Lívia Maria Gonçalves Rossi
Epidemiologia molecular do vírus da Hepatite C: análise
comparativa de diferentes regiões subgenômicas aplicadas a
estudos de associação genética
São José do Rio Preto
2016
Lívia Maria Gonçalves Rossi
Epidemiologia molecular do vírus da Hepatite C: análise
comparativa de diferentes regiões subgenômicas aplicadas a
estudos de associação genética
Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em
Microbiologia, do Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.
Orientador: Profª. Drª. Paula Rahal Coorientador: Prof. Dr. Alejandro Escobar-Gutierrez
Rossi, Lívia Maria Gonçalves.
Epidemiologia molecular do vírus da Hepatite C : análise
comparativa de diferentes regiões subgenômicas aplicadas a estudos de associação genética / Lívia Maria Gonçalves Rossi. -- São José do Rio Preto, 2016
102 f. : il., tabs.
Orientador: Paula Rahal
Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Virologia. 2. Hepacivirus. 3. Hepatite C. 4. Vírus de RNA. 5. Epidemiologia molecular. 6. Sequenciamento de nucleotídeos em larga escala. I. Rahal, Paula. II. Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho". Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título.
CDU – 576.858
Lívia Maria Gonçalves Rossi
Epidemiologia molecular do vírus da Hepatite C: análise
comparativa de diferentes regiões subgenômicas aplicadas a
estudos de associação genética
Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em
Microbiologia, do Instituto de
Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.
Comissão Examinadora
Profª. Drª. Paula Rahal
UNESP – São José do Rio Preto Orientador
Profª. Drª. Ana Carolina Gomes Jardim UNESP – São José do Rio Preto
Profª. Drª. Camila Malta Romano USP – São Paulo
Profª. Drª. Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Mello UNIFESP – São Paulo
Profª. Drª. Marília de Freitas Calmon UNESP – São José do Rio Preto
Dedicatória
Dedico esse trabalho às minhas famílias, a inata e a adquirida, pelo amor
Agradecimentos
À minha orientadora, Paula Rahal, por sua amizade, ensinamentos e oportunidade de realizar esse trabalho.
Ao Dr. Alejandro Escobar-Gutierrez e toda a sua equipe do InDRE (Karina, Juan Carlos, Carlos e Armando), pela colaboração e por me acolherem no México.
Ao Negrito, pela ajuda intelectual, carinho e apoio nesse período tão demandante.
Aos meus queridos avós, Dona Antônia e Seu Zé, por me
acolherem e tornarem minha estadia em Rio Preto tão agradável.
À vó Maria, com a certeza, que mesmo em outro plano zela por mim.
Aos meus pais, por sempre me motivarem e incentivarem a seguir meus sonhos, ainda que estes me levem para tão longe.
À Lenira Bueno, por todo o auxílio na burocracia que faz parte da formação acadêmica.
À banca examinadora, pelo tempo dedicado a melhorar esse trabalho.
À família e aos amigos presentes (e ausentes) que torceram e rezaram por mim.
SUMÁRIO
Resumo...8
Abstract...9
Capítulo 1 1.Introdução ...11
1.1. A Hepatite C ...11
1.2. O vírus da Hepatite C ...12
1.3. Transmissão e epidemiologia ...14
1.4. Variabilidade do genoma viral ...18
1.5. Glicoproteína E2 e a região hipervariável 1 - HVR1 ...20
1.6. A região NS5A ...21
1.7. Vigilância epidemiológica molecular ...23
1.8. Tecnologias de análise de sequências ligadas à virologia e vigilância epidemiológica ...23
2. Justificativa ...25
3. Objetivos ...28
3.1. Objetivo geral ...28
3.2. Objetivos específicos ...28
4. Métodos ...29
4.1. Amostras Clínicas ...29
4.2. Extração do RNA viral e síntese do cDNA ...30
4.3. Amplificação das regiões HVR1 e NS5A ...30
4.4. Sequenciamento de nova geração ...33
4.5. Análise filogenética e construção de Median Joining Networks ...34
5. Referências ...35
Capítulo 2 Artigo científico 1 ...42
Artigo científico 2 ...50
Artigo científico 3 ...86
Artigo científico 4 ...89
Artigo científico 5 ...94
8
RESUMO
O vírus da Hepatite C (HCV) afeta cerca de 3% da população mundial. A cada ano, 3-4 milhões de novos casos são diagnosticados. A identificação de redes transmissão é complexa devido ao longo período de incubação, à falta de sintomas na fase aguda da doença e à heterogeneidade do HCV, que dificulta o estabelecimento de vínculos entre casos relacionados. Uma ampla caracterização das populações intra-hospedeiros pode ser realizada de forma eficiente através do sequenciamento de nova geração (NGS). Com base neste contexto, o sequenciamento de múltiplas regiões subgenômicas é uma solução às limitações impostas pela rápida evolução molecular do HCV. Variantes virais das regiões HVR1 e NS5A de 16 pacientes cronicamente infectados com o HCV, genótipos 1a e 1b, foram sequenciadas com a técnica de NGS. Os pacientes 1-7 compartilhavam fatores de risco, pertencendo ao mesmo grupo de usuários de drogas injetáveis, porém o parentesco genético desses casos não pode ser estabelecido com base apenas no sequenciamento da HVR1 (distância nucleotídica mínima entre 16-23). A amplificação de um fragmento maior (~450 pb), correspondente a um segmento da região NS5A, aprimorou a relação epidemiológica entre os pacientes 1-5, onde as distancias genéticas mínimas foram consideravelmente menores (9-13). Os pacientes 6 e 7 não compartilharam sequências com os outros cinco pacientes dessa rede, apresentando populações virais mais homogêneas. Adicionalmente,
Median Joining Networks foram construídas para melhor analisar a
variabilidade genética intra-hospedeiro. Em geral, observou-se que as sequências derivadas da NS5A formaram comunidades mais homogêneas e menos divergentes geneticamente. Assim, a tecnologia NGS e o sequenciamento das regiões subgenômicas HVR1 e NS5A podem ajudar a restaurar elos perdidos quando somente a região HVR1 é analisada, aprimorando portanto, a resolução de estudos de associação genética entre populações de HCV.
9
ABSTRACT
The hepatitis C virus (HCV) affects approximately 3% of the world's population. Each year 3-4 million new cases are diagnosed. The identification of transmission networks is complicated due to the characteristic long incubation period, the lack of symptoms during the acute phase of the disease and the heterogeneity of HCV, making it challenging to link related cases to a common source of infection. Extensive characterization of intra-host populations can be reliably archived using next generation sequencing (NGS) approaches. Sequencing of multiple and longer subgenomic regions has been proposed as an alternative to overcome the limitations imposed by the rapid molecular evolution of the HCV HVR1. Thus, the NS5A and HVR1 regions of 16 chronically infected individuals, genotypes 1a and 1b, were sequenced using a NGS platform. Patients 1-7 shared risk factors and belonged to the same injection drug users network. However, genetic relatedness could not be established based on the HVR1 sequences (minimal nucleotide distance ranging from 16-23). Amplification and sequencing of a larger PCR fragment (~450 bp) targeting the NS5A region reestablished lost epidemiological links between patients 1-5. The minimum genetic distances in those patients were considerable smaller than the HVR1 counterparts (9-13). Patients 6 and 7 displayed a rather homogeneous viral population and were clearly not sharing any sequences with all other five patients in this network. Additionally, Median Joining Networks analysis was carried out to further analyze the intrahost genetic variability of all seven patients. Overall, NS5A sequences were significantly less diverse than their HVR1 equivalents. Thus, NGS technology and use of both HVR1 and NS5A sequences might help restored otherwise lost links when the HVR1 region alone is analyzed, improving the resolution of HCV genetic relatedness studies.
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Capítulo 1
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1. Introdução e Revisão Bibliográfica
1.1. A Hepatite C
A Hepatite C é causada pelo vírus da hepatite C (HCV, por sua sigla em inglês) (Choo, Kuo et al. 1989) e é reconhecida como uma das principais causas de doença hepática crônica associada à inflamação do fígado, necrose, cirrose e carcinoma hepatocelular (HCC, sigla em inglês) (Lauer and Walker 2001). O quadro clínico da infecção pelo HCV é amplo e os sintomas na fase aguda são leves ou moderados em aproximadamente 30 a 40% dos pacientes, dificultando o diagnóstico e retardando o início do tratamento (Te and Jensen 2010; Wilkins, Malcolm et al. 2010; Khudyakov 2012). A mortalidade na fase aguda da infecção pelo HCV é rara, entretanto, aproximadamente 75% dos pacientes desenvolverão um quadro de infecção crônica, sendo esta a causa de quase toda a morbidade e mortalidade relacionadas ao HCV. O risco de morte devido à infecção crônica pelo HCV é estimado em 37%. Após anos de infecção crônica, a cirrose ocorre em 15 a 35% dos pacientes, nos quais a incidência anual de HCC está entre 1 e 3%. Infecção pelo HCV eleva o risco de HCC em 17 vezes, o que explica o fato de 31 a 61% dos casos de HCC serem de pacientes infectados por este vírus. Adicionalmente, aproximadamente 36% das pessoas na lista de espera de transplante de fígado tem uma doença hepática relacionada ao HCV (Ward 2013).
12
que um aumento da mortalidade é esperado dentro dos próximos anos (Te and Jensen 2010; Wilkins, Malcolm et al. 2010; Ward 2013).
1.2. O vírus da Hepatite C
O HCV é um patógeno humano globalmente prevalente que tem por característica causar infecções hepáticas persistentes na maioria dos indivíduos infectados (Jackowiak, Kuls et al. 2013). Cerca de 180 milhões de pessoas no mundo estão cronicamente infectadas com o HCV, e em torno de 3 a 4 milhões de novas infecções são reportadas a cada ano. Além disso estima-se que 499.000 mortes relacionadas à infecção pelo HCV ocorram anualmente (Lavanchy 2009; Lozano, Naghavi et al. 2012; Mohd Hanafiah, Groeger et al. 2013).
13
and Lohmann 2000; Moradpour, Penin et al. 2007). De forma semelhante a outros vírus de RNA, o HCV codifica sua própria RNA polimerase RNA-dependente, a qual não possui função de reparo (Jackowiak, Kuls et al. 2013).
Fig. 1. Representação esquemática do (a) genoma do HCV e das (b) proteínas virais Adaptado de (Preciado, Valva et al. 2014).
14
Fig. 2. Genótipos do HCV. Linhagens de HCV representando os sete genótipos e os diferentes subtipos. As sequências da região NS5B foram escolhidas para ilustrar a diversidade máxima dentro de um subtipo. A árvore filogenética foi construída utilizando-se MEGA5 (Rossi, Escobar-Gutierrez et al. 2015).
1.3. Transmissão e epidemiologia
15
Ásia Central (Tanaka, Kurbanov et al. 2006; Khan, Tanaka et al. 2009). Posteriormente, durante a década de 1980 e início de 1990, observou-se um rápido declínio no número casos de Hepatite C aguda nos EUA (Williams, Bell et al. 2011). Tais variações no tamanho da população do HCV impactaram a diversidade genética do vírus (Tanaka, Kurbanov et al. 2006; Magiorkinis, Magiorkinis et al. 2009; Markov, Pepin et al. 2009). Do mesmo modo, os padrões de transmissão, característicos a grupos de risco específicos, e as variações nas taxas e padrões de transmissão tendem a reconfigurar a composição genética das populações do HCV (Khudyakov 2012).
16
18
1.4. Variabilidade do genoma viral
O HCV é conhecido por sua alta variabilidade genética, em grande parte devida à ausência de atividade corretora de sua RNA polimerase RNA-dependente. Consequentemente, a enzima não corrige nucleotídeos incompatíveis e trocas de bases são introduzidas aleatoriamente no genoma viral, produzindo continuamente genomas mutantes a cada ciclo de replicação (Lesburg, Cable et al. 1999; Bowen and Walker 2005; Jackowiak, Kuls et al. 2013). A mutação viral, descrita aqui como taxa de incorporação errada de nucleotídeos por nucleotídeo copiado por replicação, é tema recorrente em vários estudos (Ogata, Alter et al. 1991; Abe, Inchauspe et al. 1992; Lutchman, Danehower et al. 2007; Cuevas, Gonzalez-Candelas et al. 2009; Ribeiro, Li et al. 2012). Conforme estabelecido em experimentos in vitro, a polimerase viral apresenta um índice de incorporação de erros que varia entre 8,7 x10-3 a 1,4 x10-6 por base replicada (Powdrill, Tchesnokov et al. 2011). Apesar de ser sujeita a erros, a replicação do RNA é extremamente eficiente e permite a produção de aproximadamente 1012 vírions/dia em um único hospedeiro (Neumann, Lam et al. 1998). Assim, a elevada taxa de mutação, um genoma relativamente pequeno e o grande tamanho da população viral, contribuem, conjuntamente, para a rápida evolução viral. Essas mudanças evolutivas permitem que o HCV se adapte continuamente ás pressões seletivas exercidas pelo organismo hospedeiro e à medicamentos antivirais. Dessa forma, o HCV é conhecido por formar populações de variantes intimamente relacionadas, mas geneticamente distintas, que estão presentes em um único hospedeiro e estão sujeitas a contínua variação genética e seleção. No caso do HCV, depois de estabelecer uma infecção produtiva, a variante inicial se replica e dá origem a um novo pool de variantes virais (Khudyakov 2012).
19
características inerentes da polimerase. Teoricamente, a NS5B (polimerase) pode introduzir mutações aleatoriamente. Entretanto, algumas regiões do genoma do HCV são mais plásticas, fixando mutações sem que isso comprometa a viabilidade do vírion (por exemplo, a região hipervariável 1 (HVR1) do gene de E2), ao passo que outras regiões são moderadamente variáveis quando comparadas com a HVR1 (NS5A, por exemplo) ou mesmo altamente conservadas (core e 5’UTR) (Polyak, McArdle et al. 1998; Rispeter, Lu et al. 2000; Simmonds 2004; Fan, Zhu et al. 2005) (Fig. 1).
(Cruz-20
Rivera, Carpio-Pedroza et al. 2013). Entretanto, a alta variabilidade genética encontrada na região HVR1 se faz necessária em estudos epidemiológicos (Gonzalez-Candelas, Bracho et al. 2013).
Durante as etapas iniciais da infecção, os genes que codificam as proteínas estruturais do HCV exibem um elevado grau de homogeneidade. Análises filogenéticas destes genes mostraram que a evolução segue a partir de um único fundador após um evento de gargalo, tendência comum em casos de transmissão (Li, Stoddard et al. 2012). Notadamente e mesmo após anos de infecção crônica pelo HCV, a taxa de divergência da região NS5A é significantemente inferior a da região HVR1, apesar desta também ser considerada uma região de maior variabilidade dentro do genoma viral (Smith, McAllister et al. 1997; Rispeter, Lu et al. 2000; Fan, Zhu et al. 2005). Adicionalmente, em infecções acompanhadas por anos, a maioria das variantes de HCV foi observada apenas em determinados pontos de coleta, entretanto algumas variantes foram detectadas em mais de um ponto. Tal persistência de variantes foi mais facilmente detectada utilizando-se a região NS5A (Ramachandran, Campo et al. 2011). Em outro estudo, os autores não observaram diferença significativa no valor médio de Entropia de Shannon em sequências de nucleotídeos do gene NS5A entre amostras de pacientes crônicos obtidas no início do estudo e as obtidas 10 anos depois (Fan, Zhu et al. 2005).
1.5. Glicoproteína E2 e a região hipervariável 1 - HVR1
21
transmembranar carboxi-terminal, a qual se associa em heterodímeros não covalentes com a glicoproteína E1 do HCV (Deleersnyder, Pillez et al. 1997). Os ectodomínios da glicoproteína E2 são altamente modificados por glicanos, sendo que a E2 possui até 11 locais bem conservados de glicosilação (Goffard and Dubuisson 2003; Zhang, Gaschen et al. 2004). Alguns desses glicanos desempenham um papel importante na dobragem da glicoproteína ou na entrada do HCV nas células (Goffard, Callens et al. 2005). Porque ser essencial para a entrada do vírus, a E2 é alvo constante de anticorpos neutralizantes (Cashman, Marsden et al. 2014).
Regiões hipervariáveis (HVR) foram identificadas na sequência da glicoproteína do envelope E2 (Weiner, Brauer et al. 1991). A primeira, a região hipervariável 1 (HVR1), está localizada na extremidade 5’ do gene E2 e consiste em 27 a 31 aminoácidos. Sugere-se que essa região seja um epítopo imunodominante para ativação especifica de células B e T (Gale and Foy 2005; Scotta, Garbuglia et al. 2008) e esteja envolvida com a entrada do vírus na célula (Roccasecca, Ansuini et al. 2003; Sabo, Luca et al. 2011). Mudanças rápidas nos aminoácidos constituintes da HVR1 permitem que o HCV escape do reconhecimento por imunoglobulinas, contribuindo para a persistência da infecção. A taxa de mutação anual estimada para a proteína do envelope E2 é de 4.7 x 10-3 substituições de nucleotídeos por sítio por ano (Δnt), enquanto que para a HVR1 é de 23 x 10-3Δnt (Rispeter, Lu et al. 2000). Devido a sua alta variabilidade, a HVR1 é frequentemente utilizada para a identificação de eventos de transmissão recente do HCV (Ramachandran, Xia et al. 2008; Fischer, Schaefer et al. 2010; 2011).
1.6. A região NS5A
22
23
1.7. Vigilância epidemiológica molecular
A vigilância epidemiológica da prevalência e incidência de infecções por HCV é uma ferramenta fundamental para o monitoramento da disseminação viral, implementação e avaliação de medidas de controle (Khudyakov 2012). Contudo, a vigilância epidemiológica tradicional, baseada apenas na manifestação da doença, é limitada em sua capacidade para rastrear e controlar as transmissões. O emprego de testes genéticos e técnicas de biologia molecular são formas mais eficientes de se estabelecer elos entre transmissões diretas, pois permitem a avaliação de correlação genética entre variantes de HCV e baseiam-se no pressuposto de que variantes compartilhadas por dois pacientes têm composição genética idêntica ou muito semelhante. A avaliação acurada da relação genética entre linhagens do HCV pode ser alcançada através do isolamento de representantes da população viral do hospedeiro na forma de pequenas sequências de determinadas regiões genômicas (Ramachandran, Xia et al. 2008). Apesar da análise de variantes virais ser muito complexa e trabalhosa, esta não pode ser substituída por simples sequenciamento consenso, uma vez que sequências consenso de regiões curtas não representam a população viral de forma adequada (Ramachandran, Xia et al. 2008). Além disso, com o passar do tempo, a composição da população do HCV em pacientes sofre mudanças significativas resultantes do processo de evolução viral (Ramachandran, Campo et al. 2011).
1.8. Tecnologias de análise de sequências ligadas à virologia e
vigilância epidemiológica
24
avaliação da relação genética de variantes virais entre pacientes infectados (Ganova-Raeva, Dimitrova et al. 2013). O sequenciamento de nova geração (NGS), aqui também chamado de pirossequenciamento de
alta capacidade (UDPS – do inglês “Ultra-Deep PyroSequencing”)
25
2. Justificativa
A Hepatite C é uma doença que incide em todos os países, inclusive no Brasil, onde se estima que 0,8 a 3,4% da população está infectada com seu agente causal, o Vírus da Hepatite C (HCV). Dentre os indivíduos recém-infectados, muitos não apresentam os sintomas da doença, embora em aproximadamente 75% dos casos a infecção progrida para Hepatite C crônica. Como agravante à natureza crônica desse vírus, ainda não existe vacinas profiláticas contra a infecção pelo HCV e apenas recentemente tratamentos antivirais eficazes foram aprovados. Entretanto, devido a questões econômicas e logísticas, países e pacientes com recursos limitados não terão acesso imediato à essas drogas de última geração. Dessa forma, a prevenção mantém-se como uma das medidas mais eficazes contra a disseminação do HCV e da Hepatite C.
26
Análises aprofundadas sobre a composição e distância genética de variantes virais intra- e inter-hospedeiro são formas eficientes de estabelecer elos entre transmissões diretas, pois pressupõem que variantes compartilhadas por dois pacientes têm composição genética muito semelhante. Tais análises são normalmente realizadas através do sequenciamento da região HVR1. Entretanto, nem sempre as relações epidemiológicas detalhadas entre vírus de receptores primários e secundários podem ser adequadamente reproduzidas pela análise filogenética da região E1/E2. Isso se deve em parte ao padrão evolutivo observado na região HVR1, onde a taxa de mutação para esta região é em torno de 23 x 10-3 substituições de nucleotídeos por sítio por ano (Δnt). Em muitas instâncias, o alto grau de diversidade observado nessa região torna a identificação de casos relacionados, mas com longa história de infecção, extremamente difícil. Como alternativas a essa limitação, análises da relação filogenética podem ser usadas para se estabelecer elos de transmissão. Adicionalmente, o emprego de fragmentos maiores ou outras regiões do genoma viral podem, também, auxiliar e enriquecer os métodos atuais de investigação epidemiológica.
A região NS5A também é considerada um sítio de maior variabilidade genética dentro do genoma viral. Entretanto, taxa de divergência dessa região é significantemente inferior a da HVR1. Enquanto muitas variantes de HCV são perdidas continuamente durante a infecção pelo HCV, algumas circulam por mais tempo, e essa persistência é mais facilmente detectada em sequências de NS5A do que nas sequências de HVR1. Em contra partida, o uso de regiões muito conservadas, como a NS5B ou core, não é recomendado, pois tais regiões não provêm informação genética suficiente para estudos de parentesco genético e epidemiológico.
27
uma melhoria significativa na taxa de transferência e redução de custos. O pirossequenciamento de alta capacidade (UDPS) apresenta diversas vantagens sobre as técnicas tradicionais de sequenciamento, incluindo maior amostragem da população viral intra-hospedeiro e redução dos custos. Além disso, demonstra melhor resolução e alta sensibilidade na detecção de mutações e divergência para o estudo da epidemiologia molecular do HCV. Assim, a utilização dessa técnica em estudos de associação genética aprofundará o nosso entendimento sobre a dinâmica da transmissão do HCV e do parentesco genético entre linhagens relacionadas.
28
3. Objetivos
3.1. Objetivo geral
Analisar e comparar o sequenciamento das regiões subgenômicas NS5A e HVR1 do HCV, buscando aprofundar os estudos de relação genética entre linhagens de HCV.
3.2. Objetivos específicos
- Analisar o parentesco genético entre as linhagens de HCV dos casos isolados.
- Analisar e comparar a diversidade intra- e inter-hospedeiro das regiões HVR1 e NS5A.
- Sequenciar por UDPS a região NS5A e desenvolver um
29
4. Métodos
4.1. Amostras clínicas
30
Tabela 1. Características dos pacientes
Paciente Gênero Idade (anos) Genótipo do
HCV
Título viral (IU/ml)
P1 Masculino 40 1a 3,680,000
P2 Feminino 44 1a 2,090,000
P3 Masculino 56 1a 2,790,000
P4 Feminino 45 1a 7,900,000
P5 Masculino 58 1a 4,400,000
P6 Masculino 43 1a 7,190,000
P7 Feminino 36 1a 5,740,000
P8 Masculino 51 1a 7,300,000
P9 Masculino 57 1a 8,430,000
P10 Feminino 49 1a 5,230,000
P11 Masculino 50 1a 4,080,000
P12 Feminino 42 1a 9,500,000
P13 Masculino 53 1b 6,204,000
P14 Feminino 56 1b 7,860,000
P15 Masculino 34 1b 8,620,000
P16 Masculino 37 1b 5,370,000
4.2. Extração do RNA viral e síntese do cDNA
A extração do RNA viral foi realizada utilizando o kit de extração RNA viral QIAamp viral RNA kit (QIAGEN, Valencia, CA). Para cada amostra de soro, 140μL foram utilizados e o produto eluído em 60μL, seguindo as instruções do fabricante. A síntese do DNA complementar (cDNA) e subsequente primeiro round de PCR foram realizados com o kit One Step RT-PCR (QIAGEN), utilizando-se primers específicos para cada região, segundo as instruções do fabricante. O desenho dos primers
seguem as recomendações do Centers for Disease Control and
Prevention (CDC).
4.3. Amplificação das regiões HVR1 e NS5A
31
ciclos de PCR, RT-PCR e Nested-PCR, etapa na qual se incluiu os adaptadores para o sequenciamento. Resumidamente, o cDNA de cada amostra foi utilizado para amplificação independente das regiões utilizando-se primers específicos para HVR1 e NS5A (Tabela 2), seguindo as condições: 95oC for 5 min, 40 ciclos à 95oC por 30s, 55oC por 20s, 72oC por 40s. Os produtos (2μl) dessas reações foram utilizados como substrato para a Nested-PCR. Essa reação é realizada com os primers de fusão para 454 (Fig. 5), os quais contêm os adaptadores A e B (em azul) e a chave (em vermelho), necessários no sistema 454, e estão acoplados a identificadores múltiplos (MID) (em alaranjado e amarelo), que são
sequências únicas que permitem a identificação dos amplicons
associados a cada um dos pacientes, e por fim contêm os primers específicos para as cada uma das regiões, HVR1 e NS5A (Tabela 2). Uma marcação híbrida com os MIDs foi realizada de tal maneira que cada amostra foi amplificada com uma combinação única de primers forward e
reverse, permitindo a utilização de um número limitado de
oligonucleotídeos (Tabela 2). Os produtos da Nested-PCR foram
32
Fig 4. Localização das regiões amplificadas, em relação ao genoma do HCV. Representação do genoma viral adaptado de (Preciado, Valva et al. 2014).
Fig. 5. Representação esquemática dos oligonucleotídeos (primers) de fusão utilizados
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Tabela 2. Primers utilizados na amplificação das regiões HVR1 e NS5A
Etapa Região (posição) Sequência
First Round
HVR1-F1 (1294 -1317) TGGCTTGGGATATGATGATGAACT
HVR1-R1 (1599-1618) GCAGTCCTGTTGATGTGCCA
NS5A-F1 (7019-7039) TCATAGAGGCCAACCTCCTGTG
NS5A-R1 (7539-7560) TCGACCATGACCCGTCGCTGAG
4
5
4
Se
qu
e
nci
ng
FWD-HVR-MID-1 (1302-1320) CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTGGATATGATGATGAACTGGT
FWD-HVR-MID-2 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGCTCGACAGGATATGATGATGAACTGGT
FWD-HVR-MID-3 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGACGCACTCGGATATGATGATGAACTGGT
FWD-HVR-MID-4 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCACTGTAGGGATATGATGATGAACTGGT
RVS-HVR-MID-1 (1586-1609) CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTTGATGTGCCAGCTGCCGTTGGTGT
RVS-HVR-MID-2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGCTCGACATTGATGTGCCAGCTGCCGTTGGTGT
RVS-HVR-MID-3 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGACGCACTCTTGATGTGCCAGCTGCCGTTGGTGT
RVS-HVR-MID-4 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGCACTGTAGTTGATGTGCCAGCTGCCGTTGGTGT
FWD-NS5a-MID-1 (7089-7110) CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTAGTGGTGATTCTGGACTCTTTCG
FWD-NS5a-MID-2 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGCTCGACAAGTGGTGATTCTGGACTCTTTCG
FWD-NS5a-MID-3 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGACGCACTCAGTGGTGATTCTGGACTCTTTCG
FWD-NS5a-MID-4 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCACTGTAGAGTGGTGATTCTGGACTCTTTCG
RVS-NS5a-MID-1 (7482-7505) CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTCATGGAGGAATAGGACTCAGCGTC
RVS-NS5a-MID-2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGCTCGACACATGGAGGAATAGGACTCAGCGTC
RVS-NS5a-MID-3 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGACGCACTCCATGGAGGAATAGGACTCAGCGTC
RVS-NS5a-MID-4 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGCACTGTAGCATGGAGGAATAGGACTCAGCGTC A posição dos primers em relação à sequencia de referencia H77 (genótipo 1) está entre
parênteses.
4.4. Sequenciamento de nova geração
A identificação das variantes virais seguiu o protocolo de sequenciamento de nova geração desenvolvido por nossos colaboradores (Escobar-Gutierrez, Vazquez-Pichardo et al. 2012; Fonseca-Coronado, Escobar-Gutierrez et al. 2012). As amostras positivas para anticorpos anti-HCV foram sequenciadas usando o sequenciador 454 GS Jr System (Roche Applied Sciences , Indianapolis , IN).
Nessa técnica, os produtos de PCR, ligados a adaptadores, foram amplificados por clonagem em esferas de captura em emulsão de água-em-óleo (emPCR) e em seguida sequenciados. As reações de
34
pirosequenciamento (Margulies, Egholm et al. 2005). Resumidamente, os fragmentos de PCR gerados na reação de Nested-PCR foram utilizados na emPCR utilizando-se os adaptadores do sistema 454 A e B e esferas de captura, de modo cada esfera continha uma molécula de DNA, permitindo dessa maneira a amplificação clonal dos fragmentos gerados
durante a Nested-PCR. Uma vez terminada a reação de emPCR, esferas
vazias foram removidas da mistura, restando somente as esferas a serem sequenciadas. Para o pirosequenciamento, foi usado o kit “GS Junior Titanium Sequencing Kit”, permitindo assim o sequenciamento simultâneo das amostras. As sequências lidas pelo sequenciador foram processadas utilizando-se a ferramenta NexGen Workbench v3.2.0. Sequências pertencentes a cada amostra foram identificadas e separadas pelos seus MIDs correspondentes e arquivos Fasta foram gerados para cada paciente. A limpeza dos dados foi realizada por meio do método implementado em QIIME (Caporaso, Kuczynski et al. 2010).
4.5. Análise filogenética e construção de Median Joining Networks
Apenas fragmentos cobrindo todo o comprimento do amplificon, incluindo os MIDs em ambas as extremidades, foram analisados. O alinhamento múltiplo foi realizado com o programa MAFFT v7 (Katoh and Standley 2013). Os alinhamentos otimizados foram então analisados em MEGA 5 e árvore filogenéticas construídas com o método de
Neighbor-Joining (Tamura, Peterson et al. 2011). A variação genética
intra-hospedeiro também foi analisada utilizando a análise de Median Joining
Networks (Bandelt, Forster et al. 1999), tal como implementada em
35
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41
Capítulo 2
Research paper
Multiregion deep sequencing of hepatitis C virus: An improved approach
for genetic relatedness studies
Livia Maria Gonçalves Rossia,b,⁎, Alejandro Escobar-Gutierrezb, Paula Rahala
aDepartment of Biology, Institute of Bioscience, Language and Exact Science, São Paulo State University, São José do Rio Preto, Sao Paulo, Brazil bInstituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, Mexico City, Mexico
a b s t r a c t a r t i c l e i n f o
Article history:
Received 22 November 2015
Received in revised form 23 December 2015 Accepted 24 December 2015
Available online 28 December 2015
Hepatitis C virus (HCV) is a major public health problem that affects more than 180 million people worldwide. Identification of HCV transmission networks is of critical importance for disease control. HCV related cases are often difficult to identify due to the characteristic long incubation period and lack of symptoms during the acute phase of the disease, making it challenging to link related cases to a common source of infection. Addition-ally, HCV transmission chains are difficult to trace back since viral variants from epidemiologically linked cases are genetically related but rarely identical. Genetic relatedness studies primarily rely on information obtained from the rapidly evolving HCV hypervariable region 1 (HVR1). However, in some instances, the rapid divergence of this region can lead to loss of genetic links between related isolates, which represents an important challenge for outbreak investigations and genetic relatedness studies. Sequencing of multiple and longer sub-genomic re-gions has been proposed as an alternative to overcome the limitations imposed by the rapid molecular evolution of the HCV HVR1. Additionally, conventional molecular approaches required to characterize the HCV intra-host genetic variation are laborious, time-consuming, and expensive while providing limited information about the composition of the viral population. Next generation sequencing (NGS) approaches enormously facilitate the characterization of the HCV intra-host population by detecting rare variants at much lower frequencies. Thus, NGS approaches using multiple sub-genomic regions should improve the characterization of the HCV intra-host population. Here, we explore the usefulness of multiregion sequencing using a NGS platform for genetic relatedness studies among HCV cases.
© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Hepatitis C virus Next generation sequencing Outbreak
Multiregion Genetic relatedness
1. Introduction
Globally, hepatitis C virus (HCV) affects more than 180 million people (Mohd Hanafiah et al. 2013), in addition to 3–4 million new infections per year (Alter 2007; Lavanchy 2009). HCV infection is one of the leading causes of chronic liver disease associated with end-stage cirrhosis and hepatocellular carcinoma (Lauer and Walker 2001; McHutchison and Bacon 2005).
HCV is a small single-stranded, positive polarity, enveloped virus be-longing to theHepacivirusgenus within theFlaviviridaefamily (Smith et al. 2014). The RNA viral genome (~9.6 kb in length) contains a single open reading frame encoding for a long polyprotein that upon matura-tion by enzymatic cleavage originates three structural proteins and seven non-structural proteins (Chevaliez and Pawlotsky 2006; Stanley et al. 2007). The HCV RNA replication process is highly error prone (Moradpour et al. 2007), and so far seven major HCV genotypes and several sub-types have been identified (Smith et al. 2014). Introduction of point mutations by the RNA polymerase is the primary element
contributing to the high genetic variability of HCV. The HCV mutation rate in vivo is ~ 2.5 × 10−5per nucleotide per genome replication (Ribeiro et al. 2012); however, higher estimates have also been reported (Cuevas et al. 2009).
Rapid detection of HCV outbreaks and implementation of proper disease control measures are crucial to prevent virus spread and provide adequate health care. However, HCV transmission networks are difficult to identify. The intricate patterns of HCV molecular evolu-tion and silent onset of disease complicate the recognievolu-tion of transmis-sion events (Goncalves Rossi and Rahal 2014). The hypervariable region 1 (HVR1) is generally used to characterize the HCV intra-host population (Campo et al. 2014; Forbi et al. 2014), and to detect HCV transmission by assessing the genetic relatedness of HVR1 variants among infected patients (Campo et al. 2015; Cruz-Rivera et al. 2013; Escobar-Gutierrez et al. 2013; Escobar-Gutierrez et al. 2012; Gismondi et al. 2013; Rossi et al. 2015). However, there are intrinsic limitations imposed by the use of a rapidly evolving sub-genomic region (Preciado et al. 2014; Rossi et al. 2015). Over time, genetic links can be lost due to rapid sequence divergence, impairing outbreak investigation studies (Cruz-Rivera et al. 2013). Thus, we propose that sequencing of additional sub-genomic regions might aid to restore links between
Infection, Genetics and Evolution 38 (2016) 138–145
⁎ Corresponding author.
E-mail address:liv.rossi@yahoo.com(L.M. Gonçalves Rossi).
http://dx.doi.org/10.1016/j.meegid.2015.12.020 1567-1348/© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved.
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isolates. Here, deep sequencing of the HCV HVR1 supplemented with sequences originated from the NS5A region was used to establish relat-edness among HCV cases.
2. Materials and methods
2.1. Clinical samples
HCV chronic cases, aged 34–58 years, were enrolled in this study. These patients were a sub-set of a larger cohort (Cruz-Rivera et al. 2013; Escobar-Gutierrez et al. 2012; Fonseca-Coronado et al. 2012). All patients were anti-HCV treatment-naïve reporting injection drug users (IDU) activity. Ethical review and informed consent approval were granted by the Ethical Committee of the reference laboratory in Mexico. Informed consent was obtained from all subjects. Plasma samples from all subjects were obtained and stored at−70 °C until
use. Patients' characteristics are summarized inTable 1.
2.2. Amplicon deep sequencing
The intra-host viral genetic variation in each patient was evaluated by deep amplicon sequencing of the HCV HVR1 and NS5A regions using the 454 GS Junior system. Viral RNA was extracted using the QIAamp viral RNA kit (QIAGEN, Valencia, CA), according to the manufacturer's recommendations. Extracted RNA was used as a tem-plate for the RT-PCR using the One Step RT-PCR kit (QIAGEN), and spe-cificfirst round primers recommended by the Centers for Disease Controls and Prevention (CDC) for each sub-genomic region (Ramachandran et al. 2011). Amplification of independent samples and regions was carried out under the following conditions: 50 °C for 60 min, 95 °C for 15 min, followed by 40 cycles at 95 °C for 30 s, 55 °C for 20 s, 72 °C for 60 s. Subsequently, each sample was amplified inde-pendently with fusion primers including the 454 primer key (A and B for forward and reverse primers, respectively), a multiple identifier (MID) and the specific primers (Table 2). Hybrid MID tagging was per-formed in such way that each sample was amplified with a unique com-bination of forward and reverse primers, allowing for a limited number of fusion primers (Table 3). Nested PCR reaction was carried out using 2μl of the originalfirst round PCR product as template. PCR products
were subsequently resolved and purified by agarose gel electrophoresis on SizeSelect e-gels (Invitrogen, Carlsbad, CA). The quality and quantity of individual amplicons were assessed on a 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) using a DNA 1000 kit (Agilent Technolo-gies). Purified amplicons were mixed at equimolar concentrations.
Amplicon deep sequencing was performed on a 454/Roche GS Junior in-strument (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) using the titanium chemistry (Roche Applied Science). Denoising of data sets was carried out usingflow clustering as implemented in QIIME (Caporaso et al., 2010; Quince et al., 2011).
2.3. Phylogenetic and median joining network (MJN) analyses
Only long reads covering the entire length of the amplicon, including MID at both ends, were analyzed. Multiple alignment was performed using MAFFT v7 (Katoh and Standley 2013). Sequence reads were then analyzed using the neighbor joining method as implemented in MEGA 5 (Tamura et al. 2011). Intra-host genetic variation was also analyzed using MJN analysis (Bandelt et al. 1999), as implemented in Network v4.6 (Fluxus Technology) as previously described ( Escobar-Gutierrez et al. 2013).
Table 1
Patients' characteristics. Patient
identifier
Gender Age (yr) HCV genotype Viral titer (IU/ml) Number of haplotypes HVR1 NS5A
P1 Male 40 1a 3,680,000 744 125
P2 Male 44 1a 2,090,000 67 51
P3 Male 56 1a 2,790,000 366 172
P4 Female 45 1a 7,900,000 194 128
P5 Male 58 1a 4,400,000 299 81
P6 Male 43 1a 7,190,000 28 20
P7 Female 36 1a 5,740,000 13 166
P8 Male 51 1a 7,300,000 153 92
P9 Male 57 1a 8,430,000 95 289
P10 Female 49 1a 5,230,000 713 74
P11 Male 50 1a 4,080,000 79 164
P12 Female 42 1a 9,500,000 313 55
P13 Male 53 1b 6,204,000 135 123
P14 Female 56 1b 7,860,000 1145 106
P15 Male 34 1b 8,620,000 56 42
P16 Male 37 1b 5,370,000 24 131
Table 2 Primer sequences.
First Round HVR1-F1 TGGCTTGGGATATGATGATGAACT HVR1-R1 GCAGTCCTGTTGATGTGCCA NS5A-F1 TCATAGAGGCCAACCTCCTGTG NS5A-R1 TCGACCATGACCCGTCGCTGAG 454 sequencing FWD-HVR-MID-1 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCG TGGATATGATGATGAACTGGT FWD-HVR-MID-2 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGCTCGAC AGGATATGATGATGAACTGGT FWD-HVR-MID-3 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGACGCACT CGGATATGATGATGAACTGGT FWD-HVR-MID-4 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCACTGTA GGGATATGATGATGAACTGGT RVS-HVR-MID-1 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTG CGTTTGATGTGCCAGCTGCCGTTGGTGT RVS-HVR-MID-2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGCTCGAC ATTGATGTGCCAGCTGCCGTTGGTGT RVS-HVR-MID-3 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGACGCACT CTTGATGTGCCAGCTGCCGTTGGTGT RVS-HVR-MID-4 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGCACTGTA GTTGATGTGCCAGCTGCCGTTGGTGT FWD-NS5a-MID-1 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCG TAGTGGTGATTCTGGACTCTTTCG FWD-NS5a-MID-2 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGCTCGAC AAGTGGTGATTCTGGACTCTTTCG FWD-NS5a-MID-3 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGACGCACT CAGTGGTGATTCTGGACTCTTTCG FWD-NS5a-MID-4 CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGCACTGTA GAGTGGTGATTCTGGACTCTTTCG RVS-NS5a-MID-1 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTG CGTCATGGAGGAATAGGACTCAGCGTC RVS-NS5a-MID-2 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGCTCGAC ACATGGAGGAATAGGACTCAGCGTC RVS-NS5a-MID-3 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGACGCACT CCATGGAGGAATAGGACTCAGCGTC RVS-NS5a-MID-4 CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGCACTGTA GCATGGAGGAATAGGACTCAGCGTC Table 3 Hybrid MID tags.
Forward primer
MID1 MID2 MID3 MID4
Reverse primer MID1 P1 P2 P3 P4
MID2 P5 P6 P7 P8
MID3 P9 P10 P11 P12
MID4 P13 P14 P15 P16
3. Results
3.1. Phylogenetic analysis
3.1.1. HVR1 analysis
Initially, we selected a sub-set of seven patients from our cohort from whom we have information about risk factors. Patients 1–7 were epidemiologically linked, belonging to the same IDU network. Addition-ally, nine unrelated cases, including 4 genotype 1b infected patients, were included in the study. All seven patients were HVR1 PCR positive, and genotyping showed that all strains belonged to genotype 1A. Deep sequencing was carried out targeting the HVR1 region from all seven related patients and a sub-group of non-related cases. Clean and corrected read sequences from all isolates were used to generate the
corresponding phylogenetic (Fig. 1A). Related patients did not share any HCV variants. In fact, nucleotide distances from patients 1–5 were significantly large (Table 4). As a consequence, all variants were consid-erably distant from each other (minimal distance ranging from 15 to 23), exceeding the genetic distance threshold (Campo et al. 2015), effectively preventing us from assigning any genetic link. Therefore, genetic links purely based on sequence data from HVR1 could not be established. Interestingly, patients 1–5 exhibited very large intra-host genetic variability (maximum distance ranging from 30 to 60), suggest-ing the presence of more than one viral lineage in each patient (Table 4). On the other hand, patients 6 and 7 displayed a rather homogeneous viral population (average genetic distances 3.2 and 1.8, respectively), and were not genetically close to all otherfive patients in this network (minimal distance ranging from 35 to 48).
