Efeitos comparativos de vitamina C sobre os efeitos dos anestésicos locais ropivacaína, bupivacaína e lidocaína em condrócitos humanos.

(1)

REVISTA

BRASILEIRA

DE

ANESTESIOLOGIA

PublicaçãoOficialdaSociedadeBrasileiradeAnestesiologia

www.sba.com.br

ARTIGO

CIENTÍFICO

Efeitos

comparativos

de

vitamina

C

sobre

os

efeitos

dos

anestésicos

locais

ropivacaína,

bupivacaína

e

lidocaína

em

condrócitos

humanos

Jun

Tian

∗

_e

_Yan

_Li

DepartamentodeAnestesiologia,HospitalCentralXinxiangdaProvínciadeHenan,Xinxiang,China

Recebidoem16dejaneirode2015;aceitoem26dejaneirode2015 DisponívelnaInternetem28denovembrode2015

PALAVRAS-CHAVE

Condrócitos; VitaminaC; Anestésicoslocais; Ropivacaína; Bupivacaína; Lidocaína

Resumo

Justificativa: Injeçõesdeanestésicoslocaisporviaintra-articularsãocomumenteusadaspara melhoraraanalgesianoperíodopós-operatóriodecirurgiaortopédicacomo artroscopia.No entanto, relatosrecentesde complicações graves devidoaousode anestésicolocal porvia intra-articularcausoupreocupações.

Objetivos: OobjetivodoestudofoiavaliarousodevitaminaCparareduzirosefeitosadversos dosanestésicosmaiscomumenteusados(ropivocaína,bupivacaínaelidocaína)sobre condró-citoshumanos.

Métodos: Aviabilidadedoscondrócitosapósaexposic¸ãoàbupivacaínaa0,5%ouropivacaínaa 0,75%oulidocaínaa1,0%e/ouvitaminaCemdosesde125,250e500␮Mfoideterminadapelo ensaioVivo/Mortoecolorac¸ãocomanexinaV.Osníveisdeexpressãodascaspases3e9foram

avaliadoscomousodeanticorpospelatécnicaWesternblotting.Citometriadefluxofoifeita paraanalisaragerac¸ãodeespéciesreativasaooxigênio.

Resultados: Naexposiçãoaosanestésicoslocais,condrotoxicidadefoiencontradanaseguinte ordem:ropivacaína<bupivacaína<lidocaína.AvitaminaCefetivamentemelhorouaredução daviabilidadedoscondrócitosediminuiuosníveiselevadosdeapoptoseapósaexposiçãoà anestesia.Emdosesmaisaltas,avitaminaCfoieficienteparareduzirageraçãodeespécies reativasaooxigênioeassimregularnegativamenteaexpressãodascaspases3e9.

Conclusões: Observamos que avitamina Cfoi eficaz naprotec¸ão dos condrócitos contra a agressãotóxicadosanestésicoslocaisropivacaína,bupivacaínaelidocaína.

∗_Autor_para_{correspondência.}

E-mail:juntian2004@gmail.com(J.Tian).

http://dx.doi.org/10.1016/j.bjan.2015.11.004

(2)

KEYWORDS

Chondrocytes; VitaminC; Localanesthetics; Ropivacaine; Bupivacaine; Lidocaine

ComparativeeffectsofvitaminContheeffectsoflocalanestheticsropivacaine,

bupivacaine,andlidocaineonhumanchondrocytes

Abstract

Background: Intra-articularinjectionsoflocalanestheticsarecommonlyusedtoenhance post-operativeanalgesiafollowingorthopedicsurgeryasarthroscopicsurgeries.Nevertheless,recent reportsofseverecomplicationsduetotheuseofintra-articularlocalanesthetichaveraised concerns.

Objectives:ThestudyaimstoassessuseofvitaminCinreducingadverseeffectsofthemost commonlyemployedanesthetics--- ropivacaine,bupivacaineandlidocaine---onhuman chon-drocytes.

Methods:Thechondrocyteviabilityfollowing exposureto0.5%bupivacaineor0.75% ropiva-caine or1.0%lidocaineand/or vitaminCatdoses125,250 and500␮M wasdetermined by Live/DeadassayandannexinV staining.Expressionlevelsofcaspases3and9wereassessed

usingantibodiesbyWesternblotting.Flowcytometrywasperformedtoanalyzethegeneration ofreactiveoxygenspecies.

Results:On exposuretothelocal anesthetics, chondrotoxicitywasfound intheorder ropi-vacaine<bupivacaine<lidocaine. Vitamin C effectively improved the reduced chondrocyte viabilityanddecreasedtheraisedapoptosislevelsfollowingexposuretoanesthesia.Athigher doses,vitaminCwasfoundefficientinreducingthegenerationofreactiveoxygenspeciesand aswelldown-regulatetheexpressionsofcaspases3and9.

Conclusions:VitaminCwasobservedtoeffectivelyprotectchondrocytesagainstthetoxicinsult oflocalanestheticsropivacaine,bupivacaineandlidocaine.

Introduc

¸ão

Os anestésicos locais são comumente usados em várias situaçõesclínicasparaaprevençãoouoalíviodador sinto-mática.Duranteapráticadaortopedia,sãoadministrados pormuitas vias,como espinal, epiduralouintra-articular, paraoalíviodadornopós-operatóriooucomouma modali-dadenotratamentodeosteoartrite.Váriosestudosclínicos demonstraramqueainjeçãointra-articulardeanestésicos locaistemtaxaselevadasdesucessoquandoadministrada paraanalgesianopós-operatório.1-3

A preocupac¸ão com os efeitos prejudiciais dos

anes-tésicos locais veio a público quando vários estudos de

caso demonstraram toxicidade grave em cartilagem e

condróliseapósinfusõesdeanestésicolocalnaarticulac¸ão

glenoumeral após artroscopia.4-8 _Como _as _evidências _de

condrotoxicidadedevidoaanestésicoslocaisestão

aumen-tando, pesquisas sobre o uso de outras substâncias para

inibiroureduziratoxicidadeestãosendofeitas.Em

cirur-gias ortopédicas, alémdos efeitos dos anestésicos locais,

a limitac¸ão do potencial de cura da cartilagem articular

hialinatambéméproblemabemconhecido.9

Entre os anestésicos locais que são usados com mais

frequênciaparaoalíviodador,lidocaínaebupivacaínasão

membrosdogrupoamida,masotempodeac¸ãodalidocaína

écercademetadedaqueledebupivacaína.10_Ropivacaína_é

umanestésicolocaldotipoamino-amida,deac¸ão

prolon-gada,quepertenceaogrupodaspipecoloxilididaseeéum

substitutopromissorparabupivacaínapararaquianestesia.1

Contudo,estudosrecentesdemonstraramosefeitos

deleté-riosdessesanestésicossobreoscondrócitos.11-14_Lo_et_al.14

mostraramque bupivacaína,ropivacaínae lidocaína

apre-sentamumefeitonegativodeformadependentedadosee

dadurac¸ãosobreaviabilidadedoscondrócitos.

Estudosinvitromostraramquelidocaínaebupivacaína

podemter efeitos citotóxicos sobreosneurônios e

mióci-tos. Amorte celularocorre tanto pornecrosequanto por

apoptose.15,16_Em _{condrócitos,}_a_exposic_¸ão_a_esses

anesté-sicostambémlevaàmortecelularporapoptoseenecrose

deumaformadependentedadoseedadurac¸ão.1,17_Fedder

etal.18_relataram_que_a_exposic_¸ão_à_{ropivacaína,}_lidocaína_e

bupivacaína reduziu a viabilidade dos fibroblastos, o que

estáligadoàgerac¸ãodeespéciesreativasdeoxigênio(ERO).

Apoptose éumprocesso altamenteregulado, diferentede

necrose,queocorreemrespostaatrauma,toxinas,citocinas

eagentespatogênicos.19,20_Portanto,_a_inibic_¸ão_da_apoptose

de condrócitosfoi descrita como um meiopotencial para

reduziraperdadecondrócitos.20,21

Asvitaminassãoconsideradasvitais.AvitaminaC,uma

substância exógena solúvel em água,22 _é _um _cofator _na

construc¸ão de vasos sanguíneos e assume o papel de um

antioxidante,23 _atua_como_um_doador_de_elétrons_e_agente

redutor e,assim, impedeaoxidac¸ão delípidos, proteínas

eDNA.24 _Há_um_{reconhecimento} _crescente_da_importância

defatoresnutricionaisparaamanutenc¸ãodasaúdeósseae

articular.25 _A_matriz_óssea_contém_mais_de_90%_das

proteí-nas,comocolágeno,26_e_a_vitamina_C_é_um_cofator_essencial

paraaformac¸ãodecolágenoesíntesedehidroxiprolinae

hidroxilisina.27 _Portanto,_a_vitamina _C_pode_ajudar_no

for-talecimento dos ossos e prevenir fraturas. Deficiência de

vitamina C induzida experimentalmente em animais leva

(3)

Umestudocomacompanhamentopor17anosconduzidopor

Sahnietal.29_demonstrou_que_a_suplementac_¸ão_de_vitamina

Cdiminuio riscodefratura dequadrile osteoporose.Por

conseguinte,considerandoosefeitosdavitaminaC,o

pre-sente estudo investigouse a vitamina C inibea perda de

condrócitoseprotegeacartilagemcontraosefeitos

adver-sosdeanestésicoslocais.

Métodos

Produtosquímicosecélulas

Condrócitos humanos normais foram adquiridos da

Pro-mocell, Alemanha, e colocados em meio de cultura, sob

condic¸ões laboratoriais padrão (atmosfera umidificada de

95% dear e 5% deCO2 a37◦C).A culturade condrócitos

em monocamadahá muitoéusada comoummétodopara

aavaliac¸ãoin vitroderespostascelulares aotratamento.

Ascélulasnapassagem5foramsemeadasaumadensidade

de103_células/cm2_em_placas_de₉₆_poc_¸os_e_cultivadas_até

75-80% deconfluência. Aoatingir a confluência desejada,

ascélulasforamexpostas aosanestésicos locais.Todosos

produtosquímicosusadosnoestudoforamobtidosde

Sigma--Aldrich,MO,EUA;casocontrário,elessãomencionados.

Exposic¸ãoanestésica

Oscondrócitosforamexpostosduranteumahoraa1mLdas

soluc¸õesdosanestésicoslocaisbupivacaínaa0,5%ou

ropi-vacaínaa0,75%oulidocaínaa1,0%.21,30 _Todas_as_amostras

foram tratadas com o uso do mesmo protocolo.

Especi-ficamente, o meio de cultura foi aspirado; 1mL de soro

fisiológico normal a 0,9% oude anestésico foi adicionado

acadapoc¸o;asamostrasforamincubadasemCO2a5%ea

37◦_C_por₆₀_minutos;_e_a_soluc_¸ão_de_tratamento_foi_aspirada

eomeiodeculturafrescofoiadicionado.Asamostrasforam

devolvidasaoincubadoreaviabilidadedoscondrócitosfoi

medida 24horas mais tarde. Em experiências separadas,

logo após a exposic¸ão àanestesia, as célulasforam

incu-badasem meiofrescosuplementadocomvitamina C (125

ou250 ou 500␮M) por 24horas e, em seguida, ascélulas

foramavaliadasparaaviabilidade.

Análisedeapoptose

Os condrócitos expostos aos anestésicos e/ou vitamina C

foramlavadoscomPBSeusadosparaaanálisedeviabilidade

celular.Paramediraapoptose,oensaioparaaviabilidade

celular Vivo/Morto (kit de viabilidade celular Live/Dead,

Invitrogen)foifeito.Oensaiodetectaaatividadeda

este-raseintracelular ea integridadedamembranaplasmática

paraavaliaraviabilidadedascélulas.Oscondrócitos,

célu-las tratadasounãotratadas comanestesia e/ouvitamina

C,foramcoradoscom5␮mol/Ldehomodímerodeetídioe

5␮mol/Ldecalceína-AMeincubadosa37◦_C_por₃₀_minutos.

Ascélulasforamentãoanalisadassobummicroscópiode

flu-orescência,NikonLabophot-2.Oscondrócitosvivosretêma

calceína-AM, umcorante polianiônico não fluorescente,e

produzemumafluorescênciaverdepormeiodaconversão

(esterase) enzimática. Subsequentemente, o homodímero

de etídio entra nas membranas danificadas das células

mortas,liga-seaosácidosnucleicosedáorigemauma

flu-orescênciavermelha.

A apoptose também foi detectada por mensurac¸ão da

perdadeassimetriadamembranaao seavaliarem as

pro-priedadesdeligac¸ãodaanexinaV.Apropriedadedeligac¸ão

daanexina V foi avaliada com o uso do kit de colorac¸ão

de anexina V (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA,

EUA).Os anticorpos antianexina V foramconjugados com

um corante de fluoresceína isotiocianato (FITC).

Resumi-damente,1×106_células_foram_expostas_à _bupivacaína_ou

ropivacaína ou lidocaína por umahora após o tratamento

comvitaminaC,ouapenasaquelesexpostosaos

anestési-cosforamsubmetidosàcolorac¸ãocomanexinaV.Ascélulas

foramlavadasemPBS,suspensasnovamenteemtampãode

ligac¸ãode100␮L,comanticorpo antianexinaVconjugado

comFITC,edepoisanalisadascomcitometriadefluxo(FACS

Calibur,BDBiosciences).

Westernblot

Para saber se a ativac¸ão da caspase estava envolvida na

iniciac¸ão da apoptose após a exposic¸ão aos anestésicos

locais,umaanáliseadicionalcomométodoWesternblotfoi

feitaparadeterminaraexpressãodascaspases3e9,com

ousodosrespectivosanticorpos(CellSignalingTechnology,

Danvers,MA,EUA).Paraoisolamentodasproteínas

celula-restotais,ascélulasforamlisadasemtampãodelisecelular

(CellSignaling Technology, Danvers, MA, EUA)e

processa-dasdeacordocomasinstruc¸õesdofabricante.Asproteínas

foramentão fracionadas por SDS-PAGE, eletrotransferidas

paramembranasdenitrocelulose,marcadascomseus

res-pectivosanticorposedetectadasporquimioluminescência

avanc¸ada(GEHealthcare).Ossinaisdafaixadeoutras

pro-teínasforamnormalizadosparaosde␤-actinacomousode

anti-␤-actinaemdiluic¸ãode1:2000(CellSignaling

Techno-logy,Danvers,MA,EUA).

Determinac¸ãodeespéciesreativasdeoxigênio (ERO)

Agerac¸ãodeEROintracelularfoimedidaporcitometriade

fluxo,comousodecolorac¸ãocom2’,7’-diclorofluoresceína

diacetato(DCFH-DA).DCFH-DAéumcompostonão

fluores-centeque podeser enzimaticamente convertido em DCF,

umcompostoaltamentefluorescentenapresenc¸adeERO.

Apósaexposic¸ãoaoanestésicoe/ouvitaminaC,ascélulas

foramadicionalmenteincubadascomDCFH-DA(10␮M)por

30minutosa37◦_C_no_escuro._{Subsequentemente,}_as

célu-las foramlavadasduas vezes comPBS e aintensidade da

fluorescênciafoimedidaporcitometriadefluxo.31

Análiseestatística

Osresultadossãorepresentadoscomomédia±DP.Os

valo-resdep<0,05foramconsideradossignificativos,conforme

determinadoporumaanálisedevariância(Anova).As

aná-lisesforamfeitascomaversão17.0doprogramaestatístico

(4)

∗

100

75

50

25

0

Controle

Viabilidade celular, %

Controle

Bupivacaína + 250 µM vitamina C Bupivacaína + 500 µM vitamina C

Bupivacaína + 125 µM vitamina C Bupivacaína a 0,5%

Ropivacaína + 250 µM vitamina C

Ropivacaína a 0,75%

Ropivacaína + 250 µM vitamina C Ropivacaína + 500 µM vitamina C Lidocaína a 1,0%

Lidocaína + 500 µM vitamina C

Lidocaína + 125 µM vitamina C Lidocaína + 250 µM vitamina C Bupivacaína Ropivacaína Lidocaína

Figura1 InfluênciadevitaminaCsobreaviabilidadecelulardecondrócitos.Osvaloressãoexpressoscomomédia±DP;n=6. *Representap<0,05,comparadocomcontroles,conformedeterminadopelaanálisedevariânciasimples,Anova.

Resultados

AvitaminaCmelhoraaviabilidadedoscondrócitos apósaexposic¸ãoaanestésicos

A viabilidade dos condrócitos em resposta à exposic¸ão a

anestésicofoi analisada com o uso doensaio Vivo/Morto.

Apósaexposic¸ãodasculturasdecondrócitosaos

anestési-coslocaispor24horas,acondrotoxicidadeobservadacom

lidocaína a 1% foi quase duas vezes maior do que a de

ropivacaína a0,75% (fig. 1). Houveuma diminuic¸ão

acen-tuada na percentagem de viabilidade das células após a

exposic¸ãoàlidocaína,ropivacaínaoubupivacaína.

Compa-randoasconcentrac¸õesequipotentesderopivacaína(0,75%)

ebupivacaína(0,5%),astaxasdeviabilidadecelularforam

significativamentemaiselevadas24horasapósotratamento

comropivacaína a 0,75% doque combupivacaína a0,5%.

A condrotoxicidade foi mais pronunciada na exposic¸ão à

lidocaínaseguida porbupivacaína.Aexposic¸ãoàvitamina

Capósa anestesiaresultou emumamelhoria significativa

(p<0,05) na percentagem de viabilidade celular. As

con-tagensviáveisdecondrócitossubiramcomoaumentodas

concentrac¸ões de vitamina C. A concentrac¸ão de 500␮M

causou um aumento acentuado da viabilidade dos

con-drócitos, em comparac¸ão com doses mais baixas (125 e

250␮M).

Aapoptosedos condrócitosapósa exposic¸ãoà

aneste-siatambémfoidetectadapormeiodamensurac¸ãodaperda

deassimetriadamembranapor colorac¸ãocom anexinaV.

A contagem de células em apoptose foi acentuadamente

maior(p<0,05)após aexposic¸ãoà anestesia.Ropivacaína

a 0,75% causou apoptose consideravelmente mais baixa,

emcomparac¸ãocom lidocaína a1%e bupivacaínaa0,5%.

Aincubac¸ãocomvitaminaCresultouemaumentoda

percen-tagemdeviabilidade,comcontagensdiminuídasdecélulas

em apoptose.Vitamina Cem concentrac¸ão de500␮Mfoi

maispotenteparareduziraapoptoseapósaexposic¸ãoaos

anestésicoslocaisdoqueemdosesmaisbaixas(fig.2).

AvitaminaCsuprimeaapoptoseporsubregulac¸ão daexpressãodascaspases3e9

Paraavaliaropossívelenvolvimentodaativac¸ãodecaspases

emcondrotoxicidadeinduzidaporanestesia,aexpressãoda

caspases 3e 9 foi determinada24horas após a exposic¸ão

à anestesia. Uma horade exposic¸ão aos anestésicos

cau-sousobrerregulac¸ãodacaspase-3edacaspase-9daseguinte

forma:lidocaína>bupivacaína>ropivacaína(fig.3).Embora

ropivacaínaa0,75%tenhacausadooaumentodaexpressão

dascaspases,verificou-sequeesseaumentonãofoi

signifi-cativo em relac¸ão aoscondrócitos controlesnão expostos

aos anestésicos. No entanto, lidocaína a 1% resultou em

melhoria acentuadadonível deexpressão,o queindica a

ativac¸ãodacascatadecaspasesnaapoptose.Aincubac¸ão

com vitamina C para 24horas reduziu acentuadamente a

expressãodascaspasesdeformadependentedadose,oque

está deacordo com osresultados doensaio Vivo/Mortoe

dacolorac¸ão comanexinaV. AvitaminaC a250e 500_␮M

foi mais eficaz em subregular as expressões das caspases

3e9.

InfluênciadavitaminaCnagerac¸ãodeERO

DeterminamososníveisdeEROporcitometriadefluxocom

ousodecolorac¸ãocom2’,7’-diclorofluoresceínadiacetate

(DCFH-DA).Lidocaína,bupivacaínaeropivacaínacausaram

um aumento acentuado na produc¸ão de ERO. Lidocaína

causou uma produc¸ão em dobro deERO, em comparac¸ão

comropivacaína, e quase10% amaisdoquebupivacaína.

Esse aumento, entretanto, foi suprimido em condrócitos

incubados com vitamina C, em comparac¸ão com células

semvitaminaC.OtratamentocomvitaminaCreduziu

sig-nificativamente a produc¸ão de ERO, na seguinte ordem:

125<250<500␮M (fig. 4). A capacidade antioxidante da

vitaminaCpodetersidoresponsável pelasupressão

(5)

100 ₁₀1 a

a

102 ₁₀3 ₁₀4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

100 ₁₀1 b

102 ₁₀3 ₁₀4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

100 ₁₀1 c

102 ₁₀3 ₁₀4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

100 ₁₀1 d

102 ₁₀3 ₁₀4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

100 ₁₀1 e

102 ₁₀3 ₁₀4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

100 ₁₀1 f

102 ₁₀3 ₁₀4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

100 ₁₀1 g

102 ₁₀3 ₁₀4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

100 ₁₀1 h

102 ₁₀3 ₁₀4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

100 ₁₀1 i

102 ₁₀3 ₁₀4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

100 ₁₀1 j

102 ₁₀3 ₁₀4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

100 ₁₀1 k

102 ₁₀3 ₁₀4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

100 ₁₀1 l

102 ₁₀3 ₁₀4

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

∗

_∗

∗

_∗

∗

100

b

75 50 25 0 Controle

Contagem de células apoptóticas, %

Controle

Bupivacaína + 250 µM vitamina C Bupivacaína + 500 µM vitamina C

Bupivacaína + 125 µM vitamina C Bupivacaína a 0,5%

Ropivacaína + 125 µM vitamina C

Ropivacaína a 0,75%

Ropivacaína + 250 µM vitamina C Ropivacaína + 500 µM vitamina C Lidocaína a 1,0%

Lidocaína + 125 µM vitamina C Lidocaína + 250 µM vitamina C

Bupivacaína Ropivacaína Lidocaína

Figura2 Condrotoxicidadeinduzidaporexposic¸ãoaanestésicos:(a)bupivacaínaa0,5%;(e)lidocaína a1%;(i)ropivacaínaa 0,75%.VitaminaCsobreosefeitosdosanestésicos:(b)bupivacaínaa0,5%+125␮MdevitaminaC;(c)bupivacaínaa0,5%+250␮M devitaminaC;(d)bupivacaínaa0,5%+500␮MdevitaminaC;(f)lidocaínaa1%+125␮MdevitaminaC;(g)lidocaínaa1%+250␮Mde vitaminaC;(h)lidocaínaa1%+500␮MdevitaminaC;(j)ropivacaínaa0,75%+125␮MdevitaminaC;(k)ropivacaínaa0,75%+250␮M devitamina C; (l)ropivacaínaa 0,75%+500␮M devitamina C. Contagens decélulas em apoptose. Valoresapresentados como média±DP;n=6.*Representap<0,05,comparadocomcontroles,conformedeterminadopelaanálisedevariânciasimples,Anova.

Discussão

Injec¸ões intra-articulares de anestésicos locais são

admi-nistradas com frequênciaem ambientes perioperatóriose

ambulatoriais.32_As_injec_¸ões_{intra-articulares}_de_anestésicos

locaismelhoramaanalgesianoperíodopós-operatório.1,2,33

Lidocaína,bupivacaínaeropivacaínasãoanestésicoslocais

(6)

∗ ∗

∗

∗ ∗

∗

200

150

100

50

0

Expressão relativa, %

Controle

Bupivacaína + 250 µM vitamina C Bupivacaína + 500 µM vitamina C Bupivacaína a 0,5%

Ropivacaína a 0,75% Ropivacaína + 125 µM vitamina C Ropivacaína + 500 µM vitamina C

Controle Bupivacaína

Bupivacaína L1

a

b

c

d

L5 L4 L3 L2

Ropivacaína

Lidocaína

Bupivacaína L5

L4 L3 L2 L1

Ropivacaína

Lidocaína

Controle

Bupivacaína + 125 µM vitamina C

Ropivacaína + 250 µM vitamina C Lidocaína a 1,0%

∗ ∗ ∗

∗ ∗

∗ _∗

200

150

100

50

0

Expressão relativa, %

Controle

Bupivacaína + 250 µM vitamina C Bupivacaína+ 500 µM vitamina C Bupivacaína a 0,5%

Controle

Figura3 EfeitodavitaminaCnasexpressõesdacaspase-3(aeb)ecaspase-9(ced)emcondrócitosapósexposic¸ãoaanestésicos. L1, controle; L2, anestésico isolado; L3, anestesia+125␮M de vitamina C; L4, anestesia+250␮M de vitamina C; L5, aneste-sia+500␮M devitamina C.(be d)Valoresapresentadoscomo média±DP;n=6(bed). *Representap<0,05, comparadocom controles,conformedeterminadopelaanálisedevariânciasimples,Anova.

efeitos adversos desses três anestésicos locais sobre

con-drócitosarticularesinvitro.1,11

Váriosestudosdescreveramefeitosprejudiciaisde

anes-tésicos locais sobre a viabilidade dos condrócitos. Chu

et al.34 _demonstraram _grave _toxicidade _de _{bupivacaína.}

O estudo evidenciou a exposic¸ão à bupivacaína a 0,5% e

> 99% dos condrócitos bovinos foram encontrados mortos

em todasas culturas expostas. Gomollet al.35 _relataram

acentuadas alterac¸ões histopatológicas e metabólicas em

articulac¸õesdecoelhoscominfusãocontínuadebupivacaína

a0,25%,comesemepinefrina.Relatou-sequedosesde

lido-caínaa1%e2%apresentaramtoxicidadeemcondrócitos.11

∗ ∗

∗

∗ ∗

∗

∗ 200

150

100

50

0

Espécies reativas de oxigênio, %

Controle

Bupivacaína + 250 µM vitamina C Bupivacaína + 500 µM vitamina C Bupivacaína a 0,5%

Controle

(7)

Além disso, toxicidade em condrócitos foi relatada por

Pipere Kim1 _após_a_exposic_¸ão _de_explantes_de_cartilagem

humana e condrócitos aos anestésicos locais bupivacaína

e ropivacaína. Corroborando relatosanteriores, em nosso

estudo, bupivacaína a 0,5%, ropivacaína a 0,75% e

lido-caína a 1% induziram apoptose e reduziram a viabilidade

dos condrócitos. Observamos que lidocaína foi

potenci-almente mais tóxica do que bupivacaína e ropivacaína.

Semelhantemente a estudos anteriores, descobriu-se que

ropivacaínafoimenoscondrotóxicadoquebupivacaínaem

condrócitoshumanos.1,36 _A _vitamina_C _melhorou_de_forma

significativaaviabilidade celulardoscondrócitos.Estudos

demonstraramoefeitopositivodavitaminaCnasaúdedos

ossos.29

Aapoptosepodeserinduzidapormeiodevias

intrínse-caseextrínsecas,ambasenvolvemaativac¸ãodecaspases

celulares.Caspasessãoenzimasimportantesenvolvidasna

regulac¸ãodaclivagemproteolíticaaltamenteespecíficade

proteínas celulares quelevam à morte celular.Evidências

sugeremqueacaspase-3 tambémpodeestarenvolvidana

fragmentac¸ãodoDNA.21_No_nosso_estudo,_observamos_que_os

anestésicoslocais----lidocaína,bupivacaínaeropivacaína

----induziramníveisdeexpressãodecaspasequesãoindicativos

deinduc¸ãodeapoptoseemcondrócitospormeiodaativac¸ão

decaspases. Perez-Castro etal.16 _demonstraram _ativac_¸ão

das caspases 3 e 7 em célulasdo neuroblastoma humano

após incubac¸ão comlidocaína, ropivacaína e bupivacaína.

Noentanto,avitamina Csuprimiuaexpressão das

caspa-ses 3e 9,o quesugere deformamarcante asuaeficácia

antiapoptótica.

Osmecanismosquelevamàcondrotoxicidadedos

anes-tésicos locais não são totalmente compreendidos. Para

analisar o envolvimento daapoptose mediada por ERO, a

gerac¸ão de ERO nos condrócitos foi avaliada. O aumento

acentuadonagerac¸ãodeEROapósaexposic¸ãoaos

anesté-sicosfoireduzidoparaníveisquasenormaisnasincubac¸ões

de condrócitos com várias concentrac¸ões de vitamina C.

Isso pode ser devido à potente propriedade antioxidante

davitaminaC.AvitaminaCteriaefetivamenteimpedidoa

gerac¸ãodeEROeouneutralizadoasERO.Noentanto,

obser-vamos uma correlac¸ão surpreendente entre a viabilidade

celular,aexpressãodecaspaseseosníveisdaproduc¸ãode

ERO.Parketal.37_mostraram_um_aumento_da_concentrac_¸ão

deEROem correlac¸ãocom amortecelulardascélulasde

Schwannapósincubac¸ãocombupivacaína.Emnossoestudo,

asconcentrac¸õesde EROaumentaram apósa exposic¸ão à

lidocaínaebupivacaína,masníveisnãosignificativosforam

observadosapósaexposic¸ãoàropivacaína.Aumento

seme-lhante na gerac¸ão deERO após a exposic¸ãoa anestésicos

locaisfoirelatadoporGrishkoetal.38

Para resumir, mostramos que ropivacaína a 0,75%,

emboratóxicaparaascélulasdecondrócitoshumanos,após

60minutosde exposic¸ão,está na faixaconsideravelmente

menor de toxicidade em comparac¸ão com bupivacaína a

0,5% e lidocaína a 1%. Entre os anestésicos estudados,

lidocaínaem concentrac¸ãode1%apresentouamaior

con-drotoxicidade.Oaumentodaproduc¸ãodeEROevidenciado

em nosso estudo sugere que a condrotoxicidade pode ser

devidaàapoptosemediadaporERO.Contudo,aincubac¸ão

com vitamina C ofereceu uma protec¸ão significativa aos

condrócitos, que poderia ser atribuída a sua capacidade

antioxidante.

Conclusão

AvitaminaCforneceuprotec¸ãoacentuadaaoscondrócitos

contraosefeitostóxicosdosanestésicoslocais:ropivacaína,

bupivacaínaelidocaína.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

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