PATRICIA NAPOLI BELFORT MATTOS
AVALIAÇÃO DA GRANZIMA B E DO FATOR DE CRESCIMENTO
ENDOTELIAL VASCULAR EM PACIENTES COM NEOPLASIA
INTRA-EPITELIAL ESCAMOSA CERVICAL
DE BAIXO E DE ALTO GRAU
Tese apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Mestre em Ciências.
PATRICIA NAPOLI BELFORT MATTOS
AVALIAÇÃO DA GRANZIMA B E DO FATOR DE CRESCIMENTO
ENDOTELIAL VASCULAR EM PACIENTES COM NEOPLASIA
INTRA-EPITELIAL ESCAMOSA CERVICAL
DE BAIXO E DE ALTO GRAU
Tese apresentada a Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientadora:
Profa. Dra. Julisa Chamorro Lascasas Ribalta
Co-Orientadores:
Dra. Neila Maria de Góis Speck
Dr. Gustavo Rubino de Azevedo Focchi
Mattos, Patricia Napoli Belfort
Avaliação da granzima B e do fator de crescimento endotelial vascular em pacientes com neoplasia intra-epitelial escamosa cervical de baixo e de alto grau. / Patricia Napoli Belfort Mattos.– São Paulo, 2008.
xiii, 82f.
Tese (Mestrado): Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação do Departamento de Ginecologia.
Título em inglês: Immunohistochemical expression of granzyma B and vascular endothelial growth factor (VEGF) in normal uterine cervix, low and high grade squamous intraepithelial lesions.
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Afonso Celso Pinto Nazário
Coordenador do Curso de Pós-graduação:
iv
“Para um homem sábio, todas as terras são acessíveis, pois a pátria de uma
alma virtuosa é o Universo”
v
Dedicatória
Aos meus filhos Gabriela e Gustavo,
prioridades na minha vida.
Ao Armando, companheiro de todos os momentos.
Aos meus pais Antonio e Irani, sempre presentes em todos os momentos da minha vida, compartilhando
alegrias, tristezas e por não me deixarem desistir nunca.
À Fernanda minha irmã, pelo amor, amizade e carinho.
À Izabel minha avó “in memorian”, minha segunda mãe.
vi
Agradecimentos
À Prof. Dra. JULISA CHAMORRO LASCASAS RIBALTA
“Uns são homens, alguns são professores, poucos são mestres. Aos primeiros,
escuta-se, aos segundos, respeita-se e aos últimos segue-se.” Minha eterna
gratidão pela confiança, oportunidade e sobretudo pelos ensinamentos.
Ao Prof. Dr. Gustavo Rubino de Azevedo Focchi
Pela orientação desta tese que de forma singela, amiga e efetiva transferiu seus
conhecimentos. Sou eternamente grata pelas idéias e parceria que tornaram
possível a realização deste trabalho.
À Dra. Neila Maria de Góis Speck
Pela sabedoria que transmite sempre de forma amiga e exemplo de dedicação,
organização e perseverança.
À Dra. Nabiha Saadi Abrahão Taha
Pela amizade, apoio e ensinamento constante.
À Dra. Pabline Barbosa Lima Almeida
Pela sincera amizade, ajuda e companheirismo nesta longa jornada
À Dra. Raquel Autran Coelho
vii
A todos os chefes e colegas do ambulatório de Patologia do Trato Genital
Inferior do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina/UNIFESP-EPM: Alessandra Mollo, Ana
Carolina da Silva Chuery, Ana Luisa de Figueiredo e Silva, Carmen Regina
Nogueira de Carvalho, Clarissa de Cerqueira Monteiro, Clóvis Gonzaga
Cunha Camargo, Cristiane Cruz Nervo, Elizabeth Rautman Cezarino
Linhares, Fernanda Kesselring Tso, Flávio Zucchi, Gisele Negro, Helenice
Júlio Kang, Jefferson Alfredo Barros, Kátia Franco Quaresma de Moura,
Mayara Karla Figueiredo Facundo, Natália Zekhry e Valéria Grisólia de
Freitas.
Às enfermeiras e funcionários da Escola Paulista de Medicina/UNIFESP-EPM,
em especial a Marilda e Ivanilda, pelo apoio estrutural na realização dos
exames, marcação de consultas e tratamentos.
Às funcionárias do laboratório de Imuno-histoquímica do Departamento de
Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo – USP,
pela realização do método imuno-histoquímico na lâmina.
viii
Sumário
Dedicatória... v
Agradecimentos... vi
Listas... ix
Resumo... xiii
1. INTRODUÇÃO... 1
2. PROPOSIÇÃO... 11
3. PACIENTES E MÉTODOS... 13
3.1 Pacientes... 14
3.2 Métodos... 17
3.3 Método Estatístico... 24
4. RESULTADOS... 25
5. DISCUSSÃO... 31
6. CONCLUSÃO... 40
7. ANEXOS... 42
8. REFERÊNCIAS... 63
Abstract
Bibliografia Consultada
ix
Lista de Tabelas
Tabela 1. Distribuição de 142 casos de fragmentos de colo uterino segundo a positividade da imuno-expressão da granzima B e as diferentes
lesões pré neoplásicas, grupo controle e avaliação estatística... 27
Tabela 2. Demonstrativo de 142 casos estudados segundo subgrupo,
número de casos parciais e testes estatístico de Kruskal-Wallis... 27
Tabela 3. Demonstrativo das diferentes médias e totais de linfócitos ativados seguindo local de contagem, total de casos estudados e avaliação estatística... 28
Tabela 4. Demonstrativo dos 160 casos avaliados para o VEGF segundo subgrupos, número de casos, grau de expressão e avaliação
x
Lista de Quadros
Quadro 1. Distribuição de 196 casos segundo diagnóstico histopatológico e avaliação da imuno-expressão da granzima B e do fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF)... 16
xi
Lista de Anexos
Anexo 1. Carta de aprovação do comitê de ética em pesquisa... 43
Anexo 2. Termo de consentimento livre e esclarecido... 44
Anexo 3. Ananmnese/ Exame colposcópico/ Resultado anátomo-patológico e imuno-histoquímico... 46
Anexo 4a. Granzima B- Neoplasia intra-epitelial de grau I ... 47
Anexo 4b. Granzima B- Neoplasia intra-epitelial de grau II ... 48
Anexo 4c. Granzima B- Neoplasia intra-epitelial de grau III ... 49
Anexo 4d. Granzima B- Controle... 50
Anexo 5a. VEGF- Neoplasia intra-epitelial de grau I... 51
Anexo 5b. VEGF- Neoplasia intra-epitelial de grau II... 52
Anexo 5c. VEGF- Neoplasia intra-epitelial de grau III... 53
Anexo 5d. VEGF- Controle ... 54
Anexo 6a. Granzima B e VEGF – (GB) – NIC I... 55
Anexo 6b. Granzima B e VEGF – (GB) – NIC II... 56
Anexo 6c. Granzima B e VEGF – (GB) – NIC III... 57
Anexo 6d. Granzima B e VEGF – (GB) – Controle... 58
Anexo 7a. Granzima B e VEGF – (VEGF) – NIC I... 59
Anexo 7b. Granzima B e VEGF – (VEGF) – NIC II... 60
Anexo 7c. Granzima B e VEGF – (VEGF) – NIC III... 61
xii
Lista de Abreviaturas e Símbolos
APTS 3-Aminopropil-trietoxi-silano-Sigma
CH Captura de híbridos
CTL Linfócito T citotóxicos
DMS Diferença mínima significante
DNA Ácido desoxirribonucléico
Fas Fibroblast associated
Flt-1 (VEGFR-1) Receptor tirosina quinase
GB Granzima B
HPV Papilomavírus humano
IHQ Reação imuno-histoquímica
INCA Instituto Nacional do Câncer
KDR (VEGFR-2) Receptor tirosina quinase
LCR Large control region
NIC I Neoplasia intra-epitelial cervical de grau I
NIC II Neoplasia intra-epitelial cervical de grau II
NIC III Neoplasia intra-epitelial cervical de grau III
NIC Neoplasia intra-epitelial cervical
NK Célula natural killer
NS Não significante
NUPREV Núcleo de prevenção de doenças ginecológicas
OGF,[MET(5)] Crescimento opióide endógeno
PBS Solução salina tamponada com fosfato
PCR Reação em cadeia de polimerase
STB Sistema de Bethesda
Th1 Linfócito T auxiliar 1
Th2 Linfócito T auxiliar 2
VAMPD Valor absoluto da diferença entre as médias dos postos
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
VPF Fator de permeabilidade vascular
xiii
Resumo
Introdução: A família granzima caracteriza um grupo especial de
serino-proteases que permanecem armazenadas, completamente processadas e na
forma ativada, em grânulos citoplasmáticos dos linfócitos T citolíticos (CTL).
Angiogênese é o processo pelo qual novos vasos sanguíneos são formados. Está
associada ao desenvolvimento da neoplasia intra-epitelial de alto grau e do
carcinoma invasor do colo uterino. Objetivos: O objetivo deste estudo foi avaliar a
imuno-expressão da granzima B e do fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF) com as variantes da neoplasia intra-epitelial escamosa cervical.
Métodos: A expressão imuno-histoquímica da granzima B foi estudada no
epitélio, estroma e ainda no epitélio - estroma de 142 fragmentos de colo uterino
sendo, 34 de neoplasia intra-epitelial cervical de grau I (NIC I), 36 de neoplasia
intra-epitelial cervical de grau II (NIC II), 33 de neoplasia intra-epitelial cervical de
grau III (NIC III) e 39 fragmentos de colo uterino sem atipias – grupo controle. Foi
estudada a imuno-expressão para o fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF) em 160 fragmentos de colo uterino sendo, 43 de neoplasia intra-epitelial
cervical de grau I (NIC I), 33 de neoplasia intra-epitelial cervical de grau II (NIC II),
31 de neoplasia intra-epitelial cervical de grau III (NIC III) e 53 fragmentos de colo
uterino sem atipias – grupo controle. Resultados: No estroma, a
imuno-expressão para a granzima B na neoplasia intra-epitelial cervical de grau I
mostrou-se menor do que na neoplasia intra-epitelial cervical de grau III.
Encontrou-se alta imuno-expressão para o fator de crescimento endotelial
vascular na neoplasia intra-epitelial cervical de grau III e baixa imuno-expressão
na neoplasia intra-epitelial de grau I e no grupo controle. Conclusão: Quanto
maior a gravidade da lesão intra-epitelial cervical maior imuno-expressão para a
granzima B. Encontrou-se aumento progressivo da imuno-expressão para o fator
de crescimento endotelial vascular no grau intenso, de acordo com a severidade
Introdução 2
O câncer do colo do útero é a segunda neoplasia mais comum em
mulheres, em todo o mundo, correspondendo anualmente a 15% de todos os
casos de tumores femininos. No Brasil, o câncer do colo do útero é o terceiro
mais comum na população feminina, sendo superado pelos cânceres de pele e
de mama. Responde como quarta causa de morte por câncer em mulheres.
É doença que pode ser prevenida, estando diretamente vinculada ao grau de
subdesenvolvimento do país.
De acordo com os dados absolutos do Instituto Nacional do Câncer
(INCA) sobre a incidência e mortalidade por câncer, o tumor de colo uterino foi
responsável pela morte de 3.953 mulheres no Brasil no ano de 2000. Para 2007
as estimativas de incidência para este câncer são de 19.260 novos casos.
Vários são os fatores de risco identificados para o câncer do colo
uterino tais como sociais, ambientais e hábitos de vida: baixas condições
socioeconômicas, início precoce da atividade sexual, múltiplos parceiros
sexuais, tabagismo, poucos hábitos de higiene e uso prolongado de
contraceptivos hormonais (Karlsson et al., 1995; Muñoz et al., 1996; Chaouki et
al., 1998; Svare et al., 1998; Burk, 1999; Noriyuki et al., 2007).
Esforços são empregados com sucesso, para diminuir a incidência
de câncer de colo uterino por meio de exames preventivos, o exame
citopatológico e a colposcopia tornando o diagnóstico mais preciso em
pacientes com atipias celulares cervicais (Andersen et al., 1995).
Segundo Meisels, Fortin (1976) o papilomavírus humano (HPV) foi
indicado pela primeira vez como tendo relação com o câncer de colo de útero
nos anos 70 do século XX. Nas últimas décadas, múltiplos ensaios sugerem ter
o HPV, papel central na etiopatogenia dessa neoplasia e de suas lesões
precursoras (Ferenczy, 1995; Liaw et al., 1999).
O Ministério da Saúde do Brasil estima estar, de forma pontual, 25% da
população brasileira sexualmente ativa contaminada pelo papilomavírus humano,
Introdução 3
Esse fato leva ao conceito de que a presença exclusiva do vírus não
basta para o desenvolvimento do processo neoplásico. Fatores epidemiológicos,
ambientais e gênicos parecem ser de grande valor no processo da
transformação neoplásica, sugerindo ser o HPV considerado iniciador da
carcinogênese cervical, pois é componente necessário, ainda que não
suficiente para o desenvolvimento do carcinoma (Kaufman et al., 2000).
O papilomavírus humano está presente na maioria absoluta dos casos
de câncer cervical e o estudo que mais concretamente estabelece esta relação é o
de Walboomers et al., 1999. Ao analisar, mais de 900 amostras de câncer, oriundas
de 32 hospitais de 22 países da Europa, Ásia, Américas (Norte, Central e Sul) e
África, os autores detectaram a presença do HPV em 99,7% dos casos, por meio
da reação em cadeia da polimerase (PCR), associada a testes sorológicos.
O HPV, juntamente com o Polyomavírus e o SV40, pertence à família
Papovaviridae. Seu genoma é constituído por dupla alça de ácido
desoxirribonucléico (DNA) circular. O diâmetro do seu capsídeo é de 55 nm, seu
DNA possui 7.900 pares de bases e seu peso molecular é de 5,2.10 daltons
(Bernard et al., 1994; Kaufman et al., 2000).
O genoma contém nove janelas de leitura onde estão posicionadas
sete genes de leitura precoce (early – E1, E2, E3, E4, E5, E6, e E7) e dois de
leitura tardia (late L1 e L2). Há também uma região não codificadora (large control
region – LCR) que controla os demais genes (Turek, 1994). São considerados
mais importantes e relacionados à oncogênese os componentes E6 e E7
(Galloway, MCDougall, 1996).
Mais de 100 tipos de papilomavírus humano foram descritos, sendo
que aproximadamente 30 tipos infectam a mucosa anogenital de ambos os
sexos (Forslund et al., 1999).
Os papilomavírus humanos podem ser classificados, de acordo com
a sua capacidade de indução neoplásica, em vírus de baixo, intermediário e
alto risco oncogênico. O maior ou o menor potencial oncogênico viral parecem
estar, fundamentalmente, relacionados à sua capacidade de integrarem-se ao
Introdução 4
A presença dos tipos de HPV de alto risco oncogênico, confere
significante risco de desenvolvimento de lesão intra-epitelial escamosa cervical
e câncer cervical (Moscicki et al., 1998; Liaw et al., 1999; von Knebel, 2002;
Tang et al., 2007 ).
Avanços das técnicas de biologia molecular, nas últimas décadas,
aumentaram a compreensão da relação entre o papilomavírus humano e a
neoplasia cervical uterina (Bigio et al., 2002).
Técnicas de mensuração viral permitem confirmar determinados
tipos de HPV como causa central no desenvolvimento do câncer cervical e de
seus precursores. Progressos na mesma área promovem avanços no processo
de detecção e tipagem do HPV, bem como na investigação e diagnóstico de
lesões relacionadas aos vírus.
Várias técnicas estão disponíveis para demonstrar a presença do
DNA dos papilomavírus humanos. Na prática, três são as técnicas
biomoleculares utilizadas na detecção de DNA viral: Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR), Captura de Híbridos (CH) e Hibridização in situ. O teste de
hibridização por Southern Blot é considerado padrão ouro para essa detecção
porém, a mais sensível técnica de detecção de HPV é, sem dúvida, a reação
em cadeia da polimerase (PCR) (Peyton et al., 1998).
A transmissão das infecções genitais por HPV depende do acesso do
vírus à camada basal de células indiferenciadas, favorecido por microtraumas do
epitélio, conseqüentes ao ato sexual ou não. Estando a infecção viral estabelecida,
o genoma viral pode persistir, em forma latente, nas células das camadas basal e
parabasal sem mudanças visíveis, ou ainda, estabelecer infecção ativa das células
parabasais. Neste caso, o HPV estimula a proliferação celular desencadeando a
formação de lesão epitelial detectável.
A infecção persistente pelo HPV oncogênico é essencial para a
progressão da lesão de menor gravidade para neoplasia intra-epitelial de alto
grau e, a seguir, para lesão invasora (Hildesheim et al.,1994). Assim, a infecção
por longos períodos de tempo permite o desenvolvimento de alterações
Introdução 5
De acordo com von Knebel (2002), mulheres infectadas por HPV de
alto risco oncogênico apresentam risco 100 vezes maior para desenvolver lesão
intra-epitelial de alto grau, quando comparadas a mulheres não infectadas. .
Descritas pela primeira vez no início do século XX, as lesões
intra-epiteliais são conhecidas por variada nomenclatura. O termo displasia foi aplicado
a lesões do epitélio pavimentoso estratificado, que apresentassem anomalias de
maturação e diferenciação menos intensas do que daquelas apresentadas pelo
carcinoma in situ. Em decorrência da variação do comprometimento do epitélio
escamoso por células atípicas, as lesões epiteliais foram classificadas em diferentes
graus: displasia leve, moderada e acentuada, além do carcinoma in situ.
O conceito de neoplasia intra-epitelial cervical foi introduzido por
Richart em 1967, para classificar as diferentes etapas do processo displásico,
enfatizando o potencial evolutivo dessas alterações na carcinogênese cervical.
Por deduzir que haveria um único clone de células, a partir do qual
originar-se-ia o câncer cervical, as alterações epiteloriginar-se-iais foram reunidas, sob a
denominação de neoplasia intra-epitelial cervical (NIC).
As neoplasias intra-epiteliais cervicais representam grupo de
modificações epiteliais, algumas com potencial maligno. Os critérios
histológicos essenciais são: atipia nuclear, capacidade de diferenciação
celular, atividade mitótica e caracterizam-se por alterações de maturação e
anomalias nucleares, nos diferentes níveis do epitélio. São divididas em três
graus crescentes de gravidade e extensão. A neoplasia intra-epitelial cervical
de grau I corresponde à displasia leve; a neoplasia intra-epitelial de grau II, à
displasia moderada; e a neoplasia intra-epitelial de grau III, corresponde tanto
à displasia acentuada quanto ao carcinoma in situ (Anderson, 1987).
Visando a compreensão clínica das alterações cito-epiteliais e seu
prognóstico, surge em 1988 o Sistema de Bethesda (STB), uniformizando
referências em laudos citopatológicos como lesões de baixo e de alto grau, dentre
outras. Usando técnicas de biologia molecular e comparando os tipos de HPV, o
Sistema de Bethesda conclui serem o condiloma plano e a NIC I, correspondentes
clínicos, biológicos e moleculares, denominados de lesões de baixo grau. Do
Introdução 6
Richart, Wright (1993) agrupam as lesões histopatológicas
intra-epiteliais cervicais à semelhança do Sistema Bethesda (STB), em neoplasia
intra-epitelial de baixo grau, correspondendo ao condiloma plano e NIC I.
Neoplasia intra-epitelial de alto grau corresponde às NIC II e NIC III. Essa
classificação visa principalmente, facilitar a conduta terapêutica.
Disaia, Creasman (1997) mostraram que o tempo de transição do
epitélio normal para a neoplasia intra-epitelial de baixo ou alto grau seria de
aproximadamente 1,62 anos.
A lesão intra-epitelial diagnosticada tem evolução incerta: regride,
persiste ou progride. Existe, no entanto, pouca uniformidade no que se refere
às porcentagens de regressão ou de progressão das lesões. O comportamento
da lesão parece estar relacionado ao grau de comprometimento do epitélio:
quanto mais próximo do aspecto normal, maior a probabilidade de regressão.
Por outro lado, quanto maior o comprometimento do epitélio, maior a
possibilidade de progressão.
Estudo prospectivo realizado na Universidade de Kuopia, Finlândia,
demonstrou altas taxas de regressão das neoplasias intra-epiteliais cervicais
conforme o tempo de seguimento. As que progrediam, o faziam de forma
rápida, quase que invariavelmente durante os dois primeiros anos após o
diagnóstico. As taxas de progressão permaneciam praticamente inalteradas,
ao redor de 14% dos casos, após 25 meses de seguimento (Syrjanen, 1997).
Em exaustiva revisão de literatura sobre a história natural das
neoplasias intra-epiteliais cervicais estudadas durante 40 anos, Ostor, em
1993, mencionou incidência média global de progressão de NIC I para
carcinoma in situ em 11% dos casos e da NIC II, em 22%. A progressão para a
doença invasiva ocorreu em 1% das neoplasias intra-epiteliais cervicais grau I,
em 5% das neoplasias intra-epiteliais cervicais grau II e em mais de 12% dos
casos de neoplasias intra-epiteliais cervicais de grau III.
A resposta imunológica do hospedeiro, particularmente a resposta
celular, desempenha importante papel na eliminação de infecções pelo HPV, como
indicado por evidências clínicas e laboratoriais. Há possibilidade de persistência e
Introdução 7
Os linfócitos T citotóxicos (CTL) e as células natural killer (NK) são
as principais células efetoras no processo de erradicação das células
infectadas por vírus e das células tumorais, além de contribuir na rejeição aos
transplantes e nas doenças auto-imunes (Blink et al., 1999).
Os linfócitos T citotóxicos (CTL) e as células natural killer (NK)
utilizam dois mecanismos contato-dependentes para efetuar a morte celular:
ligação enzimática e exocitose granular.
A ligação enzimática resulta na ligação do Fas (fibroblast associated)
ligante na célula efetora com a molécula Fas, na célula alvo receptora; assim
estimula reações em cascata na célula alvo que levam à sua morte. A
exocitose granular, predominantemente usada pelas células natural killer,
envolve a liberação controlada de grânulos, com conteúdo citolítico na
superfície das células alvo induzindo à citotoxicidade (Blink et al., 1999).
Podack, Dennert (1983) demonstraram a existência de grânulos
densos citoplasmáticos nos linfócitos T e nas células natural killer que, por
algum mecanismo, até então desconhecido, causava lise em hemácias e em
outras células de linhagem hematopoiética. Posteriormente Jenne e Tschopp
(1988) isolaram seis proteínas armazenadas em grânulos intra-citoplasmáticos
pelo método Percoll. A proteína de maior peso molecular foi denominada
perforin (pore forming protein). As demais foram conjuntamente denominadas
granzymes (granule associated enzymes).
A família granzima designa um grupo especial de serino-proteases
que permanecem armazenadas, completamente processadas e na forma
ativada, em grânulos citoplasmáticos dos linfócitos T citolíticos e células
natural killer. Foram identificados oito tipos de granzimas: A, B, C, D, E, F, G e H, as
quais compartilham características estruturais. A granzima B é a granzima mais
abundante no linfócito T, está relacionada à indução da citotoxicidade e aos eventos
proteolíticos no processo de reconhecimento de células-alvo (Heusel et al., 1994;
Blink et al., 1999; Shafer-Weaver et al., 2006).
A ativação dos receptores de linfócitos T determina a liberação da granzima
Introdução 8
Em presença de cátions, os grânulos são vetorialmente secretados no espaço
intercelular, formado pelo contato entre o efetor e as células alvo, num processo de
conjugação. A perforin induz a formação de poros na membrana celular, por lise
focal da membrana citoplasmática das células-alvo, dando passagem à granzima
para o interior das células alvo. Portanto, a perforin e a granzima B disparam, de
forma sinérgica, o sinal para que haja destruição da célula alvo (Blink et al., 1999;
Dong et al., 2005; Caldas et al., 2006; Loeb et al., 2006).
A ação sinérgica entre a perforin e a granzima B, que culmina em
morte celular, poderia ser o mecanismo a impedir a progressão de uma lesão
pré-maligna para a invasão, por meio do reconhecimento imunocelular.
Bontkes et al. (1997) foram os primeiros a pesquisar a granzima B
no colo uterino e a verificar maior expressão nos casos de lesão invasiva do
que nas lesões pré-malignas.
Kondo (2003) concluiu que a positividade de linfócitos ativados em
fragmentos de tecido do colo uterino obedece a valores crescentes a partir de
tecido sem atipia, em direção à neoplasia intra-epitelial de alto grau e o
carcinoma espinocelular invasivo. Verifica ainda diferença nos índices de
granzima B entre os casos de neoplasia intra-epitelial de alto grau, com menor
imuno-expressão nos casos recidivantes do que naqueles não recidivados.
Desde a primeira descrição por Hans Hinselmann, em 1940, o
padrão de alteração vascular no colo uterino tem sido usado para a localização
de lesões intra-epiteliais de baixo e alto grau à colposcopia.
Angiogênese é a neovascularização ou formação de novos vasos
sanguíneos a partir de microvasculatura pré-existente. É essencial no
desenvolvimento, reprodução e cicatrização dos tecidos. Sabe-se que a
angiogênese ocorre no desenvolvimento embrionário, nos processos
fisiológicos, em situações inflamatórias e também em condições neoplásicas
(Folkman, Shing, 1992).
Tumores sólidos necessitam de angiogênese para progressão e
metastização, transportando células neoplásicas para a circulação geral (Liotta et al.,
Introdução 9
ativam a neovascularização dos tumores (Folkman, Shing, 1992). Angiogênese
também ocorre nas condições pré-malignas da mama, cólon e cérvice uterina
antes da franca invasão (Sillman et al., 1981; Guidi et al., 1995).
A densidade dos microvasos aumenta progressivamente com o grau da
neoplasia intra-epitelial cervical (Smith-McCune, Weidner, 1994; Guidi et al., 1995).
Desta forma, Stafl, Mattingly (1975) sugerem que a neovascularização seria
observada em todos os estágios de neoplasia intra-epitelial cervical, ocorrendo
pequeno aumento de densidade vascular já detectado na neoplasia
intra-epitelial cervical de grau I (NIC I).
Um dos mais potentes e específicos fatores angiogênicos é o fator
de crescimento endotelial vascular (VEGF) (Abufalia et al., 1999, Clere et al.,
2007). Esse fator foi originalmente detectado em células foliculares do
conduto médio da glândula pituitária dos bovinos. O fator de permeabilidade
vascular (VPF), identificado em tumores ascíticos, foi considerado idêntico ao
VEGF (Senger et al., 1983; Ferrara, Henzel, 1989; Kodama et al., 1998).
O fator de crescimento endotelial vascular é uma glicoproteína dimérica
e estimula a angiogênese pelo aumento da permeabilidade vascular. É
considerado um importante regulador de tumores angiogênicos.
O VEGF age na célula mitogênica endotelial, aumenta a
permeabilidade dos microvasos resultando no extravasamento das proteínas
plasmáticas adjacente ao estroma. Extravasa coágulos de fibrinogênio no
espaço intra-vascular para formar matriz provisória rica em fibrina dentro da
qual células inflamatórias, fibroblastos e células endoteliais migram resultando
em alta vascularização do tecido conjuntivo similar ao tecido de granulação
(Senger et al., 1983; Guidi et al., 1995; Lebrecht et al., 2002).
Detectado em várias linhagens celulares e tecidos tumorais, o fator
de crescimento endotelial vascular é considerado fator seletivo de crescimento
de células endoteliais (Ferrara et al., 1992). Pode ser expresso em quatro
isoformas codificadas pelo mesmo gene. Os efeitos biológicos do VEGF são
mediados por dois receptores tirosina quinase, Flt-1 (VEGFR-1) e KDR
Introdução 10
O controle da secreção e expressão dos receptores está ligada à
hipóxia tecidual promovendo vasodilatação, aumento da permeabilidade
vascular, proliferação das células endoteliais e ativação das metaloproteínases
que lisam a matriz extracelular, deixando espaço para o crescimento de um
novo vaso.
Consoante Abufalia et al. (1999) a expressão do VEGF estaria
elevada na neoplasia intra-epitelial cervical relacionada à angiogênese. A
expressão do fator de crescimento endotelial vascular seria maior na lesão
epitelial cervical de alto grau comparada à observada na lesão
intra-epitelial cervical de baixo grau e ao epitélio escamoso benigno (Guidi et al.,
1995; Kodama et al., 1999; Branca et al., 2006).
De igual maneira, estudos imuno-histoquímicos demonstraram
progressão da neoplasia intra-epitelial cervical associada ao aumento da
densidade dos microvasos e da expressão do fator de crescimento endotelial
vascular (Dobbs et al., 1997; Obermair et al., 1997; Baritaki et al., 2007).
No carcinoma espinocelular cervical invasor o fator de crescimento
endotelial vascular implica na promoção da angiogênese e na sua rápida
invasão (Kodama et al., 1999; López-Ocejo et al., 2000; Shi et al., 2007).
Concentrações séricas elevadas do fator de crescimento endotelial
vascular estariam relacionadas com pior prognóstico do câncer, como os
relatos para carcinoma ovariano e câncer de pequenas células do pulmão
(Salven et al., 1997; Tempfer et al., 1998; Noriyuki et al., 2007).
Frente à paucidade de estudos específicos sobre possível relação
entre granzima B e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) nas
lesões intra-epiteliais escamosas cervicais de grau I, II e III, indaga-se qual
seria a imuno-expressão desses marcadores em pacientes com neoplasia
intra-epitelial cervical de grau I, II e III. Busca-se a confirmação da hipótese de
que a granzima B e o fator de crescimento endotelial vascular possam ser
utilizados como marcadores prognósticos das lesões intra-epiteliais cervicais
Proposição 12
Propõe-se no estudo avaliar:
1. a imuno-expressão da granzima B em fragmentos de tecido de
colo uterino normal e com neoplasia intra-epitelial escamosa de
grau I, II e III.
2. a imuno-expressão do fator de crescimento vascular endotelial
em fragmentos de tecido de colo uterino normal e com neoplasia
Pacientes e Métodos 14
3.1 Pacientes
Foram selecionadas 196 mulheres, atendidas no ambulatório de
Patologia do Trato Genital Inferior da Disciplina de Ginecologia Geral do
Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo - Escola
Paulista de Medicina/UNIFESP-EPM, no período de 2002-2005.
Todas as pacientes foram previamente esclarecidas quanto aos
objetivos do estudo, assinaram termo de consentimento informado e o projeto
foi apresentado e aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa da UNIFESP
– Hospital São Paulo sob o número CEP 0356 / 05 (Anexos 1 e 2).
Como critérios de inclusão observou-se estarem as pacientes no
menacme e serem portadoras de neoplasias intra-epiteliais cervicais de grau I,
II ou III, definidas por exame histopatológico. Todos os cortes histológicos
foram analisados por dois patologistas independentes.
Para o grupo controle utilizou-se fragmentos de tecido do colo
uterino com ausência de neoplasia intra-epitelial cervical definida por exame
histopatológico.
Não foram incluídas pacientes gestantes e ou lactantes, as com
história prévia de tratamento de neoplasia intra-epitelial vaginal ou cervical de
qualquer grau, as com antecedentes de cirurgias ou de cauterizações no colo
do útero e pacientes portadoras de imunossupressão adquirida, infecciosa e
ou iatrogênica.
Consoante o diagnóstico histopatológico o grupo estudo ficou assim
composto NIC I – 54 pacientes, NIC II – 40 pacientes, NIC III - 38 pacientes
totalizando 132 pacientes.
O grupo controle foi composto por 64 mulheres com ausência de
neoplasia intra-epitelial cervical.
Em decorrência aos acidentes de percurso ocorridos nos fragmentos
à histopatologia e imuno-histoquímica, o grupo estudo foi dividido para
Pacientes e Métodos 15
Do total do grupo estudo, 103 casos foram submetidos à avaliação da
imuno-expressão da granzima B. O grupo controle contribuiu com 39 casos.
Já para o estudo da imuno-expressão do fator de crescimento
endotelial vascular (VEGF) foram utilizados 107 casos do grupo de
neoplasias intra-epiteliais de grau I, II e III e 53 do grupo controle.
Dos 196 casos selecionados, estudou-se de forma simultânea, a
imuno-expressão da granzima B e do fator de crescimento endotelial vascular
em 106 pacientes sendo 23 portadoras de neoplasia intra-epitelial cervical de
grau I, 29 de neoplasia epitelial cervical de grau II e 26 de neoplasia
intra-epitelial cervical de grau III. O grupo controle foi composto por 28 casos com
Pacientes e Métodos 16
Quadro 1 - Distribuição de 196 casos segundo diagnóstico histopatológico e
avaliação da imuno-expressão da granzima B e do fator de crescimento
endotelial vascular (VEGF).
Granzima B Número de casos
Na 39
NIC I 34
NIC II 36
NIC III 33
Total 142
VEGF Número de casos
Na 53
NIC I 43
NIC II 33
NIC III 31
Total 160
Granzima B e VEGF Número de casos
Na 28
NIC I 23
NIC II 29
NIC III 26
Total 106
Legenda:
Pacientes e Métodos 17
3.2 Métodos
O estudo prospectivo transversal comportou a utilização dos
seguintes métodos:
Método Clínico
As pacientes submeteram-se à consulta clínica, na qual estava
incluída a anamnese geral e específica para doenças do colo uterino, segundo
protocolo utilizado no setor de Patologia do Trato Genital Inferior da Disciplina
de Ginecologia Geral do Departamento de Ginecologia da UNIFESP-EPM.
Após exame físico geral, ginecológico e especular foi realizada
coleta de esfregaço cérvico-vaginal para exame citopatológico e, a seguir,
colposcopia e biópsia dirigida das áreas anormais.
Todos os dados clínicos e laboratoriais foram registrados em
formulário específico (Anexo 3).
A faixa etária das mulheres variou de 13 a 53 anos com média de
29,38 anos para o grupo neoplasia intra-epitelial cervical de grau I, 33,25 anos
para o grupo de neoplasia intra epitelial de grau II, 34,24 anos para o grupo de
neoplasia intra-epitelial de grau III e 28,9 anos para o grupo controle (Quadro 2).
Método citológico
Os esfregaços cérvico-vaginais foram colhidos utilizando-se espátula
de Ayre e escova endocervical com coleta tríplice em lâmina única, fixação em
álcool absoluto e encaminhados ao Laboratório de Citopatologia do Núcleo de
Prevenção de Doenças Ginecológicas (NUPREV) da Disciplina de Ginecologia
Geral do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo -
Escola Paulista de Medicina/ UNIFESP- EPM onde foram submetidas à técnica
de coloração modificada de Papanicolaou e submetidas a leitura citológica.
Todos os esfregaços foram analisados por dois observadores independentes
Pacientes e Métodos 18
Método colposcópico
Todas as pacientes foram submetidas à investigação colposcópica
do colo uterino e de paredes vaginais, seguindo técnica de exame preconizada
pela Associação Brasileira de Genitoscopia, explicitada no Manual de Normas
e Rotinas em Patologia do Trato Genital Inferior e Colposcopia (1998).
Os achados colposcópicos foram classificados segundo a
Terminologia Internacional de Aspectos Colposcópicos, estabelecida em
Barcelona, 2002.
Todo e qualquer achado colposcópico anormal foi submetido à
biópsia dirigida utilizando-se pinça de Gaylor-Medina. Os fragmentos foram
fixados em solução de formol tamponado a 10% e encaminhados ao
Departamento de Patologia para exame histopatológico.
Método Histopatológico
Os fragmentos de colo uterino obtidos por biópsias dirigidas na zona
de transformação anormal e na zona de transformação normal para o grupo
controle, foram fixados em solução de formol tamponado a 10% e, então,
desidratados em concentrações crescentes de álcool etílico, diafanizados pelo
xilol e incluídos em parafina por processador automático de tecido, conforme
rotina estabelecida no Departamento de Patologia da UNIFESP-EPM.
O grupo controle foi composto por pacientes atendidas no
ambulatório de Patologia do Trato Genital Inferior da Disciplina de Ginecologia
Geral do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo
- Escola Paulista de Medicina/UNIFESP-EPM que apresentavam colpocitologia
oncótica normal e fragmentos de tecido de colo uterino biopsiados à
colposcopia com ausência de neoplasia intra-epitelial escamosa cervical.
Os blocos de parafina foram encaminhados para corte com
micrótomo tipo Minot, marca American Optical, modelo 820. Os cortes obtidos
com 4 µm de espessura foram montados em lâminas de vidro e corados pela
hematoxilina-eosina, de acordo com a técnica de Michalany (1981).
Pacientes e Métodos 19
seguir observados ao microscópio óptico comum, por dois patologistas
independentes do Departamento de Patologia.
As alterações encontradas foram classificadas e laudadas de acordo
com o preconizado por Richart (1967) em neoplasia intra-epitelial cervical de
Pacientes e Métodos 20
Quadro 2 – Distribuição dos 196 pacientes segundo número de ordem, idade e diagnóstico histopatológico.
CONTROLE NIC I NIC II NIC III
Paciente nº Idade (anos) Paciente nº Idade (anos) Paciente nº Idade (anos) Paciente nº Idade (anos)
1 28 1 50 1 49 1 46
2 19 2 33 2 31 2 47
3 16 3 16 3 37 3 38
4 21 4 14 4 29 4 21
5 36 5 40 5 42 5 28
6 20 6 45 6 47 6 24
7 36 7 18 7 23 7 36
8 30 8 20 8 28 8 24
9 23 9 21 9 28 9 38
10 30 10 21 10 28 10 39
11 50 11 22 11 36 11 28
12 43 12 40 12 17 12 31
13 46 13 20 13 37 13 37
14 18 14 22 14 49 14 24
15 25 15 36 15 28 15 29
16 25 16 16 16 29 16 29
17 30 17 36 17 43 17 31
18 31 18 41 18 31 18 33
19 22 19 24 19 30 19 25
20 44 20 39 20 23 20 50
21 26 21 18 21 36 21 31
22 28 22 21 22 31 22 35
23 21 23 24 23 35 23 37
24 30 24 26 24 30 24 34
25 25 25 52 25 37 25 35
26 27 26 32 26 37 26 26
27 50 27 26 27 30 27 30
28 24 28 33 28 39 28 46
29 25 29 18 29 27 29 31
30 44 30 31 30 43 30 48
31 30 31 37 31 29 31 35
32 27 32 20 32 23 32 37
33 44 33 23 33 27 33 27
34 22 34 26 34 44 34 48
35 39 35 21 35 28 35 45
36 24 36 21 36 35 36 28
37 36 37 28 37 41 37 35
38 30 38 30 38 42 38 35
39 32 39 16 39 29
40 53 40 49 40 22
41 24 41 40
42 24 42 32
43 23 43 43
44 19 44 17
45 30 45 28
46 26 46 21
47 26 47 20
48 20 48 20
49 22 49 37
50 23 50 34
51 27 51 46
52 32 52 30
53 28 53 44
54 36 54 49
55 30
56 44
57 13
58 24
59 17
60 28
61 33
62 27
63 16
64 25
Média (anos) 28,9 29,38 33,25 34,24
Legenda:
Pacientes e Métodos 21
Método Imuno-histoquímico
As reações imuno-histoquímicas foram efetuadas no Laboratório de
Imuno-histoquímica do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo - USP.
A reação imuno-histoquímica (IHQ) utilizada para a pesquisa dos
antígenos do estudo, em fragmentos do colo uterino, foi realizada pelo método
biotina-estreptavidina peroxidase.
Iniciou-se por preparação dos cortes histológicos de 3 µm de
espessura, a partir de material blocado em parafina, em lâminas previamente
tratadas com APTS (3-Aminopropil-trietoxi-silano-Sigma) e deixados por 24
horas em estufa a 60°C para melhor adesão do tecido à lâmina.
As lâminas foram desparafinizadas com xilol aquecido por 30
minutos e posteriormente resfriadas à temperatura ambiente por 15 minutos.
Foram hidratadas em álcool etílico em concentrações decrescentes de 100, 95,
80 e 70% respectivamente, por 30 segundos cada e lavadas em água corrente.
A recuperação antigênica foi realizada com calor irradiado em forno
de microondas na potência de 700 watts, imergindo as lâminas em tampão de
citrato de sódio 10mM pH 6,0 por 30 minutos, resfriando-as à temperatura
ambiente por 30 minutos.
Em seguida realizou-se bloqueio da peroxidase endógena com três
banhos em peróxido de hidrogênio a 6% diluído a 20 volumes por cinco
minutos. Posteriormente, procedeu-se a nova lavagem em água corrente e
imersão em solução salina tamponada com fosfatos (PBS 10mM pH 7,4).
Após o bloqueio de peroxidase endógena, o anticorpo primário
(Granzyme B, Dakocytomation, Denmark, Cód.: M7235 título 1:20), foi diluído
em BSA e aplicado sobre os cortes e controles, positivo e negativo de tecido, e
as lâminas incubadas durante o período noturno.
Da mesma maneira, após os bloqueios o anticorpo (VEGF A-20, Sta.
Cruz Biotecnology, Inc., Europe, Cód.: sc 152, título 1:800), foi diluído em BSA
e aplicado sobre outros cortes, estudos e controles, positivo e negativo de
Pacientes e Métodos 22
Todas as lâminas foram lavadas em PBS e incubadas pelo ABCKit
Vectastain (Vector Elite PK-6102, Burlingame, CA), e em seguida foram lavadas
em PBS. Seguiu-se a revelação pelo cromógeno 3,3 Diaminobenzidine (DAB -
Sigma Chemical Co, St Louis, MO, EUA). Foram lavadas abundantemente em
água corrente e contra-coradas com Hematoxilina de Harris (Merck, Darmstadt,
Alemanha) e novamente lavadas em água corrente, desidratadas, diafanizadas e
montadas com resina para microscopia Entellan (Merck, Darmstadt, Alemanha).
3.2.1 Avaliação da imuno-expressão da granzima B
A imuno-expressão da granzima B foi analisada no Departamento
de Patologia da UNIFESP- EPM.
Para leitura utilizou-se microscópio óptico com aumento de 400
vezes da marca Olympus modelo BX 51. As imagens foram capturadas por
sistema computadorizado, que consiste em videocâmera colorida (Samsung
modelo SCS 131), computador Pentium 64 MB de memória RAM e
graficamente analisadas por programa Imagelab 2.3.
Foram analisados 34 fragmentos de colo uterino com neoplasia
intra-epitelial cervical grau I, 36 com neoplasia intra-intra-epitelial cervical grau II, 33 com
neoplasia intra-epitelial grau III e 39 com ausência de neoplasia – grupo controle,
correspondendo à 142 pacientes.
Analisou-se, em cada lâmina, três campos microscópicos
consecutivos de epitélio e três campos consecutivos do estroma adjacente,
padronizados nas áreas de maior concentração de células que apresentavam
positividade para o anticorpo granzima B.
A imuno-expressão da granzima B foi considerada positiva nas células
cuja coloração nuclear apresentou-se acastanhada e, negativa, na sua ausência
ou naquelas fracamente coradas.
A contagem foi realizada manualmente nos campos selecionados e
Pacientes e Métodos 23
Foram consideradas positivas para a granzima B o total de 1226
células distribuídas no epitélio e estroma, dos grupos NIC I, NIC II, NIC III e
controle.
Na neoplasia intra-epitelial de grau I, foram consideradas positivas para
a granzima B 147 células locadas no epitélio e 95 no estroma. Nos casos de
neoplasia intra-epitelial de grau II, foram observadas 117 células coradas no
epitélio e 176 no estroma e na neoplasia intra-epitelial de grau III, 145 células
positivas para a granzima B no epitélio e 209 positivas no estroma No grupo
controle, foram consideradas positivas 156 células no epitélio e 181 no estroma
(Anexos 4 a,b,c,d).
3.2.2 Avaliação da imuno-expressão do fator de crescimento
endotelial vascular
A imuno-expressão do fator de crescimento vascular endotelial foi
analisada no Departamento de Patologia da UNIFESP- EPM.
Para leitura utilizou-se microscópio óptico com aumento de 200
vezes da marca OLYMPUS modelo BX 51 e dois observadores. Para avaliação
da imuno-expressão do fator de crescimento endotelial vascular observou-se a
intensidade de coloração do epitélio nos diferentes grupos estudados. O
anticorpo anti-VEGF cora o citoplasma e as membranas das células epiteliais.
Foram analisados 43 fragmentos de colo uterino com neoplasia
intra-epitelial cervical grau I, 33 com neoplasia intra-intra-epitelial cervical grau II, 31 com
neoplasia intra-epitelial grau III e 53 com ausência de neoplasia – grupo controle,
correspondendo à 160 pacientes.
A imuno-expressão para o fator de crescimento endotelial foi dividida
em três grupos de acordo com a intensidade da coloração observada no
citoplasma e membranas citoplasmáticas das células epiteliais: ausente ou
Pacientes e Métodos 24
3.3 Método estatístico
Para avaliar possíveis diferenças para a variável granzima B entre os
grupos NIC I, NIC II, NIC III e grupo controle tanto no epitélio quanto no estroma
e epitélio - estroma foi utilizado o teste não paramétrico para “k” amostras
independentes de Kruskal-Wallis complementado, quando necessário, pelo teste
de comparações múltiplas (Siegel, 1975).
Para o cálculo das possíveis diferenças entre as porcentagens do
fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), segundo o grau de
intensidade de coloração previamente definido, entre os grupos NIC I, NIC II,
NIC III e Controle foi utilizado o teste do Qui-Quadrado (x2) para as tabelas de contingência, obedecendo-se as restrições de Cochran (Siegel, 1975).
Em todos os casos o nível de rejeição para a hipótese de nulidade
foi fixado sempre em valor menor ou igual a 0,05 (0,5%).
Quando a estatística calculada apresentou significância foi
caracterizada com um asterisco (*), caso contrário, isto é, não significante,
utilizou-se “NS”.
Usando-se o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis pressupõe-se
que a contagem de células não é uma variável que se distribui segundo a
curva de Gauss, portanto, não foi calculado o desvio padrão e, por esse
mesmo motivo, não foi utilizado o teste ANOVA (Horlander, 1973).
Resultados 26
A imuno-expressão da granzima B, foi estudada no epitélio, no estroma
e no conjunto epitélio - estroma de 142 fragmentos de colo uterino sendo 34 de
neoplasia intra-epitelial cervical de grau I, 36 de neoplasia intra-epitelial cervical
de grau II, 33 de neoplasia intra-epitelial cervical de grau III, e 39 com ausência de
neoplasia intra-epitelial cervical, ou seja, fragmentos de colo uterino sem atipias –
grupo controle.
A análise das lâminas submetidas à reação imuno-histoquímica,
para a granzima B, mostrou positividade de linfócitos ativados no epitélio e
estroma em 29 casos do total de 39 analisados no grupo controle. Na
neoplasia intra-epitelial de grau I observou-se positividade de linfócitos em 28
de 34 casos, na neoplasia intra-epitelial de grau II em 34 casos do total de 36 e
na neoplasia intra-epitelial de grau III não foi observada a positividade de
linfócitos ativados em apenas um caso de um total de 33 (Tabela 1).
Foram consideradas positivas para granzima B 1226 células no total
estudadas, distribuídas no epitélio e estroma do grupo controle, NIC I, NIC II e
NIC III, sendo 565 células positivas no epitélio e 661 positivas no estroma
(Anexos 4a,b,c,d).
No grupo controle, foram consideradas positivas para a granzima B 156
células no epitélio e 181 no estroma. Nos casos de neoplasia intra-epitelial de
grau I, 147 células marcadas no epitélio e 95 no estroma, na neoplasia
intra-epitelial de grau II, 117 no epitélio e 176 no estroma. Na neoplasia intra-intra-epitelial
de grau III, foram encontradas 145 células positivas no epitélio e 209 positivas no
estroma (Anexos 4a,b,c,d).
De acordo com a somatória total da positividade dos linfócitos ativados
no epitélio, estroma e epitélio - estroma realizou-se a média dos linfócitos ativados
nos grupos Controle, NIC I, NIC II e NIC III dividindo o número total de linfócitos
ativados, no epitélio, estroma e epitélio - estroma pelo número de casos nos
Resultados 27
Tabela 1 – Distribuição de 142 casos de fragmentos de colo uterino segundo a
positividade da imuno-expressão da granzima B, as diferentes lesões pré
neoplásicas e grupo controle.
GB + GB - Total
n % n % n %
CONTROLE 29 20,4 10 7,1 39 27,5
NIC I 28 19,0 06 4,9 34 23,9
NIC II 34 24,0 02 1,4 36 25,4
NIC III 32 22,5 01 0,7 33 23,2
TOTAL 122 85,9 20 14,1 142 100
Tabela 2 – Demonstrativo de 142 casos estudados segundo subgrupo, número de
casos parciais, médias e teste estatístico de Kruskal-Wallis
Granzima B - Grupos: Controle x NIC I x NIC II x NIC III Postos
Grupos
N Média de Postos
Epitélio Controle 39 64,12
NIC I 34 74,91 NIC II 36 68,15
NICIII 33 80,36 Total 142
Estroma Controle 39 67,63
NIC I 34 55,63 NIC II 36 76,08
NICIII 33 87,42 Total 142
Epitélio+Estroma Controle 39 66,60
NIC I 34 63,34 NIC II 36 72,15
NICIII 33 84,98
Total 142
Teste de Kruskal-Wallis
Testes Estatísticos a, b
Epitélio Estroma Epitélio + Estroma
Qui-quadrado 3,321 11,023 5,477
Df 3 3 3
p= ,345 ,012 ,140
a. Teste de Kruskal Wallis b. Grupos Variáveis
Resultados 28
Tabela 3 – Demonstrativo das diferentes médias e totais de linfócitos ativados
segundo local de contagem, total dos casos estudados e avaliação estatística
Descritiva Grupos
Epitélio Estroma Epitélio + Estroma
N 39 39 39
Controle
Média 4,0 4,6 8,6
N 34 34 34
NIC I
Média 4,3 2,8 7,1
N 36 36 36
NIC II
Média 3,3 4,9 8,2
N 33 33 33
NIC III
Média 4,4 6,3 10,7
Comparações (Estroma) NIC I < NIC III
GRANZIMA B - CONTROLE X NIC I X NIC II X NIC III
x2 calc = 11,023*
VALORES CRÍTICOS: 7.815 (alfa = 5%) e 11345 (alfa = 1%) ; G.L. = 3
*** TESTE DE COMPARAÇÕES MULTIPLAS ***
PARES VADMP DMS
(D1,D2) 12.00 25.46 (D1,D3) 8.45 25.08 (D1,D4) 19.79 25.67 (D2,D3) 20.45 25.95
(D2,D4) 31.79 26.52 (D3,D4) 11.34 26.16
Legenda
VAMPD -> VALOR ABSOLUTO DA DIFERENÇA ENTRE AS MÉDIAS DOS POSTOS. DMS -> DIFEREÇA MÍNIMA SIGNIFICANTE.
D1 -> CONTROLE D2 -> NIC I
Resultados 29
Quando comparamos os grupos, em relação a granzima B, verificamos
que o teste de Kruskal-Wallis não mostrou diferença significante entre os grupos
(epitélio e epitélio - estroma) verificando-se os valores do x2 3,321 NS (p = 0,345) para o epitélio e x2 5,477 NS (p = 0,140) para o epitélio e estroma.
Por outro lado, considerando a contagem realizada no estroma, o
teste de Kruskal-Wallis mostrou diferença estatisticamente significante entre os
grupos sendo x2 11,023 (p 0,012). O teste de comparações múltiplas revelou haver diferença estatística significante entre os valores do grupo NIC I em
relação ao grupo NIC III, com valor absoluto de diferença calculada 31,79 para
valor crítico (26,52) enquanto que as comparações entre NIC I e NIC II o valor
da estatística calculada (20.45) ficou próximo do valor crítico (25,95), o que
sugere possível diferença de NIC I para NIC II, mostrada pelas médias 2,8 para
NIC I e 4,9 para NIC II.
Para a variável fator de crescimento endotelial vascular, foi estudada
a imuno-expressão em 160 fragmentos de colo uterino sendo, 43 de neoplasia
intra-epitelial cervical de grau I, 33 de neoplasia intra-epitelial cervical de grau II,
31 de neoplasia intra-epitelial cervical de grau III, e 53 com ausência de
neoplasia intra-epitelial cervical, ou seja, fragmentos de colo uterino sem atipias
– grupo controle (Tabela 4).
Na comparação entre os grupos, previamente definidos e a intensidade
da coloração - ausente ou grau leve, moderado ou intenso na tabela de contigência
observamos diferença estatisticamente significante entre os grupos e a intensidade
da coloração x2 calc = 44,154 (p = 0,000).
Na neoplasia intra-epitelial cervical de grau I, foram observados 14
(32,6%) fragmentos de colo uterino com ausência ou leve expressão para o
VEGF, 28 (65,1%) com moderada expressão e 01 (2,3%) fragmento de colo
uterino com intensa expressão para o VGEF.
Na neoplasia intra-epitelial cervical de grau II, foram observados 14
(42,4%) fragmentos de colo uterino com ausência ou leve expressão para o
VEGF, 11 (33,3%) com moderada expressão e 08 (24,3%) fragmento de colo
Resultados 30
Na neoplasia intra-epitelial cervical de grau III, encontrou-se 03
(9,6%) fragmentos de colo uterino com ausência ou leve expressão para o
VEGF, 14 (45,2% dos casos) com moderada expressão e outros 14 (45,2%)
fragmento de colo uterino com intensa expressão para o VEGF.
No grupo controle, ou seja, epitélio escamoso estratificado sem atipias,
foram observados 31 (58,5%) fragmentos de colo uterino com ausência ou leve
expressão para o VEGF, 19 (35,8%) com moderada expressão e três (5,7%)
fragmento de colo uterino com intensa expressão para o VEGF (Tabela 4).
Predominaram os casos com ausência ou leve expressão para o VEGF.
Tabela 4 – Demonstrativo dos 160 casos avaliados para VEGF seguindo
subgrupos, número de casos, grau de expressão e avaliação estatística por
cáculo de contigência
VGEF VGEF – Grupos x Grau
Ausente/Leve Moderado Intenso Total
Grupos Controle N 31 19 3 53
% 58,5 35,8 5,7 100,0
NIC I N 14 28 1 43
% 32,6 65,1 2,3 100,0
NIC II N 14 11 8 33
% 42,4 33,3 24,3 100,0
NIC III N 3 14 14 31
% 9,6 45,2 45,2 100,0
Total N 62 72 26 160
% 38,8 45,0 16,2 100,0
Qui-quadrado
Valor (Grau de liberdade) P
Qui-Quadrado x 2 =44,154ª 6 ,000
Discussão 32
O carcinoma de células escamosas do colo uterino cumpre o modelo
de clássica doença multi-estagiária iniciando pelo desenvolvimento de lesão
precursora, progressão morfológica desta lesão durante o decorrer do tempo e
em alguns casos, o desenvolvimento de carcinoma invasor (Hildesheim et al.,
1994; Pinto, Crum, 2000).
Como agente etiológico, a infecção pelo papilomavírus humano
(HPV) tem forte associação com carcinoma cervical e suas lesões precursoras,
as lesões intra-epiteliais escamosas de baixo e alto grau (Liaw et al., 1999).
Uma vez que a neoplasia cervical uterina é considerada doença HPV
associada e de curso clínico dependente da resposta imunológica do
organismo hospedeiro, aprofundam-se cada vez mais as pesquisas no tocante
aos aspectos biomoleculares e imunogenéticos.
No epitélio do trato genital inferior, junto à membrana basal e nas
camadas epiteliais a ela mais próxima, é possível encontrar macrófagos,
linfócitos, plasmócitos, células de Langerhans, eosinófilos e mastócitos. As
células de Langerhans e os macrófagos precedem o aparecimento de
linfócitos, principais elementos de defesa (Le Bouteiller et al., 2003).
Esse fato desencadeia mecanismos de ativação de células de
defesa, as células natural killer, os linfócitos T e os linfócitos T auxiliares, Th1 e
Th2. A células natural killer favorecem a destruição de células infectadas pelo
agente estranho. Na falha da imunidade celular e com persistência da
exposição ao antígeno, ocorre predomínio de resposta humoral e produção de
anticorpos de tipo IgE pelos mastócitos.
A detecção da infecção viral é proveniente do surgimento de
antígenos produzidos pela expressão de proteínas virais e gera um estímulo às
respostas imunológicas. Ao redor da área acometida há infiltração celular
mononuclear composta por linfócitos T, natural killer e macrófagos. Esta
resposta ativa é independente da presença de certos estímulos inflamatórios,
ocorrendo logo após a observação da infecção. À medida que as modificações
celulares implicam em alterações teciduais pré-malignas, ocorre a ativação da
Discussão 33
A função dos linfócitos T está estabelecida na infecção pelo HPV,
porém pouco está elucidado acerca do processo imunológico vigente na lesão
pré-maligna, as neoplasias intra-epiteliais cervicais de alto grau.
As células T são as principais efetoras da imunidade protetora
anti-tumoral, causam lise e destruição de células alogênicas, morte de células
infectadas e tumorais. O linfócito T não reconhece o antígeno livre. As células
tumorais exibem seus próprios antígenos para as células T, que passam a
reconhecer peptídeos derivados de proteínas mutantes ou anormalmente
presentes nas células transformadas malignamente (Trapani, 1996).
A granzima B é uma serino protease que permanece armazenada,
completamente processada e na forma ativada em grânulos citoplasmáticos
dos linfócitos T citolíticos e células natural killer. É a mais abundante no
linfócito T e relaciona-se especificamente com a indução da citotoxidade. A sua
função fisiológica foi demonstrada por Heusel et al.,1994, estando relacionada
aos eventos proteolíticos, no processo de reconhecimentos de células alvos
(Blink et al., 1999).
Recentemente a função das granzimas na morte das células alvo
tem sido extensivamente estudada. Estudos em ratos mostraram que a
granzima B desempenha um papel crucial nos linfócitos T citotóxicos (CTL) e
células natural killer provocando apoptose das células alvo (Bontkes et al.,
1997; Loeb et al., 2006).
Ko et al. (2007), verificaram que a granzima B induz morte celular na
neoplasia de células T maduras e natural killer (linfoma não Hodgkin) e está
relacionada com necrose extensiva observada neste tipo de tumor.
Neste estudo, pesquisou-se a imuno-expressão quantitativa
linfocitária da granzima B e as variações desta serino protease, nas lesões
precursoras do câncer do colo uterino, de acordo com a sua gravidade.
A imuno-expressão foi avaliada no epitélio, estroma e epitélio –
estroma. Observou-se crescente positividade para a granzima B no estroma,
conforme a gravidade da neoplasia intra-epitelial cervical. A média encontrada por
campo, no grupo estatisticamente significante, o estroma, foi de 2,8 na neoplasia
intra-epitelial cervical de grau I, 4,9 na intra-epitelial cervical de grau II e 6,3 na
Discussão 34
No estroma, a imuno-expressão para a granzima B na neoplasia
epitelial cervical de grau I mostrou-se menor do que na neoplasia
intra-epitelial cervical de grau III. A ativação dos receptores dos linfócitos T e células
natural killer determina a liberação da granzima B, dos grânulos
intra-citoplasmáticos, por exocitose promovendo apoptose das células alvos e
erradicação das células tumorais. Quanto maior a imuno-expressão de
granzima B encontrada, pressupõe-se melhor prognóstico da lesão
intra-epitelial cervical pois maior é o número de células ativadas e melhor resposta
do organismo no combate à progressão da lesão precursora para carcinoma
espinocelular invasor.
A alta imuno-expressão da granzima B ocorreu no estroma das
neoplasias intra-epiteliais de grau II e III. Depreende-se assim, ser a alta
positividade dessa granzima, fator indicativo de maior comprometimento
epitelial cervical. Esse fato seria de extrema importância no estudo das
neoplasias intra-epiteliais cervicais indicando provável lesão intra-epitelial
cervical de grau II ou III.
Comparando as neoplasias intra-epiteliais cervicais de grau II e III
observou-se aumento da positividade da granzima B no estroma na neoplasia
intra-epitelial de grau III. Este resultado pode ser explicado pela maior
gravidade da neoplasia intra-epitelial de grau III e a granzima B desempenhar
papel crucial nas células T citotóxicas (CTL) e natural killer provocando
apoptose das células alvo e erradicação das células tumorais.
De forma semelhante, o grupo epitélio – estroma apresentou
aumento progressivo da imuno-expressão para a granzima B nas neoplasias
intra-epiteliais de grau I, II e III embora sem significância estatística.
Quanto às avaliações feitas no grupo epitélio, a neoplasia
intra-epitelial de grau I apresentou imuno-expressão média de granzima B
semelhante à neoplasia intra-epitelial de grau III. Isso levanta a hipótese de
tentativa de erradicação da células tumorais na lesão intra-epitelial de baixo
Discussão 35
Kondo (2003) em um estudo concordante com este, concluiu que a
positividade dos linfócitos ativados em fragmentos de tecido do colo uterino
obedece a valores crescentes a partir de tecidos sem atipias, em direção à
neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau. Encontrou também granzima B
em todos os casos de neoplasia intra-epitelial cervical, com distribuição
preponderante no estroma. O número de células positivas pela granzima B foi
significantemente alta no grupo que não apresentou recorrência da neoplasia
intra-epitelial cervical em comparação com o grupo que apresentou
recorrência. Com esses dados é possível sugerir a hipótese de quanto maior o
número de células ativadas pela granzima B, melhor prognóstico da lesão
intra-epitelial cervical, com menor progressão para carcinoma invasor e menor
recidiva após tratamento específico.
No grupo controle a imuno-expressão estromal de granzima B
assemelhou-se aquela dos casos de neoplasia intra-epitelial de grau II,
reafirmando ser esse fato resultante de resposta a processos inflamatórios de
qualquer natureza etiológica: viral, bacteriana, fúngica ou por protozoários. O
epitélio e epitélio – estroma também apresentaram imuno-expressão para a
granzima B no grupo controle, apesar de não serem estatisticamente significante.
Tumores sólidos requerem angiogênese para progressão e
metástase. A formação de novos capilares é essencial para o crescimento dos
tumores maiores que 1-2 mm2 e contribui para o processo metastático pelo transporte de células cancerígenas na circulação. A quantidade de vasos é
sabido ser o reflexo da atividade angiogênica e o aumento da densidade
vascular mostrou relação com alta incidência de metástase e pior prognóstico
nos diferentes tumores (Tjalma et al., 2000).
Considerando-se a existência de diferentes graus de processo
inflamatório estromal, a densidade vascular parece ser importante fator a ser
analisado. Nos processos reparativos teciduais a angiogênese é essencial para
favorecer a chegada dos elementos de defesa e restauração. Da mesma forma
a formação de novos vasos é fator importante no crescimento e propagação
Discussão 36
A angiogênese constitui formação de novos capilares a partir de
vasos pré-existentes, graças ao crescimento, desenvolvimento e migração das
células do endotélio vascular. É essencial também na reprodução,
desenvolvimento e reparos de feridas. O processo é regulado por fatores
endoteliais estimuladores e inibidores. Agentes pró-angiogênicos, como o fator
de crescimento vascular endotelial (VEGF) e o naltrexone, têm se mostrado
indutores efetivos do crescimento de novos vasos. Já o fator de crescimento
opióide endógeno (OGF,[Met(5)]-encefalina) e o ácido retinóico são inibidores
da angiogênese (Blebea et al., 2002). O fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF) é considerado o mais importante regulador da angiogênese,
bem como um mediador da permeabilidade vascular (Guidi et al., 1995; Clere
et al., 2007). Aumenta a permeabilidade dos microvasos resultando no
extravasamento das proteínas plasmáticas adjacente ao estroma. Extravasa
coágulos de fibrinogênio no espaço intra-vascular para formar matriz provisória
rica em fibrina dentro do qual células inflamatórias, fibroblastos e células
endoteliais migram resultando em alta vascularização do tecido conjuntivo
similar ao tecido de granulação (Senger et al., 1983; Guidi et al., 1995).
Evidências substânciais implicam o VEGF com sindromes de
neovascularização intra-ocular e com o desenvolvimento de vários tumores,
incluindo tumores de mama, cérebro, pulmão e do trato gastro-intestinal
(Salven et al., 1997). O alto nível de expressão do VEGF nos tumores cervicais
é particularmente interessante pois a proliferação vascular é característica
destes tumores (Tjalma et al., 2000) e a alta densidade dos microvasos é
indicador de pior prognóstico para o câncer cervical (Obermair et al., 1997). O
proceso de angiogênese tem sido avaliado em tumores pela medida da
densidade dos microvasos, da análise imuno-histoquímica da expressão do
VEGF e da mensuração de seus níveis circulantes, sendo importante indicador
de sobrevida e da resposta terapêutica (Greb et al., 1999; Smith et al., 1999;
Adams et al., 2000; Seki et al., 2000; Fujisawa et al., 2001; Miralem et al.,
2001; Benoy et al., 2002; Toi et al., 2002).
Neste estudo, pesquisou-se a expressão imuno-histoquímica do
VEGF nas neoplasias intra-epiteliais de baixo e alto grau e sua relação com a
