ERICK DE ABREU SILVEIRA
Caracterização bioquímica de leveduras industriais produtoras de etanol cultivadas em diferentes açúcares
Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. José Roberto Ernandes
Aos meus pais, Vaner e Jaqueline
Aos meus irmãos, Lucas e Letícia
E à minha noiva Mariana
Obrigado pela dedicação, pelo respeito, pelos ensinamentos e companheirismo.
Aprendi com vocês a ser dedicado e determinado.
Obrigado pela confiança de sempre.
Nunca conseguiria atingir mais este objetivo sem o apoio de vocês.
Agradecimentos
Agradeço a Deus pela força e perseverança para alcançar minhas metas.
Ao Prof. Dr. José Roberto Ernandes pela orientação e pela oportunidade de desenvolvimento profissional e também pessoal.
Aos Professores João Atílio Jorge e Rubens Monti pelas valiosas sugestões.
A CAPES pelo apoio financeiro concedido.
A UNESP pela formação profissional proporcionada.
À minha amiga Heloisy Suzes Barbosa, por quem tenho grande consideração, não somente pela ajuda na pesquisa, mas também por todos os momentos de apoio pessoal e palavras de incentivo.
A todo o pessoal do laboratório, Thiago, Rodrigo, Eliane, Stela, Susilaine, Ana Carolina, Fernanda Cupertino, Fernanda Zanoli, Tarcísio e Sandra.
À Profa. Dra Maria Célia Bertolini.
Ao Dr. Messias Miranda Júnior pelo apoio na pesquisa.
À minha noiva Mariana Araújo Costa, pela paciência, carinho, dedicação e suporte durante toda a minha vida acadêmica.
“O único lugar onde o sucesso vem antes do trabalho é no dicionário”
Dados Curriculares Erick de Abreu Silveira
1. Dados pessoais
Nascimento: 17 de maio de 1986 Nacionalidade: brasileiro
Naturalidade: Barretos - SP Estado civil: solteiro
Filiação: Vaner Silveira e Jaqueline de Abreu Silveira
Profissão: Biotecnologista
Documento de identidade: 44.663.070-6 Cadastro de pessoa física: 317.229.298-39 Endereço: Rua Dois, nº 66
CEP: 14781-347 Barretos - SP
Endereço profissional: Instituto de Química de Araraquara - UNESP Departamento de Bioquímica e Tecnologia Química
Rua Prof. Francisco Degni nº 55 CEP: 14800-900 - Araraquara – SP
2. Formação acadêmica
Bacharel em Biotecnologia, concluído em 2010, Universidade Federal de Alfenas – UNIFAL-MG, Alfenas-MG.
3. Atividades de pesquisa
3.1. Trabalhos apresentados em congressos
Silveira, E.A.; Barbosa, H.S.; Ernandes, J. R. Caracterização Bioquímica De Leveduras Industriais Produtoras De Etanol Cultivadas Em Diferentes Açúcares.
XXI Congresso Latinoamericano de Microbiologia e I SIFEA - Simpósio de
Fermentação Alcoólica – SANTOS-SP (2012).
Silveira, E.A.; Barbosa, H.S.; Ernandes, J. R. Caracterização Bioquímica de Invertases de Leveduras Industriais Produtoras de Etanol Combustível.
III Jornada de Biotecnologia – UNIFAL-MG (2012).
Silveira, E.A.; Barbosa, H.S.; Ernandes, J. R. Caracterização Eletroforética de Invertases de Leveduras Industriais Produtoras de Etanol Combustível.
III Jornada de Biotecnologia – UNIFAL-MG (2012).
Silveira, E. A.; Albino, B. E. S; Martins, J. P. R.; Batista, T. R.; Paiva, R.; Polo, M.; Barbosa, S.; Santos, B. R. Enraizamento in vitro de brotações e aclimatização de plântulas de pequizeiro (Caryocar brasiliense Camb.).
Jornada De Iniciação Científica Da UNIFAL-MG (2008).
3.2. Participação em congressos, simpósios e demais eventos científicos
XXI Congresso Latinoamericano de Microbiologia 2012. (Congresso).
SIFEA - Simpósio de Fermentação Alcoólica. 2012. (Simpósio).
III Jornada de Biotecnologia - III JOBITU. 2012. (Outra).
I SIMPÓSIO SULMINEIRO DO MAROLO E FRUTOS DO CERRADO. 2009. (Simpósio).
I SEMANA DE BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL: "Inovações e perspectivas da Biotecnologia Industrial no Brasil". 2009. (Outra).
XVII Congresso de Pós-graduação da UFLA, I Encontro de Engenharia de Sistemas e IV Workshop de Laser e Óptica na Agricultura. 2008. (Congresso).
I JOBITU - I Jornada Científica de Biotecnologia de Alfenas. 2008. (Outra).
Jornada De Iniciação Científica Da Unifal-Mg. 2008. (Outra).
Reforma Universitária. 2007. (Seminário).
III Seminário sobre Rotas Tecnológicas da Biotecnologia: Oportunidades de Investimentos e Inovações no Brasil. 2007. (Seminário).
I Ciclo de Palestras em Biotecnologia. 2007. (Outra).
3.3. Organização de eventos
Barbosa, S.; Silveira, E. A.; Ariosa, M. F. C.; Marques, M. J. Primeira JOBITU - Primeira Jornada Científica de Biotecnologia de Alfenas. 2008.
RESUMO
Para o aprimoramento do processo industrial de produção de bioetanol, é fundamental o conhecimento da bioquímica e fisiologia dos microrganismos envolvidos. Assim, este estudo tem o objetivo de obter informações bioquímicas de leveduras industriais, principalmente ao que se refere à hidrólise da sacarose e
maltose pela enzima invertase (β-frutofuranosidase, EC 3.2.1.26) e maltase (α
-glicosidase, EC 3.2.1.20) respectivamente. As linhagens industriais Ethanol RedTM
(Fermentis/Lasaffre - linhagem francesa) PE-2, SA-1, CAT-1 e BG (linhagens brasileiras) foram cultivadas em meios contendo diferentes fontes de carbono (sacarose, glicose, frutose, maltose e galactose), suplementados com peptona e extrato de levedo, e avaliadas com relação a produção de biomassa, consumo da fonte de carbono, viabilidade celular e níveis de atividade invertásica e maltásica. Resultados mostraram que todas as linhagens apresentam crescimento rápido e intenso em sacarose, glicose e frutose, porém apresentam comportamento diferente em meios contendo maltose e galactose. Todas as linhagens crescem lentamente
em galactose. Ethanol RedTM é mais adaptada para o crescimento em maltose do
que as linhagens brasileiras PE-2 e SA-1. As outras linhagens brasileiras (CAT-1 e BG) não crescem em maltose devido à ausência de atividade maltásica. Com relação aos níveis de atividade invertásica, foi identificada a presença de três
categorias de linhagens: uma com altos níveis de atividade (Ethanol RedTM), outra
com níveis mais baixos (PE-2, CAT-1), e uma terceira categoria com atividade intermediária entre estas duas primeiras categorias (SA-1 e BG). Além do valor acadêmico, os resultados obtidos têm importância aplicada na medida em que indicam que as linhagens industriais produtoras de etanol combustível apresentam diferentes características fisiológicas, que podem ser exploradas para aperfeiçoar o processo de fermentação alcoólica.
Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae. Invertase. Fermentação. Fontes de
ABSTRACT
For the improvement of the industrial ethanol fuel-producing process, it is crucial to understand the biochemistry and physiology of the microorganisms involved. This study aims to obtain biochemical information of industrial yeasts, especially when it refers to the hydrolysis of sucrose and maltose by the enzyme
invertase (β-frutofuranosidase, EC 3.2.1.26) and maltase (α-glicosidase, EC
3.2.1.20) respectively. The industrial strains Ethanol RedTM (Fermentis/Lasaffre -
French strain) PE-2, SA-1, CAT-1 and BG (Brazilian strains) were cultured in media containing different carbon sources (sucrose, glucose, fructose, maltose and galactose) supplemented with peptone and yeast extract, and evaluated relative to biomass production, carbon source consumption, cell viability and levels of invertase and maltase activities. Results showed that all strains exhibit rapid and intense growth in presence of sucrose, glucose and fructose, but they have differing behavior in media containing maltose and galactose. All strains grow slowly on galactose.
Ethanol RedTM is more adapted for growing in maltose than Brazilian PE-2 and
CAT-1. The remaining Brazilian strains (BG and CAT-1) do not grow in maltose, due to the absence of maltase activity. As far as the levels of invertase activity is concerned, three categories of strains have been identified: with high activity levels (Ethanol
RedTM), with lower levels (PE-2, CAT-1), and a third category with intermediate
activity levels between these first two categories (SA-1 and BG). Besides academic value, the results obtained have applied significance in indicating that industrial ethanol fuel-producing strains exhibit different physiological characteristics that can be exploited to improve the fermentation process.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fotomicrografia da levedura Saccharomyces cerevisiae. ... 20
Figura 2 - Representação das vias de utilização de açúcares por S. cerevisiae. ... 23
Figura 3 - Mecanismo de reação catalisada pela invertase. ... 25
Figura 4 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem Ethanol RedTM em meio YNB. ... 38
Figura 5 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem Ethanol RedTM em meio YP. ... 39
Figura 6 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem PE-2 em meio YNB. ... 41
Figura 7 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem PE-2 em meio YP. ... 42
Figura 8 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem SA-1 em meio YNB. ... 44
Figura 9 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem SA-1 em meio YP. ... 45
Figura 10 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem CAT-1 em meio YNB. . 47
Figura 11 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem CAT-1 em meio YP. .... 48
Figura 12 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem BG em meio YNB. ... 50
Figura 13 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem BG em meio YP... 51
Figura 14 - Atividade invertásica específica para as cinco linhagens em estudo para o primeiro ciclo, durante fermentação em condições de VHGF (Very High Gravity Fermentation Technology). ... 57
Figura 15 - Atividade invertásica específica para as cinco linhagens em estudo para os dez ciclos, durante fermentação em condições de VHGF (Very High Gravity
Fermentation Technology). ... 58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Algumas propriedades da invertase. ... 26
Tabela 2 - Tempo de cultivo, em horas, para consumo de 50% da fonte de carbono. ... 52
Tabela 3 - Biomassa, em mg/mL, após 10h de cultivo. ... 54
Tabela 4 - Intensidade de repressão catabólica. ... 54
Tabela 5 - Atividades invertásicas específicas em meio YNB. ... 55
Tabela 6 - Atividades invertásicas específicas em meio YP. ... 55
Tabela 7 - Atividades invertásicas em função dos passos de purificação. ... 62
LISTA DE ABREVIATURAS
DNS - ácido 3,5-dinitrosalicílico. g - gramas.
h - horas.
M – molar (mols/L). mg - miligramas. min - minutos. mL - mililitros.
ηm - nanômetros.
rpm - rotações por minuto.
Ethanol RedTM, PE-2, SA-1, CAT-1 e BG - linhagens de Saccharomyces cerevisiae.
YP - meio contendo extrato de levedo e peptona. YNB - yeast nitrogen base.
VHGF – Very High Gravity Fermentation µL - microlitros.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 18
1.1. Saccharomyces cerevisiae ... 19
1.2. Fonte de Carbono ... 21
1.3. Fonte de Nitrogênio ... 23
1.4. Invertase e Maltase ... 24
2. OBJETIVOS ... 28
2.1. Objetivo geral ... 29
2.2. Objetivos específicos ... 29
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 31
3.1. Microrganismos utilizados ... 31
3.2. Manutenção da cultura e preparo do inóculo ... 31
3.3. Meios de cultivo e condições de crescimento ... 31
3.4. Determinação dos parâmetros fermentativos ... 32
3.4.1. Determinação da produção de biomassa ... 32
3.4.2. Determinação da viabilidade celular ... 32
3.4.3. Determinação do consumo da fonte de carbono ... 33
3.4.4. Determinação dos níveis de atividade invertásica das leveduras íntegras ... 33
3.5. Extração e purificação parcial das enzimas invertase e maltase ... 33
3.6. Dosagem de proteínas totais ... 34
3.7. Atividades específicas das enzimas extraídas ... 34
3.7.1. Atividade invertásica ... 34
3.7.2. Atividade maltásica ... 34
3.8. Atividade inulinásica ... 35
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 37
4.2. Determinação da atividade invertásica durante fermentação em meios
concentrados em sacarose ... 56
4.2.1. Experimentos com meio sintético e sacarose 30% (p/v) ... 56
4.2.2. Experimentos com mosto industrial e sacarose 21% (p/v) ... 59
4.3. Estudos com maltose ... 60
4.4. Purificação parcial das invertase(s) e maltase ... 61
4.5. Estudo da atividade inulinásica em leveduras industriais ... 63
5. CONCLUSÕES ... 65
18
1. INTRODUÇÃO
Logo após a primeira crise do petróleo em 1973, o Brasil investiu fortemente no Plano Nacional do Álcool (PROÁLCOOL) - criado em 14 de novembro de 1975 - o que figurava uma tentativa de fomentar a produção do etanol, uma fonte de energia sustentável a qual minimizaria o impacto do aumento do preço do petróleo. De fato, atualmente, um dos maiores desafios mundiais é a busca de alternativas ao petróleo, combustível fóssil, com reserva em declínio, altamente poluente e com preços voláteis. A busca de alternativas para combustíveis derivados de petróleo tem aumentado a fim de reduzir a dependência mundial dos recursos não renováveis. A segurança energética e as mudanças climáticas requerem uma
substituição em larga escala dos combustíveis a base de petróleo (FARRELL et al.,
2006).
O etanol produzido no Brasil é obtido por fermentação de açúcares contidos no mosto de cana-de-açúcar, tendo como principais características a alta densidade celular, curto tempo de fermentação e reciclo das leveduras. Atualmente, nas usinas, trabalha-se com mosto que apresentam em torno de 21% de sólidos solúveis, produzindo um vinho com baixa quantidade de etanol, induzindo a um grande consumo de energia na destilação e gerando grandes volumes de vinhaça. A obtenção de altos níveis de etanol poderia ser feita através da utilização da tecnologia de fermentações de mostos concentrados em açúcares, processo conhecido na literatura internacional como “Very High Gravity Fermentation” (VHGF)
(PULIGUNDLA et al., 2011), que permite a obtenção de vinhos com concentrações
de etanol variando de 19 a 21% (v/v) (THOMAS e INGLEDEW, 1990). A aplicação da VHGF, ou seja, a utilização de substratos concentrados em açúcar para a produção industrial de etanol tem uma série de benefícios, incluindo: diminuição da processo necessidades de água e energia, aumento global da produtividade da planta industrial e maiores concentrações de etanol no produto de fermentação que permite uma considerável economia de energia para a etapa destilação (WANG et
al., 2007). Entretanto, processos industriais sob estressantes condições de
específico. (PEREIRA et al., 2010). Um dos passos limitantes do processo de
produção de altos níveis de bioetanol é a resposta fisiológica da levedura
Saccharomyces cerevisiae frente a altas concentrações de açúcares presentes no
meio, além da tolerância limitada a temperaturas e a concentrações mais elevadas de etanol.
Enquanto que os genes codificadores das enzimas da via glicolítica e vários
outros foram conservados durante a evolução da S. cerevisiae, os mecanismos que
controlam a metabolização das diferentes fontes de carbono podem variar de acordo com as características genéticas e fisiológicas de deferentes linhagens industriais. Com isto, estudos realizados para caracterizar a utilização de açúcares são importantes do ponto de vista biotecnológico e econômico, permitindo desenvolver estratégias de forma a incrementar o desempenho das linhagens de levedura, tanto por modificações na condução do processo industrial, quanto desenvolvendo leveduras que possuam as características desejadas para cada setor industrial
(FEREA et al., 1999; IHMELS et al., 2005; LANDRY et al., 2006; PFEIFFER et al.,
2001; QUEROL et al., 2003).
1.1. Saccharomyces cerevisiae
A levedura Saccharomyces cerevisiae (figura 1) é um dos eucariotos mais
20
Figura 1 - Fotomicrografia da levedura Saccharomyces cerevisiae.
Fonte: Miranda Júnior, 2008.
Em todos os processos industriais em que se utiliza a levedura
Saccharomyces cerevisiae os meios de cultivo devem conter necessariamente uma
fonte de nitrogênio, uma fonte de carbono, além de sais e vitaminas (HORAK, 1997). Por esse motivo, os principais nutrientes utilizados pelas leveduras, quanto à quantidade, são o carbono e nitrogênio. Isso implica que os fluxos de carbono e nitrogênio tanto quanto suas interações constituem parâmetros importantes na regulação do crescimento celular (HORAK, 1997). As coordenações dos fluxos de carbono e nitrogênio podem ser reguladas na assimilação ou no metabolismo, dependendo das condições de crescimento e da natureza da fonte de carbono e
nitrogênio (TER SCHURE et al., 1995; SCHNEPER et al., 2004).
No caso de leveduras e outros microrganismos eucariotos, o transporte celular é o primeiro passo para a utilização dos nutrientes, o qual é regulado por uma resposta intracelular precisa e também por mudanças do ambiente extracelular. Devido à complexidade dos sistemas de transporte e dos mecanismos de controle celular, recentemente vários estudos estão sendo realizados com o objetivo de elucidar estes mecanismos (JAUNIAUX e GRENSON, 1990; HORAK, 1997;
BEESER e COOPER, 1999; WILES et al., 2006).
(“Repressão Catabólica do Carbono”) ou pela fonte de nitrogênio (“Repressão Catabólica do Nitrogênio”), os quais impõem à levedura um seqüência ordenada de utilização de fontes de carbono e de nitrogênio. Além dessas vias de regulação, existem outras de sinalização e de sensoriamento de nutrientes em leveduras, além de ocorrer integração de várias vias de regulação envolvendo aquelas descritas para o carbono e outras para o nitrogênio, criando um quadro complexo de regulação e sinalização (THEVELEIN, 1994; GANCEDO, 1998; GASCH e
WERNER-WASHBURNE, 2002; SCHNEPER et al., 2004; PETER et al., 2006).
1.2. Fonte de Carbono
Os principais compostos utilizados como fonte de carbono são os monossacarídeos (glicose, frutose e galactose) ou dissacarídeos (maltose e sacarose). Quando a levedura é cultivada em meio contendo uma mistura de glicose e outros açúcares como sacarose, maltose ou galactose, o metabolismo é diáuxico, ou seja, a glicose é preferencialmente utilizada, enquanto que os outros açúcares somente serão metabolizados quando após a exaustão da glicose. Este comportamento diáuxico ocorre devido ao fenômeno de repressão catabólica, ou
repressão exercida pela glicose (DYNESEN et al., 1998; GANCEDO, 1998). A
substituição, redução ou remoção da glicose do meio de cultura provoca uma importante alteração fisiológica em conseqüência a alterações genômicas nas
leveduras (PETER et al., 2006). Além da glicose, outros açúcares fermentescíveis
como a frutose e a manose também desencadeiam o processo de repressão
catabólica. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, a repressão pela glicose regula
a expressão dos genes envolvidos com a produção de enzimas necessárias para o metabolismo da sacarose, maltose e galactose, e também das enzimas da
gliconeogênese e da cadeia respiratória (DYNESEN et al., 1998; PETER et al.,
2006). Em leveduras, a regulação das enzimas submetidas ao controle da repressão catabólica é complexa e além do controle da expressão gênica, envolve também o fenômeno de inativação catabólica e o nível da atividade enzimática (HOLZER, 1976; THEVELEIN, 1994; GANCEDO, 1998).
As vias bioquímicas de fermentação de açúcar pelas leveduras são bem
estabelecidas e foram estudadas em grande detalhe (HORAK, 1997; Berthels et al.,
22
(Hxt) na membrana plasmática. Hxt6 e Hxt7 são transportadores de alta afinidade, e Hxt1 e Hxt3 são transportadores de baixa afinidade. Existem vários outros transportadores Hxt com afinidade intermediária, porém não está bem estabelecido que esses transportadores contribuam para o transporte de açúcares (OZCAN e
JOHNSTON, 1999; BERTHELS et al., 2008).
Muitas das aplicações industriais de leveduras Saccharomyces dependem da
fermentação eficiente de sacarose ou dos hidrolisados de amido ricos em α
-glicosídeos maltose e maltotriose, inclusive glicose (DEVANTIER et al., 2005). Na
indústria cervejeira, por exemplo, estes dois açúcares são de especial importância uma vez que são os açúcares predominantes no mosto (tipicamente 50-60% é maltose, maltotriose é de 15-20%), seguido pela glicose (10-15%) e outros
carboidratos minoritários (ERNANDES et al., 1993). Destes açúcares, a glicose é
preferencial e rapidamente utilizada por células de levedura, mas tanto a eficiência do processo e qualidade do produto requerem a utilização completa de todos os açúcares, incluindo maltose e maltotriose. Embora maltose seja facilmente fermentada pela maioria das linhagens de levedura, ela só ocorre após o exaustão da glicose. Maltotriose não é somente o açúcar menos preferido para a absorção
pelas células de Saccharomyces, mas muitas leveduras podem não usar este α
-glicosídeo (ZHENG et al., 1994b; YOON et al., 2003 apud DUVAL et al., 2010).
Algumas leveduras possuem transportadores de sacarose. A análise da
captação direta da sacarose por Saccharomyces cerevisiae revelou a presença de
um co-transporte de sacarose-H+ (MWESIGYE e BARFORD, 1996; SANTOS et al.,
1982), que de acordo com STAMBUK e colaboradores (1999), é mediado pela permease Agt1 (figura 2). Desta forma, as linhagens não necessitam hidrolisar a sacarose extracelularmente para metabolizá-la, ou seja, a sacarose é levada para o
interior da célula através de um co-transporte com prótons H+ onde é hidrolisada
pela invertase intracelular, liberando moléculas de glicose e frutose que serão
Figura 2 - Representação das vias de utilização de açúcares por S. cerevisiae.
Fonte: Salvato, 2010.
Portanto, duas vias de utilização da sacarose são conhecidas na levedura S.
cerevisiae: pela ação da invertase extracelular a sacarose é hidrolisada em glicose e
frutose, sendo seus produtos de hidrólise transportados para o interior da célula através da difusão facilitada via transportadores de hexoses e fermentados, ou alternativamente por transporte ativo onde a sacarose pode ser captada diretamente através do co-transporte com H+ e hidrolisada pela invertase intracelular (BADOTTI
et al., 2006; BATISTA et al., 2005; MWESIGYE e BARFORD, 1996; ORLOWSKI e
BARFORD, 1991).
1.3. Fonte de Nitrogênio
24
nitrogenados mais complexos, como proteínas, por S. cerevisiae só ocorrem após
sua hidrólise a aminoácidos simples, dipeptídeos ou tripeptídeos.
Para selecionar a melhor opção de utilização de nutrientes frente à ampla diversidade de fontes de carbono e nitrogênio, as leveduras desenvolveram mecanismos de sensoriamento, sinalização e regulação, que incluem processos de indução e repressão de vias metabólicas de utilização destes nutrientes (GANCEDO,
1998; THEVELEIN, 1994; SCHNEPER et al., 2004). Como as fontes de carbono e
nitrogênio são os principais nutrientes presentes em mosto para a produção de cerveja e vinho, sugere-se que as interações mútuas desses nutrientes podem ter
efeitos importantes no metabolismo de leveduras (SCHNEPER et al., 2004; PETER
et al., 2006).
Nem todas as fontes de nitrogênio propiciam crescimento igualmente eficiente: a glutamina juntamente com o glutamato, o amônio e a asparagina são considerados fontes primárias de nitrogênio, portanto, a presença destes nutrientes no meio de cultura controla a atividade das permeases, e por isso são utilizados preferencialmente. O mecanismo no qual ocorre o controle do transporte está envolvido na repressão da síntese da permease e na inativação reversível da mesma (JAUNIAUX; GRENSON, 1990). Quando essas fontes primárias estão limitadas ou próximas da exaustão, o organismo pode expressar seletivamente genes cujos produtos permitem utilizar muitas outras fontes de nitrogênio
secundárias, incluindo outros aminoácidos, peptídeos e proteínas (HORAK, 1986). A
utilização de aminoácidos como fonte de nitrogênio envolve inicialmente seu transporte para o interior da célula, onde pode ser utilizado diretamente na síntese
de proteínas e/ou doando seu derivado α-cetoácido após a desaminação enzimática
para outros processos metabólicos. Assim, glutamato, glutamina e amônio
desempenham funções essenciais no metabolismo central de nitrogênio (TER
SCHURE et al., 2000).
1.4. Invertase e Maltase
invertase favoreceu seu uso como enzima modelo para estudos de catálise enzimática. No século XX teve início a sua comercialização, sendo uma enzima versátil que pode ser utilizada em diversos processos industriais. Também
conhecida como β–D frutofuranosidase, a invertase hidrolisa a ligação glicosídica
(tipo α-β) de carboidratos possuidores de um radical β-fructofuranosil não
substituído, sendo a sacarose o substrato preferencial. Seu nome comum, invertase, deve-se ao fato de que a hidrólise da sacarose leva à inversão da rotação óptica do meio reacional, basicamente em conseqüência do surgimento de frutose, quando observado em polarímetro. O mecanismo de reação é baseado no esquema abaixo (Figura 3):
Figura 3 - Mecanismo de reação catalisada pela invertase.
Esta reação catalítica, geralmente ocorre em pH entre 4,6 e 5,0 e temperatura entre 35ºC e 50ºC, com concentração de substrato da ordem de 120g/l. Acima desta concentração a solução de sacarose tem a viscosidade aumentada reduzindo a atividade enzimática na presença de água (VITOLO; BORZANI, 1983). O produto final da hidrólise da sacarose são os monossacarídeos glicose e frutose. Existem diferentes isoformas de invertases que diferem quanto ao seu pH ótimo de atividade, podendo ser ácidas, neutras e alcalinas. As formas ácidas têm sido encontradas no vacúolo, ao passo que as neutras e alcalinas no citoplasma. Estas diferenças não estão esclarecidas, mas parecem estar relacionadas com a entrada da sacarose em diferentes vias de utilização.
De forma geral, a síntese de invertases em leveduras é controlada por uma
família de genes SUC (SUC1 a SUC5 e SUC7) (NAUMOV et al., 1996 apud
26
celular e associada a manana (carboidrato polimérico) – extracelular ou periplasmática - e a forma intracelular localizada no citoplasma e não associada a carboidrato polimérico. Porém, a enzima destinada à parede celular, apresenta uma seqüência de aminoácidos que as encaminha para o retículo endoplasmático, onde ocorre a glicosilação. Após a invertase extracelular ser glicosilada, ela é armazenada em vesículas no Complexo de Golgi sendo finalmente liberada no espaço periplásmico durante a gemulação (reprodução assexuada da levedura) (PERLMAN; HALVORSON, 1981).
Algumas propriedades da invertase interna e externa estão apresentadas na tabela 1:
Tabela 1 - Algumas propriedades da invertase.
Propriedade
Invertase externa
Invertase interna
Massa molecular (Da) 270.000 135.000
% carboidrato 50 3
Atividade específica U/mg de proteína 2700 2900
pH estabilidade 3,0 - 7,5 6,0 - 9,0
pH ótimo - atividade 3,5 - 5,5 3,5 - 5,5
U = micromol de sacarose hidrolisada por minuto Fonte: GÁSCON, 1981 apud SALVATO, 2010.
A atividade invertásica de células de leveduras é oscilante. Vitolo e Borzani
(1983) estudaram a atividade de invertase de células de S. cerevisiae em melaço de
cana e concluíram que durante o cultivo contínuo de leveduras a parede celular e o espaço periplasmático são submetidos às mudanças morfológicas contínuas, as quais afetam a interação entre a invertase e moléculas de sacarose, induzindo a oscilação da atividade invertásica.
A maltose é outro dissacarídeo de importância industrial. Utilização deste α
-glicosídeo exige o transporte ativo do açúcar através da membrana plasmática, feito
pela permease de maltose e a sua hidrólise subsequente por uma α-glicosidase
citoplasmáticas (maltase), proteínas induzidas pela presença de maltose. As análises genética e bioquímica da fermentação de maltose por células de levedura
telômeros: MAL1 (cromossomo VII), MAL2 (cromossomo III), MAL3 (cromossomo II),
MAL4 (cromossomo XI) e MAL6 (cromossomo VIII). Cada lócus contém pelo menos
uma cópia de três genes diferentes que codificam uma maltose-permease (MALx1,
onde x representa um dos cinco loci, por exemplo, MAL11 é a permease no locus
MAL1 no cromossomo VII), uma maltase (MALx2) e uma proteína reguladora
positiva (MALx3), que induz a transcrição de dois outros genes, na presença de
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
O objetivo deste trabalho é dar continuidade ao estudo do desempenho fermentativo de leveduras industriais produtoras de etanol combustível, verificando condições que possam permitir o aprimoramento do processo de produção do bioetanol, principalmente no que se refere à obtenção de vinhos com maiores conteúdos de etanol, através da fermentação de mostos com alta concentração de sacarose. Neste projeto, inserido no contexto da linha de pesquisa proposta, tem-se como foco maior a caracterização bioquímica de leveduras industriais produtoras de etanol combustível, e o estudo das enzimas invertase e maltase destas leveduras.
2.2. Objetivos específicos
- Caracterização bioquímica de leveduras industriais Ethanol RedTM, PE-2, SA-1,
CAT-1 e BG, produtoras de etanol combustível, através do crescimento em diferentes mono e dissacarídeos;
- Determinar as atividades invertásica e maltásica das linhagens de leveduras submetidas a diferentes condições de crescimento e fermentação, analisando o efeito da complementação nutricional do meio de cultura com diferentes fontes de nitrogênio na secreção das atividades enzimáticas;
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular de Microrganismos do Departamento de Bioquímica e Tecnologia Química do Instituto de Química de Araraquara da Universidade Estadual Paulista – UNESP.
3.1. Microrganismos utilizados
Foram utilizadas 5 linhagens industriais de levedura Saccharomyces
cerevisiae: Ethanol RedTM (gentilmente cedida pela empresa Fermentis/Lasaffre),
PE-2 (Usina da Pedra), SA-1 (Usina Santa Adélia), CAT-1 (Usina de Catanduva) e BG (Usina da Barra Grande) isoladas em diferentes unidades produtoras de etanol
combustível (BASSO et al., 2008), e comercializadas pela empresa LNF Latino
Americana.
3.2. Manutenção da cultura e preparo do inóculo
As culturas estoques de células leveduriformes foram mantidas em meio YPD ágar contendo 1,0% (p/v) de extrato de levedo, 2,0% (p/v) de peptona, 2,0% (p/v) de glicose, 2,0% (p/v) de ágar. Após incubação por 48 horas a 30 ºC, as culturas foram armazenadas a 4 ºC, sendo utilizadas no máximo após 10 dias.
3.3. Meios de cultivo e condições de crescimento
32
Além dos estudos com meios de cultivo com baixa concentração de açúcar (acima descritos), também foram feitos experimentos com leveduras em condições de VHGF (Very High Gravity Fermentation Technology), nas quais as linhagens são submetidas à fermentações em meio sintético YPSac contendo 1% (p/v) de extrato de levedo, 1% (p/v) de peptona e 30% (p/v) de sacarose, com alta concentração e reciclo de células, por 10 ciclos consecutivos, com duração de 10 horas/ciclo. Para este experimento, foi realizado pré-inóculo YPSac contendo 1% (p/v) extrato de levedo, 1% (p/v) peptona e 10% (p/v) de sacarose. Condições de cultivo: agitação de 250 rpm, a 30 ºC e pH inicial de 5,0, fermentação por 10 ciclos consecutivos, com duração de 10 horas/ciclo
Por fim, também foram realizados experimentos com mosto industrial de cana-de-açúcar ajustado para 21% de sacarose em que também foram mantidas as condições de cultivo e de pré-inóculo acima descritas para ensaios em VHGF.
3.4. Determinação dos parâmetros fermentativos
3.4.1. Determinação da produção de biomassa
O acompanhamento do crescimento celular foi feito através de medidas turbidimétricas a 570 nm, de uma suspensão de células com diluição conhecida, relacionando-a com a massa celular, através da seguinte equação:
[células] (mg/mL) = ∆A570 x Diluição x f
onde f, fator de conversão de absorbância em massa seca, para a levedura S.
cerevisiae é 0,6711 ± 0,0469. O fator f foi determinado a partir da medida de
absorbância de suspensões com diferentes concentrações de células comparada com a massa seca obtida após a secagem a 100 ºC de 1 mL de cada suspensão filtrada em membrana Milipore por duas horas.
3.4.2. Determinação da viabilidade celular
A determinação da viabilidade celular foi rotineiramente realizada através do
3.4.3. Determinação do consumo da fonte de carbono
Foi realizada a medição de consumo de açúcar utilizando o método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) (MILLER, 1959), que se baseia no poder redutor de açúcares, originando um composto colorido que absorve em 546 nm.
3.4.4. Determinação dos níveis de atividade invertásica das leveduras íntegras
A atividade da invertase, enzima envolvida na hidrolise de sacarose e produzindo de açúcares redutores, foi determinada com base no procedimento descrito por (VITOLO; BORZANI, 1983), no qual células intactas, separadas do meio de crescimento por centrifugação, foram lavadas com solução de NaCl 0,85% e ressuspensas em tampão acetato de sódio 50 mM e pH 4,6. Este procedimento mede a quantidade de açúcares redutores liberados da sacarose pela ação da invertase de parede, usando o método do DNS.
3.5. Extração e purificação parcial das enzimas invertase e maltase
Para a purificação parcial da(s) invertase(s), inicialmente, foi preparado um lisado celular através da maceração das leveduras com nitrogênio líquido e o tampão de extração utilizado foi tampão acetato de sódio 50 mM e pH 4,6. Posteriormente procedeu-se a diálise do lisado contra tampão acetato de sódio 5 mM e pH 4,6, por 24 horas, em membrana de celulose Sigma (Dialysis Tubing Cellulose D9652 - 100FT). A etapa final da purificação parcial foi realizada através da uma precipitação com acetona, à frio, na proporção de 3 volumes de acetona para 1 volume de dialisado (3:1).
Já para a maltase, a única diferença foi a utilização de o tampão de extração foi o fosfato de sódio 0,1 M e pH 7,0, em vez de tampão acetato, e a diálise foi feita contra tampão fosfato de sódio 10 mM e pH 7,0.
34
3.6. Dosagem de proteínas totais
A dosagem de proteínas foi realizada sempre após as etapas de extração,
diálise e de precipitação através do método de (LOWRY et al., 1951) modificado por
(HARTREE, 1972).
3.7. Atividades específicas das enzimas extraídas
3.7.1. Atividade invertásica
A atividade invertásica específica também foi determinada através do método de DNS e foi expressa em unidades de atividades/mg de proteínas, em que uma
unidade enzimática foi definida como a quantidade de enzima que libera 1µmol de
açúcar redutor por minuto.
Foi preparada uma solução de sacarose 10% (p/v) em solução acetato de
sódio 50 mM e pH 4,6. A reação foi iniciada adicionando-se 100 µL de suspensão de
células de leveduras, devidamente diluídas ou concentradas, em 4 mL de solução de
sacarose. Alíquotas de 100 µL do meio de reação foram retiradas no tempos 0, 5, 10
e 15 minutos e a reação paralisada com 100 µL de reagente de DNS. Seguiu-se
para a fervura das amostras durante 5 minutos e, após resfriamento em banho de gelo, adicionou-se 1 mL de água destilada e, por fim, foi realizada a leitura em
espectrofotômetro a 546 ηm.
3.7.2. Atividade maltásica
A atividade maltásica específica foi determinada através da utilização de kit enzimático comercial PAP liquiform (Labtest, Brasil), baseado na atuação da enzima glicose oxidase, e foi expressa em unidades de atividades/mg de proteínas, em que
uma unidade enzimática foi definida como a quantidade de enzima que libera 1µg de
açúcar redutor por minuto.
Foi preparada uma solução de maltose 2% (p/v) em solução fosfato de sódio
0,1 M e pH 7,0. A reação foi iniciada adicionando-se 50 µL de extrato (ou dialisado
concentrado, em 500 µL de solução de maltose. Alíquotas de 100 µL foram retiradas
no tempos 0, 5, 10 e 15 minutos e a reação imediatamente paralisada com fervura. Seguiu-se ao resfriamento em banho de gelo, adicionou-se 1 mL de solução
enzimática do kit PAP Liquiform e deixou-se em banho a 37 oC por 15 minutos. Por
fim, foi realizada a leitura em espectrofotômetro a 505 ηm.
3.8. Atividade inulinásica
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Crescimento das linhagens industriais em diferentes açúcares
Os gráficos apresentados nas figuras de 4 a 13 mostram vários parâmetros fermentativos, como a produção de biomassa, a viabilidade celular, o perfil de consumo da fonte de carbono e da atividade invertásica específica das diferentes
linhagens de Saccharomyces cerevisiae, durante o crescimento aeróbico em meio
contendo 2% (p/v) de açúcar. Nas tabelas de 2 a 6 são apresentados dados adicionais para destacar alguns aspectos relacionados com os estudos realizados, principalmente, os que se referem aos níveis de atividade invertásica desenvolvidos pelas diferentes linhagens e ao crescimento diferenciado em maltose e galactose.
Nos estudos realizados com fonte de carbono 2% (p/v), verifica-se a ocorrência de diauxia: inicialmente a levedura utiliza o carboidrato para crescer e produzir etanol, e após a exaustão do carboidrato, o etanol é utilizado como fonte de carbono.
Para os experimentos realizados com a linhagem Ethanol RedTM, (figuras 4 e
38
esperado, é mais intensa quando o carboidrato disponível é a glicose, frutose ou sacarose (tabela 4).
Meio YNB – Ethanol RedTM
Figura 4 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem Ethanol RedTM em meio YNB.
0 2 4 6 8 10 0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24 0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24 0 10 20 30 40 50 60 70 D C B A A B io m as sa ( m g/ m L) A çu ca r re si du al V ia bi lid ad e ce lu la r (% ) Tempo (h) A tiv id ad e in ve rt as ic a (U /m g de L ev ed ur a) Tempo (h)
Meio YP – Ethanol RedTM
Figura 5 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem Ethanol RedTM em meio YP.
0 2 4 6 8 10 12 14 0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24 0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24 0 10 20 30 40 50 60 70 80 D C B A B io m as sa ( m g/ m L) A çu ca r re si du al ( % ) Tempo (h) V ia bi lid ad e ce lu la r (% ) A tiv id ad e in ve rt as ic a (U /m g de L ev ed ur as ) Tempo (h)
40
Para a linhagem PE-2, também se verifica a ocorrência de diauxia, com maior evidência nos gráficos, em ambos os meios YP e YNB contendo sacarose, glicose, frutose ou galactose. A produção de biomassa por essa linhagem é aproximadamente igual no meio YP, para todas as fontes de carbono, mas diferentes em YNB. Quando o carboidrato disponível é a maltose, o crescimento é mais lento, indicativo da dificuldade desta linhagem em utilizar maltose. Em todos os experimentos a viabilidade se manteve elevada. Nos meios contendo glicose, frutose e sacarose o acúmulo de biomassa e consumo de açúcar ocorreram de forma mais rápida, indicando a adequação do metabolismo destas linhagens a estes açúcares. No meio com galactose e maltose, o consumo dos açúcares e crescimento foram mais lentos quando comparados ao observado em glicose, frutose e sacarose, e a utilização da maltose é ainda mais lenta do que a da galactose. Com relação à atividade invertásica específica desenvolvida por essa linhagem, há uma tendência de valores constantes e relativamente baixos ao final da fermentação em ambos os meios (Figuras 6 e 7), quando comparados com os valores obtidos pela linhagem
Etanol RedTM. A atividade invertásica é maior nos meios YP e YNB contendo
Meio YNB – PE-2
Figura 6 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem PE-2 em meio YNB.
0 2 4 6 8 10 12 14 0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24
0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24 0
2 4 6 8 10 12 D C B A A B io m as sa ( m g/ m L) A çu ca r re si du al ( % ) V ia bi lid ad e ce lu la r (% ) Tempo (h) A tiv id ad e in ve rt as ic a (U /m g de L ev ed ur a) Tempo (h)
42
Meio YP – PE-2
Figura 7 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem PE-2 em meio YP.
0 2 4 6 8 10 12 14 0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24
0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24 0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 D C B A B io m as sa ( m g/ m L) A çu ca r re si du al ( % ) V ia bi lid ad e ce lu la r (% ) Tempo (h) A tiv id ad e in ve rt as ic a (U /m g de L ev ed ur as ) Tempo (h)
Com relação à linhagem SA-1 (figuras 8 e 9), mais uma vez, verifica-se a ocorrência de diauxia, mais claramente, em ambos os meios YP e YNB contendo sacarose, glicose, frutose ou galactose. A produção de biomassa por essa linhagem é aproximadamente igual no meio YP e YNB para todas as fontes de carbono. Em todos os experimentos a viabilidade se manteve elevada e o consumo de açúcar foi eficiente para os meios contendo sacarose, glicose e frutose; já para a galactose, o consumo foi lento e, para a maltose, o consumo de açúcar só se completou após 24 horas de cultivo. Com relação à atividade invertásica específica secretada por essa linhagem, nota-se a tendência de valores constantes e intermediários aos valores
das linhagens Ethanol RedTM e PE-2 (conforme tabelas 5 e 6) após 24 horas, em
44
Meio YNB – SA-1
Figura 8 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem SA-1 em meio YNB.
0 2 4 6 8 10 12 0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24 0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24 0 5 10 15 20 25 30 35 D C B A A B io m as sa ( m g/ m L) A çu ca r re si du al ( % ) V ia bi lid ad e ce lu la r (% ) Tempo (h) A tiv id ad e in ve rt as ic a (U /m g de L ev ed ur a) Tempo (h)
Meio YP – SA-1
Figura 9 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem SA-1 em meio YP.
0 2 4 6 8 10 12 14 0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24
0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24 0
5 10 15 20 25 30 35 D C B A B io m as sa ( m g/ m L) A çu ca r re si du al ( % ) V ia bi lid ad e ce lu la r (% ) Tempo (h) A tiv id ad e in ve rt as ic a (U /m g de L ev ed ur a) Tempo (h)
Fonte:Elaborado pelo autor.
46
Meio YNB – CAT-1
Figura 10 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem CAT-1 em meio YNB.
0 2 4 6 8 10 12 0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24 0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24 0 5 10 15 20 25 D C B B io m as sa ( m g/ m L) A A A çu ca r re si du al ( % ) A V ia bi lid ad e ce lu la r (% ) Tempo (h) A tiv id ad e in ve rt as ic a (U /m g de L ev ed ur a) Tempo (h)
48
Meio YP – CAT-1
Figura 11 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem CAT-1 em meio YP.
0 2 4 6 8 10 12 24
0 2 4 6 8 10 12 14
0 2 4 6 8 10 12 24
0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24
0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 D C B B io m as sa ( m g/ m L) A A çu ca r re si du al ( % ) V ia bi lid ad e ce lu la r (% ) Tempo (h) A tiv id ad e in ve rt as ic a (U /m g de L ev ed ur a) Tempo (h)
Fonte:Elaborado pelo autor.
50
Meio YNB – BG
Figura 12 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem BG em meio YNB.
0 2 4 6 8 10 12 0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24
0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24
0 5 10 15 20 25 30 35 40 D C B B io m as sa ( m g/ m L) A çu ca r re si du al ( % ) A V ia bi lid ad e ce lu la r (% ) Tempo (h) A tiv id ad e in ve rt as ic a (U /m g de L ev ed ur a) Tempo (h)
Meio YP – BG
Figura 13 - Produção de biomassa (A), do consumo de açúcar (B), da viabilidade celular (C) e da atividade invertásica específica (D) para a linhagem BG em meio YP.
0 2 4 6 8 10 12 24
0 2 4 6 8 10 12 14
0 2 4 6 8 10 12 24
0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24
0 20 40 60 80 100
0 2 4 6 8 10 12 24
0 5 10 15 20 25 30 35 D C B B io m as sa ( m g/ m L) A çu ca r re si du al ( % ) V ia bi lid ad e ce lu la r (% ) Tempo (h) A A tiv id ad e in ve rt as ic a (U /m g de L ev ed ur a) Tempo (h) A
52
As tabelas de 2 a 4 mostram uma compilação de resultados com a finalidade de melhor caracterizar as diferenças fisiológicas entre as linhagens industriais com relação ao tempo de crescimento, produção de biomassa e atividade invertásica específica. A tabela 2 mostra o tempo de cultivo necessário para consumo o de 50% da fonte de carbono presente no meio. Sacarose, glicose e frutose são rapidamente assimiladas por todas linhagens, e o consumo desses açúcares ocorre num intervalo
de 3 a 4 horas. A linhagem Ethanol RedTM consumiu 50% da maltose em 4 horas
para o meio YP, e em 5 horas para o meio YNB. Já para as linhagens PE-2 e SA-1, o consumo da mesma quantidade de maltose se deu por volta de 11 horas de cultivo em ambos os meios, e as linhagens CAT-1 e BG não são capazes de assimilar a maltose, sugerindo que as linhagens brasileiras apresentam dificuldade em utilizar maltose como fonte de carbono. Com relação à galactose, todas as linhagens apresentam dificuldade em utilizar este monossacarídeo, sendo que a linhagem
Ethanol RedTM é a que mais dificuldade apresentou para o consumo de galactose
(11 horas para meio YP e aproximadamente 16 horas para meio YNB). Além das características fisiológicas que determinam a utilização de diferentes açúcares, pode-se observar que a composição do meio de cultura pode também interferir no desenvolvimento da levedura.
Tabela 2 - Tempo de cultivo, em horas, para consumo de 50% da fonte de carbono.
RED PE SA CAT-1 BG
YNB YP YNB YP YNB YP YNB YP YNB YP
Sac/glic/fru 4 3 3,5 3 4 4 4 4 4 4
Maltose 5 4 11 10 11 11 * * * *
Galactose ≈ 16 11 7 7 8 9 11 9 12 9
*CAT-1 e BG não consomem maltose. Fonte: Elaborado pelo autor.
industrial desejado: as brasileiras mais adaptadas à sacarose e a Ethanol RedTM aos açúcares sacarose e maltose.
Os dados contidos na tabela 4 ilustram a intensidade de repressão catabólica, interpretada a partir da relação entre o valor de atividade específica após 24 horas de crescimento (que apresenta valor máximo de atividade específica, após a exaustão da fonte de carbono), e o menor valor de atividade específica (geralmente detectado na presença da fonte repressora - o açúcar). Apesar de todos os açúcares utilizados neste estudo exercerem repressão catabólica (a existência da diauxia é uma indicação do fenômeno de repressão), o fenômeno se manifesta com diferentes intensidades: normalmente, glicose e frutose são os açúcares que induzem maior efeito de repressão catabólica. Assim, estamos sugerindo esta relação dos valores de atividade específica como uma forma de verificar a intensidade do efeito da repressão catabólica exercido pelos açúcares. Como o esperado, para as linhagens
Ethanol RedTM, SA-1 e BG, a relação mostra-se perfeitamente coerente com o nível
54
Tabela 3 - Biomassa, em mg/mL, após 10h de cultivo.
Ethanol Red PE SA CAT-1 BG
YNB YP YNB YP YNB YP YNB YP YNB YP
Sacarose 4,438 5,756 5,34 6,519 6,241 6,657 6,449 6,657 6,241 6,449
Maltose 4,646 7,073 2,427 3,051 3,814 4,681 0,416 0,416 0,416 0,416
Glicose 4,750 5,340 5,894 6,241 6,519 5,478 5,617 6,657 4,993 6,033
Frutose 3,745 5,409 5,419 6,033 5,617 6,241 6,033 6,241 5,617 5,825
Galactose 0,936 3,19 6,796 6,103 6,449 6,311 2,496 5,201 2,288 4,577
Fonte:Elaborado pelo autor.
Tabela 4 - Intensidade de repressão catabólica.
Ethanol Red PE SA CAT-1 BG
YNB YP YNB YP YNB YP YNB YP YNB YP
Sacarose 4,89 5,38 1,95 3,50 3,65 2,10 0,77 1,45 1,23 3,81
Maltose 1,71 1,88 1,39 2,60 1,31 2,06 - - - -
Glicose 6,96 8,18 1,83 4,73 6,44 3,07 1 1,14 2,33 5,25
Frutose 6,1 5,09 2,10 4,48 2,96 2,02 1,19 1,96 3,76 6,26
Galactose 1,34 2,18 1,00 1,00 1,80 2,01 0,17 0,22 1,10 2,19
Tabela 5 - Atividades invertásicas específicas em meio YNB.
Atividades invertásicas (U/mg de levedura) em meio YNB Fontes de C RED PE-2 SA-1 CAT-1 BG
Valor mínimo (obtido na presença do
açúcar)
Sacarose 11,5 3,77 6,67 5,92 9,89
Maltose 40,92 1,7 15,87 - -
Glicose 7,1 1,77 4,06 3,95 7,42
Frutose 9,59 2 7,79 3,3 5,2
Galactose 23,4 1,78 8,55 2,35 5,05
Após 24h
Sacarose 56,22 7,33 24,33 4,6 12,2
Maltose 70,09 2,87 20,78 - -
Glicose 49,44 3,25 18,76 3,9 17,29
Frutose 58,5 4,2 23,12 3,95 19,59
Galactose 31,45 1,78 15,45 0,41 5,51
U = µmol/min
Fonte:Elaborado pelo autor.
Tabela 6 - Atividades invertásicas específicas em meio YP.
Atividades invertásicas (U/mg de levedura) em meio YP Fontes de C RED PE-2 SA-1 CAT-1 BG
Valor mínimo (obtido na presença do
açúcar)
Sacarose 13,16 3,29 11,1 6,17 5,81
Maltose 37,22 2,04 13,78 - -
Glicose 8,2 1,83 4,91 3,72 4,05
Frutose 11,63 2,45 8,4 3,2 5,17
Galactose 26,89 5,28 7,81 7,42 5,39
Após 24h
Sacarose 70,8 11,51 23,36 9 22,15
Maltose 70,22 5,28 17,65 - -
Glicose 67,7 8,87 23,09 4,27 21,27
Frutose 59,3 11 17 6,29 32,4
Galactose 58,62 5,28 15,73 1,7 11,8
U = µmol/min
56
4.2. Determinação da atividade invertásica durante fermentação em meios concentrados em sacarose
Como o objetivo central deste estudo é a obtenção de vinhos com maiores conteúdos de etanol, através da fermentação de mostos com alta concentração de sacarose por leveduras industriais produtoras de etanol combustível, a determinação da atividade invertásica na fermentação de sacarose 30% (p/v) foi realizada no sentido de verificar a possibilidade desta atividade enzimática poder ser utilizada como um indicador da manutenção da vitalidade fermentativa em condições estressantes de fermentação, principalmente durante o reciclo de células. Além da sacarose 30% (p/v) em meio sintético, também foram feitos experimentos com mosto industrial com sacarose 21% (p/v) para determinação dos níveis de atividade invertásica.
4.2.1. Experimentos com meio sintético e sacarose 30% (p/v)
A análise das figuras 14 e 15 mostram, em linhas gerais, o que foi observado
anteriormente: indicam que a linhagem Ethanol RedTM é a que apresenta maior valor
de atividade invertásica. Adicionalmente, este experimento mostra também que outras linhagens industriais diferem nas suas capacidades de expressarem atividade invertásica: as linhagens PE-2, CAT-1 e BG apresentam baixos níveis de atividade invertásica, e a linhagem SA-1 valores intermediários. Entretanto, apesar das atividades enzimáticas terem sido determinadas para células no final do ciclo, em condições de exaustão de açúcar do meio de fermentação, observa-se que os valores de atividade invertásica são menores que os determinados em crescimento com baixa concentração de sacarose (Figuras 4 a 13, Tabelas 5 e 6), principalmente
aqueles verificados para a linhagem Ethanol RedTM. Outro aspecto interessante é a
atividade enzimática (SALVATO, 2010). Estes resultados sugerem a possibilidade da utilização da atividade invertásica como um possível indicador da vitalidade das leveduras industriais.
Figura 14 - Atividade invertásica específica para as cinco linhagens em estudo para o primeiro ciclo, durante fermentação em condições de VHGF (Very High Gravity Fermentation Technology).
0,0 2,5 5,0 7,5 10,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Ciclo 1
A
tiv
id
ad
e
in
ve
rt
as
ic
a
(U
/m
g
de
L
ev
ed
ur
a)
Tempo (h)
58
Figura 15 - Atividade invertásica específica para as cinco linhagens em estudo para os dez ciclos, durante fermentação em condições de VHGF (Very High Gravity Fermentation Technology).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 2 4 6 8 10 12 14 16
18 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10
A
tiv
id
ad
e
in
ve
rt
as
ic
a
(U
/m
g
de
L
ev
ed
ur
a)
Tempo (h)
4.2.2. Experimentos com mosto industrial e sacarose 21% (p/v)
Os dados da figura 16 de atividade invertásica foram obtidos na fermentação de sacarose 21% (p/v) em mosto industrial, ao longo de dez ciclos de fermentação, e mostram que há uma diminuição na atividade ao longo dos ciclos, e que variou com a condição de cultivo. Na complementação com peptona, há uma diminuição contínua, como observado na fermentação do meio YP contendo sacarose 30% (p/v), e sem complementação e com extrato de levedura há aumento da atividade nos últimos ciclos de fermentação. Estas diferenças podem refletir a possibilidade da ocorrência de alterações nas condições fisiológicas das células ao longo dos ciclos fermentativos, e que podem variar nas diferentes condições de cultivo.
Figura 16 - Atividade invertásica específica para a linhagem CAT-1 para os dez ciclos, durante fermentação em mosto com 21% de sacarose.
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 0,0
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
4,0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10
A
tiv
id
ad
e
in
ve
rt
as
ic
a
(U
/m
g
de
L
ev
ed
ur
a)
Tempo (h)
60
4.3. Estudos com maltose
Considerando que os principais açúcares para a produção de etanol combustível são a sacarose (cana de açúcar) e maltose e glicose (resultantes da hidrólise do amido de milho), estudos foram desenvolvidos em nossos laboratórios para verificar a possibilidade da utilização das leveduras industriais brasileiras na produção de etanol a partir do amido, e neste caso verificando a fermentação da maltose. Resultados descritos neste trabalho e em trabalhos anteriores (MIRANDA
JÚNIOR et al., 2012) mostraram que as linhagens industriais brasileiras diferem nas
suas capacidades de fermentar maltose. Assim, foram realizados estudos adicionais para melhor compreensão do metabolismo da maltose para as linhagens brasileiras.
Para os estudos com maltose, inicialmente as células foram crescidas em sacarose (para o acúmulo de células) e, posteriormente, incubadas em meio contendo maltose como descrito anteriormente. Crescimento adicional após
inoculação em maltose só foi detectado para as linhagens Ethanol RedTM, PE-2 e
SA-1. Os dados da tabela 8 mostram os valores obtidos para a atividade maltásica desenvolvida pelas linhagens industriais Observa-se que as linhagens CAT-1 e BG apresentam baixíssimos níveis de atividade maltásica, quando comparadas com as outras linhagens industriais, o que explica a ausência de crescimento no meio contendo maltose. Cumpre salientar que, apesar das linhagens SA-1 e PE-2 apresentarem valores relativamente altos de atividade maltásica, o crescimento em
maltose é muito mais eficiente para a linhagem Ethanol RedTM, quando comparado
com o crescimento das outras linhagens (Tabelas 2 e 3).
A análise dos dados obtidos neste estudo, e dos anteriores, mostram a existência de diferentes categorias de linhagens com relação à fermentação de
maltose: a que fermenta maltose de forma rápida e eficaz (Ethanol RedTM), as que
não fermentam o açúcar (BG e CAT-1), e as que fermentam maltose, mas não de
forma tão eficiente como a Ethanol RedTM,(PE-2 e SA-1) e que eficácia na
4.4. Purificação parcial das invertase(s) e maltase
Com relação aos ensaios enzimáticos, as tabelas 7 e 8 mostram alguns dados obtidos com as enzimas invertase e maltase respectivamente.
Nota-se uma purificação parcial relativamente baixa com as etapas de diálise e precipitação com acetona para as preparações protéicas das diferentes linhagens quando a atividade específica de invertase é analisada e aumenta conforme os
passos de purificação. Pode-se afirmar ainda que as linhagens Ethanol RedTM e
SA-1 apresentam níveis maiores de atividade de invertases do que as demais linhagens - dado revelado pelos valores de atividade específica que levam em consideração a
quantidade de enzima que libera 1µmol de açúcar redutor por minuto por miligrama
de proteína. O nível de atividade específica de invertase para a linhagem BG está
um pouco abaixo daquele revelado pelas linhagens Ethanol RedTM e SA-1, porém,
um pouco acima das linhagens PE-1 e CAT-1, as quais possuem níveis bem próximos e, portanto, atividades específicas comparáveis entre si.
Já no que se refere aos estudos com a enzima maltase, não foi possível recuperar os níveis de atividade maltásica (aqui, entende-se como a quantidade de
enzima que libera 1µg de açúcar redutor por minuto por miligrama de proteína) após
a etapa de precipitação - não houve atividade nem no precipitado protéico, nem no sobrenadante. Isto pode ser devido à inativação das enzimas em contato com a acetona e/ou etanol absoluto (reagentes que foram propostos para precipitar as proteínas). Todavia, após a etapa de diálise dos extratos das cinco linhagens, percebeu-se uma sensível purificação parcial, com os níveis de atividade maltásica específica aumentando levemente. Torna-se interessante notar aqui que, agora, as
linhagens que mais expressam a enzima maltase são as linhagens Ethanol RedTM e
62
Tabela 7 - Atividades invertásicas em função dos passos de purificação.
Passos de
Purificação Linhagem [Proteína] (mg/mL) U/mL de prot.
Atividade Específica (U/mg de prot.) Rendimento (%) Fator de Purificação
(no de
vezes)
Extrato cru
Ethanol Red 30,945 9410 304,08 100,00 1,00
PE-2 21,070 2765 131,21 100,00 1,00
SA-1 21,473 5778 269,10 100,00 1,00
CAT-1 18,000 2512 139,57 100,00 1,00
BG 22,392 6130 273,76 100,00 1,00
Diálise
Ethanol Red 16,487 8884 538,86 94,41 1,77
PE-2 12,282 2414 196,52 87,30 1,50
SA-1 11,590 4790 413,27 82,90 1,54
CAT-1 13,509 2114 156,47 84,15 1,12
BG 16,007 5716 357,06 93,24 1,30
Precipitação
Ethanol Red 34,462 23641 686,03 83,66 2,26
PE-2 21,886 6246 285,46 75,00 2,18
SA-1 23,498 14030 597,00 80,66 2,22
CAT-1 23,824 6100 256,04 80,94 1,83
BG 32,659 14378 440,23 78,00 1,61
U = µmol/min
Fonte:Elaborado pelo autor.
Tabela 8 - Atividades maltásicas em função dos passos de purificação.
Passos de
Purificação Linhagem [Proteína] (mg/mL)
Atividade Total (U/mL) Atividade Específica (U/mg de prot) Rendimento (%) Fator de Purificação
(no de
vezes)
Extrato cru
Ethanol Red 26,084 36808 1411,15 100,00 1,00
PE-2 22,377 37647 1682,00 100,00 1,00
SA-1 26,458 16249 614,14 100,00 1,00
CAT-1 25,271 459 18,17 100,00 1,00
BG 25,070 5223 208,34 100,00 1,00
Diálise
Ethanol Red 14,963 31396 2098,25 85,30 1,49
PE-2 13,623 26719 1961,32 70,97 1,17
SA-1 17,245 9855 571,49 60,65 0,93
CAT-1 16,615 443 26,64 96,51 1,47
BG 19,370 2912 150,32 55,75 0,72
Precipitação*
*Sem atividade maltásica após ensaios de precipitação com acetona e com etanol. U = µg/min
4.5. Estudo da atividade inulinásica em leveduras industriais
