Efeitos combinados do ácido zoledrônico e do propranolol sobre a densidade óssea e marcadores bioquímicos de remodelação óssea em ratas osteopênicas submetidas à ovariectomia.

(1)

w w w . r e u m a t o l o g i a . c o m . b r

REVISTA

BRASILEIRA

DE

REUMATOLOGIA

Artigo

original

Efeitos

combinados

do

ácido

zoledrônico

e

do

propranolol

sobre

a

densidade

óssea

e

marcadores

bioquímicos

de

remodelac¸ão

óssea

em

ratas

osteopênicas

submetidas

à

ovariectomia

Deepak

Kumar

Khajuria

a,b,∗

,

Rema

Razdan

a

e

D. Roy

Mahapatra

b

a_Departamento_de_{Farmacologia,}_Faculdade_de_Farmácia_Al-Ameen,_Bangalore,_Índia

b_Laboratory_for_Integrative_Multiscale_Engineering_Materials_and_Systems,_Departamento_de_Engenharia_{Aeroespacial,}_Instituto_Indiano

deCiência,Bangalore,Índia

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo:

Recebidoem1demaiode2014 Aceitoem21desetembrode2014

On-lineem7denovembrode2014

Palavras-chave:

Estudocomratos

Osteoporosepós-menopáusica Ácidozoledrônico

Propranolol

r

e

s

u

m

o

Objetivos:Esteestudofoidesenvolvidoparainvestigara eficáciaeaseguranc¸adoácido

zoledrônico(ZOL)edopropranolol(PRO)comomonoterapiaeterapiacombinadaemum modeloderatocomosteoporosepós-menopáusica.

Métodos:RatasWistarfêmeasforamovariectomizadas(OVX)ousubmetidasàcirurgia

simu-lada(placebo)aostrêsmesesdeidade.Dozesemanasdepoisdacirurgia,asratasforam divididasemseisgrupos:(1)placebo+veículo;(2)OVX+veículo;(3)OVX+ZOL(100␮g/kg, doseúnicaintravenosa);(4)OVX+ZOL(50␮g/kg,doseúnicaintravenosa);(5)OVX+PRO (0,1mg/kg,viasubcutânea,cincodiasporsemana);(6)OVX+ZOL(50␮g/kg,doseúnica intravenosa)+PRO(0,1mg/kg,viasubcutânea,cincodiasporsemana)durante12semanas. Depoisdotratamento,testou-seadensidadeóssea,aporosidadeeamicroarquitetura tra-beculardosfêmures.Tambémforamavaliadosmarcadoresbioquímicosséricoseurinários.

Resultados: AterapiacombinadacomZOLmaisPROfoimaiseficazemcorrigiradiminuic¸ão

docálcioséricoeoaumentodonívelséricodefosfatasealcalinaefosfataseácidaresistente aotartaratodoqueamonoterapiacomZOLouPRO.Alémdisso,aterapiacombinadacom ZOLmaisPROfoimaiseficazemcorrigiroaumentodosníveisurináriosdecálcio,fósforoe creatininadoqueamonoterapiacomZOLouPRO.AterapiacombinadacomZOLmaisPRO tambémpreservouamicroarquiteturatrabeculareaporosidadedoossocortical.

Conclusão:OsresultadossugeremqueaterapiacombinadacomZOLmaisPROpodesera

abordagemmaiseficazparaotratamentodaosteoporosegraveemhumanos.

∗ _Autor_para_{correspondência}_.

E-mail:deepakkumarkhajuria@yahoo.co.in(D.K.Khajuria).

http://dx.doi.org/10.1016/j.rbr.2014.09.006

(2)

Additive

effects

of

zoledronic

acid

and

propranolol

on

bone

density

and

biochemical

markers

of

bone

turnover

in

osteopenic

ovariectomized

rats

Keywords:

Ratmodel

Postmenopausalosteoporosis Zoledronicacid

Propranolol

a

b

s

t

r

a

c

t

Objectives: Thepresentstudywasdesignedtoinvestigatefurthertheefficacyandsafetyof

zoledronicacid(ZOL)andpropranolol(PRO)asmonotherapyandcombinationtherapyina ratmodelofpostmenopausalosteoporosis.

Methods: FemaleWistarratswereovariectomized(OVX)orsham-operatedat3monthsof

age.Twelveweekspost-surgery,ratswererandomizedintosixgroups:(1)sham+vehicle; (2)OVX+vehicle;(3)OVX+ZOL(100␮g/kg,i.v.singledose);(4)OVX+ZOL(50␮g/kg,i.v. sin-gledose);(5)OVX+PRO(0.1mg/kg,s.c.5daysperweek);(6)OVX+ZOL(50␮g/kg,i.v.single dose)+PRO(0.1mg/kg,s.c.5daysperweek)for12weeks.Aftertreatment,femurswere testedforbonedensity,porosityandtrabecularmicro-architecture.Biochemicalmarkersin serumandurinewerealsodetermined.

Results: CombinedtreatmentwithZOLplusPROcorrecteddecreaseinserumcalciumand

increaseinserumalkalinephosphataseandtartarateresistantacidphosphataselevel bet-terthansingle-drugtherapyusingZOLorPRO.Moreover,combinedtreatmentwithZOL plusPROcorrectedincreaseinurinecalcium,phosphorousandcreatininelevelbetterthan single-drugtherapyusingZOLorPRO.CombinationtherapyusingZOLplusPROalso pre-servedthetrabecularmicro-architectureandcorticalboneporosity.

Conclusion: ThesedatasuggestthatcombinedtreatmentwithZOLplusPROcouldbemore

effectiveapproachfortreatingsevereosteoporosisinhumans.

Introduc¸ão

Aosteoporoseéumadoençadegenerativacaracterizadapela diminuiçãodamassaósseaedeterioraçãodas microestrutu-rasdosossos,oqueaumentaoriscodefratura.1_Na _maior

partedoscasos,aosteoporosesedesenvolvesemsintomase temumcursoprogressivo.Odiagnósticooportunoeaseleção dotratamentoidealnosestágiosapropriadosdadoençasão essenciaisparaaeficáciadotratamentoeaprevençãoda oste-oporose.

Osmarcadoresbioquímicosestão emergindocomo uma das ferramentas de diagnóstico essenciais para rastrear a remodelaçãoósseaduranteaprogressãodedoençasósseas. Esses marcadores são liberados no soro e na urina como resultadoda formaçãoereabsorçãoósseaeoferecemuma visãogeraldasaúdedoesqueleto.Alémdastécnicasde ima-geminvasivas, osmarcadoresbioquímicossãoferramentas muito eficazes para sefazerem estimativas esão indicati-vosdeváriasdoenças dometabolismoósseo.Emcontraste comosmétodosinvasivos,comootestemecânicodosossos, osmarcadoresbioquímicossãoconvenientesdeusar, bara-tosenãoinvasivos.Quandofeitoseanalisadoscorretamente, revelam-seumapotencial ferramentapara o diagnóstico e determinaçãodotratamentodasdoençasdosossos.2,3

O ácido zoledrônico (ZOL) é um difosfonato de terceira gerac¸ãoque contémnitrogênio.Esse agente mostrou redu-zirsignificativamenteoriscodefraturasempacientesqueo usamemdoseúnicaanualparaotratamentodaosteoporose pós-menopáusica.4_Embora_os_agentes_{antirreabsorc¸ão}_como

osbisfosfonatossejameficazesemreduziraperdaóssea,não sãocapazesdeinduziraformac¸ãodeossonovo.1

Opropranolol(PRO),umantagonistabeta-adrenérgiconão seletivo, está sob investigação e agora é considerado um potencial fármaco paraa cicatrizaçãoóssea, mais especifi-camente paraotratamento daosteoporose.Emumestudo comanimais,umadosemaisbaixadePRO,um betabloque-adornãoseletivo,demonstrouaumentaramassaósseaem diferentes modelosexperimentaisdedisfunções ósseas.4-10

Osresultadosdealgunsestudosepidemiológicosanteriores confirmamahipótesedequeousodebetabloqueadoresestá associadoaumadiminuic¸ãonoriscodefraturas.11–13

Rodri-gues etal.demonstraram queoPROsuprimeareabsorção ósseapelainibiçãodaosteoclastogênese,bemcomodos mar-cadores de inflamação.14 _Esse _resultado _é_apoiado _por_um

achado anteriorque mostrouque opropranololestimulaa osteoprotegerina (OPG)nososteoblastos.15 _A_capacidade_de

estimularososteoblastos,enquantosuprimeososteoclastos, torna o PRO uma opção atraente e exclusiva para a tera-piaantirreabsorção paraaosteoporose.OPRO, quepoderia impedirdiretamenteaperdaósseaeaalteraçãobiomecânica, aoaumentaraformaçãodeossoediminuirsuareabsorção, podeseropróximoagenteanabólicoparaotratamento da osteoporose.4,5,14,15

Combinaçõesdeagentesanabolizanteseantirreabsorção têmopotencialdemelhoraradensidadeeforçadosossos, maisdoquequalqueroutroagenteisolado.16_Como_a_perda

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epreservaramicroarquiteturatrabecularemummodelode ratocomosteoporosepós-menopáusica.4_À_luz_desses

resul-tados,esteestudofoidesenhadoparaavaliaradicionalmente aatividadeantiosteoporóticaeasegurançadaterapia combi-nadacomZOLePROemummodeloderatocomosteoporose pós-menopáusica.Foramavaliadososparâmetrosconforme descritoaseguir:(1)mediçãodaporosidadedoossofemoral direito;(2)mediçãodopesoseco,dovolumeedadensidadedo ossofemoral;(3)parâmetrosbioquímicosséricoseurinários; (4)estudohistopatológicodoossofemoralesquerdo.

Materiais

e

métodos

Fármacos,produtosquímicoseoutrosmateriais

OZOLfoiobtidodoslaboratóriosNaprodLifeSciences (Maha-rashtra, Índia). O PRO, a cetamina, a xilazina e o xileno foram obtidos dos laboratórios Aurobindo Pharma (Hyde-rabad, Índia), Glaxo Smithkline Pharmaceuticals (Mumbai, Índia),NeonPharma(Mumbai,Índia),IndianImmunologicals (Hyderabad,Índia)eS.D.FineChemicals(Mumbai,Índia), res-pectivamente.

ForamobtidassuturasEthiconCrômico3/0esuturas Ethi-conMersilk3/0daJohnson&JohnsonLtd.,Baddi,Himachal Pradesh,Índia.

Animaisexperimentais

Foram incluídas no estudo ratas Wistar fêmeas saudáveis de12semanasdeidade,criadasemlaboratório.Osanimais foram mantidossob temperatura controlada a25◦_±₂◦ _C _e cicloclaro/escurode12 horas,com comidaeágua forneci-dosàvontade.Osexperimentosforamfeitosdeacordocom asdiretrizesdoCPCSEA(CommitteeforthePurposeof Con-trolandSupervisionofExperimentsonAnimals),depoisde obtidaumaautorizac¸ãoéticadoInstitutionalAnimalEthical Committee.

Metodologiadoestudopré-clínico

Aostrêsmesesdeidade,asratasforamsubmetidasà ovari-ectomiasobanestesiacomcetaminaexilazina (80mg/kge 10mg/kg;viaintraperitoneal),deacordocomométodo des-critopor Khajuria et al.17 _As _ratas _submetidas _à _operac¸ão

simulada(placebo)foramoperadassemaremoçãodos ová-rios.Trêsmesesdepoisdaovariectomia(idade=seismeses), osanimaisforamdivididosemseis gruposdeseisanimais cada.Umgrupoderatasovariectomizadas(OVX)foideixado semtratamento(OVXnãotratado).TantoosgruposOVXnão tratadoquanto OVX placebo foram usados como controle. Doisdosgrupos OVXforam tratadoscom uma dose intra-venosaúnicadeZOLde50␮g/kg(grupoZOL50)e100␮g/kg (grupoZOL100),administradanaveiadacauda,pormeiode umainjeçãointravenosalentade30segundos,sobanestesia inalatórialeve.UmgruposubmetidoàOVXfoitratadocom PROaumadosede0,1mg/kg,injetadaporvia subcutânea cincodiasporsemana,durante12semanas.Foiiniciado trata-mentodogrupoOVXremanescentecomterapiacombinadade 50␮g/kgdeZOLe0,1mg/kgdePRO(ZOL50+PRO).Asinjeções

subcutâneascincodiasporsemanafeitasnosgruposOVX tra-tadoscomPROeZOL50+PROexigiramalgummanejodos animaiseimpuseramaelesalgumestresse.Portanto,além dosgrupos de controle positivo enegativo, os gruposOVX tratadoscomZOL(100␮g/kge50␮g/kg,emdoseúnica intra-venosa)tambémreceberamadministrac¸ãodeveículoporvia subcutânea(sorofisiológico,cincodiasporsemana)durante 12semanas.Asdosesdemedicac¸ãousadasnesteexperimento foramselecionadasapartirdeestudosanteriorescom mode-losderatoscomosteoporose.4

Nofimdoexperimento(animaiscom aproximadamente seismesesdeidade),asratasforamanestesiadascométere seusanguefoicoletadoapartirdoplexoretro-orbital.Aseguir, osorocentrifugadofoicoletadoemantidoa-20◦_C,_até_a aná-lise.Nofimdoestudo,todososgruposforammortosporuma overdosedeanestesia.Emtodasasratas,osfêmuresforam excisadosesubmetidosàremoc¸ãodegorduraetecidos con-juntivos.Osfêmuresdireitosforamembebidosemgazecom sorofisiológicoecongeladosa-20◦ _C_para_ser_submetidos_a testesdaporosidadeedensidadeóssea.Emtodosasratas,os fêmuresesquerdosforamremovidosesubmetidosàremoc¸ão degorduraetecidosconjuntivoseimediatamentefixadosem formola10%durante48horasa4◦_C.

Análisebioquímicadosoroeurina

Osníveisséricoseurináriosdecálcioefósforoinorgânico,a creatininaurináriaeaatividadedafosfatasealcalinaforam estimados por kits disponíveis comercialmente (Autospan, Span DiagnosticsLtd. Surat,Índia)com umautoanalisador (ArtosSemi-autoanalyzer,SwemedBiomedicalsPvt.Ltd, Ban-galore, Índia). A atividade da fosfatase ácida resistente a tartarato(TRAP)séricafoideterminadaporummétodo base-adononitrofenol,conformedescritoporJanckilaetal.18

Medic¸ãodaporosidadedoossoporradiografia

Osfêmuresdireitosdetodososanimaisforamradiografados com oaparelhoFox-Rayzor,queéumsistemadeinspec¸ão porraios-Xportátilequipadocomaferramentadesoftware CalculateHistogram’,deacordocomométododescritopor Khajuriaetal.6_Em_resumo,_para_a_análise_{radiográfica,}_o_fêmur

foi divididoemquatroáreasiguais,queincluíramaepífise femoraldistal(R1),adiáfisefemoral(R2eR3)eaepífisefemoral proximal(R4).

Medic¸ãodopesoseco,volumeedensidadedoosso

Depoisdasradiografias,ofêmurdireitodetodososanimais foidesidratadocometanoleagordurafoiremovidacométer dietílico.Aseguir,deixou-sequeosossossecassemaoarlivre eopesosecodoossofoimensuradocomumabalanc¸adigital (Contech CA-124,ContechInstumentsLtd., Mumbai,Índia). Ovolumeeadensidadedosossosforammedidosdeacordo comoprocedimentodescritoporKhajuriaetal.6

Histopatologiaóssea

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Tabela1–Critériosparaaavaliac¸ãodoescorehistopatológicousadoparaavaliarograudeosteoporose

Escore Integridadeda

cartilagemarticular doquadril

Estruturadoosso trabecular

Quantidadedeosso trabecular(%daárea

deinteresse)

0 Cartilagemcompleta Normal 90-100

1 Cartilagemcompleta Parcialmentereduzida 60-90

2 Cartilagemparcialmentecompleta Marcadamentereduzida 30-60

3 Cartilagemausente Ausente 0-30

clorídricoa8%(37%v/v)eácidofórmicoa10%(89%v/v)em soluçãosalinatamponada com fosfato]durante 24horas a 37◦ _C,_desidratados _em_etanol_a_95% _(v/v)_e_embebidos_em parafina. Foram cortadas secções horizontais de 5 mm de espessura da extremidade proximal da diáfise, embebidas emparafina,coradascomhematoxilina-eosinaeexaminadas pormicroscopia óptica. As cabeçasdofêmur(área entre a cartilagem articular doquadril e a cartilagem metafisária) foram avaliadas quanto à qualidade e densidade do osso trabecular,deacordocomoescoreapresentadonatabela1.A integridadedacartilageméconsideradaumíndiceadicional daqualidadedoosso,porqueaosteoporoseétambém respon-sávelporumadeterioração dacartilagemeostratamentos querestauramaintegridadeósseatambémsãocapazesde, indiretamente,preservarumbomtrofismodacartilagem.19

Avaliac¸ãodaseguranc¸adosdiferentestratamentos

Oestudogeraldatoxicidadefoifeitodeacordocomasboas práticas de laboratório (BPL) e com as diretrizes da OCDE (OrganizationforEconomicCo-operationandDevelopment) paratestesdeprodutosquímicos,comalgumasmodificações. Foramestudadosasmudançasdecomportamento,os parâ-metrosfísicos(pesocorporal,ingestãodealimentoseágua) ealesãolocal(danoounecrosetecidualnolocaldainjeção, inflamaçãoeoutrossinaisanormais)durantetodooperíodo de tratamento. Também foi registrada a mortalidade – se houvesse alguma morte – em todos os grupos. Nofim do tratamento,foifeitaumaanálisehematológicaebioquímica (testesdefunçãohepáticaetestesdefunçãorenal).Aanálise bioquímicadosorofoifeitacomumanalisadorquímico semi-automáticoekits para transaminaseglutâmico oxalacética

(TGO)séricaetransaminaseglutâmicopirúvica(TGP)séricada AgappeDiagnosticsLtd.Kerala,Índia.Foramestimadosoutros parâmetros,comoonitrogêniodaureiasanguínea(Autospan, Span DiagnosticsLtd.Surat,Índia),aproteínatotalea cre-atinina(AgappeDiagnosticsLtd.Kerala,Índia),àprocurade sinaisdenefrotoxicidade.

Análiseestatística

Todos os dados foram expressos como a média ± desvio padrão (DP).Paratodos osdados, ascomparac¸ões entreos diferentestratamentosforamanalisadaspeloAnovaone-way, seguido pelotestede comparac¸õesmúltiplas deTukey.Em todososcasos,foiselecionadaumaprobabilidadedeerro infe-rior a0,05 comocritério paraasignificânciaestatística. Os gráficosforamelaboradoscomoprogramaGraphPadPrism (versão5.0paraWindows).

Resultados

Efeitossobreosparâmetrosbioquímicosséricos

Aconcentraçãoséricadecálciofoisignificativamentemenor nogrupoOVXdoquenogrupoplacebo(p<0,05).Nãoforam observadasdiferençasestatisticamentesignificativasnos gru-posquereceberammonoterapiaemrelaçãoaogrupoOVX.No entanto,onívelséricodecálcionogrupoZOL50+PROfoi sig-nificativamentemaiselevadodoquenogrupoOVX(p<0,05). Os níveis séricos de fósforo finais não foram significativa-mentediferentesentreosgruposplaceboeOVX.Domesmo modo,nãohouvealteraçõesnosníveisséricosdefósforoentre osdiversostratamentosfarmacológicos(tabela2).

Tabela2–Efeitosdoácidozoledrônicoedopropranolol,isoladosouemcombinac¸ão,nosníveisséricosdecálcio(Ca), fósforoinorgânico(Pi),fosfatasealcalina(ALP)efosfataseácidaresistenteaotartarato(TRAP)emratassubmetidasàOVX

Grupo Ca(mg/dL) Pi(mg/dL) ALP(UI/L) TRAP(U/L)

Placebo 9,03±0,13a _6,77_±_0,41 _74,85_±_3,88c _0,31_±_3,02c

OVX 7,99±0,29 6,30±0,38 155,7±14,47 1,18±10,12

OVX+ZOL100 8,03±0,58 6,43±0,25 108,2±9,65b,d _0,72_±_9,05b,d

OVX+ZOL50 8,31±0,51 6,55±0,42 105,01±8,13b,d _0,66_±_10,18c,d

OVX+PRO 8,11±0,21 6,53±0,44 103,36±6,14b,d _0,63_±_14,99c,d

OVX+ZOL50+PRO 9,13±0,82a _6,90_±_0,32 _80,03_±_10,13c _0,41_±_10,1c

Osdadossãoexpressoscomoamédia±DP(n=6),avaliadospelotestedecomparac¸õesmúltiplasdeTukey. a _p_<_0,05.

b _p_<_0,01.

c _p_<_0,001,_em_{comparac¸ão}_com_o_grupo_OVX.

d_p_<_0,05,_em_{comparac¸ão}_com_o_grupo_ZOL₅₀₊_PRO.

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Tabela3–Efeitosdoácidozoledrônicoedopropranolol,isoladosouemcombinac¸ão,sobreosníveisurináriosdecálcio (Ca),fósforoinorgânico(Pi)ecreatinina(Cr)emratassubmetidasàOVX

Grupo Ca(mg/dL) Pi(mg/dL) Creatinina(mg/dL)

Placebo 20,10±7,16c _3,86_±_0,33c _1,22_±_0,81c

OVX 48,33±11,07 5,58±0,88 3,14±0,97

OVX+ZOL100 34,03±17,58a,d _4,36_±_0,56a,d _1,82_±_0,49b,d

OVX+ZOL50 36,31±11,98a,d _4,15_±_0,59a,d _1,67_±_0,46b,d

OVX+PRO 33,22±12,81a,d _4,05_±_0,74a,d _1,76_±_0,39b,d

OVX+ZOL50+PRO 28,15±9,02c _3,68_±_0,42c _1,13_±_0,34c

Osdadossãoexpressoscomoamédia±DP(n=6),avaliadospelotestedecomparac¸õesmúltiplasdeTukey. a _p_<_0,05.

b _p_<_0,01.

d _p_<_0,05,_em_{comparac¸ão}_com_o_grupo_ZOL₅₀₊_PRO.

Todososgrupos,excetooplacebo,foramsubmetidosàovariectomia.

Nofimdoexperimento,osníveisséricosdefosfatase alca-linaforamsignificativamentemaioresnogrupoOVXdoque nogrupoplacebo(p<0,001).Emcontraste,onívelséricode fosfatasealcalinafoisignificativamenteinferioremtodosos gruposdemonoterapiaquantocomparadoscomogrupoOVX (p<0,05).Domesmomodo,onívelséricodefosfatase alca-linanogrupoZOL50+PROfoisignificativamentemaisbaixo doquenogrupoOVX(p<0,01).Alémdisso,osníveisséricos defosfatasealcalina nogrupo ZOL50 +PROforam signifi-cativamentemenoresdoquenosgruposZOL100,ZOL50e PRO(p<0,05,tabela2).Aovariectomia induziuarenovação ósseaelevadaemratoseumaumentonosníveisséricosde TRAPnogrupocontroleOVX,emcomparaçãocomogrupo controleplacebo(p<0,001).OsgruposZOL100,ZOL50,PROe ZOL50+PROapresentaramníveisséricosdeTRAP significati-vamentemenoresemcomparaçãocomogrupoOVX(p<0,01, p<0,001, p<0,001ep<0,001,respectivamente).Alémdisso, foramobservadasreduçõessignificativasnosníveisséricosde TRAPnogrupoZOL50+PROemcomparaçãocomosgrupos ZOL100,ZOL50ePRO(p<0,05).

Efeitosnosníveisurináriosdecálcio,fósforoecreatinina

Osperfisdeexcreçãourináriadecálcio,fósforoecreatininado grupoplacebo,grupoOVXeratasOVXtratadascomas dife-rentesintervençõesterapêuticassãoapresentadosnatabela3. Foiobservadoumaumentosignificativonaexcreção uriná-ria de cálcio no grupo controle OVXem comparação com ogrupoplacebo(p<0,001).OsgruposZOL100,ZOL50,PRO eZOL 50 + PROtinham níveis significativamente diminuí-dosde excreçãourinária decálcio(p<0,01,p<0,01,p<0,01 ep<0,001,respectivamente).Domesmomodo,observou-se um aumento significativo na excreção urinária de fósforo no grupo controle OVX em comparaçãocom o grupo pla-cebo(p<0,001).OsgruposZOL100,ZOL50,PROeZOL50+ PROtinhamexcreçãourináriadefósforosignificativamente diminuída (p<0,01, p<0,01, p<0,01 e p<0,001, respectiva-mente).Similarmente,observou-seumaumentosignificativo naexcreçãourináriadecreatininanogrupocontroleOVXem comparaçãocomogrupoplacebo(p<0,001).OsgruposZOL 100,ZOL 50,PROeZOL50+ PROtinham excreçãourinária decreatininasignificativamentediminuída(p<0,01,p<0,01, p<0,01 e p<0,001, respectivamente). Além disso, foram

observadasreduc¸õessignificativasnosníveisurináriosde cál-cio,fósforoecreatininanogrupoZOL50+PROemcomparac¸ão comosgruposZOL100,ZOL50ePRO(p<0,05;tabela3).

Medic¸ãodopesoseco,volumeedensidadedoosso

Atabela4resumeosefeitosdaOVXedotratamentoderatas

submetidas à OVX com ZOL 100, ZOL 50, PROe ZOL 50 + PRO sobreo peso secodo osso, volumeósseo epeso seco porvolumedeosso(densidade)dofêmurdireito.Opesoseco dofêmurdeanimaiscontrolesubmetidosàOVXfoi signifi-cativamentemenordoqueo dosanimaiscontrole placebo (p<0,001).Os gruposZOL 100, ZOL50 ePROapresentaram valores mais elevados de peso seco do que o grupo OVX (p<0,05,p<0,01ep<0,01,respectivamente).Domesmomodo, ogrupoZOL50 +PROapresentouvaloresmaiselevadosde pesosecodofêmurdoqueogrupoOVX(p<0,001).Ovolume dofêmurnogrupoOVXfoisignificativamentemaiselevado doquenogrupoplacebo(p<0,05).Essaconclusãosebaseia no ganho de peso corporal observado no grupo OVX. Não foramobservadasdiferençassignificativasnovolumeósseo emnenhumadasintervençõesterapêuticasemcomparação comogrupoOVX(tabela4).Noquedizrespeitoàmassaóssea, ogrupoOVXapresentouvaloressignificativamentemais bai-xosdedensidadedofêmurdoqueosanimaisdogrupoplacebo (p<0,001).Issoindicaqueadensidadedamassaósseaé dimi-nuídapelaovariectomia.Osvaloresnosgruposqueusaram bisfosfonatos(ZOL100eZOL50)enogrupoPROforammaiores doquenogrupoOVX(p<0,01,p<0,001ep<0,001, respecti-vamente).Similarmente,osvaloresforamsignificativamente maiselevadosnogrupoZOL50+PROemcomparaçãocom ogrupoOVX(p<0,001).Opesosecoeadensidadedoossono grupoZOL50+PROforamsignificativamentemaiselevados doquenosgruposZOL100,ZOL50ePRO(p<0,05).

Porosidadedoosso

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Tabela4–Efeitosdoácidozoledrônicoedopropranolol,isoladosouemcombinac¸ão,sobreopesoseco,volumee densidadedoossoemratassubmetidasàOVX

Grupo Pesoseco(mg) Volume(mL) Densidade(g/mL)

Placebo 615,2±26,20b _0,31_±_0,03a _1,98_±_0,02c

OVX 488,7±25,20 0,37±0,04 1,31±0,05

OVX+ZOL100 601,6±33,40a,d _0,37_±_0,03 _1,63_±_0,03c,d

OVX+ZOL50 626,6±20,90b,d _0,37_±_0,02 _1,69_±_0,04c,d

OVX+PRO 630,7±19,40b,d _0,36_±_0,04 _1,75_±_0,03c,d

OVX+ZOL50+PRO 674,2±22,30c _0,35_±_0,03 _1,90_±_0,06c

Osdadossãoexpressoscomoamédia±DP(n=6),avaliadospeloAnovaone-way,seguidopelotestedecomparac¸õesmúltiplasdeTukey. a _p_<_0,05.

b _p_<_0,01.

d_p_<_0,05,_em_{comparac¸ão}_com_o_grupo_ZOL₅₀₊_PRO.

Todososgrupos,excetooplacebo,foramsubmetidosàovariectomia.

oqueindicaumaumentoinduzidopelaOVXnaporosidade nessasáreas.Depoisde12semanasdetratamento,todosos tratamentosativoslevaramaumadiminuic¸ãonaporosidade ósseadosanimaissubmetidosàOVX.Osvaloresda intensi-dadedetransmissãoderaios-XemR1nosgruposZOL100, ZOL50,PROeZOL50+PROforamsignificativamente meno-resdoquenogrupoOVX(p<0,05,p<0,01,p<0,01ep<0,001, respectivamente).Aintensidadedatransmissãoderaios-Xdo

grupoZOL50+PROfoisignificativamentemaisbaixadoque nosgruposZOL100,ZOL50ePROemR1(p<0,01,p<0,05e p<0,05,respectivamente).Alémdisso,osvaloresde intensi-dadedetransmissãoderaios-X nasregiõesR2,R3eR4dos gruposZOL 100,ZOL 50,PROeZOL50+ PROforam meno-resdoquenogrupoOVX(p<0,05,p<0,05,p<0,05ep<0,001, respectivamente).Aintensidadedetransmissãoderaios-Xdo grupoZOL50+PROfoisignificativamentemaisbaixadoque

Epífise femoral distal (R1)

PLACEBO OVX

OVX + ZOL 100 OVX + ZOL 50 OVX + PRO

OVX + ZOL 50 + PRO

0 10 20 30 40 50

***

**

a

*

b

_**

a

Intensidade dos pixels (%)

Diáfise femoral distal (R2)

0 10 20 30 40 50

***

*

a

*

a

*

a

Diáfise femoral proximal (R3)

0 20 40 60

***

*

a

*

a

***

*

a

Epífise femoral proximal (R4)

0 10 20 30 40 50

***

*

a

*

a

*

a

PLACEBO OVX

OVX + ZOL 50 + PRO

PLACEBO OVX

OVX + ZOL 50 + PRO

PLACEBO OVX

OVX + ZOL 50 + PRO

(7)

Figura2–Efeitosdoácidozoledrônicoedopropranolol,isoladosouemcombinac¸ão,sobreamicroarquiteturatrabecular femoralemratasovariectomizadas.(a)placebo;(b)grupoOVX;(c)grupoOVX+ZOL100;(d)grupoOVX+ZOL50;(e)grupo OVX+PRO;(f)grupoOVX+ZOL50+PRO.Colorac¸ãoH&E;Barradeescala=100(␮m).Asimagensforamfeitas

emampliac¸ãode50×.

adetodosostratamentosindividuaisnasregiõesR2,R3eR4 (p<0,05).Nãoforamobservadasdiferenc¸assignificativasentre osgrupossubmetidosàmonoterapianasregiõesR1,R2,R3e R4.Esses resultadosindicamqueaterapiacombinadacom ZOL50+PROébenéficaparaamassaóssea–tantodoosso trabecularquantocortical–queestavadiminuídapelaOVX (fig.1).

Efeitodostratamentossobreahistopatologiaóssea

Asseçõesdecabeçadofêmurforamexaminadasàprocurade quaisqueralteraçõeshistopatológicas.Os animaisdogrupo placeboapresentaramcompactaçãonormaldadiáfisee tra-béculascompetentes(fig.2a).OsanimaissubmetidosàOVX mostraramtrabéculascomafinamentoesparsoeuniforme, comtendênciaaodesaparecimentoeperdadaconectividade, queresultouemespaçosintertrabecularesalargados(fig.2b). Também foram observadas proliferações cartilaginosas na áreadeplacasamolecidasdeilhotasfocaisarestritas.A his-topatologiadoosso(fig.2c-f)revelouumefeitoimportantedo ZOL100,ZOL50,PROeZOL50+PROsobreaosteoporose

indu-zidapelaovariectomia.Oescorehistológico(fig.3)dosgrupos avaliadosdeacordocomoscritériosémostradonatabela1. Aavaliaçãohistopatológicadosanimaistratadoscom quais-querintervençõesterapêuticasmostrouumarestauraçãoda arquiteturadosossoscorticaletrabecular,commatrizóssea bemorganizada.

Avaliac¸ãodaseguranc¸a

(8)

Tabela5–Efeitosdoácidozoledrônicoedopropranolol,isoladosouemcombinac¸ão,sobreparâmetrosbioquímicos diversosderatassubmetidasàOVX

Grupo Hemoglobina(g%) Contagemtotalde

eritrócitos(×106_/mm3₎

Contagemtotalde leucócitos(×103_/mm3₎

Placebo 15,17±1,42 5,98±0,89 5,92±0,96

OVX 13,98±1,96 5,87±0,97 5,81±1,11

OVX+ZOL100 14,44±2,11 6,12±1,13 6,09±1,22

OVX+ZOL50 14,85±2,01 5,73±0,68 5,89±0,50

OVX+PRO 15,01±1,63 5,83±1,17 5,77±0,88

OVX+ZOL50+PRO 14,11±1,36 5,79±0,70 5,97±1,09

Osdadossãoexpressoscomoamédia±DP(n=6).Todososgrupos,excetooplacebo,foramsubmetidosàovariectomia.

Tabela6–Efeitosdoácidozoledrônicoedopropranolol,isoladosouemcombinac¸ão,sobreproteínaséricatotal, creatinina,nitrogêniodaureiasanguínea,transaminaseglutâmicooxalacética(TGO)séricaetransaminaseglutâmico pirúvica(TGP)sérica

Grupo Proteínasérica

total(g/dL)

Creatinina (mg/dL)

Nitrogêniodaureia sanguínea(mg/dL)

TGP(U/L) TGO(U/L)

Placebo 6,90±0,18 0,66±0,02 18,03±1,42 24,81±1,70 34,76±1,45

OVX 6,17±0,04 0,73±0,03 17,73±2,09 25,63±1,67 33,22±1,78

OVX+ZOL100 6,32±0,15 0,71±0,02 17,38±0,95 24,25±1,71 33,19±2,25

OVX+ZOL50 6,03±0,67 0,69±0,01 16,45±3,64 23,49±2,80 32,17±2,85

OVX+PRO 6,47±0,13 0,73±0,01 18,60±2,42 25,15±1,46 34,80±3,48

OVX+ZOL50+PRO 6,41±0,12 0,74±0,05 18,84±2,88 25,27±2,70 33,81±0,44

Nãoforamobservadasalterac¸õessignificativasnosníveis deproteínatotal,creatininaenitrogêniodaureiasanguínea nosgrupossubmetidosàmonoterapiaouterapiacombinada quandocomparadosaogrupocontrole.Nãohouveaumento significativonosníveisséricosdeTGPeTGOemintervenc¸ão terapêuticaalguma,quandocomparadocomogrupocontrole (tabela6).

0 1 2 3 4

***

Escore histopatológico

PLACEBO OVX

OVX + ZOL 50 + PRO

Figura3–Efeitosdoácidozoledrônicoedopropranolol, isoladosouemcombinac¸ão,sobreoescorehistopatológico. Osdadossãoexpressoscomoamédia±DP(n=6),

avaliadospelotestedecomparac¸õesmúltiplasdeTukey. ***p<0,001,emcomparac¸ãocomogrupoOVX.Todosos grupos,excetoogrupoplacebo,foramsubmetidosà ovariectomia.

Discussão

Osresultadosdesteestudopré-clínicomostram claramente que a terapia combinada com ZOL maisPRO foi capaz de neutralizaraperdaósseaemummodeloderatocom osteopo-rosepós-menopáusica.Essesresultadosapoiamosresultados encontradosemnossapesquisaanterior,queindicouquea adiçãodePROàterapiaantirreabsorçãocomZOLéclaramente superioraqualquerintervençãoisolada.4

Jásesabequeataxadeperdaósseasubsequenteà defi-ciência de estrogêniopodeseravaliadaindiretamente com o uso de marcadores bioquímicos de remodelac¸ão óssea estabelecidos.20 _Foram_observados_reduc¸ão_da_massa_óssea,

alterac¸ões no metabolismo do cálcio e valores signifi-cativamente menores de cálcio sérico em mulheres na pós-menopausa.21,22_Neste_estudo,_a_terapia_combinada_com

ZOL mais PRO corrigiu completamente a diminuic¸ão nos níveisséricosdecálcioeindicaqueessetratamentocompensa asalterac¸õesocorridasnocálcio.

O grupo ZOL maisPROfoi estatisticamente superiorna diminuição da fosfatase alcalina séricanas ratas submeti-dasàOVX.Alémdisso,aterapiacombinadacomZOLmais PRO foi estatisticamente superiora quaisquer tratamentos individuaisemsuprimiroaumentonaquantidadedeTRAP sérica.EssesresultadossugeremqueotratamentocomZOL mais PROmelhora a perda ósseadecorrente da ovariecto-mia,tantopelaestimulaçãodaformaçãodeossoquantopela inibiçãodareabsorçãoóssea.Osindivíduosquepassampor perdarápidadeossotêmconcentraçõeselevadasde marca-doresdereabsorçãoóssea,emcomparaçãocomaquelesque perdem ossolentamente.23 _As _ratas_deste _estudo

(9)

fósforoecreatinina,emcomparaçãocomogrupoplacebo.Mas essasrespostasforamsignificativamentereduzidasnasratas submetidasàOVXquereceberamtratamentocomZOLmais PRO.Issosugerequeessa reduçãosignificativanaexcreção urináriadecálcio,fósforo ecreatininapodeseratribuída à diminuiçãodareabsorçãoósseaouaoaumentodaformação ósseaouaambos.Valelembrarqueaterapiacombinadacom ZOLmaisPROfoiestatisticamentesuperioraquaisqueroutras intervençõesterapêuticasemsuprimiroaumentonosvalores urináriosdecálcio,fósforoecreatinina.

Na análise da porosidade do fêmur de ratos com ima-gensradiográficas,verificou-sequeaterapiacombinadacom ZOL maisPROfoi estatisticamentesuperior àmonoterapia com ZOL ou PRO em suprimir o aumento da porosidade óssea decorrente da ovariectomia. Isso indica que a tera-pia combinada com ZOL mais PRO engrossa e fortalece o ossocortical.Osresultadosdopesosecoedadensidadedo fêmurestimadosdiretamenteforamconsistentescomosda porosidade femoral encontrada nas imagens radiográficas. Neste estudo,os animais submetidos àOVX apresentaram umareduc¸ãosignificativano peso secoena densidade do fêmur,semelhanteàobservadaemmulheresosteoporóticas comdeficiênciadeestrogênio.Éinteressantenotarquenos animaistratadoscommonoterapia eterapia combinadaos valoresdepeso secoedensidadedofêmurforam significa-tivamentemaiores doque no grupo OVX.Além disso, nos animaistratadoscomterapiacombinadadeZOL maisPRO, osvaloresde pesoseco edensidadefemoralforam signifi-cativamentemaiores doquenosgruposZOL ouPRO.Esses resultadosdemonstraramqueaterapiacombinadacomZOL maisPROébenéficaemaumentar amassade osso femo-ralqueestavadiminuídaemdecorrênciadaovariectomiaem ratos.

Aanálisehistopatológicadoossodasratassubmetidasà OVXmostroudiminuiçãonaquantidadeeespessuradas tra-béculas eno alargamento dos espaços intertrabeculares,o quesugerequefoiinduzidaperda ósseanessas ratas,pela diminuiçãonaformaçãoepeloaumentonareabsorçãoóssea. Osexameshistopatológicostambémrevelaramapropriedade antiosteoporóticadaterapiacombinada,comodemonstrado pelarecuperaçãodoossotrabecularnogrupotratadocomZOL maisPROemcomparaçãoaogrupoOVX.Comoresultado,a terapiacombinadacom ZOLmaisPROpodeatuartanto na estruturadocolágenoquantonareabsorçãoóssea.Isso,por suavez,podereduzirfraturasnãovertebrais(porexemplo, fra-turadequadril),quesãootipodefraturademaiorrelevância clínicanapopulaçãoidosa.

Ostestesdetoxicidadegeralqueusammodelos apropria-dospodemajudaradefinirosriscosdeeventosadversosea projetarprotocolosdemonitoramentoclínicocomdesfechos claros.Afimdeinvestigarpossíveisdesfechostóxicosde tera-piasindividuaisecombinadas,foramestimadosparâmetros físicos,hematológicosebioquímicos.Nãoforamobservados sinais de toxicidade com quaisquer das doses de quais-querintervenc¸õesterapêuticasusadasnesteestudo.Nãofoi observadamortalidadeemnenhumdosgrupostratados.Os parâmetroshematológicosebioquímicospermaneceram inal-teradosemtodososníveisdedosagemnosgrupostratados commonoterapia eterapia combinada emrelac¸ão ao con-trole.A partirdos resultadosdeste estudo, infere-seque a

monoterapiaeaterapiacombinadacomZOLePROnãosão tóxicasparaosanimaisexperimentais.

Conclusões

Osresultadosdesteestudodemonstramqueaterapia combi-nadaZOL(agenteantirreabsorção)ePRO(agenteanabólico) pode representar uma nova abordagem eficaz para tra-tar ou reverter a osteoporose grave em seres humanos. Assim, esse regime combinadopode ser de interesse para a avaliação adicional por meio de estudos clínicos, a fim de representaruma opção terapêutica potencialmente útil parapacientescomosteoporose.Alémdisso,oPROpodeser umpotencialnovoagenteanabolizantedotecidoósseopara prevenção/tratamentodaosteoporoseepodeserusado isola-damenteouemassociaçãocomosbisfosfonatos.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

Agradecimentos

OsautoresagradecemaoProf.B.G.Shivananda,Diretor da FaculdadedeFarmáciaAl-Ameen,peloconstanteincentivo, pelainfraestruturaeportodasasoutrasinstalac¸õesessenciais paraaconclusãodestetrabalho.Osautorestambémsãogratos aoSr.B.KJain,daNaprodLifeSciences,Maharashtra,Índia, porforneceramostrasgrátisdoácidozoledrônico.Osautores também agradecemacontribuic¸ãodoSr.VijayKumaredo Sr.ManishKumarPriydarshi,doDepartamentodeEngenharia Aeroespacial,Instituto IndianodeCiência,pelostestescom imagensderaios-X.

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