CLONAGEM, EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UM INIBIDOR
DE TRIPSINA PRESENTE NO MOSQUITO Aedes aegypti
São Paulo
2010
CLONAGEM, EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UM INIBIDOR
DE TRIPSINA PRESENTE NO MOSQUITO Aedes aegypti
São Paulo
2010
CLONAGEM, EXPRESSÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UM INIBIDOR
DE TRIPSINA PRESENTE NO MOSQUITO Aedes aegypti
Orientadora: Profª. Dra. Aparecida Sadae Tanaka
Co-orientadora: Dra. Anita M. Tanaka Azevedo
São Paulo
2010
Watanabe, Renata Midori Okuta
Clonagem, expressão e caracterização de um inibidor de tripsina presente no mosquito Aedes aegypti. / Renata Midori Okuta Watanabe – São Paulo, 2010
xxiii, 89 fls
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular.
Cloning, expression and characterization of a trypsin inhibitor from Aedes aegypti mosquito.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
Chefe do Departamento:
Profª Drª Marimélia Aparecida Porcionatto
Coordenadora do Curso de Pós-graduação:
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Este trabalho foi financiado por:
CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Abreviaturas ... i
Tabela de aminoácidos ... iii
Lista de figuras ... iv
Lista de tabelas ... vi
1 INTRODUÇÃO ... 1
1.1 Aedes aegyti ... 2
1.1.1 Classificação ... 2
1.1.2 Ciclo de vida ... 3
1.1.3 Transmissão de doenças ... 3
1.1.4 Morfologia dos mosquitos ... 4
1.1.5 Controle químico e biológico de mosquitos...5
1.2 Hematofagia...6
1.3 Enzimas proteolíticas... 7
1.3.1 Exopeptidases ... 8
1.3.2 Endopeptidases ... 8
1.3.2.1 Serinoproteases ... 9
1.4 Inibidores de proteases ... 9
1.4.1 Inibidores tipo Kunitz ... 11
1.4.2 Inibidores tipo Serpina ... 12
1.4.3 Inibidores tipo Kazal ... 12
1.5 Hemostasia do hospedeiro ... 14
1.5.1 Cascata da coagulação ... 15
1.5.2 Trombina ... 17
1.5.3 Inibidores de trombina de animais hematófagos ... 19
1.6 Digestão em mosquitos hematófagos...20
1.6.1 Tripsina precoce...20
1.6.2 Tripsina tardia...21
1.7 Sialotranscriptoma do mosquito Aedes aegypti ... 21
3.1 Clonagem do fragmento de DNA que codifica para o inibidor de
tripsina de Aedes aegypti (AaTI) e o inibidor truncado (rAaTI∆)...24
3.1.1 Construção de oligonucleotídeos ... 24
3.1.2 Amplificação e purificação do fragmento de DNA obtido por reação de polimerase em cadeia (PCR) ... 24
3.1.3 Reação de sequenciamento do fragmento de DNA amplificado ... 25
3.1.4 Digestão do fragmento de DNA amplificado e do vetor pPIC9 com as enzimas de restrição XhoI e NotI ... 26
3.1.5 Ligação do fragmento de DNA que codifica para o AaTI e para o AaTI∆ ao vetor de expressão pPIC9 ... 27
3.1.6 Preparo de bactérias E.coli cepa DH5-α competentes para eletroporação ... 28
3.1.7 Transformação de bactérias E. coli cepa DH5-α por eletroporação ... 28
3.1.8 Detecção de clones positivos por PCR e mini-preparação plasmidial ... 29
3.1.9 Midi preparação de DNA plasmidial...30
3.2 Expressão dos inibidores recombinantes rAaTI e rAaTI∆ ... 30
3.2.1 Preparação de levedura Pichia pastoris cepa GS115 competente para eletroporação ... 30
3.2.2 Linearização da construção pPIC9 + AaTI e pPIC9 + AaTI∆ com a enzima de restrição SacI ... 31
3.2.3 Transformação de levedura Pichia pastoris cepa GS115 por eletroporação ... 31
3.2.4 Detecção dos clones positivos por PCR e expressão analítica do rAaTI e rAaTI∆ ... 32
3.2.5 Teste de inibição de tripsina utilizando substratos cromogênicos ... 33
3.2.6 Expressão do rAaTI e rAaTI∆ em escala preparativa ... 33
3.2.7 Síntese do peptídeo C-terminal de AaTI carregado negativamente ... 34
3.3 Purificação dos inibidores recombinantes ... 34
3.3.1 Purificação por cromatografia de afinidade ... 34
3.3.2 Purificação por cromatografia de fase reversa e determinação da sequência de aminoácidos N-terminal ... 35
3.4.1 Teste de inibição sobre diferentes serinoproteases ... 35
3.4.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) ... 36
3.4.3 Determinação das constantes de inibição (Ki) ... 37
3.4.4 Testes de coagulação... 38
3.4.5 Preparo do extrato de intestino de Ae. aegypti...39
3.4.6 Ensaio de inibição de tripsinas de Ae. aegypti....39
3.4.7 Análise do transcrito em diferenes tecidos ... 40
3.4.8 Inibição da agregação plaquetária ... 41
3.4.9 Ensaio de competição do rAaTI pelo exosítio I da trombina ... 42
3.4.10 Ensaio de competição do rAaTI pelo exosítio II da trombina ... 42
3.4.11 Identificação do inibidor nativo ... 43
3.4.12 Western blotting ... 43
4 RESULTADOS ... 45
4.1 Clonagem do fragmento de DNA que codifica para o inibidor de tripsina de Ae. aegypti (AaTI) e para o inibidor truncado (AaTI∆) ... 45
4.1.1 Construção de oligonucleotídeos ... 45
4.1.2 Amplificação, purificação e sequenciamento de nucleotídeos do fragmento de DNA obtido por reação de polimerase em cadeia (PCR) ... 45
4.1.3 Ligação do fragmento ao vetor pPIC9, transformação de bactéria E. coli cepa DH5-α, e detecção dos clones positivos por PCR ... 49
4.2 Expressão, purificação e caracterização das moléculas recombinantes .... 51
4.2.1 Transformação de Pichia pastoris cepa GS115 ... 51
4.2.2 Expressão do rAaTI e rAaTI∆ em P. pastoris e síntese do peptídeo C-terminal ... 53
4.2.3 Purificação dos inibidores recombinantes AaTI e AaTI∆ ... 55
4.2.4 Caracterização bioquímica dos inibidores recombinantes AaTI e AaTI∆ e peptídeo C-terminal sintético...59
4.2.5 Testes de coagulação... 63
4.3 Análise do transcrição de AaTI em diferenes tecidos ... 67
4.4 Verificação da presença do inibidor AaTI nativo em intestino do mosquito alimentado ... 68
4.5 Teste de inibição das enzimas digestivas de Ae. aegypti por rAaTI ... 69
5 DISCUSSÃO ... 70
6 RESUMO ... 78
7 ABSTRACT ... 79
ABREVIATURAS
AMC – 7 - amino – 4 - metil coumarina
BMGY – Buffered Glycerol – complex Medium
BMMY – Buffered Methanol – complex Medium
BSA – Albumina de soro bovino
dNTP – Desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dATP + dCTP + dGTP + dTTP) DTT - Ditiotreitol
EDTA – ácido etilenodiamino tetra acético LB – Lennox Broth
FT – Fator tecidual FV – Fator V
FVa – Fator V ativo FVII – Fator VII
FVIIa – Fator VII ativo FVIIIa – Fator VIII ativo FX – Fator X
FXa – Fator X ativo FIX – Fator IX FIXa – fator IX ativo FXI – fator XI
FXIIa – Fator XII ativo FXIII – fator XIII
HMWK – cininogênio de alto peso molecular HNE – elastase de neutrófilo humano
HuPK – calicreína plasmática humana
LDTI - Leech Derived Tryptase Inhibitor
MD – Meio mínimo de dextrose pb – pares de bases
PBS – Phosphate-Buffered Saline
PCR – Reação de polimerase em cadeia PK – pré-calicreína
PVDF – polifluoreto de vinilideno pNa – p - nitroanilida
rpm – rotações por minuto SDS – Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE – Eletroforese em gel de poloacrilamida contendo SDS TEMED – N, N, N’, N, tetrametil etileno diamina
TFPI – inibidor de fator tecidual TP – tempo de protrombina
t-PA – ativador de plasminogênio tecidual
TTPA – tempo de tromboplastina parcial ativada TT – tempo de trombina
UV - ultravioleta
YNB – Base de nitrogênio levedura
TABELA DE AMINOÁCIDOS
Abreviação Aminoácido Abreviação Aminoácido
Ala A Alanina Leu L Leucina
Arg R Arginina Lys K Lisina
Asn N Asparagina Met M Metionina
Asp D Ácido aspártico Phe F Fenilalanina
Cys C Cisteína Pro P Prolina
Glu E Ácido glutâmico Ser S Serina
Gln Q Glutamina Thr T Treonina
Gly G Glicina Trp W Triptofano
His H Histidina Tyr Y Tirosina
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Morfologia interna do mosquito Aedes aegypti ... 5
Figura 2 – Cascata da coagulação ... 16
Figura 3 – Estrutura da trombina ... 18
Figura 4 – Vetor de expressão pPIC9 ... 27
Figura 5 – Sequência de nucleotídeos e aminoácidos traduzidos dos
fragmentos de DNA que codificam para o AaTI e AaTI∆ ... 47
Figura 6 – Alinhamento de aminoácidos de AaTI com diferentes inibidores do tipo Kazal ... 48
Figura 7 – Gel de agarose (1%) dos produtos das PCRs para AaTI e AaTI∆ em E. coli ... 50
Figura 8 – Gel de agarose (1%) dos produtos das PCRs para AaTI e AaTI ∆ em P. pastoris ... 52
Figura 9 – Teste de expressão analítica dos inibidores rAaTI e rAaTI∆ ... 54
Figura 10 – Curva de inibição de tripsina utilizando os sobrenadantes das expressões de rAaTI e rAaTI∆ ... 55
Figura 11 – Perfil de eluição do inibidor rAaTI da cromatografia de afinidade em coluna tripsina-Sepharose ... 56
Figura 12 – Perfil de eluição do inibidor rAaTI da cromatografia de gel
filtração em coluna Superdex 75 ... 57
Figura 13 – Perfil de eluição do rAaTI da cromatogradia de fase reversa em coluna Sephasil C8 ... 58
Figura 14 – Sequências de aminoácidos de AaTI, AaTI∆ e peptídeo C-terminal sintetizado ... 59
Figura 15 – Análise dos inibidores rAaTI e rAaTI∆ purificados por gel de
poliacrilamida contendo SDS (15%) ... 60
Figura 16 – Curvas de inibição de tripsina, plasmina e trombina ... 62
Figura 17 – Testes de tempos de coagulação. ... 64
Figura 18 – Ensaio de competição pelo exosítio I da trombina entre rAaTI e hirudina ... 65
Figura 20 – Gel de agarose (1%) dos fragmentos de DNA da análise de transcrição de AaTI em diferentes tecidos... 67
Figura 21 – Western blotting de extratos de tecidos de mosquito fêmeas
adultas e anticorpo primário contra rAaTI ... 68
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Oligonucleotídeos construídos baseados na sequência de
nucleotídeos de AaTI ... 45
Tabela 2 – Constantes de inibição (Ki) do rAaTI para diferentes serinoproteases
1 INTRODUÇÃO
Dípteras hematófagas são hospedeiras intermediárias de muitos parasitas e
patógenos, e atuam como vetores de várias doenças para humanos e outros animais
vertebrados (Hill et al., 2005). Dentre as dípteras hematófagas, os mosquitos se
destacam por contribuírem significativamente para a morbidade e mortalidade no
mundo devido à transmissão de patógenos responsáveis por diversas doenças em
humanos, incluindo malária, dengue, febre amarela e filariose (Carton et al., 2005).
Os mosquitos Anopheles gambiae e Aedes aegypti, espécies mais estudadas e,
portanto melhores caracterizadas, pertencem às subfamílias de mosquitos, Culicinae
e Anophelinae, respectivamente. A transmissão de arbovirus e filariose linfáticas é
amplamente associada à subfamília Culicinae, enquanto os vetores primários na
transmissão de malária pertencem à subfamília Anophelinae (Severson et al., 2004).
A principal via de transmissão de parasitas por vetores dípteros ocorre através do
1.1 Aedes aegypti
1.1.1 Classificação
De acordo com Linnaeus (1782), o mosquito Ae. aegypti apresenta a seguinte
classificação taxonômica:
Reino: Animalia
Filo: Arthropoda
Subfilo: Hexapoda
Classe: Insecta
Subclasse: Pterygota
Infraclasse: Neoptera
Ordem: Diptera
Subordem: Nematocera
Infraordem: Culicomorpha
Família: Culicidae
Subfamília: Culicinae
Tribo: Culicini
Gênero: Aedes (Meigen, 1818)
Espécie: Aedes aegypti
1.1.2 Ciclo de vida
O ciclo de vida do mosquito Ae. aegypti se inicia quando as fêmeas depositam os
ovos em superfícies úmidas, logo acima da linha da água durante o ciclo reprodutivo.
O desenvolvimento embrionário leva aproximadamente 48 h para se completar em um
ambiente quente e úmido. Nesta fase, os ovos podem resistir a longos períodos sem
água. Os ovos eclodem em abundância de água e as larvas (fase aquática) passam
por quatro estádios de desenvolvimento (1°, 2°, 3° e 4° instar). A duração do estágio
larval depende da temperatura, disponibilidade de alimento e da densidade larval. Em
seguida ao estágio larval, o Ae. aegypti passa pelo estágio de pupa, e posteriormente
pela fase adulta. Depois de inseminada, a fêmea se alimenta de sangue e nectar, pois
as proteínas sanguíneas são essenciais para a maturação dos ovos. Após a
alimentação com sangue, as fêmeas do mosquito depositam os ovos em lugares
úmidos, completando assim o ciclo (OMS/SEARO, 1999).
1.1.3 Transmissão de doenças
O mosquito Ae. aegypti é o vetor clássico do vírus do dengue e da febre amarela
urbana. O dengue é uma doença viral endêmica que ocorre principalmente em áreas
tropicais e subtropicais. A incidência de dengue cresceu dramaticamente no mundo
nas décadas recentes. Cerca de 2,5 bilhões de pessoas estão em áreas de risco, e a
OMS estima que há cerca de 50 milhões de infecções por ano (OMS, 2009).
A febre amarela é uma doença infecciosa não contagiosa que se mantém
endêmica nas florestas tropicais da América e da África, sendo transmitida ao homem
mediante a picada de insetos hematófagos da família Culicidae, em especial dos
maioria dos casos de febre amarela ocorre na África sub-sahariana, onde dois terços
dos países africanos estão sob risco da febre amarela, atingindo uma população de
610 milhões de pessoas, sendo que dentre elas, 219 milhões encontram-se nas áreas
urbanas (OMS, 2005).
1.1.4 Morfologia dos mosquitos
Os mosquitos têm seu corpo segmentado e revestido pelo exoesqueleto ou
cutícula, formado principalmente por quitina. Tais segmentos endurecidos e as
membranas que os unem englobam uma cavidade chamada hemocele, repleta de
hemolinfa. O corpo do adulto é dividido em cabeça, tórax e abdome. Na cabeça
encontram-se os principais órgãos dos sentidos, as antenas e os palpos. No tórax
estão os apêndices especializados na locomoção, isto é, as patas e as asas. O
abdome inclui a maior parte dos órgãos internos, dos aparelhos reprodutor, digestivo
e excretor. O metabolismo energético da maioria dos mosquitos, fêmeas e machos,
depende da ingestão de carboidratos, usualmente proveniente de seivas, flores e
frutos. O repasto sanguíneo das fêmeas está relacionado primordialmente ao
desenvolvimento de ovos (Consoli & Oliveira, 1994).
Figura 1 – Morfologia interna do mosquito Aedes aegypti. A) Sistema digestivo adulto. 1: bomba cibarial (Ci); 2: bomba faringeana (BFa); 3: bomba salivar; 4: glândula salivar; 5: esôfago; 6: divertículos dorsais; 7: divertículo ventral; 8: estômago ou intestino médio; 9: tubos de Malpighi; 10: fleo/cólon; 11: reto; 12: ânus. B) Cibário e faringe – vista dorsal. Cl: clípeo; DCi: dentes do cibário; Fa: faringe; Pr: probóscide.
(Fonte: Consoli & Oliveira, 1994)
1.1.5 Controle químico e biológico de mosquitos
A descoberta dos inseticidas revolucionou a metodologia de controle dos
mosquitos vetores de doenças. Pela primeira vez na história da saúde pública foi
possível, em muitas regiões, controlar eficazmente e mesmo erradicar algumas das
carbamatos e piretróides têm sido empregados em várias regiões do mundo para o
controle de mosquitos, e numerosos novos produtos são continuamente pesquisados
com o objetivo de oferecer alternativas no controle dos mosquitos (Consoli & Oliveira,
1994).
Organismos capazes de parasitar ou predar mosquitos em suas várias fases
evolutivas vêm sendo estudados há bastante tempo. Dentre eles as bactérias,
encontram-se como os agentes de controle biológico de mosquitos mais utilizados em
todo o mundo. As duas espécies mais estudadas e utilizadas como tais – Bacillus
thuringiensis H-14 e Bacillus sphaericus – possuem elevadas propriedades larvicidas. Ambas produzem endotoxinas protéicas, as quais, quando ingeridas pelas larvas
atacam e destroem o seu epitélio do estômago, levando-as a morte (Consoli &
Oliveira, 1994). Numerosos fungos têm sido pesquisados quanto ao seu potencial
como controladores biológicos de mosquitos, porém, os problemas mais frequentes
nesses estudos têm sido a baixa especificidade, a alta dosagem necessária e as
dificuldades de cultivo “in vitro”. Invertebrados e peixes predadores também já foram
estudados (Consoli&Oliveira, 1994).
1.2 Hematofagia
Os artrópodes hematófagos necessitam do sangue do hospedeiro vertebrado para
nutrição, desenvolvimento dos ovos e sobrevivência. Antes da alimentação, os insetos
hematófagos precisam localizar o sangue através da introdução da probóscide na
pele do hospedeiro vertebrado. Alguns insetos criam poças de sangue, de onde se
dos capilares. Durante este processo, a saliva do inseto é injetada no local da picada.
A saliva contém uma grande variedade de fatores antihemostáticos como inibidores
de agregação plaquetária, vasodilatadores e anticoagulantes (Ribeiro, 1987).
Dentre os eventos influenciados pela saliva dos insetos hematófagos destacamos
a coagulação sanguínea, que é um mecanismo de defesa do hospedeiro vertebrado
contra o sangramento, e é composta principalmente de enzimas da família das
serinoproteases.
1.3 Enzimas proteolíticas
Enzimas proteolíticas ou proteases são essenciais para a sobrevivência de todos
os organismos, e são responsáveis pela catálise da hidrólise de ligações peptídicas
em proteínas e peptídeos. As proteases participam de diversos processos fisiológicos
como a digestão de alimentos, destruição da matriz extracelular, inflamação,
reorganização e renovação tecidual, processamento de hormônios e pro-enzimas,
ativação do complemento, coagulação sanguínea e fibrinólise (Twining, 1994).
Proteases também são liberadas por células inflamatórias quando ativadas por
patógenos ou material estranho, bem como por células normais e cancerosas, quando
estas se movem através dos tecidos (Scott, 1992).
As proteases podem ser divididas em exopeptidases e endopeptidases de acordo
1.3.1 Exopeptidases
As exopeptidases podem atuar tanto na porção N-terminal da cadeia polipeptídica,
liberando um único resíduo de aminoácido (aminopeptidase), um dipeptídeo
(dipeptil-peptidase) ou tripeptídeos (tripeptidil-peptidases), ou ainda podem atuar na porção
C-terminal da cadeia, liberando um resíduo de aminoácido (carboxipeptidase), ou um
dipeptídeo (peptidil-dipeptidase). As carboxipeptidases podem ser divididas em
subclasses de acordo com o mecanismo catalítico em carboxipeptidases tipo serina,
metalocarboxipeptidases e carboxipeptidases tipo cisteína (Barret, 1994).
1.3.2 Endopeptidases
As endopeptidases agem preferencialmente nas regiões internas das cadeias
peptídicas, afastadas das regiões terminais. A presença de grupos α-amino ou α
-carboxi podem ter um efeito negativo sobre a enzima. As endopeptidases também
podem ser divididas em subclasses de acordo com o mecanismo de catálise em
serinoproteases (no sítio ativo há um resíduo de serina envolvida no processo
catalítico), cisteínoproteases (presença de um resíduo de cisteína no sítio ativo),
aspartilproteases (dependem de dois resíduos de ácido aspártico para a atividade
catalítica) e metaloproteases (utiliza um metal – normalmente zinco – no mecanismo
de catálise) (Barret, 1994). Recentemente surgiram novas classes de proteases,
como glutamilproteases e treonina proteases, porém há ainda um grupo de enzimas
1.3.2.1 Serinoproteases
As serinoproteases são amplamente distribuídas na natureza e encontradas em
todos os reinos de vida celular, e também em genomas virais. Mais de um terço das
enzimas proteolíticas conhecidas são serinoproteases (Hedstrom, 2002). O
mecanismo de ação das serinoproteases foi distinguido pela presença da tríade
catalítica Asp, His e Ser (Blow, 1997), que pode ser encontrada em, pelo menos,
quatro estruturas de enzimas diferentes. Essas enzimas são classificadas, de acordo
com o MEROPS em quatro grupos: quimotripsinas, subtilisina, carboxipeptidase Y e
protease Clp (Rawlings et al., 2008). As proteases tipo quimotripsina estão envolvidas
em muitos processos fisiológicos incluindo digestão, hemostasia, apoptose,
transdução de sinal, reprodução e resposta imune (Hedstrom, 2002). Estudos
realizados com enzimas do tipo tripsina e quimotripsina mostraram que elas clivam
cadeias polipeptídicas no lado C-terminal de um aminoácido básico (Arg ou Lys) ou
hidrofóbico (Phe, Trp, Tyr), respectivamente (Page & Di Cera, 2008).
1.4 Inibidores de proteases
Inibidores de proteases previnem a ativação descontrolada e prematura das
enzimas proteolíticas. Eles estão envolvidos no controle de processos como
maturação de hormônios, resposta imune, coagulação sanguínea, fibrinólise,
inflamação, fertilização e embriogênese (Laskowski & Kato, 1980).
Em insetos, inibidores de proteases estão envolvidos em mecanismos de
defesa, como por exemplo, a proteção contra proteases de fungos (Yoshida et al.,
Bombyx mori, que inibe as serinoproteases de fungos entomopatogênicos (Pham et al., 1996). Os inibidores ISPI-1, 2 e 3 (inducible serine protease inhibitors), purificados
de hemolinfa de larva de Galleria mellonella, são produzidos nas larvas após a injeção
de zimosan e apresentam atividades contra as proteases tóxicas do fungo
entomopatogênico Metarhizium anisopliae (Frobius et al., 2000).
Dentre os inibidores de proteases mais estudados em artrópodes hematófagos,
encontram-se os que interferem no processo hemostático dos hospedeiros
vertebrados e, portanto, facilitam a aquisição de sangue e conseqüentemente o
sucesso da alimentação (Ribeiro, 1987).
Além dos inibidores da cascata da coagulação, os animais hematófagos
também possuem inibidores de serinoproteases sem atividade anticoagulante, tais
como, o inibidor de tripsina, elastase e calicreína plasmática humana, BmTI-A
extraído da larva de carrapato Boophilus microplus (Tanaka et al, 1999) e os
inibidores de tripsina, HNE, HuPK e plasmina extraídos de larvas de carrapato
Rhipicephalus sanguineus (Sant'Anna Azzolini et al., 2003). Assim como já foi descrito, uma atividade inibitória de quimotripsina no extrato de tórax de fêmea adulta
de Ae. aegypti (Yang & Davies, 1971).
Dentre as proteases, a classe que possui o maior número de inibidores
descritos e estudados é a classe das serinoproteases. Os inibidores de
serinoproteases estão presentes nos mais variados órgãos, tecidos e organismos
como por exemplo: sementes de plantas, ovos de aves, saliva, insetos e outros. Os
inibidores de serinoproteases canônicos apresentam-se em grande variedade
estrutural, podendo ser composto desde 14 aminoácidos como o SFTI-1 (Luckett et
classificação dos inibidores foi inicialmente proposta por Laskowski & Kato (1980), na
qual os inibidores foram agrupados em 8 famílias. Atualmente 18 famílias de
inibidores são reconhecidas (Krowarsch et al., 2003). As famílias que apresentam
maior número de membros descritos são: tipo Kunitz, Serpina e tipo Kazal.
1.4.1 Inibidores tipo Kunitz
Os inibidores tipo Kunitz estão geralmente associados com inibidores de
enzimas tipo tripsina e podem se apresentar na forma de um domínio, como o inibidor
de tripsina pancreática bovina (Ascensi et al., 2003), mas também na forma de dois
domínios, como é o caso do inibidor de trombina de carrapato Boophilus microplus
denominado boofilina (Macedo-Ribeiro et al., 2008), e do BmTI-A (Tanaka et al.,
1999). Em insetos já foram descritos diversos inibidores do tipo Kunitz, tais como o
inibidor de trombina do carrapato Haemaphysalis longicornis (Liao et al., 2009), o
inibidor de tripsina e elastase de neutrófilos da mosca Haematobia irritans irritans HiTI
(Azzolini et al., 2004) e o inibidor de quimotripsina de Bombyx mori (He et al., 2004).
Um exemplo típico da família Kunitz/BPTI possui uma cadeia com cerca de 60
resíduos de aminoácidos e é estabilizado por 3 pontes dissulfeto (Pritchard & Dufton,
1.4.2 Inibidores tipo Serpina
A maioria dos inibidores tipo Serpina inibe serinoproteases, porém há serpinas
que inibem também cisteinoproteases do tipo papaína (Schick et al., 1998).
Os inibidores tipo Serpina são moléculas relativamente grandes (cerca de 330
a 500 aminoácidos) quando comparados a outros inibidores de proteases. A
irreversibilidade de inibição faz das serpinas importantes inibidores que controlam a
proteólise intra e extracelularmente. As serpinas possuem um mecanismo único de
ação, conhecido como “aprisionamento da protease”. Neste mecanismo, a Serpina se
liga à enzima de maneira similar ao substrato. No entanto, a alça reativa do inibidor,
quando clivada, altera sua conformação, aprisionando a enzima através de uma
ligação covalente (Huntington et al., 2000). As serpinas são compostas por 3 folhas β
(A, B e C) e 8 a 9 α-hélices, e no complexo serpina-protease, a protease se mantêm
covalentemente ligada ao inibidor (Law et al., 2006). Em insetos, já foram descritos
inibidores do tipo Serpina, que regulam a melanização em Drosophila (Tang et al.,
2008), um imunomodulador do carrapato Ixodes ricinus (Prevot et al., 2006), a serpina
4 de Drosophila (Osterwalder et al., 2004) e o inibidor da ativação da profenoloxidase
proteinase-3 de Manduca sexta (Wang & Jiang, 2003).
1.4.3 Inibidores tipo Kazal
Os inibidores tipo Kazal são constituídos de um ou vários domínios de 50 a 60
resíduos de aminoácidos, com 6 resíduos de cisteína conservadas formando 3 pontes
dissulfeto, uma sequência conservada VCGxD e alta homologia na estrutura
cisteínas 1-5, 2-4 e 3-6 (Mägert et al., 2002). A especificidade inibitória de cada
domínio depende do aminoácido presente na posição P1 (Jarasrassamee et al., 2005,
Schechter & Berger, 1967).
Em insetos foram caracterizados anteriormente diversos inibidores do tipo
Kazal, tais como o inibidor de subtilisina A da pupa de Bombyx mori (Zheng et al.,
2006), um inibidor de quimotripsina e de subtilisina de hemócito de Pacifastacus
leniusculus (Johansson et al., 1994), o LDTI (leech-derived tryptase inibitor) de Hirudo medicinalis (Sommerhoff et al., 1994) e o inibidor de elastase de neutrófilo
denominado Infestina 1R de Triatoma infestans (Lovato et al., 2006). Também foram
descritos inibidores de trombina (Campos et al., 2002; Mende et al., 1999; Friedrich et
al., 1993) e FXIIa (Campos et al., 2004).
Os inibidores tipo Kazal de invertebrados são considerados “não clássicos”.
Este termo foi usado por Fink et al. (1986) para descrever a bdelin B-3, um inibidor
tipo Kazal de Hirudo medicinalis. Geralmente, a quantidade de resíduos de
aminoácidos entre a cisteína 1e 2 em invertebrados contem cerca de 1 a 6 resíduos
de aminoácidos. Isto faz com que esse loop seja menor do que o loop presente nos
inibidor tipo Kazal clássicos e pode ser interpretado como menos flexível (Hemmi et
al., 2003). O espaçamento entre as cisteínas 2 e 3, onde o aminoácido P1 está
inserido é relativamente constante com 7 a 9 resíduos de aminoácidos. Entre as
cisteínas 3 e 4 geralmente encontram-se 10 resíduos de aminoácidos. O espaço entre
as cisteínas 4 e 5 acomoda entre 3 e 6 aminoácidos e entre as cisteínas 5 e 6 o
número de aminoácidos varia de 7 a 16 resíduos (Rimphanitchayakit & Tassanakajon,
Os inibidores tipo Kazal inibem as serinoproteases por um mecanismo padrão
(Laskowski & Kato, 1980). Cada domínio Kazal atua como um análogo do substrato
que se liga competitivamente ao sítio ativo da enzima alvo formando um complexo
relativamente estável. Embora a ligação não seja covalente, as inibições são fortes e
específicas com constantes de dissociação (Ki) geralmente na faixa de nM (González
et al., 2007a; González et al., 2007b, Campos et al., 2002).
Os inibidores tipo Kazal têm papel importante nos processos em que as
serinoproteases estão envolvidas, como por exemplo, a cascata da coagulação,
reprodução, prevenção da autofagia excessiva, proteção contra patógenos e atividade
antimicrobiana. No caso dos inibidores tipo Kazal presente em parasitas, são
importantes na proteção contra proteinases dos seus hospedeiros (Rimphanitchayakit
& Tassanakajon, 2009)
1.5 Hemostasia do hospedeiro
A hemostasia é a resposta do hospedeiro para controlar a perda de sangue
seguido da injúria vascular. Ela consiste em agregação plaquetária, coagulação
sanguínea e vasoconstrição, e esses eventos são redundantes. Há vários agonistas
independentes para ativar a agregação plaquetária, pelo menos dois vasoconstritores
são liberados pelas plaquetas e a coagulação sanguínea é um sistema complexo com
vários pontos de amplificação e controle (Ribeiro & Francischetti, 2003). O processo
de alimentação com sangue requer que os artrópodes sejam capazes de inibir estas
defesas hemostáticas dos hospedeiros vertebrados. Mecanismos anti-hemostáticos
durante a picada, e incluem, pelo menos, um fator anti-agregação plaquetária, um
vasodiltador e um anticoagulante, mas em muitos casos existe mais de uma molécula
em cada categoria (Ribeiro & Francischetti, 2003).
No mosquito Ae. aegypti já foram descritos: vasodilatadores do tipo taquicinina
(sialocinina I e sialocinina II) (Champagne & Ribeiro, 1994), a apyrase (Smartt et al.,
1995) e a aegyptina (Calvo et al., 2007), que tem função inibitória sobre a agregação
plaquetária e o inibidor de FXa (Stark & James, 1995).
1.5.1 Cascata da coagulação
A cascata da coagulação é um importante mecanismo de defesa contra o
sangramento, composta principalmente de serinoproteases do tipo tripsina que se
encontram na forma de zimogênios (Neurath & Walsh, 1976, Bode, 2005). A cascata
está dividida didaticamente em duas vias: a via intrínseca, na qual todos os
componentes estão presentes no sangue, e a via extrínseca, que requer o fator
tecidual (proteína de membrana celular subendotelial) (Vine, 2009). As duas vias
convergem para a via comum com a ativação do fator X (FX) em FXa.
A cascata da coagulação tem início em resposta à ruptura do endotélio, o que
permite o extravasamento do sangue para os tecidos extravasculares. A ativação da
cascata da coagulação é coordenada com a formação do tampão plaquetário, que
inicialmente bloqueia a lesão vascular, impedindo a perda de sangue. Respostas
anticoagulantes garantem o controle da coagulação e, em ocasiões normais, elas
prevalecem sobre as respostas procoagulantes (Prezelj et al., 2007). A figura 2
Figura 2 - Cascata da coagulação. HMWK – Ciniogênio de alto peso molecular, PK –
Pré-calicreína, TFPI – Inibidor de fator tecidual. As setas pretas representam a ativação dos fatores, as setas vermelhas indicam a ação de inibidores, as setas azuis indicam as reações catalisadas por fatores ativados e as setas cinza indicam as ações possíveis da trombina.
A injúria aos vasos sanguíneos é tradicionalmente considerada o principal
estímulo para o início da cascata da coagulação. Com a ruptura do endotélio, o fator
VII (FVII) entra em contato com o fator tecidual (FT) e é ativado a fator VIIa (FVIIa). O
FT então se liga ao FVIIa, aumentando sua atividade sobre o FX, ativando-o em FXa
e, em menor proporção, o fator IX (FIX) em FIXa (Orfeo et al., 2005). Então, o FXa
protrombina em trombina, que por sua vez é capaz de amplificar a cascata ativando
os cofatores V e VIII, e o FXI. A coagulação é propagada quando o fator IXa (FIXa)
liga-se ao fator VIIIa (FVIIIa) na superfície de plaquetas ativadas, aumentando a
ativação do FX (Brinkman et al., 2002). O FXa liga-se ao FVa e à protrombina,
formando o complexo protrombinase, que converte grandes quantidades de
protrombina em trombina (Spencer & Becker, 1997). No estágio final da coagulação, a
trombina converte o fibrinogênio em fibrina. A trombina também ativa o fator XIII
(FXIII) a FXIIIa, que estabiliza a rede de fibrina (Lorand & Konishi, 1964).
A regulação da coagulação ocorre em cada nível da cascata, tanto pela
inibição das serinoproteases como pela modulação da atividade dos fatores. A
maioria das enzimas geradas durante a cascata é inibida pelo inibidor de
serinoproteases antitrombina III (Bauer & Rosenberg, 1991).
1.5.2 Trombina
A trombina possui um papel essencial na hemostasia por ser a enzima central
envolvida na cascata da coagulação, na agregação plaquetária, e, além disso, na
ativação de outros fatores da cascata da coagulação. Esta enzima é sintetizada no
fígado e é secretada na circulação sanguínea na forma de zimogênio (protrombina),
que é ativado à trombina no local da injúria vascular por proteólise limitada (Davie &
Kulman, 2006).
A α-trombina é formada pela cadeia A, composta por 36 resíduos de
aminoácidos, e pela cadeia B, composta por 259 resíduos. As duas cadeias ligam-se
resultando em regiões eletrostaticamente positivas e negativas (Bode et al., 1992),
apresentando três regiões distintas. A primeira região positiva é chamada de exosítio
I, ou exosítio ligador de fibrinogênio. A segunda superfície positiva é designada
exosítio II, ou exosítio ligador de heparina. A terceira região é o sítio ativo da
trombina. O sódio parece ser um importante modulador alostérico da trombina (Bode,
2006). A estrutura da trombina está representada na figura 3.
(Fonte: Bode, 2006)
Figura 3 – Estrutura da trombina. Representação da superfície da trombina complexada
1.5.3 Inibidores de trombina de animais hematófagos
Inibidores de trombina são amplamente identificados em insetos hematófagos,
pois são essenciais para garantir o sucesso na alimentação. Alguns inibidores de
trombina já foram descritos em glândulas salivares, como a savignina de Ornithodoros
savignyi (Nienaber et al., 1999), um inibidor isolado de Boophilus microplus (Horn et al., 2000), a anofelina, isolado de Anopheles albimanus (Valenzuela et al., 1999),
inibidor isolado de Anopheles stephensi (Waidhet-Kouadio et al, 1998) e a triabina de
Triatoma pallidipennis (Noeske-Jungblut et al., 1995). Outros inibidores foram
encontrados em intestino, como por exemplo, a infestina 1-2, de Triatoma infestans
(Campos et al., 2002), hemalina, do carrapato Haemaphysalis longicornis (Liao et al.,
2009), a brasiliensina de Triatoma brasiliensis (Araujo et al., 2007) e a dipetalogastina
de Dipetalogaster maximus (Mende et al., 1999). Existem ainda casos onde o inibidor pode ser encontrado em saliva e intestino, como é o caso do inibidor de trombina de
Glossina morsitans (Cappello et al., 1998).
Existem diversos mecanismos pelos quais os inibidores são capazes de inibir a
trombina. A hirudina (Grütter et al., 1990) e a rodnina (van de Locht et al., 1995), por
exemplo, se ligam ao sítio ativo e ao exosítio I, enquanto a botrojaracina se liga ao
exosítio I e II (Arocas et al., 1996), a triabina interage somente com o exosítio I
(Fuentes-Prior et al., 1997) e a hemadina interage somente com o exosítio II da
1.6 Digestão em mosquitos hematófagos
A digestão das proteínas do sangue por mosquitos hematófagos ocorre em
aproximadamente 36 h, quando o mosquito converte as proteínas plasmáticas para
componentes dos ovos (Noriega & Wells, 1999). Proteínas são os principais
componentes do sangue e 24 h após a alimentação, 80% das proteínas ingeridas já
foram digeridas (Briegel & Lea, 1975). Isto só é possível porque a alimentação com
sangue induz o aumento da atividade proteolítica no intestino dos mosquitos (Fisk,
1950). O intestino médio das fêmeas do mosquito Ae. aegypti sintetizam duas formas
de tripsina após a alimentação com sangue, a tripsina precoce e tardia. A tripsina
precoceé produzida em pequenas quantidades e aparece no intestino médio cerca de
1 h após a alimentação e desaparece cerca de 6 a 8 h após a alimentação. A tripsina
tardia é produzida em grandes quantidades e começa a aparecer de 8 a 10 h após a
alimentação (Noriega & Wells, 1999).
1.6.1 Tripsina precoce
A tripsina precoce é a proteína mais abundante isolada de intestino médio de Ae.
aegypti após 3 h de alimentação por cromatografia de afinidade em benzamidina-Sepharose (Noriega et al., 1996a). O RNAm para tripsina precoce está ausente em
larvas pupas e fêmeas adultas recém emergidas, e apresenta níveis detectáveis após
24 h de emergência e atinge o nível máximo após 2-3 dias de emergência, porém a
trispina precoce só é produzida após a alimentação com sangue (Noriega et al.,
1.6.2 Tripsina tardia
A tripsina tardia foi isolada e caracterizada por Graf & Briegel (1985; 1989) e
Graf et al. (1988; 1991), é a endoprotease mais abundante no intestino médio de
mosquito durante a alimentação atingindo um pico de 5-6 µg/intestino (Graf et al.,
1998). O RNAm para tripsina tardia não está presente em adultas não alimentadas e
o começa a ser detectado 8 h após a alimentação com sangue, atingindo o seu nível
máximo 24 h após a alimentação. O aumento dos níveis de RNAm é seguido pelo
aumento dos níveis de proteína.
1.7 Sialotranscriptoma do mosquito Aedes aegypti
Em 2007, Ribeiro et al estudaram o transcriptoma de glândula salivar de fêmeas
do mosquito Ae. aegypti, no qual foram encontrados três inibidores hipotéticos do tipo
serpina (sendo dois deles com função desconhecida), uma cistatina e um inibidor do
tipo Kazal que foi identificado em glândula salivar de fêmeas e machos, e em carcaça
de fêmeas. Este inibidor tipo Kazal apresentou similaridade com inibidores de
trombina (Ribeiro et al., 2007). Com o objetivo de confirmar a atividade inibitória de
2 OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram a clonagem, expressão, purificação e
caracterização do inibidor tipo Kazal encontrado em transcriptoma de glândula salivar
de Ae. aegypti, denominado AaTI (Aedes aegypti trypsin inhibitor). Para alcançar estes objetivos foram necessários:
• Construção de oligonucleotídeos baseados na sequência depositada no banco
de dados pelo Dr. José M. Ribeiro sob o número de acesso DQ440176.
• Clonagem do fragmento de DNA que codifica para o AaTI em vetor de
expressão pPIC9 para levedura Pichia pastoris.
• Transformação de leveduras P. pastoris e expressão do AaTI recombinante
(rAaTI) e do inibidor truncado (rAaTI∆) sem a cauda C-terminal carregada
negativamente.
• Purificação do rAaTI por cromatografias de afinidade e gel filtração.
• Caracterização cinética do inibidor purificado sobre diferente serinoproteases
de mamíferos e tripsinas de fêmeas adultas de Ae. aegypti pós-alimentadas.
• Testes de tempos de coagulação e agregação plaquetária utilizando o rAaTI
purificado. Ensaios de competição do rAaTI pelo exosítio I e II da trombina para
identificar em que exosítio o rAaTI se liga.
• Análise do perfil de transcrição do gene de AaTI em diferentes fases de vida e
• Identificação da presença de rAaTI nativo em intestino de fêmeas alimentadas
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Clonagem do fragmento de DNA que codifica para o inibidor de tripsina de
Aedes aegypti (AaTI) e o inibidor truncado (rAaTI∆)
3.1.1 Construção de oligonucleotídeos
Os oligonucleotídeos específicos foram construídos baseando-se na sequência
de nucleotídeos que codifica para o AaTI, depositada no banco de dados pelo Dr.
José M. Ribeiro (NIH – Rockville, MD, USA) sob o número de acesso DQ 440176. No
oligonucleotídeo forward 5’ AGCTCTCGAGAAAAGAGAGAGAGGAGTTTGTGC – 3’
(pPICXhoF) foi inserido um sítio de restrição para a enzima XhoI. No oligonucleotídeo
reverse (pPICNotR) 5’ – TTTTCTTTTTGCGGCCGCTCAATACTCCTGTGGGATGAAG
– 3’ foi inserido um sítio de restrição para a enzima NotI. Para o inibidor truncado, foi
utilizado o mesmo oligonucleotídeo forward e como reverse o oligo pPICNotR∆, cuja
sequência é 5’ - TTTTCCTTTTGCGGCCGCTCAGTTGTCACATGCTTG – 3’, no qual
também foi inserido um sítio para a enzima de restrição NotI.
3.1.2 Amplificação e purificação do fragmento de DNA obtido por reação de
polimerase em cadeia (PCR)
Utilizando os oligonucleotídeos construídos e como molde um produto de PCR
gentilmente cedido pelo Dr Ribeiro contendo o AaTI, foi amplificado, por PCR, um
fragmento de DNA que codifica o inibidor AaTI e o inibidor truncado AaTI∆. As
condições foram: 5 min a 94°C seguido por 35 ciclos de [denaturação (94°C por 40 s),
anelamento (55°C por 50 s) e polimerização (72°C por 50 s)] e uma etapa final de
PTC-200 (MJ Research – Minnesota, USA) na presença de tampão tris-HCl 100 mM,
pH 8,8 contendo KCl 500 mM e Nonited P40 0,8%, MgCl2 1,5 mM, dNTP (0,2 mM) e
enzima Taq polimerase (1U) (Fermentas – Vilnius, Lituânia). O produto do PCR foi
aplicado em um gel de agarose 1% em TAE (tampão tris-acetato 40 mM, pH 8,0,
EDTA 1 mM) e a visualização da banda de DNA foi realizada na presença de brometo
de etídeo em luz UV. A banda foi recortada e extraída do gel utilizando o kit QIAEX II
(QIAGEN - Germany) segundo as especificações do fabricante.
3.1.3 Reação de sequenciamento do fragmento de DNA amplificado
O sequenciamento automático de DNA foi realizado utilizando-se o kit
DYEnamic ET* Terminator Cycle Sequencing (Amersham Biosciences – Sweden) segundo as instruções do fabricante. As condições do PCR foram: 95° por 10 s
seguidos de 30 ciclos de 95°C durante 20 s; 56,5°C por 15 s e 60°C por 1 min. Para
cada reação de sequenciamento foram utilizados 3 µL de DNA purificado, 1 µL de
oligonucleotídeo pPICXhoF, pPICNotR ou pPICNotR2 5 pmol/µL, 1,5 µL do tampão
de sequenciamento (tris-HCl 160 mM, pH 9,0, contendo MgCl2 4 mM), 2,5 µL de
DYEnamic e água estéril para completar o volume de 10 µL. Os produtos da reação
foram precipitados com 25 µL (2,5 volume) de etanol absoluto na presença de 1 µL
(0,1 volume) de acetato de potássio 2,77 M contendo EDTA 0,25 M. A solução foi
centrifugada por 20 min a 15 700 g, o sobrenadante descartado e o pellet lavado com
etanol 70% e novamente centrifugado por 5 min. O sobrenadante foi novamente
descartado e o DNA precipitado foi seco à temperatura ambiente. O pellet foi
suspenso em formamida e aplicado no seqüenciador automático de DNA – ABI Prism
3.1.4 Digestão do fragmento de DNA amplificado e do vetor pPIC9 com as
enzimas de restrição XhoI e NotI
Os fragmentos de DNA amplificados e o vetor de expressão pPIC 9 (figura 4)
foram inicialmente digeridos com enzima XhoI 20 U (Invitrogen – Carlsbad, California)
na presença de tampão React 2 (tris-HCl 0,5 M pH 8,0, contendo MgCl2 0,1 M e NaCl
0,5 M) em um volume final de 10 µL. A reação ocorreu a 37°C durante 16 h. Em
seguida o fragmento de DNA que codifica para o AaTI e o vetor pPIC 9 foram
precipitados com etanol absoluto como descrito anteriormente e foram digeridos com
a enzima NotI 10 U (Fermentas – Vilnius, Lituânia) na presença de tampão O
(Tris-HCl 50 mM pH 7,5 contendo MgCl2 10 mM, NaCl 100 mM e albumina de soro bovino
(BSA) 0,1 mg/mL) em um volume final de 10 µL. A reação ocorreu a 37°C por 16 h.
Após as digestões, o fragmento e o vetor digeridos foram aplicados no gel de
agarose 1% e as bandas foram recortadas e extraídas do gel utilizando o kit QIAEX II
(QIAGEN – Germany). O DNA foi então quantificado por leitura de absorbância em
260 nm, considerando a leitura de 1 de absorbância em 260 nm (A260) = 50 µg
Figura 4 – Vetor de expressão pPIC9. O fragmento de DNA que codifica para o AaTI foi clonado entre os sítios de restrição XhoI e NotI.
3.1.5 Ligação do fragmento de DNA que codifica para o AaTI e para o AaTI∆ ao
vetor de expressão pPIC9
Os fragmentos de DNA e o vetor de expressão pPIC9 digeridos com as
enzimas de restrição XhoI e NotI foram ligados na presença da enzima T4 ligase 1,5
U (Promega – Madison, USA) na presença de tampão tris-HCl 30 mM pH 7,8
contendo MgCl2 10 mM, DTT 10 mM e ATP 1 mM na proporção de 100:1
(fragmento:vetor). A reação foi incubada durante a noite a 16°C e, posteriormente,
precipitada com etanol absoluto, como descrito anteriormente. O precipitado foi então
3.1.6 Preparo de bactérias E. coli cepa DH5-α competentes para eletroporação
Uma colônia de E. coli cepa DH5-α foi repassada em uma placa LB (Peptona
10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl 5 g/L) contendo ágar 15 g/L. Após o
crescimento da colônia, foi feito um pré-inóculo de uma colônia isolada da placa em 3
mL de meio LB líquido foi incubado sob agitação de 180 rpm durante a noite a 37°C
em agitador orbital Gallenkamp (Surrey, UK). Posteriormente o pré-inóculo foi
adicionado em 300 mL de meio LB e a incubação prosseguiu até a leitura de
absorbância em 550 nm (A550) atingir o valor de0,5. Em seguida, as células foram
incubadas no gelo por 15 min e centrifugadas a 3225 g por 10 min a 4°C em
centrífuga Hitachi (Japão). O sobrenadante foi descartado e as células foram
ressuspensas em 50 mL de água estéril gelada (4°C) e posteriormente foram
adicionados mais 200 mL de água estéril gelada. As células foram centrifugadas
novamente a 3225 g por 10 min a 4°C. A etapa de lavagem foi repetida conforme
descrita anteriormente. Após a centrifugação, foram adicionados 40 mL de glicerol
10% estéril, e as células foram centrifugadas como descrito acima. O sobrenadante
foi novamente descartado e as células foram ressuspensas em 1 a 2 mL de glicerol
10%. Foram preparados alíquotas de 50 µL que foram estocadas a -70°C.
3.1.7 Transformação de bactérias E. coli cepa DH5-α por eletroporação
As células eletrocompetentes foram retiradas do freezer -70°C e incubadas
durante 10 min em banho de gelo. Às células, foram adicionados 3 µL da ligação
(AaTI + pPIC9) e a mistura transferida para a cubeta de eletroporação 0,2 cm
(Bio-Rad – Hercules, CA) gelada. A eletroporação ocorreu utilizando os parâmetros: 2,5
SOC: bacto triptona 2,0 %, extrato de levedura 0,5%, NaCl 100 mM, KCl 2,5 mM,
MgSO4.7H2O 10 mM, MgCl2 10 mM e glicose 20 mM (Sambrook et al., 1989) às
células. As células transformadas foram transferidas para tubos de 1,5 mL e mantidas
a 37°C por 45 min sob agitação constante de 180 rpm. Após o tempo de incubação as
células foram plaqueadas em meio LB-ágar contendo o antibiótico ampicilina 200
µg/mL e incubadas durante 15 h a 37°C.
3.1.8 Detecção de clones positivos por PCR e mini-preparação plasmidial
Cinco clones de bactéria contendo o fragmento do AaTI e oito do AaTI∆ foram
submetidos a uma PCR para verificar a presença do fragmento de DNA. Foram
utilizados os oligonucleotídeos AOX3’ e AOX5’, tampão para PCR, MgCl2 1,5 mM,
dNTP 0,2 mM e Taq polimerase 1 U. Três clones positivos foram selecionados para
extração de DNA plasmidial em pequena escala (Sambrook et al., 1989). Estes clones
foram inoculados em 3 mL de meio LB contendo ampicilina 200 µg/mL e incubados a
37°C por 16 h sob agitação constante de 180 rpm. A suspensão de bactérias foi
centrifugada a 15 700 g por 1 min à temperatura ambiente, o sobrenadante foi
descartado e as células suspensas em 100 µL da solução I (tampão tris-HCl 25 mM,
pH 8,0 contendo EDTA 10 mM, glicose 50 mM e RNAse 100 µg/mL). Em seguida
foram adicionados 200 µL da solução II (SDS 1%, NaOH 0,2 M) e a mistura foi
incubada à temperatura ambiente durante 5 min. Decorrido o tempo, foram
adicionados 200 µL da solução III (acetato de potássio 3 M, ácido acético 5 M) e a
mistura foi incubada no gelo por 30 min, sendo posteriormente centrifugada a 15 700
g por 5 min e o sobrenadante transferido para um tubo estéril, ao qual foi adicionado
novamente por 5 min, o pellet foi lavado com etanol 70% e após a última
centrifugação o DNA foi seco à temperatura ambiente e dissolvido em 30 µL de água
estéril. O DNA purificado foi submetido a uma reação de seqüenciamento como
descrita anteriormente, porém utilizando os oligonucleotídeos AOX 3’ ou AOX 5’ na
concentração de 5 pmol/µL.
3.1.9 Midi preparação de DNA plasmidial
Um das colônias de cada construção positiva, cuja sequência de DNA se
apresentava correta, foi inoculada em 200 mL de meio LB contendo ampicilina 200
µg/mL e incubada durante 18 h a 37°C. A midi preparação plasmidial foi realizada
utilizando o kit HiSpeed Plasmid Midi (QIAGEN – Germany) segundo as
especificações do fabricante. A quantificação de DNA foi feita por leitura de A260,
considerando 1 de A260 = 50 µg de DNA/mL de solução.
3.2 Expressão dos inibidores recombinantes rAaTI e rAaTI∆
3.2.1 Preparação de levedura Pichia pastoris cepa GS115 competente para
eletroporação
Uma colônia de Pichia pastoris cepa GS115 foi repassada para uma placa YPD
(extrato de levedura 1%, peptona 2%, dextrose 2%). Após o crescimento das
leveduras, foi feito um pré-inóculo de uma colônia isolada da placa em 2,5 mL de
meio YPD e incubado durante 15 h a 30°C sob agitação constante de 180 rpm. No dia
foi incubada até a leitura de absorbância em 600 nm (A600) atingir o valor de 1,3 a 1,5.
As células foram centrifugadas a 454 g em centrífuga Hitachi (Japão) por 5 min a 4°C.
O sobrenadante foi então descartado e o pellet foi ressuspenso em 250 mL de água
estéril gelada. O procedimento foi repetido, porém as células foram ressuspensas em
125 mL de água estéril. A centrifugação foi novamente repetida e as células
ressuspensas em 40 mL de sorbitol 1 M gelado e, finalmente as células foram
centrifugadas como descrito anteriormente e ressuspensas em 2 mL de sorbitol 1 M
gelado. Foram feitas alíquotas de 80 µL e estocadas por até uma semana a 4°C.
3.2.2 Linearização das construções pPIC9 + AaTI e pPIC9 +AaTI∆ com a enzima
de restrição SacI
Antes da transformação das leveduras, 7 µg da construção pPIC9 contendo o
fragmento de DNA de AaTI (ou AaTI∆) foi linearizada com a enzima de restrição SacI
15 U (Promega – Madison, USA) em tampão J (tris-HCl 10 mM pH 7,5 contendo
MgCl2 7 mM, KCl 50 mM e DTT 1 mM) em um volume final de reação de 10 µL. A
reação foi incubada a 37°C durante a noite e posteriormente precipitada com etanol
absoluto como descrito anteriormente. Após a precipitação o DNA foi ressuspenso em
5 µL de água estéril.
3.2.3 Transformação de levedura Pichia pastoris cepa GS115 por eletroporação
As células eletrocompetentes foram misturadas com 7 µg de DNA linearizado e
a mistura foi transferida para a cubeta 0,2 cm (Bio-Rad – Hercules, CA) e incubada no
kV, 400 Ohms e 25 µF. Após a eletroporação foi adicionado 1 mL de sorbitol 1 M
gelado e as células foram plaqueadas em placas MD (YNB 1,34%, biotina 0,00004%
e dextrose 2%) e incubadas a 30°C por 2 dias.
3.2.4 Detecção dos clones positivos por PCR e expressão analítica do rAaTI e
rAaTI∆
Dez clones de levedura transformada de cada construção foram submetidos a
uma PCR para verificar a presença do fragmento de DNA de AaTI e AaTI∆ na
levedura. Para isso foram utilizados os oligonucleotídeos AOX3’ e AOX5’, tampão
para PCR, MgCl2, dNTP e Taq polimerase. O produto da PCR foi aplicado em gel de
agarose 1%.
Para a expressão analítica dos inibidores recombinantes, cada clone positivo
foi inoculado em 2,5 mL de meio BMGY (extrato de levedura 1%, peptona 2%, tampão
fosfato de potássio 100 mM pH 6,0, YNB 1,34%, biotina 0,00004% e glicerol 1%) até
A600 atingir entre 2 e 6. As células foram então centrifugadas e o sobrenadante foi
desprezado. As células foram ressuspensas em meio BMMY (extrato de levedura 1%,
peptona 2%, tampão fosfato de potássio 100 mM pH 6,0, YNB 1,34%, biotina
0,00004% e metanol 0,5%) até o A600 atingir o valor de 1. A cultura foi induzida com
3.2.5 Teste de inibição de tripsina utilizando substratos cromogênicos
Após a expressão dos inibidores, o sobrenadante de cultura foi testado quanto
a sua capacidade de inibir tripsina segundo o método de Erlanger et al (1961). A
atividade proteolítica da tripsina foi determinada através da hidrólise do substrato
cromogênico Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa 0,1 mM (Sigma – St. Louis, MO, USA) em
tampão tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 contendo NaCl 0,15 M e triton X-100 0,1%. No teste de
inibição, a tripsina (208 nM) foi pré-incubada com concentrações crescentes do
inibidor recombinante por 10 min a 37°C e, posteriormente, o substrato foi adicionado
e sua hidrólise foi acompanhada por leitura de absorbância em 405 nm (A405). A
porcentagem de inibição das amostras foi calculada utilizando como referência a
hidrólise do substrato pela enzima na ausência do inibidor.
3.2.6 Expressão do rAaTI e rAaTI∆ em escala preparativa
O clone de cada construção que apresentou maior atividade inibitória para
tripsina foi selecionado para expressão em escala preparativa. A colônia escolhida foi
inoculada em 120 mL de meio BMMY até A600 atingir entre 2 e 6. As células foram
então centrifugadas e o sobrenadante foi desprezado. As células foram ressuspensas
em meio BMMY (aproximadamente 500 mL) e a cultura foi induzida com metanol
3.2.7 Síntese do peptídeo C-terminal de AaTI carregado negativamente
O peptídeo C-terminal ( Ac – D – N – L – T – D – N – V – N – D – F – I – P – Q
– E – Y – NH2) foi sintetizado manualmente pela estratégia de fase sólida (Juliano et
al., 1987). Após a síntese do peptídeo, este foi purificado por cromatografia da fase
reversa em coluna Vydac C18 sendo eluída em 60% de acetonitrila. As frações
cromatográficas contendo apenas o peptídeo foram reunidas liofilizadas, em seguida
o mesmo foi caracterizado em espectrômetro de massa LC/ESI-MS e por análise de
aminoácidos. Todos esses procedimentos foram realizados pelo grupo da Profa. Dra
Maria Aparecida Juliano, do Departamento de Biofísica da UNIFESP.
3.3 Purificação dos inibidores recombinantes
3.3.1 Purificação por cromatografia de afinidade
Após a expressão do rAaTI e rAaTI∆, as leveduras foram centrifugadas e o
sobrenadante de cultura utilizado na purificação do inibidor. Inicialmente a coluna de
tripsina-Sepharose (8 mL) foi equilibrada com 50 mL de tampão tris-HCl 100 mM pH
8,0. Em seguida, 50 mL do meio foram aplicados e a coluna foi lavada com 100 mL de
tampão tris-HCl 100 mM contendo NaCl 0,3 M. A eluição foi feita por abaixamento de
pH e aumento da concentração de sal, utilizando solução de KCl 0,5 M pH 2,0. As
frações eluídas de 1 mL foram neutralizadas com tampão tris-HCl 1M, pH 8,0, as A280
obtidas em espectrofotômetro e em seguida submetidas a ensaios de inibição de
3.3.2 Purificação por cromatografia de fase reversa e determinação da
sequência de aminoácidos N-terminal
Para confirmar a sequência de aminoácidos N-terminal do AaTI, as frações
eluídas da cromatografia de afinidade, que continham atividade inibitória para tripsina,
foram reunidas em um pool, concentradas e aplicadas em uma cromatografia de fase
reversa em coluna C8 Sephasil Peptide utilizando o sistema de purificação AKTA. Os
picos eluídos foram submetidos à determinação da sequência de aminoácidos
N-terminal por seqüenciamento automático utilizando o método da degradação de
Edman (Edman, 1949).
3.3.3 Purificação por cromatografia em gel filtração
Para a caracterização do rAaTI, as frações eluídas da cromatografia de
afinidade com atividade para tripsina foram reunidas, concentradas e aplicadas em
uma coluna de gel filtração Superdex 75 (GE) pré-equilibrada com tampão tris-HCl
100 mM pH 8,0 contendo NaCl 0,15 M. As frações eluídas foram testadas quanto a
capacidade de inibir tripsina. As frações com atividade inibitória foram reunidas em
um pool, concentradas e utilizadas na caracterização do inibidor.
3.4 Caracterização do rAaTI e rAaTI∆
3.4.1Teste de inibição sobre diferentes serinoproteases
Os inibidores purificados e concentrados (rAaTI – 325 nM ou rAaTI∆ - 346 nM)
de plasminogênio tecidual (t-PA), calicreína plasmática humana (HupK), uroquinase,
plasmina, FXa, quimotripsina e elastase de neutrófilo humano (HNE). As enzimas
foram separadamente pré-incubadas com concentrações crescentes do inibidor
recombinante e, em seguida, foram adicionados os respectivos substratos
cromogênicos: S2288 (HD-Ile-Pro-Arg-pNa), S2302 (HD-Pro-PheArg-pNa), S4444
(Piro-Glu-Gly-Arg-pNa), S2251 (HD-Val-Leu-Lys-pNa), S2222
(Bz-Ile-Glu(g-OR)-Gly-Arg-pNa), N-Suc-Ala-Ala-pNa, S2484 (Piro-Glu-Pro-Val-pNa) na concentração de 100
µM. A hidrólise dos substratos foi acompanhada por leitura da absorbância em 405
nm (A405). Para inibição de trombina, foi utilizado o substrato fluorogênico
Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC também na concentração 100 µM.
3.4.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE)
Após a purificação do rAaTI e rAaTI∆, os inibidores recombinantes foram
analisados por SDS-PAGE segundo o método descrito por Laemmli (1970).
Primeiramente foi preparado um gel de separação de poliacrilamida 15% (2,5 mL de
solução de acrilamida 30% e bis-acrilamida 0,8%, 1,87 mL de tampão tris-HCl 1 M pH
8,8, 0,57 mL de água destilada, 50 µL de solução de SDS 10%, 3,3 µL de TEMED e
13,4 µL de solução de persulfato de amônio 200 mg/mL). O gel de concentração (5%)
foi preparado com 0,56 mL de solução de acrilamida 30% e bis-acrilamida 0,8%, 0,42
mL de tampão tris-HCl 1 M pH 6,8, 2,28 mL de água destilada, 33,4 µL de solução de
SDS 10%, 2,5 µL de TEMED e 16,7 µL de solução de persulfato de amônio 200
mg/mL. As amostras foram diluídas em tampão tris-HCl 0,3 M pH 6,68 contendo 2%
de SDS, 20% de glicerol e 0,012% de azul de bromofenol e aplicadas no gel. Os
