra ins b e twe e n 5.5 a nd 40 k ilo b a sis. The re wa s o nly single rib o type pa tte rn. PCR m e tho ds did no t sho w the ge ne s ctxA, ace a nd zot, while RADP-PCR ide ntifie d ge ne tic dive rsity in the stra ins, sho wing the po te ntia l fo r va ria b ility in this spe cie s.
Ke y-words: Vibrio cholerae no n- O1. Sã o Ma rco s b a y. Eco lo gy. Mo le cula r study.
1 . Departamento de Pato lo gia da Universidade Federal do Maranhão , São Luis, MA. 2 . Centro de Pesquisa Ageu Magalhães da Fundaç ão Instituto Oswaldo Cruz, Rec ife, PE. 3 . Labo rató rio de Zo o no ses B ac terianas da Fundaç ão Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro , RJ.
Apo io finac eiro : CAPES
En de r e ço par a cor r e spon dê n ci a: Dra. Elo isa da Graç a do Ro sario Go nç alves. Depto de Pato lo gia/UFMA. Praç a Madre Deus 2 , Térreo , B airro Madre Deus, 6 5 0 2 5 -5 6 0 São Luis, MA
Telefo ne: 5 5 9 8 2 2 1 -0 2 7 0 e-mail: regio nalsbmt@ elo .c o m.br Rec ebido para public aç ão em 1 6 /1 0 /2 0 0 3 Ac eito em 1 9 /0 5 /2 0 0 4
A espéc ie Vi b ri o c h o le ra e, integrante natural da flo ra bacteriana de ambientes aquáticos9 está classificada em 1 4 0
sorogrupos, com base nas características do antígeno somático “O”2 3. Conversões sorológic as foram demonstradas entre os
sorogrupos em condições controladas no laboratório, com perda da aglutinab ilidade de V. c h o le ra e O1 e aquisiç ão de ssa característica por vibrios não-O13 6 2 0.
Pouc os estudos sobre a ec ologia desta bac téria foram de s e n vo lvido s e m c o n diç õ e s n a tur a is . I n ic ia lm e n te , a demonstração dos sorogrupos não-O1 no meio ambiente não costumava despertar a atenção como um potencial problema de saúde públic a c om a identific aç ão do sorogrupo O1 3 9 na etiologia de doença diarréica idêntica à cólera clássica, em 1 9 9 2 ,
nos países banhados pela Baía de Bengala, desfez-se a convicção de que só o sorogrupo O1 seria c apaz de produzir c ólera epidêmica1. Estudos moleculares recentes têm demonstrado o
grande potenc ial de variabilidade genétic a e a dinâmic a de transferência horizontal de genes de virulência entre os diferentes sorogrupos, reforçando o potencial de patogenicidade desta espécie7 1 2.
Ta bela 1 - Distribuiçã o têm po ro -espa cia l de 31 iso la do s de Vibrio cholerae nã o O1, nã o O139 subm etido s a estudo m o lecula r – Sã o Luis/MA ( o utubro de 1997 a o utubro de 1998) .
Isolados bacterianos Rio Bacanga Rio Anil Ano/ mês Estação 1 Estação 2 Estação 1 Estação 2 1997
dez - - - 1; 2a; 2b* ; 3; 4* * 1998
jan 5; 6; 7; 8; 9 - -
-fev 10; 13; 14 11; 12 - -mar 17 15; 16 21* * 18; 19; 20* * ; 22 abr 23; 24; 29; 25; 26; 27; 28; -
-30; 31* * * ; 32 33; 34; 35
* Vibrio a lgino lyticus; * * V. pa ra ha em o lyticus; * * * Vibrio sp
desenvolvido com o objetivo de analisar o perfil genético, assim como pesquisar a existência de genes de virulência em cepas de
Vib rio cho le ra e isoladas em amostras de zooplâncton coletadas no referido ambiente.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras de zooplancton foram coletadas de Outubro de 1 9 9 7 a Outubro de 1 9 9 8 , em intervalos mensais, elegendo-se duas estações fixas de amostragem ( 1 e 2 ) , nos estuários dos rios Anil e Bacanga, os quais deságuam na Baía de São Marcos, São Luis - MA. Foi empregada no processo, rede de plâncton, confeccionada em malha de 6 5 mm de abertura, em arrastos horizontais, subsuperficiais, por 5 minutos, cobrindo raio de c in c o m e tr o s . Am o s tr a s de 4 0 0 m l de á gua , c o n te n do zooplâncton, foram mantidas em frasco estéril e à temperatura ambiente, sendo submetidas em, no máximo duas horas, ao processo clássico de isolamento bacteriano8.
Para o estudo do DNA plasmidial das c epas isoladas foi empregada a téc nic a de extraç ão do DNA por lise alc alina, sem adiç ão de lisozima4. O material obtido foi submetido à
eletroforese em Gel de Agarose 0 ,6 % em tampão TBE ( Tris-b o r ato 0 ,0 8 9 M; ác ido Tris-b ó r ic o 0 ,0 9 8 M; EDTA 0 ,0 0 2 M) . A migraç ão deu-se em temperatura ambiente, empregando-se c orrente c onstante de 2 0 mA e 1 0 0 V, por duas horas. O DNA foi c orado c om brometo de etídio ( 1 5 mg/ml) e observado em transiluminador de luz ultravioleta ( UV) . O peso molec ular dos plasmídeos foi estimado pela c omparaç ão c om plasmídeos pr e via m e n te c o n h e c ido s , pr e s e n te s n a c e pa c o n tr o le ,
Esc he ric hia c o li 3 9 R8 6 1 .
Para a detecção dos genes de virulência – ctxA ( enterotoxina da cólera) , a ce ( enterotoxina acessória da cólera) e zo t ( toxina da zona ocludens) -o DNA total foi extraído pela técnica descrita por Maniatis e col1 5, sendo empregada PCR em sua amplificação,
com os seguintes iniciadores:
Para o gene ctxA: 5 ’ CTC AGA CGG GAT TTG TTA GGC ACG 3 ’ e 5 ’ TCT ATC TCT GTA GCC CCT ATT ACG 3 ’, descritos por Keasler e Hall1 3
.
Para o gene a c e : 5 ’ AGA GCG CTG CAT TTA TCC TTA TTG 3 ’ e 5 ’ AAC TCG GTC TCG GCC TCT CGT ATC 3 ’.
Para o gene zo t: 5 ’ GCT ATC GAT ATG CTG TCT CCT CAA 3 ’ e 5 ’ AAA GCC GAC CAA TAC AAA AAC CAA 3 ’.
Os dois últimos pares de iniciadores foram construídos a partir de seqüências disponíveis no GenBank, cuja senha de ac esso é AF 1 7 5 7 0 8 , utilizando-se o programa DNAstar. As reações foram preparadas em volume final de 2 5 ml por tubo, contendo 2 0 ng de DNA molde; Tris-HCL 1 0 mM; KCL 5 0 mM; MgCl2 1 ,5 mM; 2 ml de dNTP 2 0 0 mM de cada nucleotídeo ( Pharmacia) ; 2 0 pmo l de c ada “pr imer ” e 1 U de Taq DNA po limer ase ( Pharmacia) . Em cada partida de amplificação foi incluído um c o ntr o le po sitivo ( DNA da c epa de r efer ênc ia V. c h o le ra e
O1 5 6 9 B, Clássico/Inaba) e um controle negativo ( todos os c o m po ne nte s da m istur a de r e aç ão , e xc e to o DNA) . As amplific aç ões foram feitas em termoc ic lador Perkin Elmer,
programado para 30 ciclos de 1 minuto a 92oC para a desnaturação
do DNA, 1 minuto a 55oC para anelamento dos iniciadores e 2
minutos a 72oC, para o alongamento ou síntese de DNA, terminando
por uma etapa de 7 minutos a 72oC para alongamento final das fitas.
Dez mic rolitros dos produtos das amplific aç ões foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1 %, no tampão TBE, a 1 0 0 V e 2 0 0 mA. O gel foi corado com Brometo de etídio, sendo o DNA visualizado em transiluminador de luz ultravioleta ( UV) e fotografado em Polaroide.
O perfil genético das cepas foi estudado através de RAPD-PCR, empregando-se os iniciadores 7 8 4 ( 5 ’GCG GAA ATA G 3 ’) e 7 9 1 ( 5 ’ GAG GAC AAA G 3 ’) . As reações foram desenvolvidas em volume final de 2 5 ml por tubo, contendo 2 0 ng de DNA molde; 2 ,5 ml do tampão de raeção 1 0 x concentrado ( tris-HCl 1 0 0 mM; KCl 5 0 0 mM; MgCl2 3 ,0 mM; 2 ,5 ml de dNTP 2 0 0 mM ( Pharmacia) . Foi utilizado termociclador ( Perkin Elmer) programado para 3 0 ciclos de 1 minuto a 9 4oC, 1 minuto a 3 6oC e 2 minutos a
72oC. Finalmente, 1 0 microlitros dos produtos das amplificações
foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1 %, nas condições anteriormente descritas.
A téc nic a de r ibo tipagem po r PCR, desc r ita po r Ko stman e c o ls1 4, fo i e m pr e ga da , utiliza ndo - se o s inic ia do r e s 1
( 5 ’TTT CTG CAG YGG NTG GAT CAC CTC CTT 3 ’) e 2 ( 5 ’ ACG AAT TCT GAC TGC CMR GGC ATC CA 3 ’) , desenhado s po r Chun e c o l5.
RESULTADOS
Foram obtidos 5 5 isolados de V. c h o le ra e não O1 , 4 8 ( 8 7 ,3 %) provenientes do Rio Bacanga e 7 ( 1 2 ,7 %) , do Rio Anil, dos quais 3 1 foram submetidos ao estudo molec ular. Estes isolados são provenientes das amostras coletadas entre os meses de dezembro de 1 9 9 7 e abril de 1 9 9 8 , estando a distribuição temporal e espac ial representada na Tabela 1 . Um isolado de
V. a lgino lyticus, três de V.pa ra ha e m o lyticus e 1 de Vib rio sp foram incluídos no estudo a título experimental e para confronto com o perfil de V. cho le ra e.
Não foram detectados os genes de toxigenicidade ctxA, zo t
ou a c e em nenhum dos 3 1 isolados, pela técnica de PCR. Nas Figuras 2 e 3 estão representados os produtos da RAPD-PCR. Com o emprego do iniciador 7 9 1 foram identificados 1 3 perfis genéticos diferentes, com amplificação de 2 a 9 bandas entre 6 0 0 e 2 0 0 0 pares de bases, enquanto 7 grupos genotípicos
Fi gu ra 1 - Pro du to s de e xtra ç ã o do DNA pla sm i di a l de c e pa s de Vibrio c ho lerae n ã o O1 . Cr= DNA c ro m o ssô m i c o . Li n h a s C= c o n tro le ( E. c o li 3 9 R8 6 1 ) . Li n h a s 4 e 2 1 + V. parahaemo lytic us. Li n h a s 1 9 , 2 2 - 2 8 , 3 0 , 3 5 + Vibrio c ho lerae n ã o O1 .
foram demonstrados com o iniciador 7 8 4 , havendo amplificação de 2 a 4 bandas, variando entre 1 5 0 a mais de 2 0 0 0 pares de bases.
A ribotipagem por PCR mostrou padrão de amplificação idêntico nos 3 1 isolados não O1 , conforme gel representativo mostrado na Figura 4 .
Figura 2 - RAPD-PCR: Produtos de am plificação do DNA de cepas de Vibrio cholerae não O1 com prim er 784 - São Luís/MA ( 1997-1998) . L= ladder, pb= par de bases. Linhas 1, 2a, 3,5-19, 22-30, 32-35=V. cholerae não O1. Linha 2b= V. alginolyticus; Linha 31= Vibrio sp, linhas 4,20,21= V. parahaemolyticus.
Figura 3 - RAPD-PCR: Produtos de am plificação do DNA de cepas de Vibrio cholerae não O1 com prim er 791 - São Luís/MA ( 1997-1998) . L= ladder, pb= par de bases. Linhas 1, 2a, 3, 5-19, 22-30, 32-35=V. cholerae não O1. Linha 2b= V. alginolyticus; Linha 31= Vibrio sp, linhas 4,20,21= V. parahaemolyticus.
DISCUSSÃO
O emprego de técnicas moleculares no estudo da espécie Vibrio c ho le ra e, tem tornado possível um melhor entendimento do potencial de variabilidade genética, de virulência e da dinâmica de transferência horizontal de genes entre diferentes sorogrupos. A presença do cassete VCR, envolvido na expressão do gen sto ( toxina termo-estável) foi demonstrada em sorogrupos diversos de
V. cho le ra e, assim como em outras espécies de Vibrio1 6. Mais rec entemente, foi identific ada por Karaolis et al1 2 a Ilha de
Patogenicidade do V. cho lera e ( VPI) , onde se situa o operon que codifica o pili co-regulado com a toxina, em cepas toxigênicas de
V. cho lera e não O112. Em estudo de 41 isolados de
V. cho lera e não O1, provenientes das regiões Norte e Nordeste do Brasil, foram detectadas seqüências compatíveis com os genes to xT e tcpA em uma proporção das cepas17. Estes dados, aliados à emergência do
sorogrupo O139 como patógeno capaz de produzir doença diarréica semelhante à cólera clássica, reforçam a importância que a espécie
Vibrio cho lera e assume no campo da patologia humana. A presença de plasmídeos em 10 cepas é comparável ao achado de outros pesquisadores que os demonstraram em sorogrupos não O1 de Vibrio cho lera e2 17 18. A função exercida por estas estruturas não está bem definida em V.cho lera e, sendo considerados crípticos, uma vez que a retirada deles por passagens sucessivas in vitro não alterou as características de virulência das cepas bacterianas1 8.
Padrão similar de atividade hemaglutinante, citotóxica e enterotóxica foi constatado entre cepas de V. cho lera e, portadoras ou não de plasmídeos numa evidência de que essas características nem sempre são mediadas por eles2. Contudo, em algumas cepas foram detectados
plasmídeos que abrigavam genes de resistênc ia a múltiplos antibióticos, transferíveis a outros grupos bacterianos.
A ausência dos genes ctxA, a ce e zo t pela técnica de PCR são comparáveis aos resultados encontrados em estudo de cepas ambientais de V. cho lera e O1 e não O1 isoladas antes e durante epidemia de cólera no Estado de São Paulo, o qual demonstrou que os isolados de V. cho lera e O1 relacionados à epidemia continham os genes ctxA e zo t, enquanto os pré-epidêmicos e todos os não O1 eram negativos21 . No entanto, apesar de não ser comum o encontro
de cepas produtoras da toxina termolábil, característica da cólera, em cepas ambientais de V. c ho le ra e não O1 , a produção de citotoxinas e enterotoxinas semelhantes à toxina colérica foi demonstrada em ensaios laboratoriais, demonstrando o potencial de patogenicidade contido nessas cepas11 19 22 25.
A ribotipagem revelou apenas um perfil, evidenc iando a c irc ulaç ão de um únic o ribotipo no ambiente estudado. No entanto, a identificação de múltiplos perfis genéticos entre os 3 1 isolados submetidos à RAPD-PCR corrobora as observações de outros autores quanto ao grande potencial de variabilidade apresentada pela espécie V. cho le ra e1 0 1 2 2 4. Levando-se em conta
a distribuiç ão dos isolados nas 4 estaç ões de amostragem, constata-se que as cepas são, em geral, provenientes do mesmo estuário, ainda que de estações diferentes. No entanto, com o grupo formado c om os isolados 1 7 , 1 8 1 9 e 2 2 , os quais apresentam o mesmo perfil com o iniciador 7 9 1 a procedência foi diversificada, tendo sido o isolado 1 7 obtido de amostra
coletada na estação 1 do rio Bacanga, enquanto os outros 3 são provenientes da estação 2 do rio Anil. Com o iniciador 7 8 4 , com o qual foram definidos 7 perfis distintos, os agrupamentos são formados por maior número de isolados, observando-se que, em relaç ão à distribuiç ão espac ial, repete-se o padrão descrito com o iniciador 7 9 1 . Observou-se, ainda, em relação aos meses de coleta que alguns isolados com perfil idêntico fo r am o b tido s a par tir de amo str as c o le tadas e m me se s diferentes, como no caso dos isolados 1 3 , 1 4 ( fevereiro/9 8 ) , 1 5 e 1 6 ( m a r ç o /9 8 ) . Es ta s o b s e r va ç õ e s s uge r e m um c o m po r ta m e n to din â m ic o da e s pé c ie , c o n dic io n a do , provavelmente, pelas variações das condições ambientais, as quais poderiam selecionar a predominância de determinado genótipo em épocas e locais diferentes.
AGRADECIMENTOS
À equipe do Departamento de Microbiologia, do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ, Rec ife-PE, pelo apoio técnico no processamento das amostras
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 . Alb er t MJ. Per so nal r eflec tio ns o n disc o ver y o f Vi b ri o c h o le ra e O1 3 9 syno nym B engal: a tribute to team wo rk and internatio nal c o llabo ratio n. Jo urnal o f Diarrho eal Disease Researc h 1 1 : 2 0 7 -2 1 0 , 1 9 9 3 .
2 . B arj a JL, Santo s I, Huq I, Co lweel, RR, To ranzo AE. Plasmids and fac to rs assoc iated with virulenc e in environmental isolates of Vi b ri o c h o le ra e non-O1 in B angladesh. Jo urnal o f Medic al Mic ro bio lo gy 3 3 : 1 0 7 -1 1 4 , 1 9 9 0 .
3 . B hattac harj i LM, B o se B . Field and labo rato ry studies o n transfo rmatio n o f the V.c h o le ra e in the maintenanc e o f c ho lera endemic ity: a preliminary repo rt. Indian Jo urnal o f Medic al Researc h 5 2 : 7 7 7 -7 9 0 , 1 9 6 4 .
4 . B irnbo im HC, Do ly J. A rapid alkaline extrac tio n pro c edure fo r sc reening rec o mbinant plasmid DNA. Nuc leic Ac ids Researc h 7 :1 5 1 3 -1 5 2 3 , 1 9 7 9 .
5 . Ch un J , Huq A, c o lwe ll R R . An a lys is o f 1 6 S- 2 3 S r R NA in te r ge n ic s pa c e r r e gio ns o f Vi b ri o c h o le ra e and Vi b ri o m i m i c u s. Applie d and Enviro nmental Mic ro bio lo gy 6 5 : 2 2 0 2 -2 2 0 8 , 1 9 9 9 .
6 . Co lwe e l RR, Huq A, Cho wdhur y MAR, B r ayto n PR, Xu B . Se r o gr o up c onversion of Vi b ri o c h o le ra e. Canadian Journal of Mic robiology 4 1 : 9 4 6 -9 5 0 , 1 -9 -9 5 .
7 . Heidelberg JF, Elsen JA, Nelso n WC, Clayto n RA, Gwinn ML, Do dso n RJ, Haft DH, Hic key EK, Peterso n JD, Umayam L, Gill SR, Nelso n KE, Read TD, Tettelin H, Ric hardso n D, Ermo laeva MD, Vamathevan J, B ass S, Qin H, Drago l I, Sellers P, Mc Do nald L, Utterbac k T, Fleishman RD, Nierman WC, White O, Salzberg SL, Smith HO, Colwell RR, Mekalanos JJ, Venter JC, fraser CM. DNA sequenc e o f bo th c hro mo so mes o f the c ho lera patho gen Vi b ri o c h o le ra e. Nature 4 0 6 : 4 7 7 -4 8 2 , 2 0 0 0 .
8 . Ho fer E. Méto do s utilizado s para o iso lamento e identific aç ão de Vi b ri o c h o le ra e. Info rme de Pato lo gia Clínic a 1 : 5 -1 8 , 1 9 7 5 .
9 . Huq A, Small EB , West PA, Huq MI, Rahman R, Co lweell RR. Ec o lo gic al relationship between Vi b ri o c ho le ra e and planktonic c rustac ean c opepods. Applied and Enviro nmental o f Mic ro bio lo gy 4 5 : 2 7 5 -2 8 3 , 1 9 8 3 .
1 0 . Jiang SC, Louis V, Choopun N, Sharma A, Huq A, Colwell RR. Genetic diversity o f Vi b ri o c h o le ra e in Chesapeake B ay determined by amplified fragment le n gth po lym o r ph is m fin ge r pr in tin g. Applie d a n d En vir o n m e n ta l o f Mic ro bio lo gy 6 6 : 1 4 0 -1 4 7 , 2 0 0 0 .
1 2 . Ka r a o l i s D KR , S o m a r a S , Ma n e va l D R , J o h n s o n J A, Ka p e r J B . A bac terio phage enc o ding a patho genic ity island, a type-IV pillus and phage rec epto r in c ho lera bac teria. Nature 3 9 9 : 3 7 5 -3 7 9 , 1 9 9 9 .
1 3 . Keasler SP, Hall RH. Detec ting and bio typing V. c h o le ra e O1 with multiplex Po limerase Chain Reac tio n. Lanc et 3 4 1 : 1 6 6 1 , 1 9 9 3 .
1 4 . Ko stman JR, Edlind TD, Lipuma JJ, Stull TL. Mo lec ular epidemio lo gy o f
Ps e u d o m o n a s c e p a c i a de te r m in e d b y Po lym e r a s e Ch a in R e a c tio n Ribo typing. Jo urnal o f Clinic al Mic ro bio lo gy 3 0 : 2 0 8 4 -2 9 8 7 , 1 9 9 2 .
1 5 . Maniatis T, Fr itsc h EF, Samb r o o c k J. Mo le c ular Clo ning: A Lab o r ato r y Manual. Co ld Spring Harbo r Labo rato ry Press, Co ld Spring Harbo r. New Yo rk. 3 6 8 -3 6 9 , 1 9 8 2 .
1 6 . Mazel D, Dyc hinc o B , Webb VA, Davies J. A distinc tive c lass o f integro n in the Vi b ri o c h o le ra e geno me. Sc ienc e 2 8 0 : 6 0 5 -6 0 8 , 1 9 9 8 .
1 7 . Melo FB S. Fato res de virulênc ia em Vi b ri o c h o le ra e das regiõ es No rte e No rdeste do B rasil. Tese de Mestrado . Rec ife, PE, 1 9 9 8 .
1 8 . Nandy RK, Sengupta TK, Mukho padhyay S, Gho se AC. A c o mparative study o f pr o per ties o f Vi b ri o c h o le ra e O1 3 9 , O1 and o ther no n-O1 str ains. Jo urnal o f Medic al Mic ro bio lo gy 4 2 : 2 5 1 -2 5 7 , 1 9 9 5 .
19. Ohashi M, Shimada T, Fulcumi H. “In vitro” production of enterotoxin and hemorrhagic principle by V. cho lera e NAG. Japanese Journal of Medical Science and Biology 25: 179-194, 1972.
20. Pollitzer R. Cholera: Monograph 43. World Health Organization Geneva. Switzerland, 1959.
21. Rivera IG, Chowdhury MAR, Sanchez PS, Sato MI, Huq A, Colweel RR, Martins MT. Detection of cholerae toxin (ctx) and zonula ocludens (zo t) genes in Vibrio cho lera e O1, O139 and non-O1 strains. Journal of Microbiology and Biotechnology 11: 572-577, 1995.
22. Saha PK, Kolley H, Nair GB. Purification and characterization of an extracellular secretogenic non-membrane-damaging cytotoxin produced by clinical strains of
Vibrio cho lera e non-O1. Infection and Immunity 64: 3101-3108, 1996.
23. Shimada T, Arakawa E, Itoh HK, Okitsu T, Matsushima A, Asai Y, Yamai S, Nakazato T, Nair G B, Albert M J, Takeda Y. Extended serotyping scheme for V.cho lera e. Current Microbiology 28: 175-178, 1994.
24. Waldor MK, Mekalanos JJ. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. Science 277: 1910-1914, 1996.
